专利名称：重组突变出血败血性巴斯德氏菌蛋白及其制备方法
技术领域：
本发明提供由得自某些出血败血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)基团的DNA顺序编码的新免疫原性蛋白，所述基因编码动物的进行性萎缩性鼻炎(PAR)发病过程中所涉及到的一些毒素。要求保护的蛋白毒性低、稳定性好、易于纯化，因此可用在疫苗中预防动物体由出血败血性巴斯德氏菌毒素(PMT)引起的各种病理作用。
PAR是动物尤其是猪的一种广泛传播的、具有高度传染性的感染性疾病，其中感染是由于鼻骨吸收作用而发生于口鼻部的正常骨结构的，造成口鼻部变形、打喷嚏、流鼻涕和鼻粘膜出血。在养猪业中，这种疾病由于造成生长延迟和对其他感染性疾病的易感性增加而造成巨大经济损失。
PAR的发病与动物的鼻腔内存在不同菌株的革兰氏阴性菌即出血败血性巴斯德氏菌有关，这种细菌产生一种具有溶骨活性的毒性蛋白，这种蛋白含有1285个氨基酸残基，其计算分子量约为146.5kD。
天然出血败血性巴斯德氏菌毒素(PMT)除具有溶骨活性外，还具有其他毒性作用，包括皮肤坏死作用、细胞致病作用及对细胞的促有丝分裂作用(增殖作用)。根据常规的急性毒性测试，例如测量杀死50%实验室小动物所需的剂量(LD50)，得知PMT毒性很高，在小鼠体内的LD50值据报道在10-70ng的范围。
出血败血性巴斯德氏菌毒素具有免疫原性，因此，将该蛋白给予动物会诱发抗体形成，这可以保护动物免受这种毒素生产菌的病理作用。然而，天然毒素由于毒性高而不能作为一种疫苗组分使用。因此，用于对包括猪在内的动物进行抗出血败血性巴斯氏菌感染作用免疫接种的已知疫苗，含有已杀死的出血败血性巴斯德氏菌毒素生产细胞和/或产毒素出血败血性巴斯德氏菌的失活的(去毒的)含毒素提取物作为活性组分。这类失活的疫苗可在市场上买到。这类疫苗中PMT的失活一般是通过热处理或用醛(包括戊二醛和甲醛)处理而实现的，这两种处理都使毒素蛋白变性。
然而，已知对免疫原性蛋白进行热去毒或醛去毒可能会造成免疫原性降低或改变，这是一种不良的副作用，在很大程度上可能是由于蛋白质结构发生了不可预测的修饰作用，包括一个或若干个抗原决定基的构象修饰。值得注意的是，PMT的这类结构修饰作用会使具有其他特异性的抗体的产生受到优先刺激，并有可能造成对蛋白水解降解作用的敏感程度增加。此外，PMT的醛去毒过程造成一般约为1%的残留毒性。
因此，曾试图得到以去毒PMT为主要成分但却未经上述传统去毒处理的疫苗。WO89/09617公开了用重组方法去毒但仍具有免疫原性的PMT衍生物。这些PMT衍生物的大致制备方法是分离PMT编码基团，通过用限制酶处理DNA而缺失该基因的一个较大片段，将如此截短的基因插入合适的宿主细胞中，并使该基因表达出截短形式的天然PMT。已产生了分子量在53-136kD范围的一些PMT衍生物，这些衍生物的毒性降低，同时又保留了大部分免疫原性。一般来说，这种截短蛋白所含有的氨基酸残基比天然PMT少50-500个。该文献中所公开的一个优选的PMT衍生物是衍生物O。
疫苗中合适免疫原性组分的一个重要特征是对一级、二级和/或三级结构的降解稳定。免疫原的降解可能是由化学和/或酶促水解作用产生的，也可能是由疫苗制备或贮存过程中存在的物理或化学因子产生的，这种降解会影响一级、二级和/或三级结构，使该组分的免疫原性降低，或迅速改变或逐渐改变。
上述降解作用除了对打算用作疫苗的蛋白的免疫原性有不利影响外，在工业上可能也是不希望有的，因为如果疫苗组合物中所含的免疫原已发生过降解，则该组合物中所含的蛋白分子缺少均一性。这种分子均一性的缺乏使人们很难得到标准化的疫苗组合物。
低成本出血败血性巴斯德氏菌疫苗生产中的另一个主要要求是，免疫原性组分要易于从产生该组分的细胞培养物中纯化。特别理想的是，该组分能够用简单的一步纯化法，如常规的阴离子交换色谱步骤，以基本纯净的形式分离出来。
现已发现，通过对PMT编码DNA顺序，如toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素的toxA基因，进行定位(位点特异性)诱变，能够得到具有高度免疫原性的低毒性PMT毒素相关蛋白，这些蛋白与用重组法去毒的已知PMT衍生物相比，更能耐受降解作用，更易于以工业规模纯化。
因此，本发明的一个方面涉及一种至少部分地由一个DNA顺序编码的重组突变蛋白，该DNA顺序可以由toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种(Pasteurella multocida sspmultocida)45/78毒素的toxA基因，通过一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到，所述蛋白能够与针对由出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78编码的PMT而产生的抗体结合，该蛋白的计算分子量至少为140kD。
本发明的另一方面提供一种制备重组突变蛋白的方法，该蛋白能够与针对出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素而产生的抗体结合，其分子量至少为140kD，所述方法包括如下步骤(ⅰ)分离出DNA顺序(a)或(b)，顺序(a)包含编码出血败血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)的toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78 PMT的toxA基因;顺序(b)所含顺序的基因产物能够与针对出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78PMT而产生的抗体发生反应;
(ⅱ)对所述DNA顺序进行诱变处理，造成一个或更多个密码子的置换、缺失或插入，得到编码重组突变蛋白的突变DNA顺序;
(ⅲ)将所得的突变DNA顺序插入到一个复制子中;
(ⅳ)用该复制子转化一种细胞，在该细胞中，所述复制子能够复制，编码重组突变蛋白的突变DNA顺序能够表达;
(ⅴ)在表达突变DNA顺序的条件下培养转化细胞;
(ⅵ)从培养物中收集重组突变蛋白。
本发明的又一方面涉及一个DNA顺序，该顺序包含一个编码分子量至少为140kD的蛋白的基因，所述蛋白能够与一种抗体反应，而该抗体能与由toxA基因编码的出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)反应，所述DNA顺序是由含有toxA基因的复制子通过以下方法得到的使所述toxA基因的一个或更多个密码子发生置换、缺失或插入，或使截短或突变的toxA基因与另一基因码内融合，从而导致本文所限定的融合蛋白基因产物的表达。
本发明的再一方面提供一种携有如上所限定的DNA顺序的复制子以及用这样一种复制子转化的细胞，在该细胞中所述复制子能够复制。
本发明的一个重要方面涉及本文所限定的突变重组蛋白作为预防出血败血性巴斯德氏菌感染的疫苗的应用。
出血败血性巴斯德氏菌毒素(PMT)基因的完整核苷酸顺序已由WO89/09617(同上)和Petersen(Molecular Microbiology，4821-830，1990)公开。已证明这个命名为toxA基因的毒素编码基因是染色体基因，位于一个大于20kb的DNA片段(区段)上，并且是出血败血性巴斯德氏菌的毒素生产株所独有的。包含整个毒素编码区和天然启动子的4381bp出血败血性巴斯德氏菌DNA的核苷酸顺序示于Petersen文献(同上)的图2中，此顺序将以登记号X51512出现在EMBL/Gen Bank/DDBJ Nucleotide Sequence Databases中。
天然toxA基因编码1285个氨基酸的PMT蛋白，该蛋白的计算分子量为146，553道尔顿，与该蛋白的表观分子量(143kD)一致。
如上所述，toxA基因存在于出血败血性巴斯德氏菌的毒素生产株中，因此，本发明提供由一个DNA顺序编码的重组突变蛋白，该DNA可由上述toxA基因，包括从出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78中分离出的toxA基因得到。在下文中，用缩写“rmPMT”来表示本文所限定的重组突变PMT蛋白。
rmPMT编码DNA顺序可以由天然染色体toxA基因得到，也可以由含有该基因的另一个复制子如重组质粒得到。这类可以在编码rmPMT的DNA顺序的构建过程中作为起始物使用的质粒包括例如如
图1所示的pSPE312、pSPE680和pSPE1003。大小约为7kb的pSPE1003质粒有一个独特的EcoRI限制位点，它有利于rmPMT编码DNA顺序的构建，其中在该独特限制位点的下游通过一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而进行相对于天然PMT编码顺序的修饰。
因此，本发明的一个优选实施方案提供由一个DNA顺序编码的rmPMT，该DNA顺序可由toxA基因通过以下方法得到在所述基因的独特EcoRI限制位点的下游进行一个或更多个密码子的置换、缺失或插入，或者使截短或突变的toxA基因与第二个编码免疫原性蛋白的基因码内融合，从而导致本文所限定的融合蛋白基因产物的表达。
WO89/09617中已公开了可以分离出一些截短的PMT衍生物，这些衍生物的计算分子量在53-139.337kD范围内，并保留了在动物体内诱发预防出血败血性巴斯德氏菌相关疾病(包括进行性萎缩性鼻炎)的免疫应答的能力，但据预计，通过在这里引入计算分子量接近天然PMT(如至少140kD)的免疫原性非变性PMT相关物质，可以生产出在免疫原性、稳定性和纯化容易程度方面更具优点的疫苗。
据此，本发明的一个优选实施方案提供一种计算分子量至少为141kD的rmPMT。分子量至少为142kD的rmPMT可能更为优选，例如计算分子量至少为143kD(例如至少为144kD)的rmPMT，特别是至少为145kD的rmPMT。
本发明所提供的重组突变蛋白的一个重要特征是，这些蛋白容易从它们存在于其中的悬浮液中回收和/或纯化。这类悬浮液包括已在基因表达条件下培养了含有编码蛋白的toxA衍生基因的宿主细胞的培养基，以及已表达了这种toxA衍生基因的宿主细胞的提取液。
在本文本中，术语“容易”的含义是能够用廉价的常规工业纯化方法，优选用能够得到基本不含基本为非降解形式的非rmPMT蛋白或任何不需要的非蛋白物质的一步纯化法，回收和/或纯化出存在于悬浮液中的、有商业意义比例(例如至少50%)的rmPMT。但是，优选可回收更高比例的存在于悬浮液中的rmPMT，例如至少75%，更优选的是至少90%。因此，可以选择能以高回收率得到如上所限定的基本纯净rmPMT制备物的任何合适的低成本常规纯化方法。
特别重要的是，所选择的纯化方法应使得到的rmPMT制备物基本上不含有蛋白水解活性的酶类，例如来源于表达rmPMT编码基因的宿主细胞的酶类。如果这类酶存在于制备物中，则易受酶降解的rmPMT分子可能会发生酶促降解;这意味着该制备物可能是不稳定的，也就是说，原来表达出的蛋白分子将会随时间推移而逐渐降解，这可能会导致rmPMT的免疫原性降低或改变，如果这种rmPMT存在于疫苗组合物中则会导致疫苗标准化程度不足。
最好是，由所选的纯化方法得到的rmPMT制备物在低于10℃的温度下贮存时，在至少3个月的时间内对降解稳定，并使宿主细胞中表达的rmPMT分子保留至少90%。较为优选的是保留至少95%的分子，更为优选的是至少97%，特别是至少99%。
在本发明的优选实施方案中，rmPMT至少80%可纯化。在本文本中，术语“可纯化”用来表示用给定的纯化方法有可能得到含所指出比例rmPMT的rmPMT制备物，这一比例是按该纯化方法所得的制备物中蛋白质的总含量来计算的。按照上述rmPMT纯化容易程度的定义，优选的蛋白是至少90%(例如至少94%)可纯化的蛋白，更为优选的是至少95%可纯化。
作为可以达到所需rmPMT纯度的合适纯化方法的实例，可以使用以下纯化方法，该方法包括用Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)在2cm2×25cm色谱柱中进行阴离子交换色谱，在该柱中加入约200mg总细菌蛋白，该蛋白为表达该蛋白的细菌的提取物形式，流速为约30cm/小时，用含0-1000mM NaCl的缓冲液线性梯度洗脱吸附的蛋白，必要时接着用Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱对洗脱出的各组分进行疏水性相互作用色谱，洗脱吸附的蛋白，并测定其含量，所述色谱柱的线度为2cm2×20cm，流速为30cm/小时。
如上所述，天然PMT包含1285个氨基酸。在一个有用的实施方案中，本发明提供如本文所限定的rmPMT，编码该蛋白的DNA顺序是由toxA基因通过用编码不同氨基酸的密码子置换至少一个编码某个氨基酸的密码子，或者通过缺失或插入至少一个密码子而得到的。在本文中，术语“置换密码子”可表示天然toxA基因中所存在的密码子中1个、2个或所有3个碱基的交换。还应理解，本文所用的术语“密码子”可以是不止一个特定的核苷酸三联体，只要该三联体编码同一氨基酸就可以。
按照本发明，密码子的置换可以在能得到本文所限定的rmPMT的任何氨基酸位置上进行。在本文本中，术语“氨基酸位置”应理解为相应于特定氨基酸位置的密码子。在下文中，术语“氨基酸”有时也用于表示常用术语“氨基酸残基”。在本发明的某些优选实施方案中，密码子置换在编码该蛋白的基因的3′端进行，导致1131-1285位之间的某个或某些氨基酸位置发生改变，例如在1175-1285位之间的位置，如1200-1230位之间的位置。
