肿瘤坏死因子突变蛋白的制作方法

专利名称：肿瘤坏死因子突变蛋白的制作方法
肿瘤坏死因子，更具体地说，肿瘤坏死因子α(TNF-α)，是一种主要由受刺激的巨噬细胞产生的细胞素，它不仅对各种肿瘤细胞显示出显著的细胞毒性(Carswell等，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA 723666-3670，1975)，而且在炎症和免疫反应中起多种介导物的作用(综述见Beutler和Cerami，Ann.Rev.Immunol.7625-655，1989;Bonavista和Granger编“肿瘤坏死因子结构、作用机理、以及在疾病和治疗中的作用”，Karger，Basel，1990)。已经从大肠杆菌中克隆和表达的cDNA的核苷酸顺序，推导出了人肿瘤坏死因子α-(hTNF-α)的一级结构(Pennica等，Nature 312724-729，1984;Marmenout等，Europ.J.Biochem.152515-522，1985;Wang等，Science 228149-154，1985;Shirai等，Nature 313803-806，1985)。已发现hTNF-α和人淋巴细胞毒素的氨基酸顺序有显著的同源性(30%)。人淋巴细胞毒素常被称作人肿瘤坏死因子β(hTNF-β)，是一种主要由淋巴细胞产生的细胞素(Gray等，Nature 312721-724，1984;Fiers等，Cold Spring Harbour Symp.51587-595，1986)。
本领域内还曾描述了氨基酸顺序经过修饰的hTNF-α，即所谓的TNF-α突变蛋白(例如见Yamagishi等，Protein Engineering3713-719，1990;或Fiers在Aggarwal和Vilcek编的“肿瘤坏死因子结构、功能和作用机理”一书中的文章，Marcel Dekker，Inc.，New York，印刷中;或Fiers等人在Bonavista和Granger编的书中第77-81页的文章(同上))。此外，TNF-α突变蛋白也曾是许多专利申请的主题，例如国际专利申请公开WO 86/02381、WO 86/04606、WO 88/06625;欧洲专利申请公开155，549;158，286;168，214;251，037和340，333;以及德国公开说明书3843534。
本领域中还曾公开了淋巴细胞毒素的突变蛋白，例如见欧洲专利申请公开250，000;314094和336，383。
TNF的生物学效应是通过两种特异性受体介导的，一种受体经十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定的表观分子量为55kD(p55-TNF-R)，另一种受体经SDS-PAGE测定的表观分子量为75kD(p75-TNF-R)。这两种形式的TNF受体都已被克隆，具体地说，p55-TNF-R已由Loetscher等人克隆(Cell 61351-359，1990)，p75-TNF-R已由(例如)Dembic等人克隆(Cytokine 253-58，1990)(关于这两种受体还可参阅欧洲专利申请90116707.2)。最近发现，两种受体都不仅与TNF-α结合，而且还以高亲和性与TNF-β结合(Sch
nfeld等，J.Biol.Chem.2663863-3869，1991)。
本领域公知，根据TNF-α的生物活性，它可能是治疗各种疾病的一种有价值的化合物。例如，单独应用TNF-α或与干扰素合并应用，都可能是一种有效的抗肿瘤剂(Brouckaert等，Int.J.Cancer 38763-769，1986)。然而，其全身性毒性是更广泛的治疗性应用的主要限制(Taguchi T.和Sohmura Y.，Biotherapy 3177-186，1991)。
现已证明，在小鼠中，只与较小的小鼠TNF受体(鼠p55-TNF-R)结合的人TNF-α(hTNF-α)，其毒性比既与p55-TNF-R又与p75-TNF-R结合的鼠TNF-α(mTNF-α)要小得多。例如，在C57B16小鼠中，mTNF-α和hTNF-α的LD50分别约为10μg/小鼠和500μg/小鼠(Brouckaert等，Agents and Actions 26196-198，1989;Everaerdt，B.等，Biochem.Biophys.Res.Comm.163378-385，1989;Lewis，M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882830，1991)。因此，p75-TNF-R在全身性毒性中可能起特殊作用。
hTNF-α和mTNF-α与人p55-TNF-R和人p75-TNF-R几乎同等地结合。然而，保留了通过hp55-TNF-R介导的生物活性，而又几乎完全丧失对hp75-TNF-R活性的hTNF-α突变蛋白，在鼠体系中的功能与hTNF-α等价，预计这些突变蛋白在灵长类中的全身性毒性较低。
在欧洲专利申请公开486，908中，描述了与人p75-肿瘤坏死因子受体(hp75-TNF-R)和人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)的结合亲和力明显不同的人肿瘤坏死因子突变蛋白。
现已发现，具有人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序，但至少在86位有变化(由苏氨酸代替丝氨酸残基)的hTNF突变蛋白或其可药用盐，保留了与hp55-TNF-R结合的活性，但几乎完全丧失了与hp75-TNF-R结合的活性。另外，发现这些hTNF突变蛋白保留了通过hp55-TNF-R介导的生物活性，但却不再与hp75-TNF-R结合。然而，本发明的hTNF突变蛋白并不仅限于这种类型的突变蛋白。本发明还包括另一种类型的突变蛋白，这类突变蛋白仍然只与hp55-TNF-R结合，但却丧失了诱发功能性细胞反应的能力。
因此，本发明提供了对人p55-肿瘤坏死因子受体(hp55-TNF-R)具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在86位有变化，由苏氨酸代替了丝氨酸残基。
如Pennica等人(同上)所公开的人TNF-α的氨基酸顺序如下1 10VAL ARG SER SER SER ARG THR PRO SER ASP LYS PRO VAL ALA HIS20 30VAL VAL ALA ASN PRO GLN ALA GLU GLY GLN LEU GLN TRP LEU ASN40ARG ARG ALA ASN ALA LEU LEU ALA ASN GLY VAL GLU LEU ARG ASP50 60ASN GLN LEU VAL VAL PRO SER GLU GLY LEU TYR LEU ILE TYR SER70GLN VAL LEU PHE LYS GLY GIN GLY CYS PRO SER THR HIS VAL LEU80 90LEU THR HIS THR ILE SER ARG ILE ALA VAL SER TYR GLN GHR LYS100VAL ASN LEU LEU SER ALA ILE LYS SER PRO CYS GIN ARG GLU THR110 120PRO GLU GLY ALA GLU ALA LYS PRO TRP TYR GLU PRO ILE TYR LEU130GLY GLY VAL PHE GLN LEU GLU LYS GLY ASP ARG LEU SER ALA GLU
