专利名称：新型胞壁酰二肽衍生物以及含该衍生物的流行性感冒疫苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及胞壁酰二肽衍生物，这类衍生物具有辅药活性并适于作流行性感冒病毒颗粒类的人工膜疫苗(即通常所说的病毒颗粒疫苗)的一个成份。本发明还涉及含该胞壁酰二肽衍生物和一种流行性感冒病毒抗原的复合物的流行性感冒疫苗。
由于在流行性病毒的血球凝集素分子上发生了突变，致使目前使用的流行性感冒HA疫苗的有效性起了变化，因此人们渴望开发出较常规疫苗更加有效的疫苗。
作为最近流行性感冒疫苗的发展方向，人们已经知道了一种由HA(血球凝集素)和NA(神经氨(糖)酸苷酶)作为主要成分而构成的合成疫苗，或由6-0-(2-十四烷基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺制成的流行性感冒病毒颗粒类的人工膜疫苗，即所谓病毒颗粒疫苗[见未审查的日本专利公开申请(下文称“J.P.公开”)61-282321]。人们已经知道特别是后一种疫苗在改善血液中的抗体值方面显示出优良的效果，因此它的利用是期望中的。
然而，这种疫苗对部分人体有刺激性，用于人体会引起不希望有的有害反应，皮肤会产生红色，因此作为药它是不能令人满意的。
本发明的目的是提供可以作为病毒颗粒疫苗中一个成分的有实用价值的新型胞壁酰二肽衍生物。
本发明另一个目的是提供一种具有杰出的抗体产生能力和安全性的流行性感冒疫苗。
本发明这些目的及其它目的根据下列描述和实例将是显而易见的。
为解决上述问题而进行了紧张的研究，之后，本发明者才完成了本发明。
按本发明的第一个目的，它提供了具有下列通式(Ⅰ)的胞壁酰二肽衍生物及其盐类
(Ⅰ)式中R表示具有2-6个碳原子的酰基，X表示L-氨基丙酸残基、L-丝氨酸残基、L-缬氨酸残基或甘氨酸残基，A表示具有10-60个碳原子的脂肪酸残基，以及R1和R2独立地代表氢原子、取代的或未取代的低级烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、羟基、低级烷氧基、氨基或低级烷氨基或R1和R2可能与和它们直接相连的氮原子形成环氨基，所形成的环氨基可以具有的一个或多个选自氧、硫和氮原子的杂原子作为成环的原子并且可被取代也可不被取代。
按本发明的第二个目的，提供的流行性感冒疫苗包含上述通式(Ⅰ)的化合物或其盐和流行性感冒病毒抗原的复合物。
图1是本发明1号样品疫苗的电子显微照像(X95，000)。
图2是本发明2号样品疫苗的电子显微照像(X95，000)。
下面将对上述通式(Ⅰ)中的取代基进行描述。
具有2-6个碳原子的酰基包括乙酰基、丙酰基、丁酰基等。脂肪酸残基包括具有20-60个碳原子的直链或支链脂肪酸残基，其中可以有一个或多个不饱和键。其实例包括癸酰基、十二酰、十三酰、十四酰、十六酰、十八酰、二十酰、二十二酰、二十四酰、二十六酰、三十酰、四十酰、9-十六烯酰、9-十八烯酰、11，14-二十碳二烯酰、11-二十碳烯酰、11、14、17-二十碳三烯酰、2-十二烷基十六酰、2-十四烷基十六酰、2-十二烷基十四酰、2-十四烯基十六酰、2-十四烯基十六酰、2-十六烷基十八酰基等。最好它们是具有20-40个碳原子的支链基。
低级烷基包括具有1-6个碳原子的烷基，如甲基、乙基、丙基、异丙基、叔-丁基及其类似物。低级烷基可以具有取代基如卤原子、羟基、氨基及其类似物。取代基的数目通常最好是1-3。
环烷基是5-7节环的基，例如环丙基、环戊基、环己基、环庚基及其类似物。环烷基可以有一个或多个取代基，这些取代基包括低级烷基、卤原子、羟基、氨基及其类似物。取代基的数目通常最好为1-3。
卤原子的实例包括氯、溴、氟和碘原子。
芳基包括苯基、萘基、联苯基及其类似物、芳基可有一个或多个取代基，这些取代基包括低级烷基、卤原子、羟基、氨基及其类似物，取代基的数目通常最好为1-3。
芳烷基包括例如苯甲基、苯乙基、萘甲基及其类似物。芳烷基的芳基部分中可有一个或多个取代基，这些取代基包括低级烷基、卤原子、羟基、氨基及其类似物。取代基的数目通常最好为1-3。
环氨基包括5-7节环的环氨基，如吡咯烷基、哌啶基、高哌啶基及其类似物。环氨基可包括一个或多个杂原子，优选地是一个选自氧、硫和氮原子中的杂原子作为成环的原子。其实例包括3-恶唑烷基、3-噻唑烷基、吗啉代、硫代吗啉代、1-吡唑烷基、1-咪唑烷基及其类似物。环氨基可有一个或多个取代基，这些取代基包括低级烷基、卤原子、羟基、氨基及其类似物。取代基的数目通常最好为1-3个。低级烷氧基的例子包括甲氧基、乙氧基、丙氧基、异丙氧基及其类似物，烷氨基意指-单低级烷氨基或双低级烷氨基，其实例包括单甲氨基、单乙氨基、双甲氨基、双丙氨基、单丁氨基等。