为使所得重组突变PMT的毒性充分降低，最好置换toxA基因的两个或更多个密码子。在可用的实施方案中，至少置换3个密码子，例如4个密码子。应该理解，如上所限定的包含两个或更多个密码子的置换可能暗含了rmPMT中同一氨基酸在两个或更多个位置上的置换，或若干不同氨基酸残基的置换。另外，多个氨基酸置换可以是一个连续氨基酸区段的形式，也可以是若干空间上分散置换的形式。
除了得到低毒性rmPMT之外，toxA基因中密码子的多重置换可得到一种更为安全的免疫原性PMT相关蛋白，因为使突变回复到野生型毒性蛋白的概率随着置换数目的增加而呈指数降低。
在下文中，由密码子置换得到的rmPMT用包含被置换氨基酸残基和置换氨基酸的单字母代码的一种或若干种标示方法来表示，也用已发生置换的氨基酸位置的标示方法来表示。例如，记作SV1201的蛋白是指1201位的丝氨酸残基被缬氨酸残基置换的rmPMT，rmPMT记作HL1202HY1205HY1223HY1228则用来表示重组突变PMT中野生型PMT中存在的组氨酸残基在1202位被亮氨酸残基置换，在1205、1223和1228位被酪氨酸残基置换(在下文中，HL1202HY1205HY1223HY1228 rmPMT也写作4HX)。
按照本发明，rmPMT可以包含能导致本文所限定的rmPMT的、相对于天然PMT的任何氨基酸残基置换。例如，有用的rmPMT可以如下得到，即，置换编码选自丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的氨基酸的密码子。置换氨基酸可以是能导致如本文所限定的rmPMT的任何氨基酸，如缬氨酸、亮氨酸或酪氨酸。
重组突变PMT除了可以由上述氨基酸置换法得到外，也可以按照本发明由一个DNA顺序编码，该DNA顺序由编码PMT的toxA基因通过缺失至少一个编码某个氨基酸的密码子而得到。密码子的缺失可以在能导致本文所限定的rmPMT的任何氨基酸位置上进行。
然而，在本发明的某些优选实施方案中，密码子的缺失在编码天然PMT蛋白的toxA基因的3′端进行，例如1131-1285位之间的氨基酸残基，如1175-1285位之间，如1215-1285位之间。
毒性充分降低的rmPMT虽然可以通过缺失一个密码子(如本文所限定的rmPMT △H1223)而得到，但最好使两个或更多个密码子缺失，以进一步降低rmPMT的毒性。在有用的优选实施方案中，缺失至少3个密码子，例如至少4个密码子。更为优选的是使用相对于天然PMT缺失至少7个氨基酸的rmPMT。除了得到低毒性rmPMT外，toxA基因中碱基对的多重缺失可得到更为安全的免疫原性PMT相关蛋白，因为使突变回复到野生型毒素编码基因的概率随碱基对缺失数目的增加而呈指数下降。
在下文中，由密码子缺失得到的rmPMT用符号“△”后接天然PMT中已缺失了氨基酸的氨基酸位置来表示。例如，记作△1215-1221的蛋白质表示由一个由toxA得到的基因编码的rmPMT，该基因中缺失了编码天然toxA基因产物的1215-1221位(包括两头)氨基酸的密码子。
本发明的rmPMT可包含能导致本文所限定的rmPMT的、相对于天然PMT的任何氨基酸缺失。例如，有用的rmPMT可以通过从toxA基因中缺失编码某个氨基酸的密码子而得到，所述氨基酸选自组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸。应该理解，如上所限定的包含两个或更多个密码子的缺失，可能暗含了rmPMT中同一氨基酸在两个或更多个位置的缺失，或者若干不同氨基酸的缺失。另外，多重氨基酸缺失可以是一个连续氨基酸区段的形式，也可以是若干空间上分散缺失的形式。
重组突变PMT除了可以通过如上所述的氨基酸置换或缺失得到外，也可按照本发明由一个DNA顺序编码，该DNA顺序由编码PMT的toxA基因通过插入至少一个编码氨基酸残基的密码子而得到。密码子的插入可以在相应于能得到本文限定的rmPMT的任何氨基酸位置的任何密码子的下游进行。
然而，在本发明的某些优选实施方案中，密码子的缺失在toxA基因的3′端进行，例如1131-1285位之间的氨基酸位置的下游，如1175-1285位之间的位置的下游，如1200-1230位之间的位置的下游。
为得到毒性充分降低的rmPMT，最好相对于天然PMT编码基因插入2个或更多个密码子。在本发明的有用实施方案中，插入至少3个密码子，例如4个密码子。toxA基因中密码子的多重插入除了可得到低毒性rmPMT外，还可得到更为安全的免疫原性PMT相关蛋白，因为据认为使突变回复到野生型毒性蛋白的概率随插入碱基对数目的增加而呈指数下降。
在下文中，由密码子插入得到的rmPMT的表示方法是符号“+”后接由插入密码子编码的氨基酸残基的单字母代码、以及天然PMT中紧接其上游插入了氨基酸的位置。例如，记作+G1203的蛋白表示由一个得自toxA的基因编码的rmPMT，其中紧靠编码天然PMT 1203位氨基酸的密码子的上游已插入了一个编码甘氨酸的密码子;记作+GG1203的rmPMT表示由得自toxA的基因编码的重组突变PMT，其中紧靠编码天然PMT1203位氨基酸的密码子的上游已插入了两个编码甘氨酸的密码子。
根据本发明，rmPMT可以包含能导致如上所限定的rmPMT的、相对于天然PMT的任何氨基酸插入。应该理解，如上所限定的包含2个或更多个密码子的插入，可能暗含了rmPMT中相同氨基酸在两个或更多个位置的插入，或者两个或更多个不同氨基酸的插入。另外，多重氨基酸插入可以是相邻插入的形式，也可以是多重空间分散插入的形式。
在重要的实施方案中，本发明涉及一种如本文所限定的蛋白，该蛋白是由一个DNA顺序编码的融合蛋白，所述DNA顺序包含一个第一基因和一个第二基因，第一基因编码一种能与一种抗体反应的免疫原性蛋白，所述抗体则能与由toxA基因编码的出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)反应，所述基因是由包含toxA基因的复制子通过所述toxA基因的一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到的;第二基因编码第二免疫原性蛋白，第一和第二蛋白可作为融合蛋白表达。融合可以在第二基因的任何位置进行，导致基氨基末端或羧基末端与得自toxA的第一基因融合。
融合蛋白所包含的第二免疫原性蛋白可以是由病原生物固有表达的蛋白，也可以是这种固有表达蛋白的免疫原性片段或衍生物。这种融合蛋白作为多用途疫苗是很有用的，因为这些疫苗在给予人或动物(如哺乳动物、鸟类动物或鱼类动物)后所产生的防护作用，不仅针对由产毒素的出血败血性巴斯德氏菌所引起的疾病，而且也针对由编码第二免疫原性蛋白的基因原来所在的病原生物所引起的疾病。据认为，本发明的融合蛋白可包含其他免疫原性蛋白。编码第二免疫原性蛋白的基因可以从任何病原性病毒、细菌、原生动物、真菌、酵母或寄生生物中分离。在这方面，得自猪病原体的基因特别令人感兴趣。
按照本发明，如上所限定的融合蛋白所包含的第一免疫原性蛋白可以是分子量小于139.337kD的蛋白，在其他有用的实施方案中也可以是计算分子量至少为139.338kD的蛋白，例如至少140kD或至少143kD。本发明融合蛋白的一个实例是含有β-半乳糖苷酶作为第二免疫原性蛋白的融合蛋白1132″β-gal。这种融合蛋白是由下文中所述的质粒pSPE1134表达的，其计算分子量为约245kD。
业已发现，分子量低于140kD(如约126kD或更低)的免疫原性PMT相关蛋白，在贮存过程中可能不稳定，有可能造成免疫原性丧失，或者不能纯化到如本文所限定的对本发明蛋白所要求的程度。发现融合蛋白的纯度比低分子量蛋白本身要好。
如前面已提到的，天然PMT的毒性很高，以至于不能在疫苗组合中作为免疫原使用，另外，其显著的促有丝分裂作用将要求在生产过程中采取严格的环保措施。但是，本发明所提供的高度免疫原性toxA相关rmPMT相对于天然PMT蛋白来说毒性降低，因此允许在预防出血败血性巴斯德氏菌感染的疫苗中直接作为活性成分使用。
本文所用的术语“毒性”可以描述对活生物体的任何可检测的不利作用，所述活生物体包括原核和真核细胞培养物，也包括活动物(包括实验动物和家畜)。因此，PMT和PMT相关分子的毒性可如下测定使上述细胞和动物与不同数量的分子接触，并测定其不利作用，以获得毒性的定量量度。有关rmPMT的相对毒性可以如下来计算在毒性试验中引入确定量的任选在另一种非出血败血性巴斯德氏菌生物中表达的天然PMT作为参比毒性物质，并将其不利作用与本文所限定的给定rmPMT的量相比较，得到等效作用值。
可以应用任何合适的常规毒性试验来验证本文所限定的rmPMT的毒性作用的降低。这样一种合适而方便的方法是测定促有丝分裂效力，这是用对哺乳动物细胞培养物(包括作为实例的NIH或Swiss 3T3成纤维细胞培养物)的增殖作用来测定的，这将在下面的实施例中详细叙述。
本发明的一个有用的实施方案提供了一种促有丝分裂效力至多为75%的rmPMT，这一效力是通过测定该蛋白对NIH 3T3细胞的增殖作用而确定的，所述测定包括第一步，根据含rPMT悬浮液的连续稀释液的PE测定结果制作标准曲线，并按下式计算PEPEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx为装有样品稀释液x的三个培养皿中的平均细胞数，Npmt为装有大肠杆菌SPE1036(携有编码rPMT的pSPE680)全细胞提取液的三个培养皿中的平均细胞数，所述提取液含有终浓度为20ng/ml的rPMT，No为装有大肠杆菌DH5α全细胞提取液的三个培养皿中的平均细胞数，所述培养皿装有NIH 3T3细胞的汇合单层;第二步，测定浓度在1-1000ng/ml范围的蛋白悬浮液的PE，并利用所述标准曲线(参见图2-4)计算相对rmPMT浓度(与rPMT浓度比较)，得出某一PE值。
在本发明的优选实施方案中，如上所限定的促有丝分裂效力相对于天然PMT至多为50%，更为优选的是至多35%，更为优选的是至多25%，最优选的是至多10%，例如至多5%。在一些优越的实施方案中，促有丝分裂效力优选低至相对于天然PMT至多为2%，例如至多为1%，甚至至多为0.1%。
测定某种物质毒性作用的另一个常规方法是在动物(如体重约20g的小鼠)体内测定如上所限定的LD50值。如上所述，腹膜内给予体重约20g的小鼠数量递增的毒素，并记录存活动物的数目，由此测得天然PMT的LD50值在10-70ng范围内。
为使如上所限定的rmPMT用作安全的疫苗成分，其LD50值优选比LD50值为10ng的天然PMT或rPMT降低至少100倍，更为优选的是至少500倍，更为优选的是至少1000倍，最优选的至少1500倍，特别是至少2000倍，天然PMT或rPMT的LD50值是通过腹膜内给予小鼠蛋白而测定的，这意味着本发明特别有用的rmPMT是用同样方法测定时LD50至少50μg(例如至少51.2μg)的rmPMT。据认为，本发明甚至有可能制备出如上所限定的LD50值降低至少10，000倍或至少100，000倍的rmPMT。
如本文所限定的rmPMT，在用于预防动物(特别是猪)由天然出血败血性巴斯德氏菌毒素引起的上述毒性作用的疫苗组合物中，可以作为活性免疫原性组分使用。但是，发现小鼠的免疫接种构成了测试PMT相关蛋白免疫原性的有用模型系统(Petersen等，Infect.Immun.，59∶1387-1393，1991)。因此，可以应用这样一种模型系统作为鉴定适用于疫苗组合物的重组突变PMT蛋白的筛选系统。使用经过修改的这一系统来测试本发明rmPMT的免疫原性，在这一修改的系统中用CF1×BALB/c小鼠代替自交BALB/c小鼠。
因此，本发明的一个有用的实施方案提供一种如本文所限定的蛋白，该蛋白如果以含有至少1.0μg/ml吸收在氧化铝凝胶上的蛋白的疫苗制备物形式以两周的间隔给予小鼠两次，则能保护至少80%的小鼠不受在第二次给予疫苗两周后腹膜内注射的100ngrPMT的致死作用。本文所限定的rmPMT在以含有5.0μg/ml吸收蛋白的上述疫苗制备物形式给予时，应优选保护100%的小鼠。
所构建的rmPMT蛋白的一个实例是有4个氨基酸置换并称为HL1202HY1205HY1223HY1228(下文中也称为4HX)的蛋白。进行毒性测试时，这种重组突变蛋白的如上所限定的LD50值为至少102.4μg，并具有如上所限定的免疫原性作用。该蛋白由质粒pSPE1038编码，该质粒已于1992年9月1日保藏在DSM(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH)，保藏号为DSM 7221，保藏形式为用上述质粒转化的大肠杆菌DH5α菌株SPE1038的培养物。
rmPMT的其他实例包括由pSPE1234编码的△H1223、由pSPE1020编码的+GG1203和由pSPE1134编码的1132″β-gal。pSPE1234、pSPE1020和pSPE1134已于1993年9月9日保藏在DSM，保藏号分别为DSM8547、DSM8548和DSM8546，除pSPE1134是以大肠杆菌K12菌株MC1000的形式保藏外，其余质粒的保藏形式均为用这些质粒转化的大肠杆菌DH5α的培养物。
如上所述，本发明的另一方面涉及制备如上所限定的免疫原性重组突变PMT蛋白的方法，所述蛋白能够与针对出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)而产生的抗体结合，其分子量至少为140kD。在某些优选实施方案中，rmPMT可以是分子量至少为141kD(例如至少为143kD)的蛋白。
