专利名称：二乙酰大黄酸的制备方法
技术领域：
本发明涉及可药用纯度为非所需的芦荟-大黄素衍生物总残量低于20ppm的二乙酰大黄酸的制备方法，根据此方法获得的二乙酰大黄酸和含有此化合物的药物组合物。
下式二乙酰大黄酸
是具有抗关节炎、消炎、解热和止痛活性的药用活性化合物。因此，二乙酰大黄酸用于治疗关节炎病(参见如DE-A-2711493和US-A-4，244，968)。
例如，通过芦荟甙的乙酰化和用三氧化铬氧化全乙酰化获得的芦荟甙可以制备二乙酰大黄酸。另外，例如通过对由番泻叶生药中可获得的大黄酸的乙酰化作用可以制备二乙酰大黄酸。
根据这些方法获得的二乙酰大黄酸含有非所需的由三氧化铬未完全氧化产生的或对于番泻叶生药的萃取共萃取伴生的芦荟-大黄素衍生物。这些伴生物以相当小的量存在，因而，通过常规的纯化方法，只能很困难地分离出来。另外，对于上述第一种方法，还存在铬残余物，其必须以合适的方法除去。
因此，本发明的目的在于提供一种二乙酰大黄酸的制备方法，其进行简便、产率高并且其中获得的二乙酰大黄酸的可药用纯度为非所需芦荟-大黄素衍生物的总残量低于20ppm。
这样，本发明提供了一种二乙酰大黄酸的制备方法，其中a)于仅能与水部分溶混的极性有机溶剂和水相之间进行含有芦荟-大黄素组分(即芦荟-大黄素和/或其衍生物的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷的液-液配分，b)配分后将含于水相中的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷氧化成大黄酸-8-葡糖苷，c)于酸性介质中将大黄酸-8-葡糖苷-8-位上的葡萄糖残基裂解，并且d)将获得的大黄酸乙酰化并回收二乙酰大黄酸。
大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷的重要来源是含于番泻叶生药中的番泻甙。因此，本发明优选方案是制备其中基本上不含有芦荟-大黄素组分的二乙酰大黄酸的方法，其中a)将番泻甙混合物还原成相应的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷和芦荟-大黄素-9-蒽酮-8-葡糖苷化合物，b)于仅能与水部分溶混的极性有机溶剂和水相之间对所得化合物进行液-液配分，c)配分后将含于水相中的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷氧化成相应的蒽醌化合物，d)于酸性介质中将蒽醌化合物8-位上的葡萄糖残基裂解，并且e)将所得到的1，8-二羟基蒽醌化合物乙酰化并回收二乙酰大黄酸。
番泻苷的还原作用用作原料的番泻甙混合物可以由例如番泻叶生药中获得。番泻叶生药由番泻叶植物的干燥叶和果实构成，例如印度番泻叶Cassia angustifolia(狭叶番泻树)和埃及番泻叶Cassia acutifolia(尖叶番泻树)。番泻叶生药含有大黄酸和芦荟-大黄素的二蒽酮葡糖苷。最主要的是番泻甙A，B，Al，C，D和Dl。番泻甙对应于下列通式
对于番泻甙A，B和Al，R表示COOH，而对于番泻苷C，D和Dl，R表示CH2OH。番泻甙A，B和Al与番泻甙C，D和Dl立体异构体并且10和10′碳原子的构型各不相同。
例如，在DE-A-3200131中描述了由番泻叶生药如何得到番泻甙，此处对此参考文献做了更充分的说明。根据此方法，首先用含水甲醇萃取番泻叶生药，完全除去甲醇后，浓缩的残余物中含有以钾盐形式存在的番泻甙，此浓缩物可用作本发明方法的原料。
此浓缩物也可以用于水中部分溶解的醇或酮，如丁-2-醇或丁-2-酮通过液体萃取而纯化(残液)。将残液酸化至pH约1.5-2.0并用晶种使番泻甙结晶。
获得的粗品番泻甙混合物也可以用作本发明方法的原料。如果需要，粗品番泻甙混合物也可以被重结晶。