通式(Ⅰ)化合物的部分结构-NHCH(CONH2)CH2CH2CO-具有D-和L-异构体，这是因为它有不对称的碳原子。通常D-异构体是优选的。
至于通式(Ⅰ)化合物蔗糖部分中的1-位，具有异头异构体(α-和β-异构体)，两者对于本发明的疫苗来说都是有用的。
为了方便起见，本文中的两种异头异构体同时表示成下列部分结构式
下面将对通式(Ⅰ)化合物的生产方法进行描述。
换句话说，通过经常用于合成肽的缩合方法，如碳化二亚胺法、eintopf法或活性酯法，使通式(Ⅱ)化合物与通式(Ⅲ)化合物反应生成所需的通式(Ⅰ)化合物。例如，当通常使用活性酯法时，将通式(Ⅱ)化合物溶解于非活性有机溶剂如二甲基甲酰胺、四氢呋喃、二恶烷、乙腈或其混合物中，并与试剂反应生成活性酯如N，N-二琥珀酰亚氨基碳酸酯、N，N-羰基咪唑或N，N-二琥珀酰亚氨基草酸酯，最好是在有机碱如三乙胺、N-甲基吗啉或4-二甲氨基吡啶存在下，在0℃-约60℃下反应30分钟到数小时以生成活性酯，在上述碱存在下，于约-15℃到约60℃优选地是在0℃-25℃下将通式(Ⅲ)的胺化合物加入该活性酯中，并将反应进行数十分钟到大约1天。上述生成活性酯的试剂其使用量与通式(Ⅱ)化合物等摩尔量。上述有机碱的使用量也可与通式(Ⅱ)化合物等摩尔或过量。之后将所得到的产物用硅胶柱色谱或诸如此类的方法纯化以获得通式(Ⅰ)的化合物。
通式(Ⅱ)起始化合物可按日本专利公开63-11359中所述的方法制备。
构成本发明疫苗的复合物是通式(Ⅰ)的化合物或其盐(如需要的话)与一种类脂聚集而形成一种封闭的内质网，并且将流行性感冒病毒抗原引入到其膜内。其典型实例是病毒颗粒类疫苗，即所谓的病毒颗粒。
下文将描述本发明疫苗中的抗原。
适用于本发明的抗原包括流行性感冒病毒的HA(血球凝集素)抗原、NA(神经氨(糖)酸苷酶)抗原及其类似物。通常使用它们的混合物(即所谓的HANA抗原)是最理想的。通过对感染流行性感冒病毒的尿囊体液进行低速和高速离心分离处理或化学处理来提纯流行性感冒病毒、用表面活性剂如TritonX-100、胆酸钠及其类似物溶解经过纯化的病毒、或用有机溶剂如醚分离病毒，再通过蔗糖密度-梯度离心法亲合色谱法或诸如此类的方法进行纯化和分离而获得HANA抗原。由此获得的抗原其使用量通常为每份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的1/300-10份(重量计)，最好为1/100-1份(重量计)。
本发明的疫苗可通过各种方法如用于生产脂质体的普通方法来生产。典型的方法实例将在下文描述。
将流行性感冒病毒抗原，通式(Ⅰ)化合物或其盐以及优选地一种磷脂于一种适当的缓冲溶液，如磷酸盐缓冲溶液或诸如此类的溶液内一块混合，再将有效量的(优选的0.1-20W/V%)表面活性剂如胆酸钠、辛基葡糖苷及其类似物加入到混合物以使其溶解。然后将该混合物渗析以除去所用的表面活性剂，由此获得本发明的流行性感冒疫苗。可以将一种糖化物如葡萄糖、麦芽糖或乳糖，一种盐如氯化钠，或其混合物作为等渗剂(isotoniger)掺入所获得的本发明的疫苗中。
磷脂的实例包括磷脂酰甘油，如二肉豆寇酰磷脂酰甘油和二棕榈酰磷脂酰甘油;磷脂酰丝氨酸;磷脂酰胆碱如二棕榈酰磷脂酰胆碱;磷脂酰乙醇胺;磷酯酰肌醇;磷脂酸及其类似物。它们可由天然物质如蛋黄或大豆中获得也可以通过合成得到。它们既可单独使用也可以混合物形式使用。使用量通常为每1份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的1/20-20份(重量计)，最好为1/4-3份(按重量)。
在上述方法中，可以将磷脂和胆甾醇、α-生育酚、联十六烷基磷酸酯、硬脂酰胺或其类似物结合起来使用，这些化合物的使用量通常不超过每1份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的2份(重量计)，最好1/10-1/2份(重量计)。
由此产生的本发明的疫苗通常是这样一种形式即通式(Ⅰ)化合物或其盐和磷脂形成颗粒而将抗原引入其膜内(所谓病毒颗粒)。病毒颗粒的平均粒径和表面的
一电位可通过改变通式(Ⅰ)化合物或其盐与磷脂的比例来控制。通常病毒颗粒的平均粒径最好为40-300nm而其
一电位最好为-5--70mv。
本发明疫苗通常是通过皮下投药，在一个季节中可以一次或分几次施用350-12μg(用抗原蛋白表示)疫苗。