所述方法的第一步包括分离一个DNA顺序，该DNA顺序包含一个toxA基因，该基因编码能与抗PMT抗体反应的出血败血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)，例如出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78PMT，或其功能等价物。该toxA基因的鉴定和分离可以方便地如Petersen(1990，同上)所述进行。该基因可以从公认的产毒素出血败血性巴斯德氏菌菌株(如从感染动物体内分离出的菌株)的染色体中分离。该基因也可以从携有含该基因的DNA顺序的质粒中分离，例如从选自pSPE308、pSPE312、pSPE481、pSPE525、pSPE680、pSPE716(Petersen，1990，同上)或pSPE1003(图1)的质粒中分离，也可用常规聚合酶链反应法构建，或者合成。
按照本发明，上述方法的第二步包括对分离出的PMT编码基因进行诱变处理，任选包括更多个诱变步骤，从而引起一个或更多个密码子的置换、缺失或插入。一个特别合适的诱变方法是定位突变或位点特异性突变，例如利用如Nelson等人(Analytical Biochemistry 180∶147-151，1989)和下面的实例1所述的经过修改的水生嗜热菌聚合酶链反应(PCR)法。这里所用的方法涉及使用四种引物，其中一种是突变特异性的，另外三种则是为使突变DNA能进行特异性扩增而设计的。这种方法的独特之处是两个相关的寡聚脱氧核糖核苷酸引物(ⅰ)一个杂种引物，由一个与所要扩增的DNA区互补的3′片段和一个其顺序与任一靶DNA链都不互补的5′片段组成;(ⅱ)一个与上述杂种引物的5′片段相同的寡核苷酸引物。用于定位诱变的寡核苷酸引物示于下文实施例1中的表Ⅰ。
因此，在一个优选实施方案中，所述方法的第二步包括对所分离出的DNA顺序进行定位诱变或位点特异性诱变处理，包括如下步骤构建能够与步骤(ⅰ)中分离出的DNA顺序杂交的突变特异性引物顺序;用聚合酶链反应(PCR)法使含所述引物顺序的DNA片段扩增；然后用所述扩增出的DNA片段或其一部分置换所分离的DNA顺序中的一个片段。
通过选择适当的引物顺序，可以指导位点特异性诱变得到得自toxA基因的重组突变PMT编码顺序，在该基因中，分别通过置换改变、缺失或插入了一个或更多个预先选择的特异性密码子。举一个典型的例子，可以选择诱变策略，从而导致toxA基因的某个限制位点(如独特EcoRI限制位点)下游的一个或更多个密码子发生置换、缺失或插入。
在一个具体实施方案中，该方法步骤(ⅱ)的诱变处理引起至少一个编码1131-1285位之间某个氨基酸的密码子被一个编码不同氨基酸的密码子置换。在本发明的一个具体的有用实施方案中，诱变处理引起toxA基因的至少一个编码1175-1285位间(如1200-1230位间)某个氨基酸的密码子的置换。
因此，通过选择步骤(ⅱ)中的诱变处理，从而使所分离的PMT编码基因的至少一步诱变引起至少2个密码子(如至少3个密码子)的置换，可以得到有用的rmPMT。采用步骤(ⅱ)的诱变处理导致至少4个密码子的置换，也可以得到有用蛋白。利用如上限定的命名法，通过一个或更多个密码子的置换产生的toxA基因位点特异性突变的典型实例包括SV1201、HL1202、QL1203、HY1205、TV1206、TV1207、HY1223、HY1228、HL1202HY1205、HY1202HY1223、HL1202HY1228、HY1205HY1223、HY1205HY1228、HY1223HY1228和4HX(HL1202HY1205HY1223HY1228)。
所要置换的密码子的选择可以根据个别氨基酸的已知特性来进行，例如其疏水/亲水特性或其电荷。选择用具有特别有用的物理特性的氨基酸置换一个或更多个氨基酸，会使由这种突变DNA顺序编码的rmPMT在下游过程中变得特别容易纯化和回收。对一个或更多个密码子的置换来说，一个更重要的选择标准是由特异性氨基酸置换所致的上述rmPMT毒性降低的程度，以及被置换氨基酸与置换氨基酸之间的结构相似性。
举一个有用的实例，被置换的密码子可以是编码选自丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的氨基酸的密码子，而置换密码子则可以是编码选自缬氨酸、亮氨酸或酪氨酸的氨基酸的密码子。据认为，用疏水性氨基酸置换亲水性氨基酸，可以得到有用的rmPMT。
在另一个有用的实施方案中，步骤(ⅱ)的诱变处理可以加以选择，从而使至少一个编码1131-1285位间某个氨基酸的密码子缺失。这种缺失优选涉及至少一个编码1175-1285位间某个氨基酸的密码子，例如缺失至少一个编码1215-1285位间某个氨基酸的密码子。
按照本发明，选择本文所限定方法中步骤(ⅱ)的诱变处理，引起至少2个密码子(例如至少3个密码子)缺失，可以根据与上述相同的选择标准得到有用的rmPMT。利用步骤(ⅱ)的诱变处理导致至少4个密码子(例如至少7个密码子)缺失，也可以得到有用的rmPMT蛋白。在本发明的优选实施方案中，缺失的密码子是编码选自组氨酸、赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密码子。通过缺失编码PMT的toxA基因的一个或更多个氨基酸而得到的有用rmPMT的实例包括△H1223和△1215-1221，参见前面定义的命名法。
在旨在通过一个或更多个密码子的缺失获得rmPMT的实验过程中发现，在构建位点特异性缺失突变体DNA顺序的过程中，可能会发生与密码子的直接缺失有同样作用的移码。例如，表Ⅱ中称为△1257-1285的rmPMT，由于toxA基因的3986号胸苷残基(即编码1256号氨基酸残基的密码子中的第三个碱基)缺失，造成1256位氨基酸之后有11个氨基酸残基的码外(out-of-frame)延伸。
在本发明的另一个有用的实施方案中，步骤(ⅱ)的诱变处理引起在编码1131-1285位之间某个氨基酸的密码子的下游插入至少一个密码子，密码子的插入优选发生在编码1175-1285位间某个氨基酸的密码子的下游，例如编码1200-1230位间某个氨基酸的密码子的下游。
由一个或更多个密码子的插入得到的rmPMT一般可包含至少2个密码子(如至少3个密码子)的插入，更为优选的是可包含至少4个密码子的插入。所插入的密码子最好是编码甘氨酸的密码子。这类有用rmPMT的实例包括+G1203和+GG1203。
如前面也已提到的，本发明方法的步骤(ⅲ)包括使由步骤(ⅱ)得到的突变DNA顺序插入合适的复制子中，复制子的有用实例包括原核和真核细胞染色体、质粒、线粒体、病毒和叶绿体，插入利用标准重组方法进行。
在这方面，质粒可能是方便的复制子。合适质粒的选择可以受公知原则的指导，这些原则包括质粒在大范围的宿主生物中复制的能力，或者在宿主细胞中以高拷贝数存在的能力。一种特别有用类型的质粒可能是显示“逃跑”(runaway)复制行为的质粒。可用于本发明的质粒的实例包括选自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003、pSPE1020、pSPE1038、pSPE1134和pSPE1234的质粒。
在本文所限定方法的后续步骤(ⅳ)中，用该方法步骤(ⅲ)得到的复制子转化一种细胞，在该细胞中，复制子能够复制，含上述突变toxA基因的DNA顺序能够表达。允许复制子复制和编码rmPMT的突变基因表达的合适宿主细胞，可以从包括细菌在内的原核细胞中选择，也可以从包括酵母、真菌、哺乳动物细胞(如人细胞培养物)和植物细胞在内的真核细胞中选择。在这方面，方便的宿主细胞可从革兰氏阳性细菌属中选择，例如芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属、乳球菌属、乳杆菌属，也可从革兰氏阴性菌中选择，包括选自肠杆菌科的物种(其实例包括大肠杆菌)，以及选自假单胞菌科和弧菌科的物种。
为制备rmPMT，在能使突变toxA基因表达的条件下培养转化细胞，并从培养物中收集重组突变蛋白。培养条件如培养基组成、培养温度、通气和批量大小的选择，取决于所选择的宿主细胞对培养条件的具体要求，以及调控toxA基因表达的DNA顺序的本质。
转化细胞可以是在表达突变toxA基因时向培养基内分泌rmPMT蛋白的转化细胞，在这种情况下，可以通过直接从培养基中回收来收集蛋白，并任选用离心或过滤法除去细胞后收集。从培养基中回收蛋白质可以用任何常规蛋白回收方法进行。另外，宿主细胞也可以是那些所表达出的rmPMT在周质或细胞内累积的宿主细胞。使用这类宿主细胞时，rmPMT收集步骤包括进行某种处理而使细胞破碎到使累积的rmPMT蛋白从细胞中释放的程度。这样一种处理可以选自机械的或化学的细胞解体处理、渗透压处理或用细胞壁和/或细胞膜降解酶处理。
在本发明方法的一个方便的实施方案中，收集rmPMT的步骤包括从培养基中分出细胞，对分出的细胞进行超声处理，并除去细胞碎片。以这种方式得到含蛋白的细胞粗提液。但是，这样一种细胞粗提液将含有污染性的天然细菌蛋白和所表达的rmPMT的混合物。应该理解，这样一种rmPMT粗制备物不太适于直接作为疫苗成分使用。因此，本方法优选包括细胞粗提液的纯化作为进一步的步骤。
按照本发明，合适的具体蛋白纯化方法可以包括能使所要纯化的蛋白与污染蛋白(优选还有其他物质)分开的任何选择性蛋白纯化方法。这类公知方法的例子可以提到亲和色谱法，在该方法中使特异性蛋白与能与蛋白选择性结合的物质结合。这种物质可以是单克隆或多克隆抗体，或者合适的聚合物，包括Sepharose。亲和色谱中的结合力，可以是氢键形成、疏水性相互作用、共价键形成或抗原抗体复合物形成过程中所涉及到的力。在一个优选实施方案中，rmPMT的纯化包括阴离子交换色谱，包括下文中所例举的方法。这种色谱法通常要涉及使用洗脱剂，一般是溶于缓冲液中的盐，如NaCl。
在本发明的合适实施方案中，如上所限定的方法是一种阴离子交换色谱和一种疏水性相互作用色谱，前者包括用NaCl浓度从0递增至1000mM的缓冲液进行洗脱的步骤，后者则可以包括用硫酸铵浓度递减的缓冲液进行洗脱的步骤。一般要分析这些离子强度递增或递减的流出液中相对于蛋白总含量的rmPMT含量(即rmPMT的纯度)，据此，可以选择能得到最高rmPMT含量的洗脱剂离子强度。使用本文所例举的阴离子交换色谱法时，在约700mM NaCl时收集的流出液达到最高纯度。
纯化过程优选以一步进行，例如包括一个合适洗脱步骤的阴离子交换色谱。要得到纯度特别高的重组突变PMT蛋白时，可能需要使用两种或更多种纯化方法，这些纯化方法选自阴离子交换色谱、疏水性相互作用色谱和抗体亲和色谱。因此，合适的纯化步骤可以包括包括上述洗脱步骤在内的初始阴离子交换色谱，其后再进行对来自前一步骤且含有高浓度rmPMT的流出液进行疏水性相互作用色谱的步骤。
如上所述，希望获得高纯度的rmPMT制备物。据此，优选获得按总蛋白计算纯度至少为50%(重量)的流出液，更为优选的是至少75%(重量)，更优选的是至少90%(重量)，最优选的是至少94%(重量)，特别是至少98%(重量)。
从工业生产成本的观点看，特别重要的是要从包括下游过程在内的制备过程中获得高产率的重组突变rmPMT蛋白。在本文本中，rmPMT的产率定义为由该方法获得的纯rmPMT蛋白相对于表达所述蛋白的宿主细胞的粗提液中总蛋白含量的量。因此，按细胞粗提液的总蛋白含量计算，本方法所达到的突变重组蛋白产率至少为1%(重量)，更优选的是至少2%(重量)，例如至少3.5%(重量)，更优选的是至少5%(重量)，最优选的是至少7.5%(重量)，特别优选的是至少10%(重量)，例如至少12.5%(重量)，最特别优选的是至少15%(重量)。
如上所述，本发明的再一方面涉及编码本文所限定的重组突变PMT蛋白的DNA顺序，所述DNA顺序是由一个包含出血败血性巴斯德氏菌toxA基因的复制子，通过按本文所述方法进行的所述toxA基因中一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到的。如果重组突变PMT是如上所述的融合蛋白，则上述DNA还可包含一个编码第二免疫原性蛋白的顺序，所述顺序通过截短的或突变的toxA基因与编码第二蛋白的顺序码内融合而与得自toxA的基因相连，从而导致本文所述的融合蛋白基因产物的表达。
该DNA顺序还可包含一个启动子顺序和一个调控位点特异性突变toxA基因表达的顺序。启动子顺序宜为与天然toxA基因天然相连的启动子，但也可以是与所述基因非天然相连的启动子顺序。
突变rmPMT编码基因的表达可以在转录水平或转译水平上进行调控。转录水平的调控可以以转录阻遏物的形式出现，这种阻遏物可能包括起反向作用的TxaR阻遏蛋白，该蛋白是在产PMT出血败血性巴斯德氏菌的野生型菌株中表达的。编码rmPMT调控阻遏物的DNA顺序可以任选地受一个调控顺序调控，该调控顺序以可操纵方式与编码阻遏物的基因相连。这种调控顺序可以是温度敏感性顺序，如λcI顺序。
rmPMT编码基因可进一步在转录后水平上进行调控，例如由于与rmPMT mRNA杂交的反义mRNA的存在而受到调控。
如前面所提到的，本发明的另一方面提供一种携有如上所限定的DNA顺序并按上述方法制备的复制子，其典型有用实例是选自如下质粒的复制子编码突变重组蛋白HL1202HY1205HY1223HY1228(4HX)的质粒pSPE1038，该质粒于1992年9月1日保藏在DSM，保藏号为DSM7221;编码rmPMT+GG1203的质粒pSPE1020;编码1132″β-gal的质粒pSPE1134;编码rmPMT △H1223的质粒pSPE1234。后三个质粒于1993年9月9日保藏在DSM，保藏号分别为DSM8548、DSM8546和DSM8547。pSPE1038、pSPE1020、pSPE1234和pSPE1134也已保藏在CCTCC(中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心)。
本发明的其他方面涉及按本文所述方法用本文所述复制子转化的细胞，所述复制子在该细胞中能够复制;还涉及本文所述的突变重组蛋白作为疫苗的应用，该疫苗用于预防由产毒素出血败血性巴斯德氏菌引起的疾病。