另外，与部分溶于水的醇或酮，特别是丁-2-醇混合的浓缩物也可以用作原料。
对于番泻叶生药的萃取，生药与萃取溶剂的比率优选地是1∶4-1∶15，特别是1∶4-1∶10。
萃取较优选地是在如柠檬酸三钠、甘氨酸、碳酸氢钠或蔗糖缓冲剂存在下进行。
根据本发明的方法，对这些原料进行充分的还原得到下列通式相应的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷(R＝COOH)和相应的芦荟-大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷(R＝CH2OH)
其中R是COOH或CH2OH。
具有合适的还原电位的还原剂包括，例如，氯化亚锡，二氧化硫、碱金属硼氢化物并且较优选的是碱金属连二亚硫酸盐，特别是连二亚硫酸钠。
在进行还原反应时，原料可以以水溶液或悬浮液的形式存在并且以固体形式或溶于水的形式向其中加入还原剂。也可以在通过向其中加入与水部分溶混的极性有机溶剂，特别是丁-2-醇而形成的两相混合物中进行反应。
还原可以于室温或较高的温度下进行。还原较优选地是于40-60℃并且特别是于50-55℃下进行。反应是在起始番泻甙溶液或悬浮液的弱酸性至弱碱性pH值下，较优选地是在pH7-9下进行如果需要，还原反应可以分几次，特别是2-10次进行。
通过加入酸，例如硫酸，使pH值至4-4.5沉淀出生成的9-蒽酮-8-葡糖苷，因此，反应温度较优选地是不高于40℃。对于9-蒽酮-8-葡糖苷的沉淀及其分离，例如，通过过滤为了避免这些化合物的非控制性氧化，反应较优选地是于氮气氛下进行。
由于充分还原是至关紧要的，因此，较优选地是使用大大过量的还原剂，对于连二亚硫酸钠，通常相对于原料中番泻甙的含量，使用1-4倍重量比的连二亚硫酸钠并且令还原剂作用至少2小时，较优选地是至少3小时。通常，还原反应进行不多于10小时。较优选地是于所述条件下进行补充还原。
在用于下一步骤之前，所获得的产物较优选地是用下述方法再沉淀通过加入如氢氧化钠或氢氧化钾的碱令pH升至约6-7使其溶解，水溶液用丁-2-醇、丙酮或丁-2-酮萃取并通过加入酸使pH至约2-4令产物再次沉淀出来。
液-液配分在此步骤中，芦荟-大黄素组分，特别是芦荟-大黄素-9-蒽酮-8-葡糖苷将被除去。为此目的，于只与水部分可溶混的极性有机溶剂和水相之间进行所得产物的液-液分配。较合适的极性有机溶剂包括C4-C5-链烷醇和二-C1-C3-烷基酮，例如丙酮、丁-1-醇、丁-2-醇和丁-2-酮，较优选地是使用丁-2-醇或丙酮。
在液-液配分全过程中，为了使水相达到-210mV或更负的氧化还原电势较优选地是向水相中加入还原剂。使用与步骤a)中相同的还原剂是较优选的。至少使用作为还原剂的碱金属连二硫酸盐，通常为了维持所述电势条件于7-11pH值下2-4%重量比溶液是足够了。
水相(重相)与有机相(轻相)的体积比通常是在1∶5-1∶40范围内。
液-液萃取较优选地是在逆流下进行。从而，蒽酮化合物混合物以还原后所得到的溶液形式被分离，或者说，当蒽酮化合物被分离后，蒽酮化合物的混合物为3-15%重量比的溶液形式。
分配后，所需大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷存在于水相中，其通过加入酸使pH值至约2-4沉淀出并以常规方法回收。
大黄酸-9-蒽酮-葡糖苷的氧化大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷被氧化成下列通式的大黄酸-8-葡糖苷
为此目的可以使用的氧化剂包括例如氧、过氧化合物如过氧化氢以及于高氧化态下的镁、铬和铁化合物，优选使用地是铁盐，特别是硫酸铁。反应较优选地是在升高的温度下，但低于60℃下进行。此时，可以避免非所需的和不明确的氧化产物的形成。当氧化作用完成时，生成的大黄酸-8-葡糖苷以常规方法分离。