140150ILE ASN ARG PRO ASP TYR LEU ASP PHE ALA GLU SER GLY GLN VAL157TYR PHE GLY ILE ILE ALA LEU或者是如Marmenout等人(同上)或Wang等人(同上)或Shirai等人所公开的顺序，或者更具体地说，如编码成熟TNF-α的质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(见

图1a和图1b及实施例Ⅰ)插入片段的核苷酸顺序所编码的顺序。
如上定义的hTNF突变蛋白，可能在一个或更多个另外位置上改变了hTNF的氨基酸顺序，优选一个或两个另外位置，其中特别优选是29、31、32、29和32、或31和32位。在这些额外位置上可以使用任何氨基酸，优选任何天然存在的氨基酸。对29位的置换来说，优选谷氨酸、甘氨酸或酪氨酸，特别优选丝氨酸。对31位的置换来说，优选谷氨酸或天冬酰胺。对32位的置换来说，优选酪氨酸、色氨酸或苏氨酸，特别优选色氨酸和苏氨酸。
本发明的hTNF突变蛋白可以含有进一步的氨基酸置换，其前提是这些置换不改变突变蛋白与p55-TNF-R的选择性结合亲和性。蛋白质和多肽中基本不改变生物活性的氨基酸置换在本领域内是已知的，并由(例如)H.Neurath和R.L.Hill在《蛋白质》一书(Academic Press，New York，1979)，尤其是该书第14页的图6中作了叙述。最常见的氨基酸置换有Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val、Ala/Glu、Asp/Gly，反之亦然。本发明的hTNF突变蛋白还可含有由“接头”顺序编码的若干氨基酸的顺序。这些顺序可能是由于用表达载体来表达如上所限定的hTNF突变蛋白而出现的。
本发明的hTNF突变蛋白还可含有一些特异性顺序，这些顺序最好能与亲和性载体物质结合。这类顺序的实例是至少含有两个相邻组氨酸残基的顺序(在这方面可参阅欧洲专利申请公开282，042)。这些顺序能与次氮基三乙酸镍螯合物树脂选择性结合(Hochuli和D
beli，Biol.Chem.Hoppe-Seyler 368748，1987;欧洲专利申请公开253，303)。含有这样一个特异性顺序的hTNF突变蛋白，既可以与hTNF突变蛋白氨基酸顺序的C末端或N末端连接，也可以与两个末端都连接。
本发明的hTNF突变蛋白也可以与不同的免疫球蛋白重链或轻链多肽组合，这将得到体内半寿期较长的嵌合hTNF突变蛋白免疫球蛋白多肽。业已证明，例如由哺乳动物免疫球蛋白重链或轻链恒定区的头两个结构域组成的嵌合多肽，其体内半寿期延长(见Traunecker等，Nature 33184-86，1988;欧洲专利申请公开394，827)。
hTNF突变蛋白还可以与聚合物，例如分子量为500至20，000道尔顿的聚乙二醇或聚丙二醇偶联，这将得到可能基本上无免疫原性的受护hTNF突变蛋白组合物。现已有许多使聚合物与多肽偶联的方式，例如见美国专利4，179，337。
特别优选的本发明hTNF突变蛋白为Thr86-TNF-α、Ser-Thr86-TNF-α、Glu31-Thr86-TNF-α、Trp32-Thr86-TNF-α、Ser29-Trp32-Thr86-TNF-α或Asn31-Thr32-Thr86-TNF-α。
本发明的hTNF突变蛋白可以用本领域已知的方法来制备，例如Sambrook等人(《分子克隆实验室手册》1989年第二版，冷泉港实验室，美国冷泉港实验室出版社)所述的方法或以下段落所述的方法。可以用以下实施例所述的方法确定这些hTNF突变蛋白是否仍对p55-TNF-R具有选择性结合亲和性。另外，本发明的hTNF突变蛋白也可用本领域已知的标准方法化学合成，优选固态法，例如Merrifield的方法(J.Am.Chem.Soc.852149-2154，1963)。此外，这些突变蛋白的盐类也是本发明的目的。这些盐可以用本领域已知的方法来制备。
据信，利用与一种或另一种TNF受体特异结合的化合物(如本发明的hTNF突变蛋白)将有利和不利的TNF-α活性分割开来的对策，可通用于TNF起作用的其他疾病状态。
含有编码上述hTNF突变蛋白的DNA顺序的DNA顺序，也是本发明的目的。这些DNA顺序可以象本领域所公开的那样(同上)，利用已知的体外诱变法(参见例如Sambrook等，1989)，由编码hTNF的基因组顺序或cDNA顺序起始来构建。这种诱变法可以随机进行，以获得大量的突变体，然后可以用适当的检测体系检验这些突变体是否具有所要的性质;或者，为了在给定DNA顺序中的确定位置诱变，可以用所谓的定位诱变法(参见例如Sambrook等，15.51-15.113，1989)进行诱变，或者利用聚合酶链反应进行诱变(参见例如White等，Trends in Genetics 5185-189，1989)。
一种常用于随机诱变的化学诱变剂是亚硫酸氢钠，它使胞嘧啶残基转化为尿嘧啶残基，从而造成“C”变“T”(核苷酸的标准缩写)的转换(诱变方法参见例如Shortle和Nathans，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 752170-2174，1978或Pine和Huang，Meth.Enzym.154415-430，1987)。这种诱变剂只作用于单链DNA，而诱变后靶DNA顺序的表达则要用双链质粒载体来实现。为了免去在诱变中重新克隆及表达载体的必要，一种可能的方法就是使用所谓的“噬粒”(phasmids)。这类载体除携有质粒复制起点外，还携有来自丝状噬菌体的复制起点。这类噬粒的实例有如Stanssen等人所述的pMa和pMc噬粒(Nucleic Acids Res.174441-4454，1989)。利用这一表达体系，可以构建出所谓的“缺口双螺旋”(gap-duplex)结构(还可参阅Kramer等，Nucl.Acids Res.129441-9456，1984)，该结构中只有TNF编码顺序(同上)处于单链状态，因而易受到特定化学诱变剂的作用。可以按Stanssen等人(同上)所述的位点特异性诱变法来构建准备用于随机诱变的“缺口双螺旋”，但不同的是(-)链含有与(+)链相同的活性抗生素抗性基因。利用编码hTNF-α的DNA顺序内不同的限制性位点，有可能使缺口的宽度发生变化。这类限制位点的例子有ClaI-SalI位点(470个核苷酸)、BstXI-BstXI位点(237个核苷酸)或StyI-StyI位点(68个核苷酸)。