专利名称：肿瘤疫苗的制备方法
技术领域：
本发明涉及一种生物制品的制备方法，特别是细胞水平肿瘤疫苗的制备。
近年来人们已将肿瘤疫苗的开发研究列入四大抗癌生物工程产品之一。采用各种方法和技术(包括化学和生化方法、单克隆抗体以至基因工程技术等)，从肿瘤细胞提取或克隆表达出高纯度的TAA(见李春海、孙志贤主编的《肿瘤标志研究进展》刊物中樊代明的文章〈肿瘤疫苗的研究进展〉34-39，1992)这要求有较高的技术和设备条件，费时、费钱，不仅难以推广应用，而且这种高纯度TAA产品的主动免疫抗癌疗效尚有待临床验证。最近有资料(如在MG.Hannaetal.In“PrinciplesofCancerBiotherapy”，RKOldham(ed).2ndEdpp253～283MarcelDekkerInc.NewYork，1991)介绍，目前国外临床应用的瘤苗就是分别用放射能(X-线、钴60等)或抗癌药(如丝裂霉素C，即MMC)或病毒(痘苗病毒)处理的，虽已取得一定疗效，但其不足之处在于单因素处理疗效有限;而且都是采用新鲜或液氮冻存的肿瘤细胞，灭能，要求有专门设备(如放射能)或不易控制(如MMC、病毒)或现用现做，耗能费时，既不方便更难保存。
鉴于上述现有技术中的不足之处本发明的目的在于提供一种疗效高、灭能彻底、使用安全、保存方便、简单易行的肿瘤疫苗的制备方法。
本发明的目的可通过以下措施来实现一种肿瘤疫苗的制备方法，首先要制备单个瘤细胞悬液，即将肿瘤组织制成1mm3的小块，洗涤后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小时，再经摇床震荡30分钟，然后用200目不锈钢网过滤，滤液被离心洗涤之后用氯化铵缓冲液处理，可得到单个瘤细胞悬液，其特征在于细胞水平瘤苗的制备如下
Ⅰ型瘤苗将上述单个瘤细胞悬液与等体积的200～400μg/ml的莪术油或100～200μg/ml的β榄香烯及终浓度为50～100μg/ml的MMC处理60～120分钟，离心洗涤后加入醛类固定剂，再与短小棒状杆菌(CP)混合成为混合瘤苗;或Ⅱ型瘤苗向上述单个瘤细胞悬液加入新城鸡瘟病毒(NDV)按100-1000血凝单位(HU)/3×106-7瘤细胞或者用紫外线灭能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍数(Moi)为10的比例处理，于37℃、5%CO2下温育4小时，离心洗涤后再分别与等体积的200～400μg/ml莪术油或100～200μg/mlβ-榄香烯混合，再于37℃温育30～60分钟，离心后向细胞沉淀加入醛类固定剂并与CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述单个瘤细胞悬液加入新城鸡瘟病毒(NDV)按100～1000血凝单位(HU)/3×106-7瘤细胞或者用紫外线灭能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍数(Moi)为10的比例处理，于37℃、5%CO2下温育4小时，离心洗涤后再分别与等体积的200～400μg/ml莪术油+MMC或100～200μg/mlβ-榄香烯+MMC混合，再于37温育30～60分钟，离心后向细胞沉淀加入醛类固定剂并与CP混合。最好醛类固定剂为0.0125%的戊二醛。
本发明的方法主要是采用抗癌中药莪术及其有效成分β榄香烯直接处理肿瘤细胞制备细胞水平的瘤苗;经过多因素综合处理后用醛类固定剂固定;并与佐剂短小棒状杆菌(CorynebacteriumParvum即CP混合制成混合瘤苗。