rmPMT作为疫苗使用时，一般以疫苗组合物形式存在，该组合物任选包含免疫学上可接受的载体及任选的其他成分，例如佐剂，包括弗氏不完全佐剂或完全佐剂，以及凝胶态的氧化铝;防腐剂;缓冲盐。含rmPMT的疫苗组合物可以是水悬浮液，也可以是冰冻干燥的组合物。含rmPMT的组合物所含的rmPMT的量在常用的疫苗剂量中能达到其免疫有效量，这一数量一般取决于所要接种的特定动物。
本发明以下列非限制性实施例和附图来进一步说明，在附图中图1是用于出血败血性巴斯德氏菌toxA基因定位诱变的质粒pSPE312、pSPE680和pSPE1003的示意图。斜线区表示toxA基因，涂黑区表示载体DNA，其他出血败血性巴斯德氏菌DNA则用空白区表示;
图2示出重组出血败血性巴斯德氏菌毒素(rPMT)(即，由SPE1036中的toxA基因编码的PMT)对NIH 3T3细胞增殖作用(PE)的标准曲线，该曲线示出不同浓度rPMT的增殖作用(PE)。将含rPMT的SPE1036全细胞提取液稀释，以不同的量加到亚汇合NIH 3T3细胞中。如实施例2所述计算PE。用纯化rPMT(参见实施例3)测定20μg/ml rPMT的DE;
图3说明重组突变PMT蛋白(rmPMT)的增殖作用，这些rmPMT是由toxA通过单次定位诱变引起氨基酸置换、插入或缺失，或者通过toxA的亚顺序与lacZ融合而得到的。测定含不同rmPMT的全细胞提取液对NIH 3T3细胞的PE;
图4概括了由toxA通过连续的定位诱变引起多重氨基酸置换而得到的重组突变PMT蛋白(rmPMT)的PE;
图5示出一块经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶，该凝胶显示了产4HX、衍生物O和rPMT的大肠杆菌MC1000(dam)的蛋白图形。在指数生长后期(lx)、指数生长后期和静止期之间(lxs)、静止早期(es)和静止后期(ls)取培养物样品。每条泳道下面标出了样品中rmPMT或rPMT的相对量。
图6示出含rPMT大肠杆菌粗提液的Q-Sepharose阴离子交换色谱的色谱图。斜线区表示含高纯度rPMT的组分;
图7示出含rPMT大肠杆菌粗提液Q-Sepharose色谱过程中收集的各组分的SDS-PAGE分析。对含10%聚丙烯酰胺的凝胶进行银染色。A板泳道1和B板泳道1细菌粗提液;A板泳道2-11分别为组分9、13、29、33、35、37、39、41、43和45;B板泳道2-11分别为组分47、49、51、53、55、57、59、61、63和67。rPMT的位置用箭头表示;
图8A说明由大肠杆菌粗提液通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)纯化rPMT。对10% SDS-PAGE凝胶进行银染色。泳道1分子量标记;泳道2细菌粗提液;泳道3步骤(1)的流出液;泳道4步骤(1)的并集液;泳道5步骤(2)的流出液;泳道6步骤(2)的并集液，即纯化过程得到的最终产物。rPMT的位置用箭头标出。
图8B说明通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)纯化4HX(泳道2-4)和rPMT(泳道5-7)。对10%SDS-PAGE凝胶进行银染色。泳道1分子量标记;泳道2和5分别为含4HX或rPMT的细菌粗提液;泳道3和6步骤(1)的并集液;泳道4和7步骤(2)的并集液，即纯化过程得到的最终产物。4HX的位置用箭头标出。
图9说明rPMT的纯化。用SDS-PAGE(10%凝胶，银染色)分析纯化rPMT制备物的二倍稀释液。泳道1分子量标记;泳道2-8分别为稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的纯化rPMT。rPMT的位置用箭头标出。
图10示出含衍生物O(dO)大肠杆菌粗提液Q-Sepharose阴离子交换色谱的色谱图。斜线区表示富含dO(按这些组分的SDS-PAGE结果推出，参见图11)并合并起来供进行进一步纯化的组分;
图11示出在含dO大肠杆菌粗提液Q-Sepharose色谱过程中收集的各组分的SDS-PAGE分析。对10%聚丙烯酰胺凝胶进行银染色。A板泳道1和B板泳道11细菌粗提液;A板泳道2-11分别为组分8、12、30、32、34、36、38、40、42和44;B板泳道1-10分别为组分46、48、50、52、54、56、58、60、64和66。dO的位置用箭头标出;
图12说明通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)从大肠杆菌粗提液中纯化衍生物O的试验结果。对10% SDS-PAGE凝胶进行银染色。泳道1和5分子量标记;泳道2细菌粗提液;泳道3步骤1的并集液;泳道4步骤2的并集液。衍生物O的位置用箭头标出。
图13示出含4HX大肠杆菌粗提液Q-Sepharose阴离子交换色谱的色谱图。斜线区表示将要合并并含有高纯度4HX(按这些组分的SDS-PAGE分析结果得知，参见图14)的组分;
图14在含4HX蛋白的大肠杆菌粗提液Q-Sepharose色谱过程中收集的各组分的SDS-PAGE分析。对聚丙烯酰胺凝胶进行银染色。A板泳道1和B板泳道1细菌粗提液;A板泳道2-11;分别为组分9、12、31、34、36、39、41、43、45和47;B板泳道2-11分别为组分49、51、53、55、57、63、66、69和71。4HX的位置用箭头标出;
图15是一块经银染色的10% SDS PAGE凝胶，说明通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)从大肠杆菌粗提液中纯化4HX。泳道1分子量标记;泳道2细菌粗提液;泳道3步骤1的流出液;泳道4步骤1的并集液;泳道5步骤2的流出液;泳道6步骤2的并集液，即最终纯化产物。4HX的位置用箭头标出。
图16示出纯化4HX的SDS-PAGE分析。对纯化4HX制备物的两倍稀释液进行分析。对10% SDS-PAGE凝胶进行银染色。泳道1分子量标记;泳道2-8分别为稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的纯化4HX。4HX的位置用箭头标出。
图17说明含4HX的大肠杆菌粗提液的制备规模Q-Sepharose阴离子交换色谱。斜线区表示含高纯度4HX(根据所收集组分的SDS-PAGE分析结果得知)并合并的各组分;
图18示出通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)对4HX进行制备规模纯化的结果。对聚丙烯酰胺凝胶进行银染色。泳道1和6分子量标记;泳道2含4HX的细菌粗提液;泳道3步骤1的流出液;泳道4步骤1的并集液;泳道5步骤2的并集液，即终产物。4HX的位置用箭头标出。
图19示出由图8所示的两步制备规模纯化得到的纯化4HX二倍稀释液的SDS-PAGE分析。10% SDS-PAGE凝胶用考马斯亮蓝染色。泳道1分子量标记;泳道2-8分别为稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍、64倍和128倍的纯化4HX。4HX的位置用箭头标出。
图20示出纯化4HX的SDS-PAGE分析和免疫印迹。样品在10%凝胶上进行电泳并转移到硝化纤维素上。将印迹与抗PMT多克隆兔抗体一起保温，然后与碱性磷酸酶结合的猪抗兔免疫球蛋白(DAKO、Denmark，代号D-306)，并对碱性磷酸酶进行染色。泳道1纯化的rPMT(0.15μg，阳性对照);泳道2实验室规模纯化的4HX(0.3μg);泳道3制备规模纯化的4HX(1.1μg);泳道4在大肠杆菌中产生的重组核酸酶，分子量为30，000(3μg，阴性对照)。分子量标在左侧。
图21示出rPMT、衍生物O和4HX在37℃保温过程中的稳定性。纯化的rPMT、衍生物O和4HX在37℃下保温。在0时刻(对照)及24和48小时后取样在含10%聚丙烯酰胺的凝胶上进行SDS-PAGE分析。对凝胶进行银染色。泳道1和11分子量标记;泳道2-4rPMT;泳道5-7衍生物O;泳道8-104HX。泳道2、5和8对照;泳道3、6和924小时;泳道4、7和1048小时。
图22示出rPMT在与胰蛋白酶一起保温过程中的稳定性。将纯化rPMT的等份试样与1%、2%或5%(重量)的胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。样品如图21说明中所述进行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量标记;泳道2未加胰蛋白酶在37℃保温的纯化rPMT(对照);泳道3、4和5分别加1%、2%、5%胰蛋白酶。rPMT的位置用箭头标出。
图23示出4HX在与胰蛋白酶保温过程中的稳定性。将纯化4HX的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。样品如前面图21说明中所述进行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量标记;泳道2未加胰蛋白酶在37℃保温的纯化4HX(对照);泳道3、4和5分别加1%、2%和5%胰蛋白酶。4HX的位置用箭头标出。
图24示出用免疫亲和色谱法纯化出的衍生物O在与胰蛋白酶保温过程中的稳定性。将纯化衍生物O的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。如前面图21中的说明所述对样品进行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量标记;泳道2未加胰蛋白酶在37℃下保温的纯化衍生物O(对照);泳道3、4和5分别加1%、2%和5%胰蛋白酶。衍生物O的位置用箭头标出。
图25示出用Q-Sepharose和Phenyl Sepharose色谱法富集的衍生物O在与胰蛋白酶保温过程中的稳定性。将富集的衍生物O的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。如前面图21说明中所述对样品进行SDS-PAGE分析。泳道1和6分子量标记;泳道2未加胰蛋白酶在37℃下保温的浓集衍生物O(对照);泳道3、4和5分别加1%、2%和5%胰蛋白酶。衍生物O的位置用箭头标出。
图26示出含+GG1203大肠杆菌粗提液Q-Sepharose阴离子交换色谱的色谱图。斜线区表示含高纯度+GG1203的组分。
图27示出含+GG1203大肠杆菌粗提液Q-Sepharose色谱过程中收集的选定组分的SDS-PAGE分析。对含10%聚丙烯酰胺的凝胶进行银染色。泳道1和13分子标记;泳道2细菌粗提液;泳道3-12分别为组分55、56、57、58、59、60、61、62、63和64。+GG1203的位置用箭头标出。
图28说明通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)从大肠杆菌粗提液中纯化+GG1203。对10% SDS PAGE凝胶进行银染色。泳道1和5分子量标记;泳道2细胞粗提液;泳道3步骤1的并集液;泳道4步骤2的并集液，即最终纯化产物。
图29示出纯化+GG1203的SDS-PAGE分析。利用SDS-PAGE(10%凝胶，考马斯亮蓝染色)分析纯化+GG1203制备物的两倍稀释液。泳道1和8分子量标记;泳道2-7分别为稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍的纯化+GG1203。
图30示出含△H1223大肠杆菌粗提液Q-Sepharose阴离子交换色谱的色谱图。斜线区表示含高纯度△H1223的组分。
图31说明通过阴离子交换色谱(步骤1)和疏水性相互作用色谱(步骤2)从大肠杆菌粗提液中纯化△H1223。对10%SDS-PAGE凝胶进行银染色。泳道1和6分子量标记;泳道2和3分别为稀释2倍和4倍的细菌粗提液;泳道4步骤1的并集液;泳道5步骤2的并集液，即最终纯化产物。
图32示出纯化△H1223的SDS-PAGE分析。利用SDS-PAGE(10%凝胶，银染色)分析纯化△H1223制备物的二倍稀释液。泳道1和8分子量标记;泳道2-7分别为稀释2倍、4倍、8倍、16倍、32倍和64倍的纯化△H1223。
图33说明1132″β-gal的纯化。泳道1分子量标记;泳道2、3和4分别为稀释2倍、4倍和8倍的细菌粗提液;泳道5APTG亲和纯化的1132″β-gal。1132″β-gal的位置用箭头标出。
图34示出+GG1203对胰蛋白酶的耐受性。使纯化+GG1203的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并于37℃下保温24小时。对照样品不加胰蛋白酶而在37℃下保温24小时。保温后，样品在含10%聚丙烯酰胺的凝胶上进行SDS-PAGE分析。对凝胶进行银染色。泳道1和7分子量标记;泳道2纯化的+GG1203;泳道3对照;泳道4、5和6分别加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
图35示出△H1223对胰蛋白酶的耐受性。将纯化△H1223的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。对照样品不加胰蛋酶而在37℃下保温24小时。保温后，如前面附图34说明中所述对样品进行SDS-PAGE分析。泳道1和7分子量标记;泳道2纯化的△H1223;泳道3对照;泳道4、5和6分别加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
图36示出1132″β-gal对胰蛋白酶的敏感性。将纯化1132″β-gal的等份试样与1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶混合，并在37℃下保温24小时。对照样品不加胰蛋白酶而在37℃下保温24小时。保温后，如前面附图34说明中所述对样品进行SDS-PAGE分析。泳道1和7分子量标记;泳道2纯化的1132″β-gal;泳道3对照;泳道4、5和6分别加1%、2%和5%(重量)胰蛋白酶。