葡糖残基的裂解于酸性溶液中8-位葡糖残基被裂解。反应较优选地是于约85-95℃温度下进行。生成的产物以常规方法分离。
酸解后，通过与氯化铁反应直接将番泻甙转化成大黄酸是已知的(见例如DE-A-2711493)。但是，产率只达到约10%并且生成的大黄酸很难分离。
根据本发明的方法，番泻甙的还原裂解，生成的蒽酮化合物氧化成相应的蒽醌化合物以及蒽醌化合物8-位葡萄糖残基的裂解，每种情况分步进行。继还原裂解之后，于本方法以后的过程中所有能导致芦荟-大黄素或其衍生物生成的化合物通过液-液配分定量地被除去。另外，在适度的温度下进行氧化作用以避免生成非所需的和不明确的产物是可能的。而当进行此反应时，所用铁盐几乎可以等量收回，并于再氧化后，可再使用。实施氧化步骤和水解步骤的分离是以蒽酮葡糖苷较所述糖苷配基有较大的水溶解度为基础。氧化作用于室温或低于60℃下温和地进行，从而避免其他方法不可避免地生成的不明确的副产物。
1，8-二羟基蒽酮化合物的乙酰化用常规方法进行所得1，8-二羟基蒽酮化合物的乙酰化。例如，按照于Arch.Pharm.，241，607/1903中所述方法于乙酸钠存在下用乙酸酐可以进行乙酰化作用。但是，乙酰化作用也可以通过本专业人员公知的其它方法进行，例如通过与乙酰氯或类似物反应。
按此方法获得的二乙酰大黄酸基本上不含芦荟-大黄素及其衍生物。而此不纯物的含量仍达约50ppm(通过下列实施例中描述的分析方法测定)。当所得二乙酰大黄酸以下列方法重结晶后，此不纯物的含量可以进一步减低通过用合适的碱处理将二乙酰大黄酸转变成碱金属盐，合适的碱是如碱金属乙酸盐并且较优选地是乙酸钾，较优选地是用等量的碱和含水C1-C3-链烷醇，例如80-90%乙醇作反应介质。于冷却下，于含水C1-C3-链烷醇中聚集并通过加酸至pH值约3使其沉淀令二乙酰大黄酸碱金属盐结晶出，沉淀出的二乙酰大黄酸按常规方法分离并处理。
如此获得的产物含有的上述非纯物低于20ppm。另外，产物以特别适合于植物制剂的针状结晶形式存在。
产物可以按常规方法干燥。较优选地是先于相对较低的温度下，例如不高于40℃下进行真空干燥直至产物的水含量降至约3%或更低，随后，温度可以升至70-110℃。
本发明还涉及根据本发明可以获得的基本上纯的二乙酰大黄酸以及含有此化合物的药物组合物。其所适用领域、施用剂量以及合适的剂型是已知的并描述于例如US-A-4，244，968，US-A-4，346，103 US-A-4，950，687和DE-A-2711493以及Drugs Exptl.Clin.Res.，6(1)，53-64/1980。
下列给出的实施例说明了本发明实施例 1制备用作原料的番泻甙(Sernoside)混合物各将40kg番泻叶(含大约1.5%番泻甙)装入两个体积为250升串联着的渗滤器中，并盖上钢制孔板。用70%甲醇作为提取溶剂，使其通过第一个渗滤器中的生药。将于第一个渗滤器中形成的溶液通过第二个渗滤器中的生药。令溶剂自由地流过第一个渗滤器。
提取40kg番泻叶生药共需160升溶剂。在这样大体积的70%甲醇通过两个渗滤器，并且收集了相应量的渗滤液后，将渗滤器的空管与后一渗滤液容器连接起来，并另加60升70%甲醇，使其通过渗滤器。此后，将第一个渗滤器的剩余的游离溶剂加入第二个渗滤器的上部，并收集后一渗滤液，使其体积达到120升。然后，倒空第一个渗滤器，再装入40kg番泻叶生药并将后一渗滤液倒入此生药中，120升后-渗滤液足以覆盖渗滤器中的生药。
随后，将溶液温度控制在+30℃。
将这个渗滤器与先前提取过的渗滤器连接，并按前述方法进行提取。
每40kg生药收集160升渗滤液，并用装有填充柱的真空旋转蒸发器除去甲醇。得到30升底部产物。将该浓缩物用等体积的水饱和的丁-2-醇提取。