然后可以如Shortle和Nathans(同上)所述，用浓度递增(最高4M)的亚硫酸氢盐处理这些缺口双螺旋构建体，随后进行若干次透析。然后可以按本领域已知的方法，如Sambrook等人(同上)所述的方法，用这类噬粒构建体转化合适的原核宿主细胞。合适的原核宿主细胞在这里是指该宿主细胞有某种特异修复功能缺陷，从而使DNA中的一个尿嘧啶残基在复制过程中保留下来，而且该宿主细胞能够表达相应的突变TNF。这些特定的宿主细胞株是本领域已知的，例如大肠杆菌株BW313(Kunkel，T.A.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492，1985)。然后可以用适当的检测体系筛选出所得克隆中表达一种所要的hTNF突变蛋白的克隆。例如，可以把每个菌落接种在微量滴定板中含有相关抗生素的合适培养基中。可以加入溶菌酶使细胞溶解，随后进行依次的冻融循环。沉淀出核酸并离心后，可以用实施例Ⅱa和Ⅱb或实施例Ⅷ所述的适当检测法，直接使用每个菌落的上清液，测定与活细胞表面上的或纯态的p75-TNF-R和p55-TNF-R的结合作用。
如果需要，可以用限制片段分析法(参见例如Sambrook等，同上)确定特异性突变位点。通过测定这些片段的DNA顺序，就能确定确切的突变位置;如果这一突变导致氨基酸置换，则可由所测出的DNA顺序推出这个新的氨基酸。DNA顺序测定可以按本领域已知的方法进行，例如用市售测序试剂盒(Pharmacia，Uppsala，Sweden)利用T7聚合酶测定超螺旋DNA的顺序。
如上所述，使给定DNA顺序突变的另一种可能方法是“定位诱变”。由Hutchinson和Edgell(J.Virol.8181，1971)最先提出的一种广泛用于这种诱变法的对策包括，使携有所需核苷酸置换的合成寡核苷酸与应引入突变的单链DNA顺序的靶区退火(综述见Smith，Annual.Rev.Genet.19423，1985;改进方法见Stanssen等人(1989)文章中的参考文献2-6)。
这类方法中有一种优选方法是Stanssen等人(1989)的方法之一，该方法除使用Stanssen等人(1989，同上)所述的噬粒技术外，还使用了最早由Kramer等人(1984)提出的“缺口双螺旋DNA”(见上述文献及Kramer和Fritz，Methods in Enzymology，1987，Academic Press，Inc.USA)，但使用抗生素抗性基团代替M13功能基团来选择含突变链。这一方法的优点还在于，能够进行连续的诱变循环而无需将基因转移到新的诱变载体中，即，第二轮诱变的不同之处仅在于对另一种抗生素标记进行选择(Stanssen等，同上)。对照实验可以采用突变体向野生型TNF的位点特异性回复诱变。此外，利用寡核苷酸在TNF基因中建立或破坏某个限制位点，就不仅能通过与用于定位诱变的寡核苷酸杂交来控制突变体，而且能通过限制位点存在与否来控制突变体。为了制出一组在氨基酸顺序的确定位置上野生型氨基酸被任何天然存在氨基酸置换的hTNF突变蛋白，使用了一组所有可能的密码子都在确定位置上的寡核苷酸。
如前面已经提到的，使给定DNA顺序突变的另一可能方法是利用聚合酶链反应(PCR)进行诱变。这一方法的原理由例如White等(1989)作了概述，而其改进方法见Innis等所述(PCR程序方法及应用指南，Academic Press，Inc.1990)。
PCR是一种由少量模板DNA制备大量确定长度和顺序的特异DNA片段的体外方法。PCR的基础是侧接两个寡核苷酸引物的DNA片段的酶促扩增，而这两个引物能与靶顺序的相反链杂交。这两个引物的取向是它们的3′端彼此相对。使模板热变性，使引物与其互补顺序退火，用DNA聚合酶使退火后的引物延伸，这些步骤反复循环使PCR引物5′端之间的区段扩增。由于每个引物的延伸产物都能作为另一延伸产物的模板，所以每次循环基本上都使前一次循环产生的DNA片段的量加倍。由于引物是物理掺入扩增产物的，而且引物5′端和模板之间的错配对扩增效率没有显著影响，所以有可能改变扩增出的顺序从而在扩增后的DNA中引入所需的突变。利用从嗜热菌水生栖热菌分离出的热稳定性Taq DNA聚合酶，已有可能避免聚合酶的变性，这样就不必在每个热变性步骤之后补加酶。这一进展使PCR得以用各种简单的温度循环装置自动进行。此外，由于允许使用更高的引物退火和延伸温度，扩增反应的特异性提高了。特异性提高则由于减少了非靶片段对酶和引物的竞争而改善了扩增产物的总收率。
寡核苷酸的设计和合成可以按本领域已知的方法进行，如Sambrook等(1989)所述的方法或前面引用的有关定位诱变的参考文献之一所述的方法。
制出编码本发明的hTNF突变蛋白的DNA顺序后，就可以利用如上所述的噬粒技术，或者使用本领域公知的任何合适的原核或真核表达体系(参见例如Sambrook等，同上)，立即开始进行表达。
优选在原核细胞如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等中进行表达，其中优选大肠杆菌，尤其是大肠杆菌K12株，例如M15株(被Villarejo等人称为DZ291，见J.Bacteriol.120466-474，1974)、HB101(ATCC33694)、WK6(Stanssen等，同上)或大肠杆菌SG13009(Gottesman等，J.Bacteriol.148265-273，1981)。本发明hTNF突变蛋白的表达也可在低等或高等真核细胞中进行，例如酵母细胞(如毕赤酵母等)、丝状真菌(如曲霉等)或细胞系(如中国仓鼠卵细胞系等)，其中优选在酵母细胞中表达(见Sreekrishna等，Biochem.284117-4125，1989;Hitzeman等，Nature 293717-722，1981;欧洲专利申请公开263，311)。本发明hTNF突变蛋白在这些体系中的表达既可能在细胞内发生，也可能在经过适当的基因适应后在细胞外发生(见Leemans等，Gene 8599-108，1989)。
