专利名称：双(苯基)乙烷衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及双(苯基)乙烷衍生物领域。它涉及式Ⅰ化合物
其中R1与R2分别是烷氧基，R3为氢或酰基，且R4为烷氧基，以游离形式，或可能时，以盐的形式存在，本文以后简称为“本发明化合物”。
本发明化合物具有分化的药理学的，特别是抗过度增殖与抗癌活性。
作为取代基如烷氧基一部分的烷基最好有1至4个碳原子，特别是甲基或乙基。
酰基最好是羧酸的残基，特别是烷基、芳烷基或芳香羧酸，而芳基最好是苯基。酰基的亚烷基部分，包括羰基，最好有1至5个碳原子。一优选的酰基部分为乙酰基。
在一组优选的本发明化合物中，R1和R2分别是1至4个碳原子的烷氧基，而R3与R4则如上述定义。
在另一类化合物中，R1和R2分别是1至4个碳原子的烷氧基，R3为氢或总碳原子数为2至5的烷基碳酰，R4为碳原子数为1至4的烷氧基(Ⅰs化合物);其中R1与R2尤其分别是甲氧基或乙氧基;R4尤其为甲氧基或乙氧基。
本发明化合物可经下述方法制备，它包括a)还原式Ⅱ对应的化合物
其中-X-X-为1，2-亚乙烯基或亚乙炔基，或b)酯化或酰化式Ⅲ的化合物
其中
R1和R2为上所定义，R5为羟基或烷氧基，和R6为氢或酰基且可经酯交换反应将烷氧基R4转化为一不同的烷氧基R4，这样得来的官能团可以是被保护的形式，反应后将保护基除去，且以游离态或可能时以盐的形式回收所得式Ⅰ化合物。
本发明方法可以常规方式进行。
方法变体a)一般通过氢化作用进行，最好将氢与氢化催化剂如Pd，Pt或Rh一起使用更加优选的是采用Pd/C催化剂。
方法变体b)也以常规方式进行。
酯交换作用以及酯化作用最好在强酸如硫酸存在下与欲引入的酯基相应的醇反应进行。
保护基的除去也按常规方法进行。可被适当保护的官能团为羟基，如被三烷基甲硅烷基保护。例如三烷基甲硅烷基的除去可通过用氢氟酸在如乙腈的溶剂中处理进行。
本发明的最终产物可用已知的方法，如色谱法从反应混合物中分离并提纯。
原料也可用常规方法获得式Ⅱ化合物(其中-X-X-为1，2-亚乙烯基)可由对应的式Ⅳ化合物
(其中X为阴离子，最好是溴化物)与对应的式Ⅴ化合物
以常规的以Witting/Horner/Emmons型反应的方式反应，经在温度为约-70℃与约100℃之间用碱处理亚磷组分，所述碱如烷基锂，碱金属氢化物，或碱金属酰胺，如酰氨钠，二异丙酰胺锂，或醇的碱金属盐，然后同时或随后在温度为约-70℃与约120℃之间，最好为-60℃至60℃，在合适的溶剂中，如四氢呋喃，甲苯或二甲亚砜中，将羰基成分转化。
式Ⅱ化合物(其中-X-X-为1，2-亚乙烯基)可由式Ⅳ对应的化合物
与式Ⅶ对应的化合物
(其中Y为囟素，最好为碘)按照囟代烯烃与乙炔的Heck反应的标准方法反应得到。
式Ⅲ化合物，其中R6为氢，以及式Ⅲ化合物，其中R5是羟基，可经上述类似的方法制备，或经式Ⅰ对应化合物其中R3为酰基和/或R4为烷氧基的脱酰作用或去烷基化方法得到。
在此不特别描述原料的制备，因为它们是周知的，或可根据已知的方法，或类似于已知的方法或描述于实施例中的方法制得。
在下面实施例中，所有温度均为摄氏温度;所有核磁共振均为H-核磁共振(CDCl3)实施例一5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-羟基苯甲酸甲酯[式ⅠR1，R2，R4为OCH3;R3为H][方法变体a)]将60毫克5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙炔基]-2-羟基苯甲酸甲酯或60毫克5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙烯基]-2-羟基苯甲酸甲酯的E/Z混合物溶于10毫升乙酸乙酯中。加入10毫克10%的Pd/C后混合物，在氮气氛下搅拌过夜，用Celite过滤然后减压蒸发至干。即获得标题化合物(无色晶体;色谱提纯后熔点为65℃，经乙醇重结晶后熔点为67℃)。