本发明的胞壁酰二肽衍生物具有杰出的辅药活性并且是病毒颗粒疫苗优良的成分。
本发明疫苗具有等于或高于常用的病毒颗粒疫苗的抗体产生能力而且在变红和发热方面其安全性很高。另外，本发明的疫苗在储藏期具有很高的稳定性它可以以冷冻形式或冻干形式保存。
下列实例用来进一步说明本发明，然而并不意味着限制本发明。
例1将1.0g[6-0-(2-十四(烷)基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解于100ml的四氢呋喃中。将0.3gN，N-二琥珀酰亚氨基碳酸酯和0.15ml三乙胺加入该溶液中并将其在室温下搅拌1.5小时。然后加入0.22ml128%的氢氧化铵水溶液再于室温下搅拌30分钟。
降压下将该反应液浓缩，对其残余物进行硅胶柱色谱。用氯仿/甲醇洗脱纯化后紧接着冻干除去水/二恶烷，获得0.44g[6-0-(2-十四(烷)基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺。
熔点155-165℃分子量926(C49H91N5O11)FAB Mas m/z 927(M+1)1H-NMR(DMSO-d6)δ0.85(6H，t，J＝7Hz)，1.2-1.3，1.39，1.50(58H，m)，1.72(1H，m)，1.80(3H，s)，1.93(1H，m)，2.08(2H，t，J＝8Hz)，2.30(1H，m)，3.28(1H，t，J＝9Hz)，3.46(1H，t，J＝9Hz)，3.67(1H，m)，3.81(1H，m)，4.02(1H，d-d，J＝12Hz，5Hz)，4.12(1H，d-q，J＝9Hz，5Hz)，4.31(2H，m)，4.34(1H，d，J＝10Hz)，4.44和4.98(1H)，5.43(1H，d，J＝4Hz)，6.67(1H，d，J＝4Hz)，6.74(1H，s)，7.01(1H，s)，7.27(1H，s)，7.30(1H，s)，7.65(1H，d，J＝7Hz)，8.08(1H，d，J＝8Hz)，8.17(1H，d，J＝8Hz)。
例2将1.0g[6-0-(2-十四(烷)基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺溶解于100ml的四氢呋喃中。往该溶液中加入0.3gN，N-二琥珀酰亚氨基碳酸酯和0.15ml的三乙胺。在室温下将它们搅拌1.5小时。再往所获溶液添加0.2ml40%的甲胺水溶液再于室温下搅拌30分钟。
降压下浓缩该反应溶液，对其残余物进行硅胶柱色谱。用氯仿/甲醇洗脱纯化后，紧接着冷冻干燥除去水/二恶烷，获得0.5g的[6-0-(2-十四(烷)基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-N-甲基-D-谷氨酰胺。
熔点95-100℃
分子量939(C50H93N5O11)FAB Mas m/z 940(M+1)1H-NMR(DMSO-d6)δ0.85(6H，t，J＝7Hz)，1.2-1.3，1.39，1.50(58H，m)，1.73(1H，m)，1.79(3H，s)，1.93(1H，m)，2.07(2H，t，J＝8Hz)，2.30(1H，m)，2.55(3H，d，J＝5Hz)，3.26(1H，t，J＝9Hz)，3.46(1H，t，J＝9Hz)，3.68(1H，m)，3.82(1H，m)，4.03(1H，d-d，J＝12Hz，5Hz)，4.12(1H，d-q，J＝9Hz，5Hz)，4.30(2H，m)，4.36(1H，d，J＝10Hz)，4.98(1H，t，J＝3.5Hz)，5.43(1H，d，J＝7Hz)，6.67(1H，d，J＝4Hz)，7.01(1H，s)，7.31(1H，s)，7.64(1H，d，J＝7Hz)，7.71(1H，d，J＝5Hz)，8.07(1H，d，J＝8Hz)，8.17(1H，d，J＝8Hz)。
例3按与例2相同的方法制备[6-0-(2-十四(烷)基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-N-乙基-D-谷氨酰胺。