步骤a)还原番泻甙成大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖甙用48%氢氧化钠水溶液将1.0升提取浓缩物调至pH7.5。溶液被加热到60℃，伴随着搅拌，在半个小时内将90g连二亚硫酸钠固体加入该溶液中。加完后，再将溶液搅拌1小时。随后，向其中加入浓硫酸使pH为2。在2小时内将溶液冷却至室温。滤得晶状沉淀并用含二氧化硫的水洗涤。
如果需要可将粗品大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖甙再沉淀。通过加入48%氢氧化钠水溶液使pH为7将仍潮湿的滤饼溶解在15体积丁-2-醇，85体积其中含0.5%重量比的焦亚硫酸钠的水的混合液中，得到10%(W/V)的溶液。用浓盐酸将该溶液酸化至pH2.8或更低并放置2小时。滤出所得沉淀，用含二氧化硫或焦亚硫酸钠的水洗涤并干燥。产率90%。
按以下方法将所得产物进行重新还原(后-还原)将3.0g干的大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖甙粗品或相应量的湿产物溶解在15ml水中，加之1.4g连二亚硫酸钠和2.3ml5N氢氧化钠水溶液。随后，用水补充至24ml并将溶液加热到55℃保持20分钟。然后，再向溶液中加入1.5g连二亚硫酸钠并在55℃温热20分钟。随后，再向其中加入0.9ml 5N氢氧化钠水溶液和1.5g连二亚硫酸钠。于55℃温热20分钟后，再向其中加入0.9ml5N氢氧化钠水溶液。将所得溶液直接进行下面液-液萃取。
步骤b)分离芦荟-大黄素成分利用含有60混合沉降单位的装置通过蒽酮-8-葡萄糖苷的液-液逆流配分可分离芦荟-大黄素成分。作为较重的水相，这里所用的是3.0g连二亚硫酸钠在3.5ml 5N氢氧化钠水溶液和96ml水中的溶液。作为较轻的有机相，这里所用的是丁-2-醇或用水饱和的丙酮。按此方法以重相对轻相的体积比为1∶10的比率将两相装入装置中。
以新配制的溶液的形式或以相应的pH值和相应浓度的溶液形式将含步骤a)中得到的9-蒽酮-8-葡萄糖苷的欲分离的混合物按每体积欲分离混合物使用30体积的有机相的比率加入仪器。
用甘氨酸缓冲剂使含混合物的溶液的pH保持在9到9.5。以每150g大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷240ml缓冲溶液的量加入由3体积7.5%甘氨酸溶液和1体积1N氢氧化钠水溶液构成的缓冲液。不需要的芦荟-大黄素化合物富集在有机相中，而大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷留在水相。用硫酸将水相酸化至pH2.8，将形成的沉淀滤出并用水和丙酮洗涤，并在室温下在空气中干燥。以这种方法，得到含41ppm芦荟-大黄素组分的大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷，按照本说明书最后描述的方法测定芦荟-大黄素。大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷的产率为97%。
步骤c)氧化为大黄酸-8-葡萄糖苷将步骤b)的产物(指3.0kg的番泻甙A，Al和B)悬浮在185升软化水和75.5kg硫酸铁水合物(22%Fe3+)形成的溶液中。将悬浮液加热到55至62℃并使用快速流动分散剂(rapidly running disperser)氧化14小时。氧化完全后，滤出形成的大黄酸-8-葡萄糖苷并用50升用硫酸调节pH为2的软化水洗涤。
步骤d)水解为大黄酸将步骤c)得到的湿的过滤残留物悬浮于200kg20%重量比的硫酸中并在88到92℃搅拌8小时。滤出形成的大黄酸，为了贮存，可以在1mbar的真空下于40℃干燥48小时，或者立即在湿的状态下用于步骤e)的乙酰化。