Sambrook等(同上)和Fiers等(“第八届国际生物技术讨论会汇编”，Soc.Franc.de Microbiol.，Paris，Durand等编码中680-697页，1988)提到了用于在大肠杆菌中表达的合适载体，更具体地说，pDS家族的载体(Bujard等人，Methods in Enzymology，Wu和Grossmann编，Academic Press，Inc.1987年第155卷第416-433页;Stüber等，Immunological Methods，Lefkovits和Pernis编，Academic Press，Inc.，1990年第Ⅳ卷第121-152页)，例如pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(THr86)(见实施例Ⅰ)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)(见实施例Ⅲ)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32Thr86)、或pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)(见实施例Ⅳ)。这些特异性pDS56/RBSⅡ质粒是由于它们具有特异的可调控启动子/操纵基因成分和核糖体结合位点才达到高水平的表达，所以，只有在启动子/操纵基因成分的活性由于lac阻遏物与操纵基因结合而受到阻遏时，这些质粒才能在大肠杆菌细胞中保留。启动子的活性可以通过加入IPTG而在所需的细胞密度下得到恢复，IPTG的作用是使阻遏物失活从而使启动子复原。大多数大肠杆菌菌株所能提供的阻遏物分子都不足以完全阻遏这些高拷贝数质粒中存在的启动子顺序的功能，所以，这些大肠杆菌菌株(如大肠杆菌M15或SG13009)必须先用编码lac阻遏物的质粒如pREP4(见图2a和2b)转化，然后再用本发明的特异性pDS56/RBSⅡ质粒转化，这样这些质粒就能稳定地保留在大肠杆菌细胞中。pREP4除编码lac阻遏物外还含有质粒pACYC184的一个区域(Chang和Cohen，J.Bacteriol.1341141-1156，1978)，该区域含有复制及向子细胞稳定遗传所需的所有信息(进一步的资料还可参阅Stüber等，“供在大肠杆菌中高水平生产和快速纯化重组蛋白的体系在抗原决定基图谱测定、抗体制备及结构功能分析中的应用”，Immunological Methods，Lefkovits和Pernis编，1990年第Ⅳ卷第121-152页，Academic Press，New York)。
可以借助任何常规方法(参见例如Sambrook等人，同上)用如上所述的载体转化宿主细胞。如果宿主细胞是原核细胞，例如大肠杆菌，则由指数生长期后收集的细胞制备能够吸收DNA的感受态细胞，随后再按已知的CaCl2法进行处理。转化也可以将宿主细胞制成原生质体后进行，或者用本领域已知的其他方法进行，例如Sambrook等人(同上)所述的方法。所以，含有编码上述hTNF突变蛋白的DNA顺序的载体，尤其是用于在原核或低等真核宿主细胞中表达的载体，以及用这样一种载体转化的宿主细胞，尤其是原核宿主细胞如大肠杆菌或低等真核宿主细胞，也是本发明的目的。
通常，含有所需表达载体的宿主有机体是在最适于其生长的条件下培养的。如果是处于指数生长末期的原核宿主，则当每单位时间增加的细胞数下降时诱导所需hTNF突变蛋白的表达，即转录编码所需hTNF突变蛋白的DNA并转译转录出的mRNA。进行诱导时可以在生长培养基中加入诱导物或去阻遏剂，或者改变物理参数，如改变温度。在本发明优选实施方案中所用的表达载体中，表达受lac阻遏物的控制。通过加入异丙基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(IPTG)使表达调控顺序去阻遏，从而诱导所需hTNF突变蛋白的合成。
由上述转化宿主细胞产生的本发明hTNF突变蛋白，可以从培养基中回收，也可以在使细胞破碎和/或用蛋白质和肽化学中已知的任何适当方法提取后回收，提取方法的例子有用硫酸铵沉淀、透析、超滤、凝胶过滤或离子交换色谱、凝胶电泳、等电聚焦、亲和色谱(如免疫亲和色谱)、HPLC等。特别优选的方法是用硫酸铵和/或聚乙烯亚胺沉淀、透析、亲和色谱(例如苯基琼脂糖特别是苯基Sepharose亲和色谱)或离子交换色谱(特别是在MONO-Q和/或MONO-S基质(Pharmacia，Uppsala，Sweden)上进行离子交换色谱)，更具体地说是如Tavernier等人所述的方法(J.Mol.Biol.211493-501，1990)和实施例Ⅴ所公开的方法。
因此，本发明的目的还在于提供一种制备如上所述的hTNF突变蛋白的方法，该方法包括在合适的培养基中培养如上所述的转化宿主细胞，并从培养上清液或宿主细胞本身分离突变蛋白，需要时将所述突变蛋白转化为可药用的盐。按这样一种方法制备的化合物也是本发明的目的。
本发明hTNF突变蛋白的特征是对人p55-TNF-R具有选择性结合亲和性。这种性质可以用本领域已知的测定结合亲和性的任何测定方法来测定。例如，TNF本身及本发明突变蛋白的结合作用可以用细胞培养中两类TNF受体表达程度不同的细胞来测定，例如使用只表达人p55-TNF-R的Hep-2细胞，以及除p55-TNF-R之外还表达人p75-TNF-R的U937或HL60细胞(见Brockhaus等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 873127-3131，1990;Hohmann等，J.Biol.Chem.26414927-14934，1989;Loetscher等，1990;Dembic等，1990)。当然，也可以使用如实施例中所详细描述的纯化的天然或重组p55-TNF-R的p75-TNF-R，或使用这些受体的相应可溶性类似物，直接测定结合亲和性。
在本发明的意义上，术语“对人p55-肿瘤坏死因子受体具有选择性结合亲和性”是指，就所用的检测体系而言，与两类TNF受体的结合亲和性的差异显著到足以认为，本发明突变蛋白与野生型TNF类似地与p55TNF受体选择性结合，但却基本丧失了在功能上相关的与hp75-TNF-R结合的能力。更具体地说，这一术语就实施例中的检测体系而言是指，用体外结合测定法对重组可溶性hp75-TNF-R测定时，本发明特定hTNF的KD值至少比野生型TNF-α大10倍或更多倍，特别优选的是至少大102倍，而用体外结合测定法对重组可溶性hp55-TNF-R测定时，同-hTNF突变蛋白的KD值与野生型TNF-α相差不超过2倍，但是应该理解，给出这些具体的KD值只是为了举例说明，决不应认为是限定性的。
本发明hTNF突变蛋白可以用本领域已知的方法由其抗肿瘤活性来鉴定。
hTNF突变蛋白可以以可药用的口服、注射或局部组合物和给药方式使用，可单独给药也可与一种或更多种本发明其他化合物配伍使用。给药剂量应使该组合物在患者体内的数量有效地改善与hTNF突变蛋白功能有关的生物功能。
因此，含有hTNF突变蛋白及可配伍的药用载体物质的药物组合物，是本发明的另一个目的。可以使用任何常规载体物质。载体物质可以是适于肠内、经皮或肠胃外给药的有机或无机载体。合适的载体包括水、明胶、阿拉伯树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、植物油、聚二醇、矿脂等。此外，这些药物制剂可以含有其他有药物活性的试剂。可以按药物配制领域的普遍作法加入其他添加剂，如调味剂、防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。
这些药物制剂可以制成任何常规形式，包括a)供口服给药的固体形式，如片剂、胶囊剂、丸剂、粉剂、粒剂等;b)供口服给药的液体形式，如溶液、糖浆剂、悬浮剂、酏剂等;c)供肠胃外给药的制剂，如无菌溶液、悬浮剂或乳剂;d)供局部给药的制剂，如溶液、悬浮剂、软膏剂、霜剂、凝胶剂、碎粉剂、气雾剂等。药物制剂可以进行灭菌，并且/或者可以含有助剂，如防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、调节渗透压的盐类和/或缓冲剂。