原料可如下法获得-在氩气氛下240毫克2，5-二甲氧苯基乙炔与493毫克5-碘代水杨酸甲酯溶于20毫升无氧无水的苯中。混合物用85毫克四(磷酸三苯膦)钯，20毫克碘化铜(Ⅰ)和450毫克三乙胺处理，于室温下搅拌过夜然后倒入100毫升PH＝7的缓冲溶液中。经乙酸乙酯提取和在硅胶上色谱提纯后，即获得5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙炔基]-2-羟基苯甲酸甲酯(无色晶体，熔点为105～108℃)。
-6.6毫摩尔二异丙基酰胺锂溶于四氢呋喃/正己烷中，于-40℃加入15毫升无水四氢呋喃与1克2，5-二甲氧苯基-三苯基膦溴化物的悬浮液中。混合物搅拌1小时后冷至-70℃然后慢慢地用溶于5毫升无水四氢呋喃的372毫克3-甲氧羰基-4-羟基苯甲醛处理。混合物在-70℃下搅拌1小时，在室温搅拌2小时然后倒入氯化铵水溶液经乙酸乙酯提取和蒸发后即得(Z)-与(E)-5-[2，5-二甲氧苯基)乙烯基]-2-羟基苯甲酸甲酯，硅凝胶色谱(正己烷/乙酸乙酯9∶1)。第一级分含E-异构体(无色晶体，熔点为78～80℃)，接着为E-异构体(无色晶体，熔点为80～82℃)。
实施例二5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-羟基苯甲酸乙酯[式ⅠR1，R2为OCH3;R3为H;R4为OCH2CH3][方法变体b)]250毫克5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-羟基苯甲酸或250毫克5-[2[(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-羟基苯甲酸甲酯溶于10毫升干乙醇，然后用0.2毫升浓硫酸处理。混合物回流48个小时然后倒入150毫升水。紧接着用乙酸乙酯提取并在硅凝胶上色谱提纯即获标题化合物(无色油状)NMR10.69(s，1H);7.67(d，J＝2.2Hz，1H);7.29(dd，J＝2.2+8.5Hz，1H);6.91(d，J＝8.5Hz，1H);6.66-6.83(m，3H);4.42(qua，J＝7Hz，2H);3.79(s，3H);3.75(s，3H);2.76-2.92(m，4H);1.44(tr，J＝7Hz，3H).
实施例三5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-乙酸基苯甲酸甲酯[式Ⅰ，R1，R2，R4＝OCH3;R3＝COCH3][方法变体b)]150毫克5-[2-(2，5-二甲氧苯基)乙基]-2-羟基苯甲酸甲酯(实施例1化合物)溶于2.5毫升乙酐中，然后用45毫克吡啶处理。混合物于室温下搅拌过夜。合并的有机提取液分别用0.1N HCl溶液，碳酸钠溶液，和水洗涤。随着溶剂的蒸发即获标题化合物(无色油状)。
NMR7.85(d，J＝2Hz，1H);7.34(dd，J＝2+8Hz，1H);6.99(d，J＝8Hz，1H);6.66-6.80(m，3H);3.87(s，3H);3.76(s，3H);2.89(s，4H);2.34(s，3H).