对于步骤a)所用番泻甙A，Al和B，步骤a)到d)的总产率为79%。
步骤e)乙酰化得到二乙酰基大黄酸将6.5kg步骤d)得到的大黄酸悬浮在100升乙酸酐中放置10分钟，混入2kg乙酸钾，搅拌下加热至95℃，混入0.65kg活性碳并在90到95℃搅拌30分钟。从热溶液中滤出活性碳并在90℃将2.1kg96到98%重量比的硫酸混入滤液中。随后，伴随着搅拌，将在尽可能快地冷却到20℃并将所得到的悬浮液过滤。用软化水洗除残留物中的硫酸盐。产率为83%。
步骤f)重结晶，干燥和研磨随着快速搅拌，将7.5kg步骤e)得到的二乙酰大黄酸(这里指干物质)悬浮在375升90%体积比的乙醇中。悬浮液加热到70℃，然后混入3.75kg乙酸钾。冷却到0至2℃后，纯的二乙酰基大黄酸钾盐从新形成的澄清溶液中结晶出来。滤出钾盐，在20到30℃，随着加入3kg乙酸钾，将钾盐溶解在300升40%体积比的乙醇中。用10%重量比的硫酸将该澄清溶液的pH调至3.0。滤出结晶出的二乙酰基大黄酸并用软化水洗除硫酸盐。
首先，在40℃和1mbar的真空中，将产物干燥24小时。当残留水的含量减少到3%以下时，将其粗略粉碎并在70℃和1mbar的真空中进一步干燥24小时。随后，将其研磨过0.5mm型号的筛并在70℃和1mbar真空中再干燥以除去残留溶剂。
步骤f)的产率为95%。
实施例 2重复实施例1所述的番泻叶提取和番泻甙还原。然后按以下方法进行随后的还原将140g蔗糖，4.5g85%连二亚硫酸钠和13.3g乙酸钾溶于133ml水中，向其中加入1.3ml48%氢氧化钠溶液和17.3g碳酸钾。随后，在反应混合物中混入293ml丙酮和50ml水。将此混合物置分液漏斗中摇动并分相，由此得到375ml上层相(丙酮相)和130ml下层相。
将1.4ml48%氢氧化钠溶液和10g大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷粗品溶于98ml下层相中。将此溶液温热到45至50℃并保持这个温度20至30分钟。随后，加入1.0ml48%氢氧化钠溶液和3.4g连二亚硫酸钠并再在45至50℃下温热20至30分钟。随后，再加入1.0ml48%氢氧化钠溶液和3.4g连二亚硫酸钠，继续在45至50℃下温热20至30分钟。
通过被还原溶液对上述上层相(丙酮相)的液-液逆流分配可分离芦荟-大黄素成分。将流出的并含大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷的残油层浓缩到400ml并与20ml丁-2-醇混合。
然后，加入盐酸或硫酸使pH值为4.0至4.2。滤出形成的沉淀，用40ml水和30ml丙酮洗涤并干燥。随后，按实施例1中描述的方法进行氧化反应。
实施例 3将番泻叶提取浓缩物与约2升丁-2-醇混合在氮气作为保护气体的条件下进行番泻叶果实浓缩液和丁-2-醇混合物的7步还原反应。在Ⅰ步还原之后，得到大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷的粗沉淀。
还原步骤Ⅰ将含大约4kg番泻甙的100升番泻叶果实浓提物和丁-2-醇的混合物放入搅拌器中并充入氮气。伴随搅拌，将6升20%重量比的氢氧化钠水溶液和350升水饱和的丁-2-醇，如来自步骤Ⅱ，依次加入并搅拌15分钟。将每批溶液加到42至50℃，混以7kg连二亚硫酸钠并进一步搅拌45分钟。用20%重量比的氢氧化钠水溶液将pH值保持在7.5到8。如果需要，可以通过加入连二亚硫酸钠将还原电位(对于Ag/AgCl电极)保持在-630mV以下。冷却到30至35℃后，用10%重量比的硫酸调节pH＜4而使其沉淀1.5小时。将所得的悬浮液在＜25℃以低速搅拌约10小时并滤出所得沉淀。将沉淀悬浮在60升15%重量比的丁-2-醇中，在50至60℃搅拌30分钟，随后过滤。用100升软化水洗涤残留物。对于所用的番泻甙，大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷的粗产率大于82%。