肠胃外剂型可以是输注液或注射液，可以静脉或肌内注射。这些制剂也可以含有其他有医药活性的物质。可以按药物配制领域的普遍作法加入其他添加剂，如防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等。
因此，本发明的目的还在于提供一种制备药物组合物的方法，该方法的特征在于，将本发明方法制得的化合物及必要的其他有药物活性的物质与医疗上可配伍的惰性无毒载体混合，并将该混合物制成盖仑(galenical)剂型。
另外，按本发明方法制备的化合物在制备上述药物组合物中的应用，也是本发明的目的。
最后，可以针对本发明hTNF突变蛋白产生抗体。这些抗体可以以公知方式用于诊断或治疗及纯化。这类抗体可以用以下方法来制备用足量的含本发明hTNF突变蛋白和可配伍药物载体的疫苗制剂注射哺乳类或鸟类动物，从而诱发抗所述hTNF突变蛋白抗体的产生。所需的hTNF突变蛋白的适当数量，对本领域技术人员是已知的，或者可以用常规实验来确定。本发明所用的术语“药物载体”既可以指适于人体给药的标准组合物，也可以指动物疫苗接种中所用的典型佐剂。
TNF是一种强效的多效性细胞素。它有许多不同的活性，例如免疫细胞生长因子活性、炎症介体活性、或上皮内特异基因诱导物活性，这些活性都可以在宿主对感染和损伤的防御过程中观察到。TNF还具有高度的全身性毒性。菌血症和败血性休克或细菌性脑膜炎的有害作用在很大程度上是由内源性细胞素介导的，而在这些细胞素中TNF具有早期而且重要的作用。另外，许多细胞和细胞系都对TNF的直接细胞毒活性敏感。各种不同的全身性效应和细胞毒性可能都综合在动物实验中所观察到的TNF的抗肿瘤活性中。
这些事实构成了用本发明hTNF突变蛋白建立新的治疗方案的合理基础，特别是，应充分利用分割许多不同hTNF活性的可能性，使不利的毒性与所需的活性分开。举一个例子，由于本发明hTNF突变蛋白可能具有较低的全身性毒性，有可能用其高剂量作为抗肿瘤剂，这样便克服了毒性对剂量的限制，而这种毒性可能严重地限制了野生型hTNF在癌症患者中的使用。然而，本发明hTNF突变蛋白的可能应用并不局限于癌症的治疗。任何疾病，只要TNF能作为细菌感染的宿主防御因子(例如Kindler，V等，Cell 56731-740，1989;Nakano，Y.等，J.Immunol.1441935，1990)或作为炎症介体而起有益作用，就能从55KD TNF受体型特异药物如本发明hTNF突变蛋白中受益。还已证明，TNF在恶病质中起作用(例如Beutler，B.和Cerami，同上)，而且，具有低全身性毒性的本发明TNF突变蛋白可用于减肥治疗。即使是以TNF释放过量而产生毒性活性为特征的疾病状态，如败血性休克或细菌性脑膜炎，也可从55KD TNF受体特异性激动剂(如上述的本发明突变蛋白)或该激动剂与TNF拮抗剂的配伍中受益。
现已出版了一部有关TNF在新疗法中的突出作用的简明概要，从中可以预计，具有较低的全身性毒性并能选择性地只触发许多不同的TNF活性中的某些活性的p55-TNF受体型特异激动剂，与野生型TNF相比具有显著的优点(《肿瘤坏死因子分子及其在医学中的突出作用》，B.Beutler编，Raven Press，1992，ISBN 0-88167-852-X)。这种作用包括TNF在调节内皮细胞自身稳定性质和中性粒细胞粘附中的活性、在组织缺血和再灌损伤中的活性、在骨吸收中对成骨细胞和破骨细胞的活性、作为生长因子对许多细胞的普遍活性和在造血中的活性、以及在代谢和营养效应中的活性。提供细胞保持机制的特异基因的诱导，例如已知处于p55-TNFR调控下的Mn一超氧化物歧化酶的诱导(Lewis等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 882830，1991;Tartaglia等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 889292，1991)，或者TNF在某些细胞中的直接细胞毒性，都为使用受体型特异TNF激动剂的新治疗方案提供了合理的基础。TNF作为生长/分化因子在淋巴细胞活素激活的杀伤细胞(LAK)生成中的作用，看来对TNF的抗肿瘤活性有贡献。
一个重要的方面是，所有这些活性都可以通过与其他重组细胞素如干扰素-γ配伍而得到增强或调节。
前面已从总体上描述了本发明，下面的实施例准备结合下列附图来详细说明本发明，但决不因此而限制本发明。
以下所用的缩写和符号为B、E、H、S、Xb和X，分别表示BglⅠ、EcoRⅠ、Hind Ⅲ、SalⅠ、XbaⅠ和XhoⅠ的限制性酶切位点。
代表可调控的启动子/操纵基因单元N25OPSN25OP29;
代表合成的核糖体结合位点RBSⅡ，SphⅠ;
代表TNFα基因(TNFα)、β-内酰胺酶基因(bla)、氯霉素乙酰转移酶基因(cat)、lac阻遏物基因(lacⅠ)和新霉素磷酸转移酶基因(neo);
代表噬菌体λ(t0)的转录终止区t0和大肠杆菌rrnB操纵子(T1)的转录终止区T1; ()/() 代表质粒pBR322和pREP4的复制区(repl.);→代表处于
N25OPSN250P29和RBSⅡ，SphⅠ调控下的编码区。
图1a是质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的示意图。
图1b显示了质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的完整核苷酸顺序。在该顺序中标出了图1a中所画出的限制酶识别顺序。所示的氨基酸顺序以三字母代码表示成熟TNFα的顺序(157个氨基酸)。
图2a是质粒pREP4的示意图。
图2b显示了质粒pREP4的完整核苷酸顺序。在该顺序中标出了图2a中所画出的限制酶识别顺序。
图3概括了编码TNF-α突变蛋白Thr86-TNFα的EcoRⅠ-HindⅢ片段的制备。
图4显示了质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32)中片段1的核苷酸顺序。
图5显示了质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29)中片段1的核苷酸顺序。
图6显示了质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32)中片段1的核苷酸顺序。
图7显示了野生型人TNFα及Thr86、Trp32-Thr86和Ser29-Trp32-Thr86突变蛋白与重组人p-75 TNFR和p-55 TNFR的竞争性结合。用重组人p75 TNFR-IgGγ3融合蛋白(A组)和重组人p55TNFR-IgGγ3融合蛋白(B组)涂布微量滴定板，在不同浓度的野生型TNFα(实心圆)、Thr86突变蛋白(空心圆)、Trp32-Thr86突变蛋白(空心方块)和Ser29-Trp32-Thr86突变蛋白(空心三角)存在下，使微量滴定板与放射标记的人TNFα一起保温。室温下三小时后，用γ计数器计数结合的放射性。