分子量953(C51H95N5O11)FAB Mas m/z 954(M+1)1H-NMR(DMSO-d6)δ0.85(6H，t，J＝7Hz)，0.99(3H，t，J＝7Hz)，1.2-1.3，1.39，1.50(58H，m)，1.71(1H，m)，1.79(3H，9)，1.93(1H，m)，2.06(2H，t，J＝8Hz)，2.29(1H，m)，3.04(2H，d-q，J＝3Hz)5Hz，7Hz)，3.28(1H，t，J＝9Hz)，3.45(1H，t，J＝9Hz)，3.68(1H，m)，3.81(1H，m)，4.03(1H，d-d，J＝12Hz，5Hz)，4.12(1H，d-q，J＝9Hz，5Hz)，4.29(2H，m)，4.35(1H，d，J＝10Hz)，4.97(1H，t，J＝3.5Hz)，5.44(1H，d，J＝7Hz)，6.68(1H，d，J＝4Hz)，7.01(1H，s)，7.30(1H，s)，7.64(1H，d，J＝7Hz)，7.76(1H，d，J＝5.5Hz)，8.07(1H，d，J＝8Hz)，8.16(1H，d，J＝8Hz)。
例4制备流行性感冒HANA抗原由感染流行性感冒A/yamagate/120/86菌株的尿囊体液通过高速离心处理(23000rpm，90分钟)，低速离心处理(6000rpm，60分钟)和蔗糖密度一梯度离心(30000rpm，3h)获得纯化病毒。然后往病毒溶液添加TritonX-100，其用量应使TritonX-100的浓度为1%。彻底将其搅拌以溶解病毒然后通过蔗糖密度一梯度平衡法获得纯化的HANA抗原溶液。
制备病毒颗粒疫苗由上述获得的纯化HANA抗原溶液，按下列方式制备每种都含有表1所列成分的4种疫苗样品将各个成分混合在一起然后往该混合物中添加辛基葡糖苷，其用量为使其浓度为4%以溶解各成分。然后按常规方法用含5%蔗糖的磷酸盐缓冲溶液(PH7.4)进行渗析。将由此获得的每个样品的HANA抗原浓度调节至70μg/ml。在所获得的样品中观察病毒颗粒的形成过程。将本发明1号和2号样品中的病毒颗粒示于图1和图2中。
将本发明的病毒颗粒疫苗(1号或2号)和对照疫苗稀释至前疫苗溶液浓度的1/15，而后经皮下接种到一组10头几内亚猪的每只猪背部中，用量为0.5ml。接种后的三周以相同剂量再接种一次。3周和5周后，由几内亚猪采血并按WHO法进行血球凝集素抑制试验以测定其抗体生成能力。结果列于表1。
＊对照化合物6-0-(2-十四烷基十六酰)-N-乙酰胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺。
显红反应试验在显红反应试验中，经皮下向5只兔子中的每只兔子的背部接种0.5ml的样品，每天测量每只兔的显红表面区，计算5只兔子的总面积，而后计算兔子的平均显红表面积。结果列于表2。
根据上表，很显然由本发明疫苗引起的显红程度低于由对照疫苗引起的显红程度。
发热试验在发热试验中，按照生物制品标准通用法向兔子引入各种样品1ml。当3只兔由于反应使总热度提高1.3℃或更低时，则发热试验结果表示为阴性，而当提高2.5℃或高于此值时，结果则显示为阳性。结果列于表3。
根据上表，很显然由本发明疫苗引起的发热升高程度低于由对照疫苗所引起的发热升高程度。
权利要求
1.具有下列通式(Ⅰ)的胞壁酰二肽衍生物及其盐
(1)式中R代表具有2-6个碳原子的酰基，X代表L-丙氨酰残基、L-丝氨酸残基、L-缬氨酸残基或甘氨酸残基，A代表具有10-60个碳原子的脂肪酸残基，以及R1和R2独立地代表氢原子、取代的或未取代的低级烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、羟基、低级烷氧基、氨基或低级烷氨基或R1和R2与和它们直接相连的氮原子一起形成环氨基，该环氨基可以有一个或多个选自氧、硫和氮原子的杂原子作为成环原子，并可被取代或不被取代。
2.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中A表示具有20-40个碳原子的支链脂肪酸残基。
3.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中X表示L-丙氨酸残基。
4.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中R1和R2独立地代表氢原子或低级烷基。
5.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中该低级烷基具有1-6个碳原子。
6.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中该环烷基具有一个5-7节环。
7.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中该环氨基具有一个5-7节环。