还原步骤Ⅱ将3.3kg步骤Ⅰ所得大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷粗品悬浮于42升软化水和7.4升丁-2-醇中。加入2升20%重量比的氢氧化钠水溶液和9.9kg柠檬酸三钠使悬浮液成为溶液，然后，混入3.3kg连二亚硫酸钠和350升水饱和的丁-2-醇，如得自步骤Ⅲ。将每批溶液加热到42至45℃，用20%重量比的氢氧化钠水溶液保持pH值为8.5到9。如果需要，可通过加入连二亚硫酸钠将还原电位(对于Ag/AgAl电极)保持在-750mV以下。放置30分钟以后，除去上层相，将下层相在步骤Ⅲ中进一步处理。
还原步骤Ⅲ用步骤Ⅱ所得下层相加入下列化学成分，重复步骤Ⅱ所述还原/提取过程1.65kg连二亚硫酸钠0.8升20%重量比的氢氧化钠溶液和350升水饱和的丁-2-醇，例如得自步骤Ⅳ。
还原步骤Ⅳ到Ⅶ用前面步骤所得到的下层相加入下列化学成分重复步骤Ⅱ所述的还原/提取过程0.825kg连二亚硫酸钠0.4升20%重量比的氢氧化钠溶液350升水饱和的丁-2-醇，例如得自以下使用逆流原则的步骤。
将步骤Ⅶ中分离的下层相冷却到30至35℃，按步骤Ⅰ所述的方法将大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷沉淀出来。滤出所得的沉淀并用100升软化水洗涤。随后，将其转入10升硫酸铁溶液(如例1，步骤b制备)。
然后，按实施例1或2所述的方法将大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷转化成番泻甙。
药理学研究二乙酰大黄酸的效果可在口服给药后以慢性炎模型测定。
使用下列实验模型大鼠棉球状肉芽肿和通过关节内使用维生素A诱导的家兔关节病。
a)大鼠棉球状肉芽肿将年轻的性成熟的大鼠(n＝10)按25，50或100mg二乙酰大黄酸/kg或5mg消炎痛/kg或100mg乙酰水杨酸/kg每天给药，一共5天。对照组仅用水处理。小球的植入发生在处理后的第一天。与对照组相比，实验结束时制备的新鲜的和干的肉芽肿的重量表明明显地随剂量减少。因此，100mg二乙酰大黄酸/kg的作用大致相当于5mg消炎痛和100mg乙酰水杨酸。处理过程中胸腺和肾上腺的重量没有变化。
b)维生素A关节病按照9天内三次关节内注射30，000IU维生素A的方法在每组为10只家兔(白色新西兰种)的两组中引起关节病样关节变化。以后56天，用3mg二乙酰大黄酸/kg/天处理10只受试动物共8周。与对照组相比，肉眼检查和显微镜观察处理组的关节变化显著降低。
进一步，在用三次10，000IU维生素A预处理6天和26天无处理间隔后的8周内，通过每组7只的家兔分别接受5mg二乙酰基大黄酸/kg/天(实验组)，15mg乙酰水杨酸/kg/天(正对照组)，或保持无处理(负对照组)，来比较二乙酰基大黄酸与乙酰水杨酸的治疗作用。在最后一次注射维生素A以后的24天里，所有三组实验动物都产生了明显的后肢拖拉的运动障碍。在随后的8周内，负对照组动物中，明显的关节病的临床症状增强。在处理8周内，在实验组和正对照组的动物中，这些症状明显改善。
胃粘膜变化鉴于一次施用400mg二乙酰基大黄酸或一次施用溶剂对大鼠胃粘膜不产生任何糜烂，而在使用布洛芬(200mg/kg)或消炎痛(20mg/kg)后，发现有点状的(1mm直径)到大约(3mm直径)糜烂状明显的粘膜损伤。三天内每天两次使用100mg二乙酰基大黄酸/kg也不带来任何损伤，反之，相应地使用10mg消炎痛/kg肯定产生具有1到3mm直径的糜烂。