图8显示了野生型人TNFα及Ser29-Thr86、Glu31-Thr86和Asn31-Thr32-Thr86突变蛋白与重组人p75TNFR和p55TNFR的竞争性结合。用重组人p75 TNFR-IgGγ3融合蛋白(A组)和重组人p55TNFR-IgGγ3融合蛋白(B组)涂布微量滴定板，在不同浓度的野生型TNFα(实心圆)、Ser29-Thr86突变蛋白(空心圆)、Asn31-Thr32-Thr86突变蛋白(空心方块)和Glu31-Thr86突变蛋白(空心三角)存在下，使微量滴定板与放射标记的人TNFα一起保温。室温下三小时后，用γ计数器计数结合的放射性。
除非另外指出，以下给出的固固混合物、液液混合物和固液混合物中的百分比，分别按重量/重量、体积/体积和重量/体积计算。
实施例ⅠThr86-TNFα的制备质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα用人TNFα表达质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(见图1)作为TNFα基因的来源用于制备本发明的各种TNFα突变蛋白。转化的大肠杆菌M15株(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα)已为专利目的而按布达佩斯条约于1991年9月8日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏号为DSM6713。
用PCR法诱变TNFα基因利用Perkin-Elmer Cetus GeneAmpTMDNA扩增试剂盒及AmpliTaqTM重组Taq DNA聚合酶，用质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(图1)作模板DNA进行两个PCR反应(见图3)。
反应Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3;引物17／包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα核苷酸3949-3970)和29/M22(5′-GTAGGTGACGGCGATGCGGCTGATGGT-3′;引物29/M22包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸378-352互补的核苷酸，划下线的是突变碱基)进行。
反应Ⅱ用引物29/MR1(5′CAGACCAAGGTCAACCTCCTC-3′;引物29/MR1包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸379-399)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNF的核苷酸748-727互补的核苷酸)进行。
在一个典型的实验中，在Eppendorf管中混合下列物质10μl模板DNA(10ng)、两种引物各5μl(各100皮摩尔)、16μl dNTP混合物(1.25mM dATP、dGTP、dCTP和dTTP)、10μl 10X反应缓冲液(100mM Tris-HCl pH8.3，500mM KCl、15mM MgCl2、0.1%明胶)、1μl(5单位)AmpliTaqTMDNA聚合酶和53μl H2O。在该混合物上铺80ml矿物油(Perkin-Elmer Cetus)。将各管移入DNA热循环仪(TRIO-Thermoblock，Biometra)中，于94℃下保持1分钟，然后进行35次DNA熔化(94℃，1分钟)、引物退火(50℃，1分钟)、引物延伸(72℃，3分钟)的循环。于72℃下再经2分钟后，将反应液冷却至室温，用氯仿萃取。用乙醇沉淀出水相中所含的DNA，在6%聚丙烯酰胺凝胶中进行电泳(Sambrook等，1989)。用溴化乙锭染色DNA后，从凝胶中分离出片段Ⅰ和Ⅱ(见图3)并进行纯化(Sambrook等，1989)。
制备编码Thr86-TNFα的DNA片段使片段Ⅰ和Ⅱ酶促磷酸化，然后使其彼此连接(Sambrook等，1989)。使连接酶热失活并用限制酶EcoRⅠ和HindⅢ消化后，在6%聚丙烯酰胺凝胶中对DNA进行电泳。用溴化乙锭染色DNA后，从凝胶中分离出EcoRⅠ-HindⅢ片段A(见图3)并纯化(同上)。
制备编码Thr86-TNFα的质粒按标准方法(Sambrook等，1989)将EcoRⅠ-HindⅢ片段A插入已用EcoRⅠ-HindⅢ开环的质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα中，产生质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)。制备质粒DNA(Birnboim等，1979)，通过测定双链DNA的顺序TNFα突变蛋白编码区正确与否(Sambrook等，1989)。
产生Thr86-TNFα用标准方法(同上)将质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)转化到已含有质粒pREP4的大肠杆菌M15细胞中。于37℃下在含有100mg/l氨苄青霉素和25mg/l卡那霉素的LB培养基(Sambrook等，1989)中培养转化细胞。在600nm处光密度约为0.7-1.0时，加入IPTG至终浓度为2mM。于37℃下再过2.5至5小时后，离心收集细胞。
实施例ⅡGlu31-TNFα和Asn31Thr32-TNFα的制备原理TNFα突变蛋白Glu31-TNFα和Asn31Thr32-TNFα是按照实施例Ⅰ所详述的制备Thr86-TNFα的方法来制备的。因此，在对上列TNFα突变蛋白的制备所作的描述中，只指出了用于PCR反应Ⅰ和Ⅱ的引物。另外还给出了编码各种TNFα突变蛋白的表达质粒的名称。
制备Glu31-TNFαPCR反应Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3′;引物17/F包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸3949-3970)和21/M5(5′-ATTGGCCCGCTCGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3′;引物21/M5包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸219-184互补的核苷酸，划下线的是突变碱基)进行。PCR反应Ⅱ用引物21/MR(5′-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3′;引物21/MR包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸220-241)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸748-727互补的核苷酸)进行。