8.权利要求1中的胞壁酰二肽衍生物，其中R表示具有2-6个碳原子的酰基，X表示L-丙氨酸残基，A表示具有20-40个碳原子的支链脂肪酸残基以及R1和R2独立地代表氢原子或低级烷基。
9.一种胞壁酰二肽衍生物，它选自[6-0-(2-十四烷基十六酰基)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺、[6-0-(2-十四烷基十六酰基)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-N-甲基-D-谷氨酰基和[6-0-(2-十四烷基十六酰基)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-N-乙基-D-谷氨酰胺。
10.一种流行性感冒疫苗，它由通式(Ⅰ)化合物或其盐和流行性感冒病毒抗原的复合物组成，所述通式(Ⅰ)为式中R表示具有2-6个碳原子的酰基，X表示L-丙氨酸残基、L-丝氨酸残基L-缬氨酸残基或甘氨酸残基，A表示具有10-60个碳原子的脂肪酸残基以及R1和R2独立地代表氢原子，取代的或未取代的低级烷基、取代的或未取代的环烷基、取代的或未取代的芳基、取代的或未取代的芳烷基、羟基、低级烷氧基、氨基或低级烷氨基或R1和R2与和它们直接相连的氮原子一起形成环氨基，该环氨基可有一个或多个选自氧、硫和氮的杂原子作为成环原子并可被取代或不被取代。
11.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中A表示具有20-40个碳原子的支链脂肪酸残基。
12.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中X表示L-丙氨酸残基。
13.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中R1和R2独立地代表氢原子或低级烷基。
14.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中R表示具有2-6个碳原子的酰基，X表示L-丙氨酸残基，A表示具有20-40个碳原子的支链脂肪酸残基以及R1和R2独立地代表氢原子或低级烷基。
15.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中流行性感冒病毒的抗原是流行性感冒HANA抗原。
16.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中该抗原的使用量为每份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的1/300-10份(重量计)。
17.权利要求10中的流行性感冒疫苗，其中通式(Ⅰ)化合物或其盐和磷脂生成封闭的内质网而流行性感冒病毒被引入其膜内。
18.权利要求17中的流行性感冒疫苗，其中疫苗是病毒颗粒疫苗。
19.权利要求17中的流行性感冒疫苗，其中R表示具有2-6个碳原子的酰基，X表示L-丙氨酸残基，A表示具有20-40个碳原子的支链脂肪酸残基以及R1和R2独立地代表氢原子或低级烷基。
20.权利要求17中的流行性感冒疫苗，其中流行性感冒病毒的抗原是流行性感冒HANA抗原。
21.权利要求17中的流行性感冒疫苗，其中该类脂是磷脂且其使用量为每份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的1/20-20份(重量计)。
22.权利要求21中的流行性感冒疫苗，其中该类脂的使用量为每份通式(Ⅰ)化合物或其盐重量的1/4-3份(重量计)。
全文摘要
本发明提供了新型胞壁酰二肽衍生物如[6-O-(2-十四烷基十六酰基)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-D-谷氨酰胺和[6-O-(2-十四烷基十六酰基)-N-乙酰胞壁酰基]-L-丙氨酰-N-甲基-D-谷氨酰胺。胞壁酰二肽衍生物作为辅药或颗粒病毒疫苗的组成成分是优良的化合物。流行性感冒疫苗由该胞壁酰二肽衍生物和流行性感冒疫苗抗原的复合物组成。所述流行性感冒疫苗具有优良的抗体产生能力和安全性。
文档编号A61K38/00GK1062146SQ91111449
公开日1992年6月24日 申请日期1991年10月30日 优先权日1990年10月30日
发明者冲正信, 柘植英哉, 大隈邦夫, 冈徹也 申请人:第一制药株式会社, 化学及血清疗法研究所