图37示出用frPMT和4HX免疫的动物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度对免疫剂量作图。
图38示出用4HX、+GG1203和1132″β-gal免疫的动物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度对免疫剂量作图。
图39示出用4HX和△H1223免疫的动物的抗rPMT血清滴度。Log2滴度对免疫剂量作图。
实施例1在出血败血性巴斯德氏菌toxA基因的3′端引入位点特异性突变在toxA基因3′端独特EcoRI限制位点的下游引入定位突变。每种情况下都是用聚合酶链反应(PCR)扩增法得到带有所要突变的DNA片段。
用大肠杆菌菌株DH5α(supE44、△lacU169(φ80lacZM15)、hsdR17、recA1、endA1、gyrA96、thi-1、relA1)(Hanahan，D.“用质粒转化大肠杆菌的研究”，J.Mol.Biol.166557，1983)作为各种质粒的宿主。
用毒素编码质粒pSPE312(Petersen S.K.等，“出血败血性巴斯德氏菌毒素的重组衍生物，抗进行性萎缩性鼻炎疫苗的候选者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)、pSPE680(出处同上)、和pSPE1003来克隆PCR片段(参见图1)。pSPE1003是pSPE680去掉toxA基因外限制酶识别位点后的衍生物。因此，这一质粒的toxA基因内EcoRI位点是独特的。pSPE1003的构建方法是用RcoRI部分限制性消化pSPE680，从琼脂糖凝胶中分离线性化质粒，在所有四种脱氧核糖核苷酸存在下用T4 DNA聚合酶处理分离出的片段，用T4 DNA连接酶连接，转化DH5α。
限制酶、T4 DNA连接酶和T4 DNA聚合酶购自New England Biolabs，Inc.MA，并按制造商所推荐的方法使用。用Geneclean(BIO101 Inc.，CA)法从琼脂糖凝胶中分离DNA。简言之，该方法用于1)用4M NaI溶解含DNA的琼脂糖;2)利用DNA与硅胶基质的亲和性提取DNA。
在Cyclone DNA合成仪(Biosearch Inc.，CA)上合成寡聚脱氧核糖核苷酸。表Ⅰ列出用于引入突变的引物DNA顺序(位置编号同Petersen，S.K.，“出血败血性巴斯德氏菌毒素基因的完整核苷酸顺序及转录阻遏物TxaR的证据”，Mol.Microbiol.4821-830，1990)。
表Ⅰ用于定位诱变的寡聚脱氧核糖核苷酸。
寡核苷酸在相关野生型DNA和氨基酸顺序(分别为3801-3938位和1195-1240位)下面列出(编号同Petersen等，1990)。每个寡核苷酸的名称和它所引入的突变都划了下线。
突变特异性引物用它们所引入的氨基酸改变来命名(见下文及表Ⅱ)。NsiIcw引物与toxA顺序中的头一个NsiI限制位点附近的2109-2129位杂交。PstIccw引物与Pharmacia LKB Biotechnology(Sweden)的pBR322 PstI引物PⅡ相同。在AB引物中，头半部分(A部分)与具有20碱基随机选择顺序的A引物相同，后半部分(B部分)则与toxA的3580-3600位相同。引物C和D的顺序分别与toxA的4282-4257位、4105-4084位相同。
下表Ⅱ列出了rmPMT和概括的定位诱变参数，每一重组突变PMT蛋白(rmPMT)给出了以下情况1)氨基酸改变;2)重组突变体的菌株号;3)用于诱变和扩增的PCR引物;4)相应的PCR模板;5)用于消化扩增DNA片段和载体DNA的限制酶;6)克隆载体的名称。rmPMT的名称系指由有关密码子编码的野生型和突变型氨基酸，用标准单字母代码表示。例如，产生SV1201的突变体所带有的突变是把已公开的toxA顺序中的1201号丝氨酸密码子变为缬氨酸密码子。类似地，产生+G1203的突变体带有一个插入突变，该突变引入一个甘氨酸密码子作为1203号密码子;产生△1215-1221的突变体具有1215-1221号密码子的缺失。这一命名法的唯一例外是△1257-1285，该蛋白是由一个携有移码的质粒编码的，这一质粒是在其他质粒的构建过程中偶然制得并分离出来的。△1257-1285在1256号残基后有一个11个氨基酸残基的无义延伸。
表Ⅱ rmPMT的列举及定位诱变参数的概括对每一个重组突变PMT蛋白(rmPMT)(第一栏)都给出了相应的rmPMT生产株(第二栏)、突变特异性和一般性PCR引物(第三栏)、PCR模板(第四栏)，同时也给出了用于克隆步骤的限制酶(第五栏)和载体(第六栏)(各构建方法的详细叙述见正文)。标有星号的寡核苷酸(第三栏)引入第五栏中给出的限制酶的识别位点。
如表Ⅱ所总结的，所有突变株都是通过对PCR扩增DNA片段进行重组克隆而构建的。除SPE888、SPE900和SPE1038外，它们都是按基本上如Nelson和Long所述的方法构建的(Nelson，R.M.和G.L.Long，“用经过修改的水生嗜热菌聚合酶链反应进行位点特异性诱变的一般方法”，Anal.Biochem.180147-151，1989)。简言之，这一方法涉及使用4个引物，其中一个是突变特异性的，另外三个是为使突变DNA能特异性扩增而设计的。这是用下述方法来完成的。
在Techne Programmable Dri-Block PHC-1(Techne Ltd.，UK)或Hybaid热反应器(Hybaid Ltd.，UK)中，在100μl反应缓冲液中进行PCR，并用20μl矿物油M3516(Sigma Chemical Co.，MO)覆盖。反应缓冲液中含10mM Tris HCl pH8.3、50mM KCl、2.5mM MgCl2、0.01%(w/v)明胶、每种dNTP 200μM、2.5单位水生嗜热菌(Taq)聚合酶(Ampli Taq，Perkin Elmer，CT)。每次循环包括变性(95℃ 2分钟)、退火(37℃ 2分钟)和聚合(72℃ 3分钟)。在所有情况下，在1毫微微摩尔模板DNA上进行的第一次PCR扩增(30次循环)中，都使用突变特异性引物(100皮摩尔)和AB引物(100皮摩尔)。然后约0.6皮摩尔的PCR产物和1毫微微摩尔模板进行92℃ 5分钟、37℃ 2分钟、72℃ 10分钟的单次循环。这最后一步导致质粒模板上只沿顺时针方向伸长，因为AB引物的A部分没有模板同源性，因此其互补顺序不能在逆时针方向引发DNA合成。
然后用这一伸长产物在进一步的PCR扩增反应中作为模板，在该扩增反应中，将引物A和C或Pstccw(各100皮摩尔)加到反应混合物中，再进行30次循环以实现突变DNA的特异性扩增。用以下方法克隆该产物用指定的限制酶(表Ⅱ)消化载体和PCR产物，用T4 DNA连接酶连接这些DNA的混合物，用Hanahan的方法(Hanahan，D.，“用质粒转化大肠杆菌的研究”，J.Mol.Biol.166557，1983)转化DH5α株。
要构建SPE888、SPE900和SPE1038，则采用不同的方法，因为突变特异性引物L1202和L1202 Y1205引入有用的限制位点(分别为一个NsiI位点和一个PstI位点)。用如下的简单PCR扩增法构建SPE888和SPE900(分别编码 HL1202或HL1202HY1205)2μg模板;每种引物各0.9μg;4次变性(95℃ 2.5分钟)、退火(52℃ 2.5分钟)和聚合(72℃ 10分钟)循环;如上所订克隆扩增出的片段。
以三步法构建SPE1038第一步，用引物L1202Y1205和Y1223Y1228(各10μg)作引物在用Hind Ⅲ切割过的50ng模板pSPE900 DNA上进行PCR扩增20次变性(95℃ 2.5分钟)、退火(60℃ 2.5分钟)和聚合(72℃ 10分钟)循环;第二步，用0.5μg用Hind Ⅲ切割过的pSPE900 DNA作为模板使PCR产物伸长1次循环(95℃ 5分钟、30℃ 2分钟、70℃ 10分钟);最后一步，加入0.9μg Pstccw引物，并再进行20次循环(95℃ 2分钟、35℃ 2分钟、72℃ 2分钟)。如上所述克隆产物。
利用双链质粒DNA和测序酶2.0版本方法(United States Biochemical Corporation，Ohio)，测定整个克隆PCR扩增片段的DNA顺序。所用的测序酶相应于toxA的下列编号的核苷酸2089-2107、2400-2417、2683-2701、3004-3024、3303-3321、3580-3600、4105-4084(表Ⅰ中的引物D)。下列实验中所用的突变株，除了两个菌株中的静息第三位突变外，在克隆DNA片段中都不携有除表Ⅱ所示突变以外的突变。
构建一个toxA″lacZ融合基因，在该融合基因中，toxA启动子、核糖体结合位点和该基因的头1132个密码子与功能性lacZ结构基因融合。这一构建过程涉及到携有toxA的质粒pSPE1003(图1)和携有lacZ的质粒pNM482(Minton，Gene，31269-273，1984)。携有toxA″lacZ的质粒pSPE1134，是通过把pSPE1003的3.6kb EcoRI片段克隆到pNM482的独特EcoRI限制位点中而构建的。pSPE1134编码的融合蛋白包含PMT的头1132个氨基酸，它们与一个功能性β-半乳糖苷酶融合。这一融合蛋白命名为1132″β-gal。
pSPE1134已于1993年9月9日保藏在DSM，保藏号为DSM8546，并已保藏在CCTCC(中国武汉武汉大学中国典型培养物保藏中心)。
实施例2重组突变PMT毒素的促有丝分裂效力为测试重组突变PMT蛋白(rmPMT)的活性，以下列方式制备全细胞提取液将实施例1的携质粒菌株于30℃下培养在含50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor N.Y.1972)。离心收集静止期培养物，重新悬浮于0℃水中，用Branson Sonifier 250(Branson Sonic Power Co.，Conn.)进行若干次0.5分钟超声处理，用孔径为0.45μm的Millex-GV滤器(Millipore S.A.，France)进行无菌过滤。
然后用以下方法评估每个全细胞提取液的rmPMT含量用7.5%(重量/体积)丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/双丙烯酰胺比例为40∶1)进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[Laemmli，U.K.，“T4噬菌体头部组装过程中结构蛋白的裂解”，Nature(London)227680-685，1970)，然后用考马斯亮蓝R250染色，在5%乙酸-50%乙醇中使凝胶脱色。用纯化的HL1202蛋白(参见实施例3)作为浓度标准物，将所有全细胞提取液的rmPMT浓度都稀释到约20μg/ml，这是通过经考马斯亮蓝染色的SDS-PAGE凝胶的一维激光光密度分析扫描(UltroScan XL Laser Densitometer，LKB/Pharmacia，Sweden)来测定的。
使用经过稀释的提取液，基本上按Rozengurt等人所述(Rozengurt，E.，T.Higgins，N.Chanter，A.J.Lax，和J.M.Staddon，“溶血败血性巴斯德氏菌毒素培养成纤维细胞的强效促有丝分裂剂”，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87123-127，1990)如下进行促有丝分裂活性测定将约105个NIH3T3细胞(ATCC CRL1658)接种到35mm培养皿中的2ml Dulbecco改良伊格耳培养基中，该培养基添加有10%新生牛血清、2mM L-谷氨酰胺、青霉素(100IU/ml)和链霉素(10μg/ml)。培养1天和4天后，将含有纯化蛋白的新鲜培养基、含rmPMT或rPMT的全细胞提供取液、或DH5α株的全细胞提取液，加到三个等同的培养皿中，培养7天后计数细胞，此时阴性对照培养物已汇合至少4天。
给定样品(x)的增殖作用(PE)如下计算PEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx是装有样品x的三个培养皿中的平均细胞数，Npmt是装有SPE1036全细胞提取液(含终浓度为20ng/ml的rPMT)的三个培养皿中的平均细胞数，No是装有DH5α全细胞提取液的三个培养皿(即装有汇合单层NIH3T3细胞的培养皿)中的平均细胞数。
用不同浓度的SPE1036全细胞提取液制做rPMT促有丝分裂活性标准曲线。SPE1036是携有pSPE680(图1)的大肠杆菌DH5α。如图2所示，达到50% PE的rPMT浓度约为4-5ng/ml，达到最大PE(100%)的rPMT浓度约为20ng/ml，与文献(Rozengurt等)一致。rPMT的浓度再高1000倍不会使PE明显不同。DH5α提取液即使以1000倍过量加入，与含20ng/ml rPMT的提取液相比也未观察到毒性作用(未给出数据)。在不同的实验中，0% PE和100% PE总是分别对应于4-6.5×105个和2.5-4×106个NIH3T3细胞/ml。