一、本发明细胞水平瘤苗的制备方法1.首先制备单个瘤细胞悬液将在无菌条件下手术切除的各种实体瘤患者的新鲜肿瘤标本(包括原发瘤及/或转移瘤)于取材供病理组织学检(复)查后，按常规方法除去包膜、结缔组织及出血坏死肿瘤组织，选取新鲜肿瘤组织剪成1mm3大小碎块，洗涤数次，依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃处理8～16小时，如为胶原含量较多的瘤块则改用0.14%的胶原酶Ⅳ(即COⅡagenaseⅣ)消化。然后将经酶消化的瘤组织用摇床震荡30分钟，之后用200目不锈钢网过滤，将滤液离心洗涤，再用155mM的氯化铵缓冲溶液去除其中的红细胞再混悬即成为单个瘤细胞悬液，如系癌性胸腹水则不必经过酶消化过程，即可直接制备成浓度为3×107～3×108个/ml单个瘤细胞悬液。
2.细胞水平瘤苗的制备它是以抗癌中药莪术油(OleumCurcumaaromatica缩写为OCA)及其有效成分β-榄香烯(βelemene)为主，结合化疗药物如丝裂毒素C(MMC)及/或病毒如痘苗病毒(VacciniaVirus，简写为VV)或新城鸡瘟病毒(Newcastlediseasevirus，简写为NDV)进行复合处理，并用醛类如戊二醛、多聚甲醛、甲醛灭能固定，即可制备出三种复合处理的细胞水平瘤苗，如下表所示。
表1是经复合方法处理制备的瘤苗类型。
瘤苗类型复合处理方法Iβ-榄香烯(或OCA)+MMCII病毒(VV或NDV)+β-榄香烯(或OCA)III病毒(VV或NDV)+β-榄香烯(或OCA)+MMC其中Ⅰ型瘤苗经醛类固定剂灭能固定，并与短小棒状杆菌菌苗(CP死菌苗)混合成混合瘤苗供临床主动免疫治疗之用。余下Ⅱ、Ⅲ型瘤苗均先经过病毒处理，然后再用β-榄香烯或β-榄香烯-MMC处理，最后用醛类固定剂灭能固定，加入CP混合备用。
上表中细胞水平瘤苗的制备工艺过程分两种第一种是不采用病毒处理的工艺如Ⅰ型瘤苗，第二种是先用病毒处理后再用与前述的第一种方法相同的方式处理。其中不采用病毒处理的工艺即直接用药物(中药和西药)处理肿瘤细胞，具体方法是所用的中药有莪术油2%乳剂，或β-榄香烯2%乳剂或β-榄香烯0.2%注射液，先分别用生理盐水稀释，其中莪术油的浓度为200～400μg/ml，β-榄香烯的浓度为100～200μg/ml。然后将它们与等体积的肿瘤细胞悬液混合，于37℃温育30～60分钟，(当用台盼兰排除法测定所处理的肿瘤细胞兰染率达50%左右时)加入西药MMC，使MMC的终浓度为50～100μg/ml，继续处理30～60分钟离心洗涤，然后再加入醛类固定剂如0.0125%的戊二醛或2%的多聚甲醛或10%福尔马林(甲醛)固定液，用这种中西药复合因素处理的瘤苗较用单种药物处理的瘤苗免疫原性强。而且用醛类固定剂固定的瘤苗即可达到灭能、灭菌、防毒(病毒)和长期保存(不必低温冻存)的目的，其安全性及有效性也早已在有关生物制品的免疫学理论和防治实践中获得证明。该Ⅰ型瘤苗在制成后立即(或于临用前)与CP混合成终浓度为3×106～7个瘤细胞/0.5mgCP/ml的混合瘤苗，可使非特异性与特异性主动免疫结合起来，从而进一步提高瘤苗的免疫抗癌效应。制备细胞水平瘤苗的第二种工艺方法是先将肿瘤细胞悬液用病毒处理，其可以是紫外线灭能的痘苗病毒(UV-VV)按感染倍数(Moi)为10的比例，也可以是新城鸡瘟病毒(NDV)按100～1000血凝单位(HU)/3×106～7瘤细胞的比例，于37℃、5%CO2下温育4小时，洗涤后再分别与β榄香烯(或莪术油)(Ⅱ型)或β-榄香烯(或莪术油)+MMC(Ⅲ型)混合，其药物浓度、处理条件及灭能固定、混合CP均与Ⅰ型瘤苗的制备方法相同。
本发明的方法具有如下优点1.方法简单、可靠制备细胞水平肿瘤疫苗比分离提纯TAA要简便、实用、可靠得多。
2.中草药瘤苗为新的抗癌生物学制剂以抗癌中药莪术及其有效成分β-榄香烯制备瘤苗在国内外均属首创。这类以莪术油或β-榄香烯为主要成分的瘤苗比国外通常用放射能(X线、钴60)照射制备瘤苗的主动免疫效果好，且易于普及推广。
