专利名称：：蚯蚓溶纤素的制备方法
技术领域：
：本发明涉及一种用蚯蚓提取物制备溶解纤维蛋白药物的方法。该方法制备的溶纤素可以有效地溶解血栓，并有明显的抗凝作用。公知的溶栓药物，如链激酶和尿激酶，一般通过静脉给药，并有产生全身溶血的危险性，其制备方法也较为复杂，尿激酶的制备需要大量的男性新鲜尿液为原料，收集较为困难。中药中也有一些活血化瘀的药物，如红花、丹参、川芎等，但其溶栓效果不明显。市售的蛇毒溶栓剂不能口服，并有明显的毒性反应。近年来，国内外有不少关于蚯蚓提取物溶栓作用的文献报道，主要是关于蚯蚓溶纤酶提取、溶栓作用的药理研究，对该类药物的开发应用报道不多。日本和南朝鲜合作开发出用蚯蚓提取溶纤药物，取名“龙心”，并用于临床。在GB2116565A中公开了该药物的制备方法及部分药理、疗效。该方法主要是将活蚯蚓(或某部分组织)加溶剂打碎成悬浮液，在37℃左右的温度下，保温72-100小时，然后过滤或分离得到提取液，经超滤或真空蒸发成浓缩液，再进行干燥(真空或冷冻)制成粗制的溶纤粉，此粗品活性仅为142mm2/mg-350mm2/mg，无法入药，用该粗品再经过精制工艺来提高纯度和活性，精制过程需加入极性有机溶剂，然后经沉淀→溶解→透析→离子交换→凝胶过滤(或亲合层析)→冷冻干燥等工艺步骤得到具有较高活性的药物制品。该方法制得的粗品活性较低，不能入药，必须经过精制工艺，因此生产工艺复杂，生产周期长，工业化规模生产成本高。此外，用该方法制得的悬浮液在37℃下保温长达72-100小时，易变质。该方法制备的药物虽然进行了溶纤实验，但对溶栓实验未见实际数据。日本专利平2-215724公开了一种真空干燥法制备蚯蚓干粉的方法，该方法将蚯蚓放入含有机或无机微酸度溶液中放养，待内腔中有菌的粪土充分排出后，粉碎得到悬浮液，再经冷冻干燥、真空干燥或负压脱水、真空回转干燥，得到蚯蚓干粉粗品，将该粗品在粉碎机下粉碎成细粉即成。该方法工艺简单，但是真空干燥设备及工艺条件要求高，为了制得无菌的粗品，其冷冻干燥温度在-10℃--60℃，真空干燥温度-60℃-+80℃，真空度10-100mmHg以下，在此工艺条件下操作时间最长达100小时。即使采用真空回转干燥的方法，也要在10mmHg下保温操作50小时，才可得到干粉，真空回转干燥设备要求也较高。本发明的目的调整普通提取工艺，使制备的蚯蚓溶纤素粗品即具无毒、无菌、活性高的特性，可直接入药，从而提供一种工艺、设备简单，生产周期短，适于工业规模生产的蚯蚓溶纤素的制备方法。本发明的要点本方法选用赤子爱胜蚓为原料，用清水洗涤去泥，再用新鲜蒸馏水洗涤3-5次，用组织捣碎机制成匀浆，加蒸馏水稀释提取，PH6.8-7.0，置4℃-6℃温度下放8-12小时，用离心方法收集上清液，沉渣再以同样方式提取3-4次，合并上清液，分装在透析袋中，透析24-72小时。这样可以去掉无机离子及小分子色素，提高纯度、降低毒性，然后用超滤或化学脱水方法脱水，得到浓缩液。其中适当选取超滤膜可以灭菌，如中孔纤维或5000-10000超滤膜等，也可以用聚乙二醇6000脱水。除菌后的浓缩液经过冷冻干燥，温度-20℃-60℃，时间8-16小时，即得蚯蚓溶纤素粗品，该粗品呈微黄色，活性达8500mm2/mg，可研磨后直接用药，也可用凝胶过滤等方法进一步精制再提纯。本发明的效果本方法将普通工艺进行调正，在粗品制备时即加入透析、超滤等工艺，使粗品的活性及纯度提高2-5倍，可直接入药，从而提供一种工艺设备简单，工艺条件易于掌握、适于规模生产的蚯蚓溶纤素的制备方法。该溶纤素粗品可制备口服、针剂、静滴等各种药剂，安全可靠、溶栓效果显著。1、从下列系列实验证明其安全可靠性。(1)溶纤素动物药理实验用本发明制备的溶纤素对家猫分组试验，观察溶纤素对心血管系统及呼吸系统的影响，测试指标为心电图、血压、心率、呼吸频率及呼吸深度。结果表明经给药前后与对照组比较均无显著差异(P＞0.05)详见表1、表2。用本发明制备的溶纤素对小白鼠神经系统的影响进行试验，测试小鼠的自由活动数及对戊巴比妥阈下催眠剂量的影响，结果表明与对照组无显著差异(P＞0.05)，即对小鼠中枢神经系统无明著显影响。详见表3、表4。(2)溶纤素长期毒性实验用本发明制备的溶纤素对狗进行长期毒性实验，连续口服三个月，观察指标为动物行为、外周血相、肝、肾功能和心电图等。结果表明各种指标无异常，动物在整个给药期间纳食正常、活泼，体重平均增长3.5Kg，说明本药口服安全、无明显副作用。详见表5、表6。(3)溶纤素的急性、亚急性毒性实验。用本发明制备的溶纤素对小白鼠进行急性亚急性毒性试验。