然后测定带有单个氨基酸置换、插入或缺失的rmPMT的PE。所有全细胞提取液的加入量都相应于＞5ng/ml突变蛋白，优选达到20-80% PE的量，相应于蛋白浓度/PE曲线最陡部分的点(参见图2)。每个实验都包括一个阳性(SPE1036)和一个阴性(DH5α)对照提取液。结果概括于图3。三个提取液在独立的实验中测定两次，以确保所测得的PE在不同实验中不变。加入提取液使终浓度达8ng/ml TV1206得PE为37.2±6.7%和31.7±10.2%;40ng/mlSV1201得PE为51.8±5.6%和48.4±5.8%;80ng/ml HY1205得PE为43.4±8.1%和40.0±9.6%。结论是，独立实验中所得到的PE可直接进行比较为把rmPMT的促有丝分裂作用与rPMT做比较，将给定rmPMT的促有丝分裂效力(MP)定义为达到给定PE的rPMT浓度与达到同样PE的rmPMT浓度的相对值。这一定义依据的是如下假定rPMT和rmPMT的蛋白浓度/PE曲线如有不同也只是平行位移，其形状是完全相同的。在本测定中，rmPMT HY1202、QL1203、TV1207和△1257-1285保留了大于50%的MP，与PMT没有明显不同;SV1201、TV1206和HY1228的MP在10-35%之间;HL1202和HY1205的MP约为5%;+G1203、+GG1203、△1215-1221、HY1223、△H1223和1132″β-gal的MP则小于5%。
结论是包含4个组氨酸残基的氨基酸1201至1228多肽区段对rPMT的PE来说至关重要;2)这种重要性反映在这一区段中某些单个氨基酸的重要性上(最明显的是组氨酸-1223，但还有丝氨酸-1201、组氨酸-1202、组氨酸-1205、苏氨酸-1206，某种程度上还有组氨酸-1228)，但显然不是所有氨基酸都重要(即谷氨酰胺-1203和苏氨酸-1207);3)涉及1200-1229位残基间的氨基酸残基的结构对功能活性特别重要，因为这一区域的插入和缺失(导致蛋白+GG1203、△H1223和△1215-1221)对MP有显著的负效应，而这一区段以外(氨基酸残基1257-1285)的缺失则不影响MP。现有的证据并不排除该结构中涉及到1201-1228位之间或别处的其他残基。
突变的本质和作用可能进一步表明(但并未证明)，对PMT的功能来说，残基1202的极性较重要，残基1201和1206的极性或羟基较重要，残基1205和1223的咪唑环特别重要。
同样测试实施例1中所述的双突变rmPMT的活性，以及带有4个独立突变的潜在候选疫苗HL1202HY1205HY1223HY1228(也称为4HX，见图4)的活性。
上述的候选疫苗蛋白4HX、+GG1203、△H1223和1132“β-gal在如实施例3所述进行纯化后也测试了促有丝分裂效力。这些纯化rmPMT的MP值与上述含rmPMT全细胞提取液的数据一致。
实施例3选定重组突变PMT蛋白的制备、纯化和稳定性a.制备rPMT(即由toxA基因编码并在大肠杆菌中表达的PMT)、前已公开的PMT缺失衍生物O(Petersen.S.K.等，“出血败血性巴斯德氏菌毒素重组衍生物抗进行性萎缩性鼻炎疫苗的候选者，“Infect.Immun.591387-1393，1991)、以及一种选定的新候选疫苗4HX的制备过程，在以下列方式进行的摇瓶实验中进行比较于30℃下，在含有50μg/ml氨苄青霉素的LB培养基(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中培养携有质粒pSPE680(Petersen.S.K.等，“出血败血性巴斯德氏菌毒素的重组衍生物抗进行性萎缩性鼻炎疫苗的候选者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)、产衍生物OpSPE680类似物pSPE670(出处同上)、或pSPE1038(见图1)的大肠杆菌K-12，MC1000(dam)(由Henrik φrum惠供)。培养后测定培养物在450nm波长处的光密度(OD450)。在对数生长20代以上从而使三个培养物稀释到相等的光密度后，令培养物进入静止期。
在下列时间收集1ml培养物样品指数生长后期(每个培养物2个样品(lx1和lx2))OD450＝1.0和OD450＝2.0时;指数生长后期和静止期之间(1个样品(lx5))OD450＝5.0时;静止早期(1个样品(es)，OD450＝6.0);静止后期13小时后(1个样品(ls)，OD450＝6.0)。对每个培养物样品进行离心以沉淀出细菌，然后将细菌悬浮在不同量的SDS样品缓冲液[62mM Tris-HCl pH6.8、10%(v/v)甘油、2%(w/v)十二烷基硫酸钠(SDS)、0.00125%(w/v)溴酚蓝、0.025%(w/v)派咯宁Y、0.1mM二硫苏糖醇]中，以使培养物的OD450恢复到正常值。用10%(重量/体积)丙烯酰胺凝胶(丙烯酰胺/双丙烯酰胺比例为40∶1)对这些样品进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，接着用考马斯亮蓝染色，再用5%乙酸-50%乙醇使凝胶脱色(参见图5)。
随后如实施例2所述对凝胶进行一维激光光密度分析扫描，得到每个样品中rPMT、衍生物O或4HX的相对量。结果示于图6。
在指数生长后期，三种蛋白的产量相似。但是，当培养物进入静止期时，由于衍生物O明显优先降解，使该蛋白每OD450的产量比PMT和4HX的产量要低。这种明显降解反映在衍生物O的最高产量较低，以及在静止早期和后期之间衍生物O损失33%。在同一时间段内，其他两种蛋白的产量相当恒定地保持在高出300%的水平。
结论是，所测试的经过氨基酸置换的新突变体的制备过程与rPMT的制备过程很难区分，因此，它比称为衍生物O的已知候选疫苗的产量更高，也明显地更能耐受在大肠杆菌中的降解，而衍生物O是缺失121个氨基酸残基的rPMT衍生物(进一步的稳定性数据还可参见下文)。
为纯化目的用下列方法制备rPMT和rmPMT在氨苄青霉素(50μg/ml)存在下，在Luria Broth(Miller，J.Experiments in molecular genetics.Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，N.Y.)中培养实施例1的携质粒菌株。收集400ml在30℃下培养的静止期培养物，并如实施例2所述分别重新悬浮于10mlH2O中，超声处理并无菌过滤。
b.rPMT的纯化用阴离子交换色谱法，接着用疏水性相互作用色谱法，从携质粒pSPE680大肠杆菌的细菌粗提液中纯化rPMT。纯化过程中的所有步骤都在4℃下进行。将得自400ml培养物的经过超声处理、无菌过滤的细菌提取液用2×1升含1mM PMSF的25mM Tris-HCl pH8.0透析过夜。经过透析的样品用缓冲液A(25mM Tris-HCl pH8.0)稀释至100ml，并加到已在相同缓冲液中平衡过的Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)柱上。所加物料中的蛋白总含量约为200mg。柱的线度为2cm2×25cm，流速为60ml/小时(30cm/小时)。用2.5个床体积的缓冲液A洗柱，然后用从缓冲液A到缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)的线性梯度洗脱吸附的蛋白10个床体积。洗脱曲线示于图6。
以10ml为一组分进行收集，并用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)进行分析(参见图7)。含10%丙烯酰胺的凝胶在Mini-PROTEAN Ⅱ装置(Bio-Rad)中进行电泳，并进行银染色(Morrissey，J.H.“聚丙烯酰胺凝胶中蛋白的银染色一种提高了均匀灵敏度的改良方法”，Anal.Biochem.117307-310，1981)。在用氯化钠梯度洗脱过程中，高纯度rPMT在约700mM NaCl时洗脱出来，见图6和7。rPMT晚于粗提液中的大多数其他蛋白洗脱出来，这表明它在pH8时比粗提液中存在的大多数其他蛋白带有更强的负电荷。合并含纯rPMT的组分，并在-20℃贮存以备进行下述的第二个色谱步骤。每次色谱操作之后用0.5M NaOH清洗色谱柱。
用疏水性相互作用色谱法进一步纯化rPMT。将步骤1的合并后的各组分调至0.72M硫酸铵，pH调至7.0。将样品加到已预先在缓冲液1(25mM硫酸钠、0.72M硫酸铵、pH7.0)中平衡过的Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱上。该柱的线度为2cm2×20cm，流速为60ml/小时(30cm/小时)。
加样后，用2个床体积的缓冲液1洗柱。所吸附的蛋白用从缓冲液1到H2O的线性梯度洗脱6个床体积，然后用4个床体积的H2O洗脱。以10ml为一组分进行收集，并如上所述进行SDS-PAGE分析。合并含纯PMT的组分并在-20℃下贮存。但是，在这一步只有少量残留污染物必须去除，参见图8A和8B。由纯化过程得到的最终产物用该制备物的两倍连续稀释液进行SDS-PAGE分析(图9)。这一分析表明所得rPMT的纯度≥94%。
c.用常规色谱法纯化衍生物O(dO)的试验对含有前述衍生物O(dO)的细菌粗提液进行如上所述的阴离子交换色谱(参见图10)。但在这种情况下，大部分dO都出现在过柱组分(run-through fraction)中，其余部分则作为含若干其他蛋白的混合物的一部分而在约500mM氯化钠时洗脱出来(参见图11)。尽管如此，将具有最佳纯度的组分合并，并如上所述进行疏水性相互作用色谱。所得dO的纯度不合格(参见图12)。因此试图优化dO的纯化方法，例如改变离子交换色谱过程中的pH。但这些尝试并不成功，因此得出结论dO不易用常规柱色谱法纯化，rPMT也是如此，这表明121个氨基酸残基的缺失已造成了重大的结构变化。这与早期发表的工作相一致。早期的工作表明，dO的N末端1/4所保留的氨基酸区段以不同于天然PMT的方式折叠。
d.rmPMT 4HX蛋白的实验室规模纯化如前面对rPMT所述，对含4HX rmPMT蛋白的细菌粗提液进行阴离子交换色谱。所得的洗脱曲线与rPMT的洗脱曲线即使不同也是相似的(参见图13)。对分级分离过程中收集的各组分进行SDS-PAGE分析，表明高纯度4HX在约700mM氯化钠处洗脱出来(参见图14)。rPMT和4HX洗脱位置的这种相似性表明，在突变蛋白4HX中保留了rPMT的色谱性质，并提示，4HX中的氨基酸置换只引入了微小的结构变化(但在功能上仍然重要，参见实施例2、4和5)。
用如上所述的疏水性相互作用色谱法进一步纯化4HX。对rPMT来说这一步只需除去少量的残留污染物(见图3、11)。最终纯化产物用4HX制备物的2倍连续稀释液进行SDS-PAGE分析(参见图16)。与rPMT类似，纯度≥94%。纯化4HX的产率一般为起始物总蛋白的3.5%(w/v)。例如，含200mg总蛋白的粗提液得到7mg纯化的4HX。按Bradford的方法测定蛋白浓度(“利用蛋白-染料结合原理定量测定微克级蛋白的快速灵敏方法”，Anal.Biochem.72248-254，1976)。不可能准确测定纯化过程中4HX的回收率。但是，通过测定粗提液和终产物中的蛋白浓度，并把各SDS-PAGE泳道与粗提液和纯化4HX蛋白的连续稀释液比较，估算回收率约为50%。
e.4HX蛋白的制备规模纯化为了测试上述纯化方法在较大规模时的效能，从5升产4HX菌株过夜培养物的粗提液中纯化4HX。如上所述收集5升过夜培养物中的细胞，重新悬浮于H2O中，超声处理，无菌过滤(终体积为100ml)。纯化过程中所有步骤都在室温下(20-22℃)进行。
细菌提取液用2×5升含1mM PMSF的25mM Tris-HCl pH8.0透析过夜。经过透析的样品用缓冲液A(25mM Tris-HCl pH8.0)稀释至1750ml，并加到已在同一缓冲液中平衡过的Q-Sepharose Fast Flow柱上。该柱的线度为20cm2×25cm。流速为600ml/小时(30cm/小时)。用2.5个床体积的缓冲液A洗柱，然后用从缓冲液A到缓冲液B(缓冲液A+1M NaCl)的线性梯度以10个床体积洗脱吸附的蛋白。
每次色谱操作后，用0.5M NaOH清洗色谱柱。Q-Sepharose阴离子交换色谱过程中所得的洗脱曲线(图17)与实验室规模纯化中所得的曲线(图13)相似。在梯度洗脱过程中以170ml为一组分进行收集，并如上所述进行SDS-PAGE分析。这一分析表明，在组分19-20中洗脱出的高纯度4HX相应于650-700mM氯化钠。合并组分19-20，用疏水性相互作用色谱法进一步纯化。
将步骤1得到的合并后的组分调至0.72M硫酸铵，pH调至7.0。然后把样品加到预先在缓冲液1(25mM 磷酸钠、0.72M硫酸铵、pH7.0)中平衡过的Phenyl Sepharose CL-4B柱中。该柱的线度为20cm2×20cm，流速为600ml/小时(30cm/小时)。加样后，用2个床体积的缓冲液1洗柱。用从缓冲液1到H2O的线性梯度以6个床体积洗脱吸附的蛋白，然后用4个床体积的H2O洗柱。
洗脱过程中以170ml为一组分进行收集，并如上所述进行SDS-PAGE分析。合并含纯4HX的组分并于-20℃下贮存。粗提液、步骤1产物和步骤2产物的SDS-PAGE分析(图18)表明，在步骤2进行过程中没有达到明显的进一步纯化。因此，4HX纯化程序可以充分简化而只由一个离子交换步骤组成。
通过对纯化4HX制备物的两倍稀释液进行SDS-PAGE(图19)，测定产物纯度(步骤2之后)。这一分析表明纯度≥91%。
与实验室规模纯化中所达到的产率相似，所得纯化4HX为总蛋白的3.5%(由6475mg粗提液总蛋白得到225mg 4HX)。
f.4HX制备物本性的测试为了确认由实验室规模及制备规模纯化所得的纯化4HX制备物的本性，对上述制备物进行SDS-PAGE分析，然后用针对rPMT产生的多克隆兔抗体进行免疫印迹分析(参见图20)。引入rPMT作为阳性对照(泳道1)，引入另一种重组大肠杆菌蛋白，即粘质沙雷氏菌的核酸酶(分子量为30，000)，作为阴性对照(泳道4)。在图20中可见，实验室规模纯化的及制备规模纯化的4HX，只在与rPMT相同的分子量处出现染色。