所得的表达质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31)用于产生Glu31-TNFα和构建质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)(见实施例Ⅳ)。
制备Asn31Thr32-TNFαPCR反应Ⅰ用引物17/F(5′-GGCGTATCACGAGGCCCTTTCG-3′;引物17/F包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸3949-3970)和21/M6(5′-ATTGGCAGTGTTGTTCAGCCACTGGAGCTGCCCCTC-3′;引物21/M6包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸219-184互补的核苷酸，划下线的是突变碱基)进行。PCR反应Ⅱ用引物21/MR(5′-GCCCTCCTGGCCAATGGCGTGG-3′;引物21/MR包含质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸220-241)和17/O(5′-CATTACTGGATCTATCAACAGG-3′;引物17/O包含与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα的核苷酸748-727互补的核苷酸)进行。
所得的表达质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32)用于产生Asn31Thr32-TNFα和构建质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn 31Thr32Thr86)(见实施例Ⅳ)。
实施例ⅢTrp32Thr86-TNFα的制备原理为制备Trp32Thr86-TNFα，构建表达质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)，然后将该质粒用于在大肠杆菌中产生Trp32Thr86-TNFα。
构建质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)实施例Ⅰ和Ⅱ所述的所有表达质粒都含有与质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα相同的两个限制酶BglⅠ位点(见图1)。这两个位点中一个位于β-内酰胺酶基因内，另一个则位于TNFα基因内。后一个位点将TNFα的编码区分隔为两部分一部分编码TNFα的1-36位氨基酸，另一部分则编码TNFα的37-157位氨基酸(见图1b)。
为构建质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)，按标准方法制备DNA片段1和2(Sambrook等，1989)。片段1(顺序见图4)为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32)的小BglⅠ片段加上可调控的启动子和Trp32-TNFα到36位氨基酸为止的编码区。片段2为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Thr86)的大BglⅠ片段加上Thr86-TNFα从37位氨基酸起始的编码区和该质粒的复制区。使片段1与经过酶促脱磷酸化的片段2彼此连接(Sambrook等，1989)，生成质粒PDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)。
M15(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32))细胞已为专利目的而按布达佩斯条约于1990年11月19日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏号为DSM6241。
产生Trp32Thr86-TNFα用标准方法(同上)将质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Trp32Thr86)转化到已含有质粒pREP4的大肠杆菌M15细胞中。于37℃下，在含有100mg/l氨苄青霉素和25mg/l卡那霉素的LB培养基(同上)中培养转化细胞。在600nm处的光密度约为0.7至1.0时，加入IPTG至终浓度为2mM。于37℃下再经2.5-5小时后，离心收集细胞。
实施例ⅣSer29Thr86-TNFα、Ser29Trp32Thr86-TNFα、Glu31Thr86-TNFα和Asn31Thr32-Thr86-TNFα的制备原理
TNFα突变蛋白Ser29Thr86-TNFα、Ser29Trp32Thr86-TNFα、Glu31Thr86-TNFα和Asn31Thr32-Thr86-TNFα，是按照实施例Ⅲ中所详述的制备Trp32Thr86-TNFα的方法来制备的。因此，在对上列TNFα突变蛋白的制备所作的描述中，只指出了相应于实施例Ⅲ中片段1的DNA片段。另外还给出了编码各种TNFα突变蛋白的表达质粒的名称。
制备Ser29Thr86-TNFα片段1(顺序见图5)为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29)的小BglⅠ片段加上可调控的启动子和Ser29-TNFα到36位氨基酸为止的编码区。使片段1与经过酶促脱磷酸化的片段2(见实施例Ⅲ)彼此连接(Sambrook等，1989)，生成质粒pDS 56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Thr86)，然后将该质粒用于在大肠杆菌中产生Ser29Thr86-TNFα。
M15(pREP4;pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29))细胞已为专利目的而按布达佩斯条约于1990年11月19日保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)(Braunschweig，BRD)，保藏号为DSM6240。