(1)参见实施例3(2)酯化始于式Ⅲ对应化合物，其中R为羟基(熔点为120～125℃)，制备方法类似于实施例1。
(3)始于Ⅱ对应化合物，其中-X-X-为1，2-亚乙烯基，(熔点为86～88℃，E-异构体;熔点为63～66℃，Z-异构体)。制备如实施例1所述。
(4)始于Ⅱ对应化合物，其中，-X-X-为1，2-亚乙烯基(熔点为45～50℃)的E/Z混合物(1.3∶1)，制备如实施例1所述。
式Ⅰ化合物以游离态形式，或可能时以药学上可接受的盐形式存在，它具有许多有益的化学治疗特性。它们适用作药物。
特别是，它们有着抗过度增殖/消炎及抗癌活性。下列为本文后面采用的缩写形式CHO-K1即所谓的“中国腮鼠-卵巢-K1”细胞系DMEM即Dulbeco改良后的Eagle氏培养基(Gibco)EGF即表皮生长因子FCS即胎儿腓肠血清HaCaT即所谓的“成年人钙温”细胞系RPMI-1640即Rosaeell Park纪念学院培养基1640TGF2即转变生长因子α抗过度增殖/消炎活性和/或抗癌活性可用下述方法测定1.人类角质化细胞系HaCaT(或参照CHO-K1)细胞线)的增殖抑制HaCaT细胞，一种自发转变而来的，TGF-α-和EGF-接受器正的非致瘤人类角质化细胞系，它还别于正常角质化细胞带有高度表型保护特征，(Boukamp et al，J.Cell.Biol.106，第761-771页，)，培养于加有2.2g/l NaHCO3，0.11g/l丙酮酸钠，15mM Hepes，5%FCS，盘尼西林(100U/m)，链霉素(100μg/ml)，及谷氨酰胺(以将最终浓度增至4mM)的DMEM培养基中。CHO-K1细胞培养于上述培养基内再加40μg/ml脯氨酸。为了做增殖鉴定，细胞经受胰蛋白酶作用而分离，在新鲜的培养基上悬浮，然后以2000-4000细胞/0.2ml/孔的浓度接种于96-凹陷式微滴度盘中。24小时后培养基用含有试样化合物分级浓度的新鲜培养基更换经3-4天培养后，用硫氰酸胺B(Skehan et al.，J.Natl.Cancer Inst.82，第1107-1112页，)经比色鉴定测量细胞增殖的程度。结果代表了三次测量的平均正负标准偏差。
在上述鉴定中，所用化合物抑制HaCaT细胞增殖的IC50值域从约0.03μM至约3μM。
抗癌功效可用下述方法查明2.脑细胞增殖的抑制瘤细胞系，如K-562，L1210，Hela，SK-BR-3，MdAMB-468，MCF-7或MDAMB-231上述所有细胞系均可从American Type Culture Couection，Rockuille，MD 20852，USA获得)，生长于RPMT-1640培养基中再添加10%热钝化(56℃/30分钟)FCS及抗生素(1X C IBCO盘尼西林-链霉素溶液)当生长于悬浮液(K-562和L1210)的脑细胞系以指数增长或粘合细胞系达到60～90%汇合度时，便采集所有细胞(粘合细胞均受胰蛋的酶作用)，在新鲜生长培养基中悬浮，然后以浓度为1000-5000细胞/孔接种于96凹防式培养盘中。细胞在2-4天内生长，在湿润的以5%CO2平衡的恒温箱于37℃以及在试样化合物分级浓度存在的条件下至最终体积为0.2ml/孔。用MTT(Alley et al.，Cancer Res.48第589-601页)对生长于悬浮液的细胞通过比色鉴定或对粘合细胞通过硫氰酸胺B来测量细胞增殖程度。
在上述鉴定中所用化合物抑制上述四种细胞系增殖的IC50值域为从约0.019μM至约3μM。