毒理学急性毒性LD50，依赖于受试物种(大鼠，小鼠，猫)，口服后为1.9到7.9g/kg。而大鼠证明是最不敏感的。非肠道给药(i.v.或i.p.)后，就这些物种来说，LD50值为从119到339mg/kg。
临床研究1.在95(49/46)名髋关节病人和膝关节病人中对萘普生和随后的术后安慰剂进行双盲试验来研究二乙酰基大黄酸的作用。使用剂量为每天两次50ml二乙酰基大黄酸或每天750mg萘普生。治疗周期为7天冲洗阶段后的60天。随后的安慰剂治疗超过60天。
按照分数标度的疼痛和运动症状，功能限制和相容性为试验参数。
在两个试验组中(二乙酰基大黄酸/萘普生)关于所有试验参数，与初值相比具有统计学意义上明显改善的比率(各自为P＜0.01和P＜0.05)。然而中断治疗后并随后施用安慰剂，在90天和120天关于自发性疼痛和主动及被动的运动疼痛，与萘普生/安慰剂组相比显示具有统计学意义上的优势(P＜0.01)。在5%水平上，停止使用二乙酰基大黄酸后30天内可变的夜间疼痛和压痛也证明这种差异。
2.在公开进行的对照试验中，对70名(35/35)患脊柱和膝骨关节痛的病人进行二乙酰基大黄酸作用的研究。用药剂量为每天100mg二乙酰基大黄酸。治疗周期为60天，观察期为75天。试验参数为疼痛和运动限制。参数按分数系统评估。
对照组包括35名全部作理疗的病人。在二乙酰基大黄酸治疗组中也进行理疗。
关于所有参数的结果评估表明治疗组较对照组在统计学意义上有明显的改善。在停药后，二乙酰大黄酸组的延续疗效(hang-over effect)也可被确定。
3.在对萘普生的单盲交叉法中研究二乙酰基大黄酸对20名局部关节痛病人的作用。将病人分为两组第一组开始20天每天两次施用50mg二乙酰基大黄酸。随后为三天冲洗阶段。然后每天两次施用250mg萘普生，共使用20天。第二组，将次序颠倒。总治疗期为43天。按分数系统测定疼痛，压痛，被运动疼，功能限制和肿胀的试验参数。
试验结果的评估显示用二乙酰大黄酸比用萘普生优越。既未观察到显著的副作用也无临床试验室参数变化。
4.对23名(12/11)骨关节病患者使用“双安慰剂技术”进行随机双盲法研究(随机性研究)来研究二乙酰大黄酸的作用。施用剂量为每天两次50mg二乙酰大黄酸和每天三次250mg萘普生。治疗周期为4周。试验参数为治疗前后食管胃十二指肠镜观测结果。在此研究中，只用那些粘膜观测结果正常的或有轻微粘膜损伤的(等级1)病人。
4周后，内窥镜观察结果显示，在二乙酰大黄酸组有一例(10%)有2级粘膜损伤，而在萘普生治疗组有5位病人(50%)显示2，3和4级粘膜损伤。所有病人都按常规方法观测。
芦荟-大黄素的分析测定将50mg二乙酰大黄酸溶于在分液漏斗中的25.3ml0.5M氢氧化钠水溶液中并振摇10分钟。随后，向其加入74.6ml含0.5M甘氨酸和0.5M氯化钠的溶液，得pH值为9.5。
此溶液用25ml氯仿萃取三次，合并的有机相用10ml0.5M pH9.5的缓冲液(甘氨酸、氢氧化钠和氯化钠)萃取一次并用10ml0.01M硫酸萃取一次。由有机相中除去溶剂并将残余物溶于1ml甲醇。
标准溶液，将2mg芦荟-大黄素溶于20ml N，N-二甲基乙酰胺并用甲醇稀释至浓度为2μg/ml，相当于40ppm。
通过HPLC测定溶液的含量。HPLC法的线性说明芦荟-大黄素标准溶液在0.11μg/ml(相当于2.2ppm)至53.6μg/ml(相当于1072ppm)的范围。含量测定是用装填Lichrospher-100RP-18的Merk HPLC柱Lichrocart 250-4，5μm，于40℃，用比率为49∶46∶5的1%乙酸乙醇液(V/V)、1%乙酸水溶液(V/V)、和乙腈作流动相进行。
步骤b)的产物，即芦荟-大黄素组分含量为41ppm的大黄酸-9-蒽酮-8-葡萄糖苷的分析测定，测定芦荟-大黄素。