g.+GG1203的纯化如前面对rPMT所述，对含+GG1203 rmPMT蛋白的细菌粗提液(菌株SPE1020)进行阴离子交换色谱。所得的洗脱曲线(参见图26)与rPMT(图6)和4HX(图13)纯化过程中所观察到的曲线类似。对分级分离过程中收集的各组分进行SDS-PAGE分析表明，高纯度+GG1203在700-800mM氯化钠处洗脱出来(参见图27)。这一洗脱范围与如上所述观察到的rPMT和4HX的洗脱范围相似。rPMT、4HX和+GG1203洗脱位置的相似性表明，在突变蛋白4HX和+GG1203中保留了rPMT的色谱性质。如前面对rPMT所述用疏水性相互作用色谱法进一步纯化+GG1203，以去除残留的污染蛋白(参见图28)。通过对+GG1203制备物的两倍连续稀释液进行SDS-PAGE，分析最终纯化产物(参见图29)。估算纯度约为90%。纯化+GG1203的产率为2.5%(从400mg细菌粗提液总蛋白中得到10mg纯化的+GG1203)。
h.△H1223的纯化如前面对rPMT所述，对含△H1223 rPMT蛋白的细菌粗提液(菌株SPE1234)进行阴离子交换色谱。所得的洗脱曲线(图30)与rPMT(图6)、4HX(图13)和+GG1203(图26)纯化过程中所观察到的曲线相似但不相同。对分级分离过程中收集的各组分进行SDS-PAGE分析表明，高纯度△H1223在约700mM氯化钠处洗脱出来，这与rPMT、4HX和+GG1203类似。
如前面对rPMT所述，用疏水性相互作用色谱法进一步纯化△H1223(参见图31)。通过对△H1223制备物的两倍连续稀释液进行SDS-PAGE(参见图32)，分析最终纯化产物。这一分析表明，纯化△H1223的纯度为95%。纯化△H1223的产率为0.6%(从485mg细菌粗提液总蛋白得到3mg纯化的△H1223)。
i.1132″β-gal的纯化通过硫酸铵沉淀并用偶联在琼脂糖上的β-半乳糖苷酶底物类似物对氨基苯基-β-D-硫代半乳吡喃糖苷(APTG-琼脂糖)进行亲和色谱，从细菌粗提液(菌株SPE1134)中纯化上述融合蛋白。基本上按Germino等人所述进行纯化(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，806848-6852，1983)。离心澄清细菌粗提液，并与一倍体积的80%饱和硫酸铵混合(室温)。离心收集沉淀物。弃去只含β-半乳糖苷酶总活性1%的上清夜。将沉淀物重新悬浮于3ml 10mM Tris-HCl、250mM NaCl、10mM MgCl2、1mM EDTA、0.1% Triton X-100，pH7.6(＝“缓冲液”)中，并用500ml缓冲液在4℃下透析过夜。将经过透析的样品加到已在缓冲液中平衡过的1ml APTG琼脂糖(Sigma Chemicals，＃A-8648)柱上。室温下进行色谱。在整个纯化过程中以1ml为一个组分进行收集。用10ml缓冲液洗柱，然后用5ml不含Triton X-100的缓冲液洗柱。用以下缓冲液洗脱吸附的蛋白1)4ml 0.1M Tris-HCl，pH10.0;2)4ml Tris，pH10.8;3)4ml 0.1M碳酸钠，pH11.0;4)4ml含6M脲的缓冲液。收集后立即用1M乙酸钠pH5中和各组分，并利用SDS-PAGE和β-半乳糖苷酶测定法进行分析。这些分析表明，大部分1132″β-gal蛋白都被0.1M碳酸钠pH11.0洗脱出来，只有少部分在pH10.0和pH10.8时洗脱出来。但在pH10时收集的组分中β-半乳糖苷酶活性相对较高，这可能是因为β-半乳糖苷酶在pH11左右失活。从在pH10.0、10.8和11.0时洗脱出的组分中选择含高纯度1132″β-gal的组分并合并。β-半乳糖苷酶活性的总回收率为13%。活性回收率低可能是由于β-半乳糖苷酶在强碱性pH下(部分)失活，而这种强碱性pH是从APTG柱中洗脱这种β-gal融合蛋白所需要的。据报道，β-半乳糖苷酶融合蛋白一般是在pH10时从APTG基质中洗脱出来，但这在上述情况下显然不可能。利用SDS-PAGE分析用于纯化的粗提液和纯化的融合蛋白1132″β-gal(参见图33)。除了分子量约为200，000道尔顿的主要成分外，纯化的制备物在分子量116，000处显示一个与β-半乳糖苷酶共同迁移的条带。还观察到一个分子量约为70，000的条带。
j.dO、rPMT、4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal对可能的残留蛋白酶活性的耐受性及对胰蛋白酶的耐受性将4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal对蛋白水解降解的敏感性与衍生物O进行比较，并在这些实验中引入rPMT作为参照蛋白。如上所述得到纯化rmPMT和rPMT的制备物(实验室规模制备)。如Petersen等人所述(Infection and Immunity，591387-1393，1991)，利用与琼脂糖偶联的单克隆抗体进行免疫亲和色谱，得到纯化dO的制备物。
在第一个实验中，将4HX、dO和rPMT的制备物稀释到相同的蛋白浓度(0.1mg/ml)，加入25mM Tris-HCl pH7.5以确保各样品中的pH相同，然后各样品在37℃下保温。在0时刻(对照)、24小时后和48小时后取样进行SDS-PAGE(参见图21)。在保温过程中，所测试的三种蛋白都未观察到明显的降解。分别代表rPMT、衍生物O或4HX的各条带的强度在24小时和48小时后保持不变。未观察到有表明降解发生的明显低分子量条带出现。由这些实验得出结论在这些保温条件下，4HX、dO和rmPMT就稳定性而言具有相同的性质。
在进一步的实验中，比较了rPMT、衍生物O和4HX在蛋白水解酶胰蛋白酶存在下的稳定性。将这三个蛋白样品如上所述调至相同的蛋白浓度和pH，并分别在1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶存在下于37℃下保温24小时。在该对比实验中引入已在利用Q-Sepharose和Phenyl Sepharose色谱进行纯化试验的过程中富集的衍生物O制备物。用SDS-PAGE分析法将经胰蛋白酶处理的样品与在加胰蛋白酶之前收集的样品进行比较，参见图22(rPMT)、图23(4HX)、图24(纯化的衍生物O)和图25(富集的衍生物O)。在含rPMT(参见图22)或4HX(参见图23)的样品中，加1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶未观察到明显降解。但衍生物O对胰蛋白酶处理高度敏感。对含经免疫亲和色谱纯化的衍生物O的样品进行SDS-PAGE表明，胰蛋白酶处理后没有残留的条带(参见图24)。在含富集的衍生物O的样品中，133kD的衍生物O条带在胰蛋白酶处理后已消失。但其他分子量较低的组分在胰蛋白酶处理后仍然存在(参见图25)。这些条带可能代表了对胰蛋白酶有耐受性的大肠杆菌蛋白，这些蛋白污染了这种富集了衍生物O的制备物。
由以上实验得出结论在没有蛋白水解酶存在情况下，4HX(如上所述纯化)和衍生物O(用免疫亲和色谱法纯化)在37℃下保温24或48小时的过程中是稳定的。但是，在胰蛋白酶存在下，衍生物O明显对蛋白水解降解敏感，而4HX rmPMT(和rPMT)在同样条件下是稳定的。因此，看来在4HX中保留了rPMT的胰蛋白酶耐受性，提示该rmPMT中的氨基酸置换并没有在该蛋白的三级结构中引入任何明显的结构变化，而不管rmPMT中氨基酸置换的功能重要性如何，参见下文的实施例4。
在第三个实验中，用以下方法考察了+GG1203、△H1223和1132″β-gal对蛋白水解降解的敏感性如前面对rPMT、dO和4HX所述，在不加蛋白水解酶和加1%、2%或5%(重量)胰蛋白酶的情况下，将纯化制备物于37℃下保温24小时。保温后用SDS-PAGE法分析样品，参见图34(+GG1203)、图35(△H1223)和图36(1132″β-gal)。在本实验中引入dO和4HX作为对照，并如上所述进行操作(数据未给出)。
在不加胰蛋白酶时，37℃下24小时后未观察到+GG1203的降解。在胰蛋白酶存在下，+GG1203条带的强度没有明显减弱，但出现了两个弱的低分子量条带，参见图34。因此，+GG1203基本上能够耐受蛋白水解酶的降解。类似地，在不加胰蛋白酶时，△H1223在37℃保温24小时的过程中是稳定的。但在蛋白水解酶存在下，出现许多紧密靠近的弱的低分子量条带，并且△H1223条带的强度略有减弱，参见图35。在不加胰蛋白酶时，融合蛋白1132″β-gal在37℃保温24小时过程中也是稳定的。但该蛋白在与胰蛋白酶一起保温过程中完全降解，因为既没有观察到1132″β-gal条带，也没有观察到任何降解产物，参见图36。
由该实验得出结论+GG1203对蛋白水解酶胰蛋白酶降解有耐受性，而△H1223略为敏感。相反，1132″β-gal融合蛋白与dO蛋白一样对蛋白水解降解敏感。
k.结论总的来说，已经证明，利用简单而廉价的色谱法，可以从400ml摇瓶培养物中以毫克量将失活rmPMT、4HX、+GG1203、△H1223和1132″β-gal纯化至纯度为90%。rPMT、4HX、+GG1203和△H1223阴离子交换色谱过程中很类似的洗脱曲线表明，这些rmPMT保留了rPMT的整个结构，因而也保留了天然PMT的整个结构。另外，纯化的rmPMT制备物不含残留的蛋白酶活性，因为在37℃保温24小时后未检测到降解。最后，4HX和+GG1203对胰蛋白酶具有高度的耐受性，△H1223略为敏感，而1132″β-gal和dO对胰蛋白酶消化高度敏感。
实施例4选定重组突变PMT蛋白的毒性早期的研究表明，在不同的生物测定中，失活PMT的功能受到同等的影响(Petersen S.K.等，“出血败血性巴斯德氏菌毒素的重组衍生物抗进行性萎缩性鼻炎疫苗的候选者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)。因此，4HX不具有任何可检测的促有丝分裂作用这一事实，提示该蛋白全面缺乏生物功能。这一问题是由于测定4HX对小鼠的毒性而提出的，这一测定基本上按Pedersen所述进行(Pedersen，K.B.1993，“猪萎缩性鼻炎的培养和血清学诊断”第22-31页，见Pedersen和N.C.Nielsen编“猪萎缩性鼻类”，CEC Agriculture EUR，8643 EN，EEC，Luxembourg)将rPMT(阳性对照)，牛血清清蛋白(BSA)(阴性对照)或4HX溶于200μl含0.02%正常小鼠血清(DAKO，Denmark)的无菌过滤磷酸盐缓冲盐水中，然后以不同的浓度给成年CF1×BALB/c小鼠腹膜内注射。用氨基酸分析法测定rPMT和rmPMT样品的浓度(Barkholt，V.和A.L.Jensen.“氨基酸分析以二硫化物为添加剂进行盐酸水解后测定蛋白质中的半胱氨酸和半半胱氨酸”，Anal.Biochem.177318-322，1989)。
将小鼠以3只小鼠为一组分为12组，所有三只小鼠都接受相同的蛋白剂量和制剂，记录激发后5天内每组中的死亡小鼠数。表Ⅲ概括了本实验的结果。
表Ⅲ 纯化4HX对小鼠的毒性与纯化rPMT的比较。
给成年CF1×BALB/c小鼠腹膜内注射不同浓度的纯化蛋白，记录5天内死亡小鼠数。本表在每组中受试小鼠数的上方给出了死亡小鼠数。引入牛血清清蛋白(BSA)作为阴性对照。
数据表明，rPMT的LD50为4-16ng，与WO89/09617所公开的LD50值一致(见上)。
表Ⅲ还表明，虽然4HX的用量最高达rPMT LD50的约5000倍，但注射4HX的小鼠无一死亡。结论是，在测试条件下，4HX与BSA一样是无毒的。
在类似的实验中，分别将+GG1203和1132″β-gal及△H1223的毒性与rPMT作了比较。实验完全如前面对4HX所述进行，所得数据概括于表Ⅳ和表Ⅴ。
表Ⅳ 纯化+GG1203和1132″β-gal的毒性与纯化rPMT的比较。
用不同浓度的纯化蛋白给成年CF1×BALB/c小鼠腹膜内注射，并记录5天内的死亡小鼠数。本表在每组受试小鼠数的上方给出了死亡小鼠数。引入牛血清清蛋白(BSA)作为阴性对照。
表Ⅴ 纯化△H1223的毒性与纯化rPMT的比较用不同浓度的纯化蛋白给成年CF1×BALB/c小鼠腹膜内注射，并记录5天内的死亡小鼠数。本表在每组受试小鼠数的上方给出了死亡小鼠数。引入牛血清清蛋白(BSA)作为阴性对照。
实施例5选定候选疫苗的免疫原性早期的研究表明，猪体内抗PMT抗体的诱导与针对进行性萎缩性鼻炎的防护作用紧密相关(Nielsen等，Can.J.Vet.Res.，55128-138，1991)。一种用于测试失活PMT在猪体内免疫原性的合适模型系统涉及小鼠的免疫接种(Petersen，S.K.，N.T.Foged，ABording，J.P.Nielsen，H.K.Riemann和P.L.Frandsen“出血败血性巴斯德氏菌毒素的重组衍生物抗进行性萎缩性鼻炎疫苗的候选者”，Infect.Immun.591387-1393，1991)。采用经过改良的这一模型，用CF1×BALB/c小鼠代替自交BALB/c小鼠，验证纯化4HX的免疫原性，从而验证4HX是否可作为疫苗的活性成分使用。按上述方法进行氨基酸分析，测定rPMT和rmPMT样品的浓度。