3.异植于秃鼠的人类肿脑生长影响因素MiapaCa-2是一种人类胰腺瘤细胞系;A431细胞系取样于人类外阴表皮样癌。它们均可由ATCC(American Type Culture Collection)处获得。这些细胞培养在没有抗生素及抗霉菌剂的情况下生长。体重20至23克的雌性Balb/C秃鼠以每群5只喂养，它们可自由喝水及无病原体的啮齿同类食物。从已培养好的瘤细胞系中通过皮下注射107细胞将瘤引入秃鼠中。一旦这些肿瘤直径达到约1cm，即切除，切成约4×3mm小块然后皮下移植于秃鼠两肋腹。移植后一个星期和二星期，用一管经器测量肿瘤大小。带有生长着肿瘤的小鼠根据每鼠同一的平均肿瘤负荷随机分成对照与治疗两组。试样化合物采用口服方式。同样的药液使用两个连续的疗程。对照组只用载体治疗。同隔每星期测定肿腹体积且表示为每鼠平均肿瘤体积(mm)。采用RS/l(BBN Software Produts Corp.)的统计程度来评估所得数据，试验包括Student的t-试验并应用Mann-whiteney试验。
在上述鉴定中，所用化合物剂量从30mg/Kg至100mg/Kg(口服)或从3mg/Kg至10mg/Kg(静脉注射)，在整个治疗期间明显地(P＜0.05或＜0.01)抑制了A431肿瘤的增长(人类表皮样瘤超出EFG接受器所表示的范围。)实验结束时(4个星期)，药物治疗过的秃鼠的肿瘤体积为对照组的约10%至约50%MiaPaCa肿瘤的生长(人类胰腺脂表达出EGF接受器的正常数目)也被类似地抑制经3个星期的治疗，被治疗的秃鼠的肿瘤体积较之对照组的受到明显地抑制。
防过度增殖/消炎活性用于传统的应用可如下述4.抑制小鼠由噁唑酮引发的过敏性接触皮炎经简单使用2%噁唑酮(10μl)于小鼠的腹部皮肤上(每组8只小鼠)可诱发过敏。8天后每只小鼠的一只耳廓第二次接触2%噁唑酮即可补发耳廓肿胀的过敏性反应。
试样化合物两种传统应用可抑制耳廓肿胀。(在激发反应的补发前30分钟与后30分钟)通过分别用药物治疗的老鼠及用载体(丙二醇/丙酮7∶3)治疗的老鼠的耳廓重量的差异来验证功效，且以百分比来表示单独使用载体的肿胀情况。
在上述鉴定中，当试样化合物剂量为1.2%时能获得约20%至约60%的抑制。
因而实验表明以游离形式，或可能时以药理学上可接受的盐的形式存在的式Ⅰ化合物可用作防过度增殖/消炎及抗癌药剂，用于治疗过度增殖/消炎疾病及癌症如用于治疗肿瘤病如发炎过高增殖皮肤病皮肤癌，用媒介免疫的皮肤及全为表现疾病，以及自体免疫病病，例如牛皮癣，特异反应式皮炎，接触皮炎和相关湿疹皮炎，皮脂溢性皮炎，扁平苔癣，天疱疮，大类天疱疮，表皮松解大疱等麻疹，血管神经性水肿，血管炎，红斑，皮肤嗜曙红细胞增多，Lupus erythematosus及簇状脱毛。
作为这种用途所用剂量当然是不定的，例如，取决于所用的特定化合物，服用的方式及欲达到的治疗效果。然而总的说来，当所用化合物日剂量为约0.1mg/Kg至约10mg/Kg动物体重(静脉内)或是为约0.5mg/Kg至约100mg/Kg(口服)，每天适宜将剂量分成2至4倍，将获得满意的效果。对于大的哺乳动物，总日剂量为约7mg至约2000mg，以方便的服用形式如一天将剂量分成4倍或以(或速的方式。单位剂量形式包含有，例如，约1.75mg至约1000mg化合物至少一种药理学上可接受的固体或液体载体或稀释剂相混合。
该化合物可以已知的用于这种病症的标准的类似方式来服用。化合物可与一般化疗法上可接受的载体和稀释剂混合，和任意赋形剂，以及以如片剂或胶囊等口服方式服用。
该化合物还可以传统的方式如软膏或乳膏，非肠道或静脉内施用。有效物质的浓度将根据所用的化合物，欲达到的治疗效果及服用方式的特性而定。然而总的来说，以浓度为约0.05至约5%，特别是从约0.1至约1%(重量比)的传统用法可获得满意的效果。