通过用氯化铁氧化同时用盐酸水解将所得底物于水溶液和四氯化碳两相混合物中转变成大黄酸和芦荟-大黄素。将大黄酸转变成盐以使其能够通过液-液配分与芦荟-大黄素分开。存在于有机相中的芦荟-大黄素通过HPLC测定。
权利要求
1.基本上不含有芦荟-大黄素组分的二乙酰大黄酸的制备方法，其中a)于仅能与水部分可混的极性有机溶剂和水相之间进行含有芦荟-大黄素组分的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷的液-液分配，b)分配后将含于水相中的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷氧化成大黄酸-8-葡糖苷，c)于酸性介质中将大黄酸-8-葡糖苷8-位上的葡萄糖残基裂解，并且d)将获得的大黄酸乙酰化并回收二乙酰大黄酸。
2.基本上不含有芦荟-大黄酸组分的二乙酰大黄酸的制备方法，其中a)将番泻甙混合物还原成相应的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷和芦荟-大黄素-9-蒽酮-8-葡糖苷化合物，b)于仅能与水部分可混的极性有机溶剂和水相之间对所得化合物进行液-液分配，c)分配后将含于水相中的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷氧化成相应的蒽醌化合物，d)于酸性介质中将蒽醌化合物8-位上的葡萄糖残基裂解，并且e)将所得的1，8-二羟基蒽醌化合物乙酰化并回收二乙酰大黄酸。
3.根据权利要求2的方法，其中碱金属连二亚硫酸盐在步骤a)中用作还原剂。
4.根据权利要求3的方法，其中反应于pH值7-9下进行。
5.根据权利要求2-4的任一方法，其中还原作用分几次进行。
6.根据上述任一权利要求的方法，其中丙酮和丁-2-醇用作液-液分配中的极性有机溶液。
7.根据上述任一权利要求的方法，其中对于液一液分配中，所用水相的氧化还原电势在-210mV或更负。
8.根据上述任一权利要求的方法，其中液-液分配于逆流下进行。
9.根据上述任一权利要求的方法，其中铁盐用作氧化剂。
10.根据权利要求9的方法，其中铁盐是硫酸铁。
11.根据权利要求2的方法，其中番泻甙混合物通过用含水甲醇萃取番泻叶生药获得。
12.根据权利要求11的方法，其中用甲醇的萃取是在缓冲剂存在下进行的。
13.根据上述任一权利要求的方法，其中获得的二乙酰大黄酸是通过将二乙酰大黄酸转变成碱金属盐，将其在C1-C3链烷醇中处理并通过加酸使二乙酰大黄酸再次沉淀重结晶得到。
14.实质上如上所述和例证的根据权利要求1的二乙酰大黄酸的制备方法。
15.根据权利要求1-14任一方法获得的二乙酰大黄酸。
16.基本不含有芦荟-大黄素衍生物的二乙酰大黄酸。
17.含有任意与常规药物载体和添加剂结合的根据权利要求15或16的二乙酰大黄酸的药物组合物。
全文摘要
本发明提供了一种基本上不含有芦荟一大黄素组分的二乙酰大黄酸的制备方法，其中(a)于仅能与水部分可混的极性有机溶剂和水相之间进行含有芦荟一大黄素组分的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷的液-液配分，(b)配分后将含于水相中的大黄酸-9-蒽酮-8-葡糖苷氧化成大黄酸-8-葡糖苷，(c)于酸性介质中将大黄酸-8-葡糖苷8-位上的葡萄糖残基裂解，并且(d)将获得的大黄酸乙酰化并回收二乙酰大黄酸。本发明还涉及用此方法获得的二乙酰大黄酸和含有它的药物组合物。
文档编号A61K31/19GK1088907SQ9310118
公开日1994年7月6日 申请日期1993年1月2日 优先权日1993年1月2日
发明者A·卡卡桑纳, W·格里明格, P·希耶塔拉, K·维特洪, H·采斯克 申请人:马道斯有限公司