3.可长期保存本发明的瘤苗在一般条件下可有效地长期保存，这就为自体瘤苗、异体瘤苗的应用以至“瘤苗库”设想的实现创造了条件。
4.使用安全本发明所制备的瘤苗是绝对灭能、灭菌(包括病毒、支原体)无毒的，使用十分安全，而且副作用也轻(局部、全身反应都轻)易于为患者和临床医护人员接受。
5.免疫效能增强采用中药(莪术油及β-榄香烯)化疗药(MMC)及/或病毒(VV或NDV)复合处理并与CP混合应用，使瘤苗的免疫原性增强。因此本发明瘤苗的使用作为一种辅助疗法将会产生予期的疗效，特别是对于术后控制微小残余瘤、防止转移与复发争取治愈更为理想，即使是对某些晚期肿瘤(包括转移肿瘤)患者也会有一定的疗效-延长生命、减少复发、控制转移、或提高生活质量等。
例1在无菌及0～4℃条件下将手术切除的结肠癌块(包括原发瘤及/或转移瘤)去除包膜、结缔组织、出血坏死组织后，剪成1mm3大小的碎块，置50ml离心管中用适量磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤之后，以1000转/分的速度离心8分钟弃除上清液。向沉淀细胞中加入含0.14%胰酶，0.02%EDTA的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)30毫升置4℃冰箱过液。翌日取出置37℃水浴中摇床震荡30分钟，之后用200目不锈钢网过滤，将滤液以1000转/分离心8分钟，再向沉积的细胞中加入0.03%DNA酶15ml，于37℃水浴摇床震荡30分钟后，以1000转/分离心8分钟，之后向沉淀细胞中加入155mM氯化铵缓冲液10ml，于室温下作用10分钟再加入磷酸盐缓冲液(PBS)30ml，然后再以1000转/分离心8分钟，之后加入磷酸盐(PBS)10ml计数肿瘤细胞数量，用台盼兰拒染法测活瘤细胞百分率大于70%。取上述10ml瘤细胞悬液加入100～200μg/ml的β榄香烯10ml和终浓度为100μg/ml的MMC于37℃温育30～60分钟，然后以1000转/分离心8分钟洗涤2次，向细胞沉淀加入0.0125%之戊二醛，再加入短小棒状杆菌(CP)0.5mg/ml调整细胞数为1×107个/ml即可得到Ⅰ型混合瘤苗。将这些Ⅰ型混合瘤苗封装于2ml的安瓿中1ml/支，(此前检查瘤苗细胞形态、完整性并取材检菌)，最后置于4℃冰箱中避光保存。该制备过程所得的外观为无色半透明混悬液即为结肠癌Ⅰ型混合瘤苗。
例2重复实施例1中制备单个细胞悬液的操作，用RPMI1640培养液(含常规量庆大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)调整肿瘤细胞数至1×107～3×107个/ml移至培养平皿中，然后加入经紫外线灭活的痘苗病毒，相当于1×108～3×108个空斑形成单位(PFU)、感染倍数(Moi)为10，在37℃及5%CO2下温育30分钟且每隔15分钟摇动一次。之后加入人AB型血清使之最终浓度成为5%。然后再在37℃及5%CO2下继续培养3.5小时且每隔30分钟摇动一次，之后以1000转/分离心8分钟，取细胞沉淀向内加入100μg/ml的β-榄香烯10ml，然后在37℃温育30～60分钟，之后以1000转/分离心8分钟，取细胞沉淀向其内加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒状杆菌(CP)，调整细胞数为1×107个/ml，封装入2ml的安瓶中1ml/支。(此前检查瘤苗细胞形态完整性及并取材检菌)，最后置于4℃冰箱避光保存，该制备过程所得的外观为无色半透明混悬液即为结肠癌Ⅱ型痘苗病毒混合瘤苗。