制备Ser29Trp32Thr86-TNFα片段1(顺序见图6)为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29TrP32)的小BglⅠ片段加上可调控的启动子和Ser29Trp32-TNFα到36位氨基酸为止的编码区。使片段1和经过酶促脱磷酸化的片段2(见实施例Ⅲ)彼此连接(Sambrook等，1989)，生成质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Ser29Trp32Thr86)，然后将该质粒用于在大肠杆菌中产生Ser29Trp32Thr86-TNFα。
制备Glu31Thr86-TNFα片段1为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31)的小BglⅠ片段加上可调控的启动子和Glu31-TNFα到36位氨基酸为止的编码区。使片段1和经过酶促脱磷酸化的片段2(见实施例Ⅲ)彼此连接(Sambrook等，1989)，生成质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Glu31Thr86)，然后将该质粒用于在大肠杆菌中产生Glu31Thr86-TNFα。
制备Asn31Thr32Thr86-TNFα片段1为质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32)的小BglⅠ片段加上可调控的启动子和Asn31Thr32-TNFα到36位氨基酸为止的编码区。使片段1与经过酶促脱磷酸化的片段2(见实施例Ⅲ)彼此连接(Sambrook等，1989)，生成质粒pDS56/RBSⅡ，SphⅠ-TNFα(Asn31Thr32Thr86)，然后将该质粒用于在大肠杆菌中产生Asn31Thr32Thr86-TNFα。
实施例Ⅴ纯化人TNFα突变蛋白离心收集1升如上所述转化和诱导的大肠杆菌细胞过夜培养物，并重新悬浮于20ml 50mM Tris pH7.2、200mM KCl、50mM MgCl2、5%甘油中。在法式压榨器中以20000磅/英寸2的压力将细胞打碎。离心(70000Xg，30分，4℃)澄清后，加入固体硫酸铵至终浓度为30%。溶液于室温下搅拌1小时，然后在4℃下以10000Xg离心20分。上清液用0.45μm滤器过滤，并调至硫酸铵浓度为70%。离心收集沉淀出的蛋白，溶于20ml 20mM Tris pH9.0中，于4℃下对同一缓冲液透析过夜。以1ml为1份，将各等份经过透析的样品加到用20mM Tris pH9.0平衡过的MonoQ柱(HR 5/5，LKB-Pharmacia)上，用线性NaCl梯度(在20mM Tris pH9.0中0-400mM)洗脱，流速为0.5ml/分。以0.5ml为一份收集各级分，并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)分析其中是否含有TNFα突变蛋白。合并阳性级分，对20mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)pH6.0透析，再加到用20mM MES pH6.0平衡过的MonoS柱(HR5/5，LKB-Pharmacia)上。用线性NaCl梯度(在20mM MES pH6.0中0-400mM)以0.5ml/分的流速洗脱蛋白质。在250mM和350mM NaCl之间洗脱出电泳纯的各种TNFα突变蛋白。对磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析后，以BCA蛋白测定法(Pierce化学公司)用野生型人TNFα作标准物测定蛋白浓度。
实施例Ⅵ人TNFα和突变蛋白与重组人p75-TNFR和p55-TNFR的竞争性结合为进行竞争性结合试验，将重组人p75-TNFR-人IgGγ3和p55-TNFR-人ⅠgGγ3融合蛋白分别是以0.3μg/ml和0.1μg/ml溶于PBS，用这两种融合蛋白涂布微量滴定板(100μl/孔4℃下过夜)(Loetscher，H.等，J.Biol.Chem.26618324-18329，1991;Lesslauser，W.等，Eur.J.Immunol.212883-2886，1991)。用封闭缓冲液(50mM Tris pH7.4、140mM NaCl、5mM EDTA、0.02% NaN3、1%脱脂奶粉)封闭后，将微量滴定板用PBS洗涤，在不同浓度的突变蛋白存在下，与10mg/ml人125Ⅰ-TNFα(用Iodogen法(Pierce化学公司)标记至比放射性约为30μCi/μg)一起保温。体积为100μl/孔，每个浓度做三次平行测定。室温下3小时后，用PBS充分洗涤各小孔，并用γ计数器计数。
权利要求
1.一种对人p55-肿瘤坏死因子受体具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在86位上有变化，以苏氨酸代替了丝氨酸残基。
2.如权利要求1所述的突变蛋白或其可药用盐，其中所述氨基酸顺序还在一个或更多个额外位置上有变化，优选在一个或二个额外位置上有变化。
3.如权利要求2所述的突变蛋白或其可药用盐，其中所述氨基酸顺序在29和86位、31和86位、32和86位、29、32和86位、以及31、32和86位有变化。
4.如权利要求1-3中任一项所述的突变蛋白或其可药用盐，该突变蛋白为Thr86-TNFα、Ser29-Thr86-TNFα、Glu31-Thr86-TNFα、Trp32-Thr86-TNFα、Ser29-Trp32-Thr86-TNFα、或Asn31-Thr32-Thr86-TNFα。
5.一种DNA顺序，该顺序包含编码如权利要求1-4中任一项所述的突变蛋白的DNA顺序。
6.一种载体，尤其是用于在原核或低等真核宿主细胞中表达的载体，该载体包含如权利要求5所述的DNA顺序。
7.一种宿主细胞，尤其是原核或低等真核宿主细胞，该宿主细胞已用如权利要求6所述的载体转化。
8.如权利要求7所述的宿主细胞，该宿主细胞为大肠杆菌。
9.如权利要求1-4中任一项所述的化合物，该化合物用于治疗疾病。
10.一种制备如权利要求1-4中任一项所述的化合物的方法，该方法包括在合适的培养基中培养如权利要求7或8所述的宿主细胞，从培养上清液或宿主细胞本身分离突变蛋白，并在需要时将所述突变蛋白转化为可药用盐。
11.一种药物组合物，该组合物含有一种或更多种如权利要求1-4中任一项所述的化合物，需要时与其他有药物活性的物质和/或在治疗上可配伍的惰性无毒载体物质配伍。
12.如权利要求1-4中任一项所述的化合物在疾病治疗中的应用。
全文摘要
本发明涉及对人p55肿瘤坏死因子受体具有选择性结合亲和性的人肿瘤坏死因子突变蛋白或其可药用盐，其特征在于，人肿瘤坏死因子的氨基酸顺序至少在86位上有变化，由苏氨酸代替了丝氨酸残基。本发明还涉及编码该突变蛋白的DNA顺序、包含该DNA顺序的载体、由该载体转化的宿主细胞、由该宿主细胞产生上述突变蛋白的方法、含有该突变蛋白的药物组合物，以及该突变蛋白在疾病治疗中的应用。
文档编号A61K38/00GK1079225SQ93103419
公开日1993年12月8日 申请日期1993年4月1日 优先权日1992年4月2日
发明者W·列斯劳尔, H·勒舍, D·施特伯 申请人:霍夫曼-拉罗奇有限公司