a、对小白鼠静脉LD50的测定得到溶纤素致死率数据(见表7)。由表7数据得到50%死亡点引出垂直线得LD50＝172mg/Kg。b、口服溶纤素毒性口服后观察7天，结果没有动物死亡，自主活动无改变，连续15天对外周血液红、白血球和血小板及肝、脾、肾功能与对照组动物比较无明显影响(见表8)。c、大小鼠生长曲线表明，生长发育与对照组比较无明显影响。附图1为大鼠生长曲线对比表。如图1所示1为口服溶纤素500mg/kg的大鼠生长曲线，2为对照组生长曲线。附图2为小鼠生长曲线对比表。如图2所示3为口服溶纤素100mg/Kg小鼠生长曲线，4为口服200mg/Kg小鼠生长曲线，5为小鼠对照组生长曲线。除上述实验数据外，本发明制备的溶纤素得到北京市卫生药检部门的许可证(见附件)。(2)本方法制备的药物用于临床，效果明显，不但对体内纤维蛋白有溶解作用，溶栓作用更为明显，特别是对陈旧性血栓也显示出意想不到的疗效。病例如下a、患者女性，诊断为左髂股静脉血栓形成，用尿激酶5天(共100万单位)无效，停药15天后，改口服本发明制备的胶囊，1g/次，3次/日，口服14人，治愈出院。b、患者为男性，61岁，因安装起博器引起左锁骨下静脉血栓形成，经尿激素治疗4天无效，停药一天，改口服本发明制备的溶纤素胶囊，每天8克，分三次服用，10天后改用每天4克，分4次服用，用11天后(共21天)，血栓溶解出院。上两例病人前后均有造影根据。c、二例眼科病人，均为男性，年龄分别为62岁、73岁，诊断为右眼眼底视网膜静脉血栓和左眼视网膜下方静栓血栓，入院时病眼视力分别为0.04和0.02，其中1例口服溶纤素1克，每天2克，用药12天，另一例先用川芎嗪和低分子右旋糖苷静脉滴无效，停药5天，改口服溶纤素胶囊，1g/次，2次/日，共服21天，二例病人治疗后视力达到0.2出院。经过实际应用，本发明制备的溶纤素，有口服、静注、肌注等多种给药途径。可用于治疗脑血栓、脑栓塞、心肌梗塞、肢体劫脉、静脉、眼底动、静塞等各种塞性疾病。下面结合实施例对本发明详细说明。附图3是本发明的工艺流程图。如图3所示将鲜蚯蚓(赤子爱胜蚓)200克，用清水洗涤去泥，再用新鲜蒸馏水洗涤3-5次，加新鲜蒸馏水(PH6.8-7.0)100毫升混合，用组织捣碎机破碎成匀浆液，加蒸馏水稀释提取，置4℃冰箱8-12小时，用3000rpm×15′离心收集上清液，沉渣以同样方式提取3-4次，合并上清液，总体积为500ml，残渣弃之。将提取液分装在透析袋中，透析2-3天后，用中孔纤维超滤(或聚乙二醇6000)脱水，浓缩提取液约200毫升，冷干燥，温度-20℃--60℃。得蚯蚓溶纤素粗品，取出少量溶纤测其活性，剩余部分或碾细直接制药，或进一步精制提纯。其中活性测定取10ml粗品，加在2.5ml生理盐水中测得每10ul含0.04mg活性，面积大小为324-361mm2，即约8500mm2/mg活性。实施例2用例1制得的溶纤素200-500mg碾成细粉，装入胶囊，得到口服胶囊。实施例3用例1制得的溶纤素10-12mg，加注射水5ml，直接肌注。实施例4用例1制得的溶纤素按12-18mg/Kg加生理盐水静滴。表3溶纤素对小鼠自主活动的影响<>表4溶纤素对戊巴比妥钠阈下催眠剂量的影响<tables>表5血色素、红细胞、白细胞测定结果<<p>表6给药前后SGPT、BUN测定结果表7蚯蚓溶纤素致死量数据权利要求1.一种蚯蚓溶纤素的制备方法，包括将活蚯蚓洗涤、破碎、分离、干燥等工艺，其特征在于将赤子爱胜蚓经洗涤后混合破碎，得到匀浆液，加入蒸馏水提取，PH值为6.8-7.0，置于4℃-6℃下保温8-12小时，离心收集上清液，将上清液透析24-72小时后，进行超滤或化学脱水浓缩灭菌，得到的浓缩液冷冻干燥8-16小时制得溶纤素。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，超滤膜采用中孔纤维或5000-10000的超滤膜。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化学脱水用聚乙二醇6000脱水全文摘要本发明涉及一种蚯蚓溶纤素的制备方法。本方法将赤子爱胜蚓经洗涤混合破碎后加蒸馏水提取，离心收取提取液，对提取液进行透析、超滤或化学脱水浓缩得到灭菌的浓缩液，再经冷冻干燥制得溶纤素粗品。该粗品活性达8500mm文档编号A61K35/56GK1079902SQ9310505公开日1993年12月29日申请日期1993年5月18日优先权日1993年5月18日发明者王中,程雨时申请人:北京市心肺血管医疗研究中心