例3重复实施例1中制备单个细胞悬液的操作。用RPMI1640培养液(含常规量庆大霉素、HEPES、NaHCO3、PH＝7.2～7.4)调整细胞浓度至1×107～3×107个/ml移至培养平皿中。然后加入新城鸡瘟病毒1000血凝单位(HU)，在37℃及5%CO2下温育30分钟，每隔10分钟轻轻摇匀一次。之后加入人AB型血清，使之最终浓度成为5%，然后再在37℃及5%CO2继续培养3.5小时，每隔15～30分钟轻轻摇匀一次，之后以1000转/分离心8分钟，取细胞沉淀向内加入100μg/ml的β榄香烯10ml，以下步骤同例2，得到的产物为结肠癌Ⅱ型新城鸡瘟病毒混合瘤苗。
例4重复例2的操作;至以1000转/分离心8分钟，取细胞沉淀向内加入100μg/ml的β榄香烯10ml和100μg/ml的MMC10ml，然后在37℃温育30～60分钟，之后以1000转/分离心8分钟，重复操作2次。取细胞沉淀向其内加入2%多聚甲醛和0.5mg/ml短小棒状杆菌(CP)调整细胞数为1×107/ml，然后用前述例中的方法包装、存放、所得产物即为Ⅲ型痘苗病毒混合瘤苗。
例5重复例3的操作至以1000转/分离心8分钟，取细胞沉淀向内加入100μg/ml的β榄香烯10ml和100μg/mlMMC 10ml，然后在37℃温育30～60分钟，之后以1000转/分离心8分钟，重复操作2次。取细胞沉淀向其内加入0.0125%戊二醛和0.5mg/ml短小棒状杆菌(CP)调整细胞数为1×107/ml，然后用前述例中的方法包装、存放、所得产物即为Ⅲ型新城鸡瘟病毒混合瘤苗。
表2各种瘤苗对L615的免疫保护效应。
处理方法动物数存活率%死亡动物的存活时间(X±SD)天莪术油2070.026.2±15.6**β-榄香烯1478.611.9±2.6MMC1573.443.0±13.7**CP和瘤细胞混合2060.033.0±20.8**戊二醛1040.09.7±0.560Co照射 30 33.3 18.0±13.6*热灭活10010.69±0.5无细胞提取液10010.1±4.2超声波瘤匀浆1009.9±0.5各对照组45010.6±1.5＊＊P＜0.01＊P＜0.05均与对照组比上表显示本发明的莪术、β榄香烯瘤苗及CP和瘤细胞混合瘤苗等均显著优于传统60Co照射瘤苗。
表3单因素和多因素处理的肿瘤细胞(L615)的免疫保护效应比较表处理因素存活率(%)MST±SD(天)β-榄香烯66.713.5±1.5MMC8014.0±0.0戊二醛4214.5±1.3β-榄香烯+戊二醛71.317.5±0.7β-榄香烯+MMC87.515.5±0.7β-榄香烯+MMC+戊二醛88.920.0±4.2对照组09.5±0.6上表显示β榄香烯、MMC、戊二醛复合处理免疫效果更佳。
表4痘苗病毒和β-榄香烯处理瘤苗的免疫保护效应比较表(MH134肝癌)组别存活率(%)死亡动物平均存活时间(天)β-榄香烯瘤苗42.915.5VV+β榄香烯瘤苗85.719对照组017.5
表5本发明方法与现有技术比较表现有技术本发明方法优点瘤单因素处理复合因素处理1)用抗癌中药及其有效苗1)放射线(X线、钴60)1)莪术油或其有效成分成分制备瘤苗均属首创制2)丝裂霉素C(MMC)β-榄香烯+MMC2)莪术油或β-榄香烯瘤备3)病毒(感染的肿瘤细2)病毒(VV或NDV)+苗的保护效应高于经典胞或病毒溶瘤物)β-榄香烯(或OCA)法钴60照射瘤苗,存活4)分离提纯的肿瘤相3)病毒(VV或NDV)+β率分别为70～80%与30关抗原-榄香烯(或OCA)+MMC～40%3)复合处理方法其疗效更优于单因素处理.
瘤液氮冻存活细胞用时采用醛类固定剂既可充分灭能保证安全苗复苏(有时还需经培养又可长期保存保扩增达到一定数量时存才能重新制备瘤苗)使用结核杆菌(BCG)或精短小棒状杆菌(CP)1)CP为死菌苗安全、时所制蛋白衍生物(结核死菌苗在制备瘤苗有效、方便.
用佐菌素PPD)与瘤苗免时同时加入成混合2)本发明将瘤苗制备、剂疫注射时并用瘤苗保存及佐剂使用在一个流程内解决,可在普通条件下长期保存备用.