药学组成包含式Ⅰ化合物以游离态，或可能时以药理学上可允许的盐的形式存在以及至少一种药理学上可接受的载体或稀释剂也是本发明的一个部分。
本发明还包含式Ⅰ化合物以游离态或可能时以药理学上可接受的盐的形式存在，以用作药物，特别是用于治疗过度增殖/发炎疾病以及癌症，如乳房癌或胰腺癌。
本发明还包含一种治疗过度增殖/发炎疾病和癌症，它包含对一个需要这种治疗的病人服用有效疗法数量的式Ⅰ化合物，它以游离态或可能时以药学上可接受的盐的形式存在，实施例1的化合物即5-[2-(2，5-二甲氧苯基)-乙基]-2-羟基苯甲酸甲酯，是种优选的化合物如，在上述的鉴定1中已测得的这种化合物有0.045μM的IC50，而EFG接受器阴性细胞系CHO-K1当IC50大于约0.3μM即被抑制。
在上述鉴定2中，这种化合物抑制了四种试验的乳房肿瘤细胞的三种，分别是SK-BR-3，MDAMB-468和MCF-7细胞，其IC50值为20至50nM，而乳房肿瘤细胞MDAMB-231和非乳房肿瘤细胞K-562，L1210及HeLa被抑制于IC50值域为200至470nM，显示了对一些乳房肿瘤的选择性，而秋水仙素则抑制了试验的IC50值为5与20nM之间的所有肿瘤细胞。
在上述鉴定3中，对于A431肿脑，口服剂量为30mg/Kg，每星期给药三次，则实验结束时(4个量期)用药物治疗过的秃鼠的肿瘤体积仅为对照组的56.3%，而当静脉注射剂量为3mg/Kg，则为对照组的40%。对于MiaPaCa胰腺肿瘤，用实施例1化合物30mg/Kg(口服)治疗二周的秃鼠的肿瘤大小约为对照组的46%，在使用二氨二氯铬铂的类似抑制实验中，二氨二氯铬铂以标准的，可比较的每三天剂量为10mg/Kg(腹膜内，二氨二氯铬铂一般不能口服)，只有治疗四星期后才达到显著疗效(肿脑大小约为对照组的40%)，虽然在二氨二氯铬铂治疗前平均肿瘤体积只有用实施例1化合物治疗的约一半。
在上述鉴定4中，实施例1中化合物在浓度的1.2%时引起的肿胀抑制为49%。
因此上述关于抗癌用途的实验表明实施例1的化合物可施用于大的哺乳动物如人类，以一般使用二氨二氯铬铂类似的剂量及类似的施用方式。在不抑制免疫反应及血细胞生成的剂量下可观察到这种强烈的抗瘤活性，而且肿瘤细胞对这种化合物所表现出的抗多种药物表型如同对其双亲复本一样敏感。
本发明还包括一种药剂的制备方法，它包含将式Ⅰ化合物以游离态，或可能时以药学上可接受的盐的形式和至少一种药学上可接受的载体或稀释剂相混合。
权利要求
1.式Ⅰ化合物
其中，R1与R2分别是烷氧基R3为氢或酰基，且R4为烷氧基以游离态，或可能时以盐的形式存在。
2.权利要求1的化合物，它是5-[2-(2，5-二甲氧苯基)-乙基]-2-羟基苯甲酸甲酯。
3.权利要求1化合物的制备方法，它包括a)还原式Ⅱ对应的化合物
其中-X-X-为1，2-亚乙烯基或亚乙炔基，或b)酯化或酰化式Ⅲ化合物
其中，R1和R2如权利要求1所定义，R5为羟基或烷氧基和R6为氢或酰基，并可经酯交换作用将烷氧基R4转化为一不同的烷氧基R4，由此得来的官能团可以是被保护的形态，且反应后将保护基除去，并且回收以游离态或以盐的形式存在的所得式Ⅰ化合物。
4.一种药用组合物，它包含权利要求1的化合物，它以游离态，或可能时以药学上可接受的盐的形式存在，以及至少一种药学上可接受的载体或稀释剂。
全文摘要
本发明涉及式I化合物。其中取代基具有多种意义，它以游离态或可能时以盐的形式存在。该化合物有着有趣的抗过度增殖/消炎及防癌活性。
文档编号A61K31/235GK1089255SQ93100329
公开日1994年7月13日 申请日期1993年1月1日 优先权日1993年1月1日
发明者P·努斯包马, A·施图埃茨 申请人:山道士有限公司