表6本发明中瘤苗的保存方法与现有技术比较表比较项目本发明方法现有方法基本方法采用醛类固定剂用液氮冷冻达到的效能保证达到灭能(瘤细胞是死是活瘤细胞冻存应用的)灭菌、防毒(病毒)而保时需复苏重新制备瘤苗存其增高的免疫原性(实际上不是瘤苗的保存)操作手续在制备瘤苗的流程中冻存要加二甲基亚砜、一次解决,十分简便人血清白蛋白,最好有专门的液氮冷冻温控仪,保存期要向液氮罐内定期加液氮复苏后还要立即将二甲基亚砜洗去.
费用只需少量固定剂成本要有专门设备、长期十分低廉(<0.1元/支)消耗液氮和冷冻用制剂安全性绝对安全冷冻、复苏及瘤苗制(>50元/支)备过程仍要注意操作的安全性.
可靠性一般置4℃就可保存如液氮冻存一般可保存置-20℃以上的低温冰一年以上,但复苏成箱可长期保存功率不一定是100%.
推广、应用保存运输均极为方便使不便于保存、运输与开发自体瘤苗、异体瘤苗以不易推广、开发至建立"瘤苗库"均可实现.
注本发明中，除特殊标明的之外均为重量百分比。
权利要求
1.一种肿瘤疫苗的制备方法，其先要制备单个瘤细胞悬液，即将肿瘤组织制成1mm3的小块，洗涤后依次用胰酶(0.14%)、DNA酶(0.03%)消化，置4℃8～16小时，再经摇床震荡30分钟，然后用200目不锈钢网过滤，滤液被离心洗涤之后用氯化铵缓冲液处理，可得到单个瘤细胞悬液，其特征在于细胞水平瘤苗的制备如下Ⅰ型瘤苗将上述单个瘤细胞悬液与等体积的200～400μg/ml的莪术油或100～200μg/ml的β-榄香烯及终浓度为50～100μg/ml的MMC处理60～120分钟，离心洗涤后加入醛类固定剂，再与短小棒状杆菌(CP)混合成为混合瘤苗，或Ⅱ型瘤苗向上述单个瘤细胞悬液加入新城鸡瘟病毒(NDV)按100--1000血凝单位(HU)/3×106～7瘤细胞或者用紫外线灭能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍数(Moi)为10的比例处理，于37℃5%CO2下温育4小时，离心洗涤后再分别与等体积的200～400μg/ml莪术油或100～200μg/mlβ-榄香烯混合，再于37℃温育30～60分钟，离心后向细胞沉淀加入醛类固定剂并与CP混合，或Ⅲ型瘤苗向上述单个瘤细胞悬液加入新城鸡瘟病毒(NDV)按100～1000血凝单位(HU)/3×106～7瘤细胞或者用紫外线灭能的痘苗病毒(UV--VV)按感染倍数(Moi)为10的比例处理，于37℃、5%CO2下温育4小时，离心洗涤后再分别与等体积的200～400μg/ml莪术油+MMC或100～200μg/mlβ-榄香烯+MMC混合，再于37温育30～60分钟，离心后向细胞沉淀加入醛类固定剂并与CP混合。
2.根据权利要求1所述的肿瘤疫苗的制备方法，其特征在于醛类固定剂为0.0125%的戊二醛。
全文摘要
一种肿瘤疫苗的制备方法，其先采用常规方法制成单个瘤细胞悬液，将它用β-榄香烯(或莪术油)和MMC处理，然后加入醛类固定剂并与CP混成I型瘤苗。或将单个瘤细胞悬液用病毒处理，其可以是紫外线灭能的痘苗病毒也可以是新城鸡瘟病毒，它们再分别与β-榄香烯(或莪术油)或β-榄香烯(或莪术油)+MMC混合，再加入醛类固定剂并与CP混合分别得到II型和III型瘤苗。本发明的方法制备的肿瘤疫苗灭能彻底、保存方便、疗效高。
文档编号A61K39/00GK1097142SQ93112060
公开日1995年1月11日 申请日期1993年7月5日 优先权日1993年7月5日
发明者钱振超, 王大庆, 刘金友, 魏文汉, 金成刚 申请人:大连医学院