所测试的疫苗制备物在250μl磷酸盐缓冲盐水(2mM磷酸钠pH7.2、6mM NaCl)(PBS)中含有不同浓度的经甲醛失活的纯化重组PMT(frPMT)(阳性对照)、或用遗传学方法失活的纯化4HX蛋白。候选疫苗4HX和rPMT的纯化如实施例2所述进行，rPMT的甲醛处理如Foged所述进行(Foged，N.T.“用单克隆抗体检测经甲醛去毒的出血败血性巴斯德氏菌毒素上的稳定抗原决定基”，Vaccine 9817-824，1991)在20℃下，将纯化的rPMT(0.5mg/ml，1ml)用含0.37%(w/v)甲醛、0.1%甲醇的1升PBS pH7.6透析。72小时后，在透析缓冲液中加入赖氨酸-HCl至终浓度为0.1%(w/v)，在4℃下再透析8小时，然后在4℃下用PBS pH7.2进行若干轮透析，得到最终的frPMT制备物。使所有疫苗制备物吸附到0.26%氢氧化铝凝胶上(Alhydrogel A级;Superfos，Denmark)。
以两周的间隔给成年CF1×BALB/c小鼠接种两次。第二次接种两周后，给小鼠腹膜内注射200μl含100ng rPMT和0.02%正常小鼠血清(Dako，Denmark)的PBS，以激发小鼠。在激发前一天从所有小鼠体内取血样，然后用下述ELISA方法分析抗rPMT抗体用已在PBS涂布缓冲液(25nM NaH2PO4、75mM NaH2PO4、145mM NaCl、0.1% Tween 20，pH7.2)中稀释至3μg/ml的rPMT涂布微量滴定板(96孔，高容量，Nunc，Denmark)，各小孔用洗涤缓冲液(PBS+0.5M NaCl、0.1% Tween 20，pH7.2)洗三次，在20℃下与已在洗涤缓冲液中稀释的血清一起保温2小时。再进行三次上述洗涤后，加入已在洗涤缓冲液中以1∶5000稀释的第二抗体(与兔抗鼠IgG抗体结合的辣根过氧化物酶，DAKO，Denmark)，并使其在20℃下反应2小时。再进行三次上述洗涤后，加入0.67mg/ml邻苯二胺(OPD)、0.0125% H2O2、34.7mM柠檬酸、66.7mM NaH2PO4以发生颜色反应。加入1M H2SO4停止反应。然后在Titertek Multiskan Ⅱ Plus ELISA读数器(Labsystems OY，Finland)上测定492nm处的光吸收，并测定每个血清样品的抗rPMT抗体滴度，以使492nm光吸收达0.5的稀释度表示。免疫接种实验的结果总结在下面的表Ⅵ、表Ⅶ和图37中表Ⅵ 纯化4HX的免疫原性与经甲醛处理的纯化rPMT(frPMT)的比较测定不同浓度的两种疫苗成分在小鼠体内诱导抗PMT抗体滴度的能力，以及保护这些小鼠免受100ng纯化rPMT腹膜内注射激发的能力。以两周的间隔给成年CF1×BALB/c小鼠皮下接种两次。第二次接种两周后取血样，并对小鼠进行激发。本表在每组中受激小鼠数上方给出了死亡小鼠数，并给出了抗rPMT滴度。
表Ⅶ 用frPMT和rmPMT接种的动物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值表示(SD标准差)
以上数据表明，在该模型系统中，4HX对小鼠的防护作用与frPMT同样有效(因此也与WO89/09617中所公开的上述衍生物O同样有效)。
本实验的抗rPMT血清滴度数据示于图37。
用25或5μg/ml frPMT或rmPMT免疫导致所有动物的血清转化。用1μg/ml免疫也导致所有5只用frPMT免疫过的动物的血清转化，而在用rmPMT的一组动物中有4只动物呈阳性。未发生血清转化的动物在激发后死亡。在用0.2或0.08μg/ml的剂量免疫后没有一只动物发生血清转化。因此，使用rmPMT时发现血清转化和对激发的防护作用之间有100%的相关性。用学生氏t检验法分析分别用frPMT和rmPMT接种的动物的血清抗rPMT滴度时，这些数据之间没有显著性差异(在5%显著性水平上)，表明这些疫苗组合物在接种的动物体内产生类似的抗rPMT抗体滴度，并产生类似的剂量-反应关系。
在一个类似的实验中，通过与4HX比较评价了+GG1203和1132″β-gal的免疫原性。rmPMT的纯化、接种、取血样及激发均如上所述进行，不同的是激发剂量改为200ng。该实验的结果示于表Ⅷ和Ⅸ及图38。
表Ⅷ 纯化rmPMT的免疫原性。
测定不同浓度的疫苗成分保护小鼠免受200ng纯化rPMT腹膜内注射激发的能力。以两周的间隔给成年CF1×BALB/c小鼠皮下接种两次。第二次接种两周后取血样，并对小鼠进行激发。本表在每组受激小鼠数的上方给出了死亡小鼠数。
表Ⅸ 用4HX、+GG1203和1132″β-gal接种的动物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值+标准差表示。
表Ⅷ、表Ⅸ和图38的数据证实，+GG1203的小鼠抗致死剂量rPMT激发保护作用，以及在该模型系统中在接种小鼠体内的抗rPMT血清滴度诱导作用，与4HX同样有效。用5和25μg/ml+GG1203免疫，或者用2.5和12.5μg/ml 4HX免疫，导致所有动物的血清转化。这相应地反映在0.7-1.3之间的低标准差上。用1μg/ml+GG1203免疫使组内5只动物都发生血清转化，而用0.5μg/ml 4HX免疫则使组内5只动物中有4只发生血清转化，并使平均滴度达到6.1，相比之下，用+GG1203免疫时平均滴度为7.5。因此，+GG1203的标准差低(0.7)，4HX的标准差高(3.4)。在更高的剂量下，4HX和+GG1203所达到的滴度差不多。
与4HX和+GG1203相反，1132″β-gal在剂量高达2μg/ml时仍不能诱发免疫反应。用10μg/ml 1132″β-gal免疫使组内5只动物中有2只发生血清转化，平均滴度为3.6，大大低于用类似剂量的4HX和+GG1203免疫时所达到的滴度。
结论是，+GG1203、4HX和1132″β-gal都产生保护性的抗rPMT抗体。+GG1203和4HX产生与rPMT反应的抗体的能力差不多，而1132″β-gal则需要更高的剂量才能产生与4HX和+GG1203的反应差不多的抗体反应。4HX和+GG1203引起抗rPMT血清滴度的能力之间没有显著差异(在5%的显著性水平上)，表明这些疫苗组合物在所接种的动物体内产生类似的抗PMT抗体滴度，并产生类似的剂量-反应关系。对所有三种候选疫苗来说，血清抗rPMT抗体滴度和抗rPMT激发保护作用之间都有高度的相关性。但是，有一只用+GG1203接种的小鼠发生了血清转化但未受到抗激发保护。
在第三个实验中，通过与4HX比较评价了△H1223的免疫原性。rmPMT的纯化、接种、取血样和激发均如上所述进行，激发剂量为200ng。本实验的结果示于表Ⅹ和表Ⅺ及图39中。
表Ⅹ 纯化rmPMT的免疫原性。
测定不同浓度的疫苗成分保护小鼠免受200ng纯化rPMT腹膜内注射激发的能力。以两周的间隔给成年CF1×BALB/c小鼠皮下接种两次。第二次接种两周后取血样，并对小鼠进行激发。本表在每组受激小鼠数上方给出了死亡小鼠数。
表Ⅺ 用4HX和△H1223接种的动物的抗rPMT血清滴度。滴度以log2值+标准差表示。
表Ⅹ、表Ⅺ和图39的数据证实，△H1223在该模型系统中的小鼠抗rPMT保护作用至少与4HX同样有效。两种免疫原的最低免疫剂量都未产生血清反应。在1μg/ml(0.5μg/ml)和更高的剂量下，所有动物都发生血清转化。用学生氏t检验法分析时，滴度在5%显著性水平上相似。这表明，这两种疫苗组合物在所接种的动物体内产生相似的抗PMT抗体滴度，并产生相似的剂量-反应关系。尽管如此，有两只用0.2μg/ml △H1223接种的小鼠在用200ng rPMT激发后存活下来。
结论证明了用纯化的置换、缺失、插入或融合rmPMT接种能保护小鼠免受致死剂量纯化rPMT的激发。在多数情况下，这种保护作用与抗rPMT血清抗体的诱导作用相关。但是，与其他rmPMT和frPMT相比，所选择的融合蛋白需要用更高的剂量免疫才能诱导出相似的血清反应和保护作用。所选择的置换、插入和缺失rmPMT在诱导血清滴度方面同样有效，它们引起抗rPMT激发保护作用的能力也差不多。但低剂量的△H1223对两只经过接种但未发生血清转化的小鼠产生保护作用，+GG1203则有一例未对发生血清转化的小鼠产生抗激发保护作用。
所选择的置换、缺失和插入rmPMT，在诱导小鼠体内血清抗rPMT抗体滴度方面及小鼠抗rPMT激发保护作用方面，与frPMT同样有效。
但是，据WO89/9617公开，与用fPMT接种的动物相比，用衍生物O接种的动物所产生的抗PMT血清滴度明显较低。据认为，这种差异的原因在于，与截短的衍生物O相比而不是与本研究中所用PMT的重组来源相比，这些rmPMT的预期结构变化较小，因为所有已知生物体系中的rPMT和PMT似乎都是难以区分的。
与前人所述的限制酶缺失O衍生物相比，rmPMT的免疫原性得到改进，产量更高，稳定性也得到改进;rmPMT在简单的常规纯化方法中易于纯化，这反映出它保留了与PMT相关的物理性质。这使本文所述的rmPMT成为在商业上令人感兴趣的候选疫苗成分，可用于有效预防由出血败血性巴斯德氏菌感染引起的疾病，例如进行性萎缩性鼻炎。
所选择的置换、插入和缺失突变基因，都包含至少3个碱基对的突变，因此，在这些情况下回复为野生型toxA的可能性可以忽略。
权利要求
1.一种重组突变蛋白，该蛋白至少部分由一个DNA顺序编码，该DNA顺序可以由toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种(Pasteurellamultocidasspmultocida)45/78毒素(PMT)的toxA基因，通过一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到，所述蛋白能够与针对由出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78编码的PMT而产生的抗体结合，其计算分子量至少为140kD。
2.权利要求1的蛋白，该蛋白由一个DNA顺序编码，该DNA顺序可以由编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素的toxA基因，通过所述基因中一个独特EcoRI限制位点下游的一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到。
3.权利要求1的蛋白，该蛋白的分子量至少为141kD。
4.权利要求3的蛋白，该蛋白的分子量至少为143kD。
5.权利要求1的蛋白，该蛋白用某种纯化方法纯化时至少80%可纯化，所述纯化方法包括利用Q-Sepharose Fast Flow(Pharmacia)在2cm2×25cm色谱柱中进行阴离子交换色谱，以表达所述蛋白的细菌提取液形式加入蛋白，加到柱上的细菌总蛋白量约为200mg，流速约为30cm/小时，用含0-1000mM NaCl缓冲液的线性梯度洗脱吸附的蛋白，必要时接着用Phenyl Sepharose CL-4B(Pharmacia)柱对洗脱出的组分进行疏水性相互作用色谱，该柱的线度为2cm2×20cm，流速为30cm/小时，洗脱吸附的蛋白并测定其含量。
6.权利要求5的蛋白，该蛋白用所述纯化方法至少94%可纯化。
7.权利要求1的蛋白，该蛋白是由一个DNA顺序编码的蛋白，该DNA顺序是由toxA基因通过用编码不同氨基酸的密码子置换至少一个编码113-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
8.权利要求7的蛋白，该蛋白是由一个至少有两个密码子(例如至少三个密码子)被置换的DNA顺序编码的。
9.权利要求8的蛋白，该蛋白是由一个至少有四个密码子被置换的DNA顺序编码的。
10.权利要求7的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，被置换的密码子是编码选自丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的氨基酸的密码子。
11.权利要求7的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，被置换的密码子是1175-1285位之间的密码子。
12.权利要求11的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，被置换的密码子是1200-1230位之间的密码子。
13.权利要求1的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序是由toxA基因通过缺失至少一个编码1131-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
14.权利要求13的蛋白，该蛋白是由一个缺失至少两个密码子(例如至少三个密码子)的DNA顺序编码的。
15.权利要求14的蛋白，该蛋白是由一个缺失至少四个密码子的DNA顺序编码的。
16.权利要求15的蛋白，该蛋白是由一个缺失至少七个密码子的DNA顺序编码的。
17.权利要求13的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所缺失的密码子是编码选自赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密码子。
18.权利要求13的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所缺失的密码子是1175-1285位之间的密码子。
19.权利要求18的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所缺失的密码子是1215-1285位之间的密码子。
20.权利要求1的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序是由toxA基因通过在编码1131-1285位间氨基酸的密码子的下游插入至少一个密码子而得到的。
21.权利要求20的蛋白，该蛋白是由一个插入了至少两个密码子(例如至少三个密码子)的DNA顺序编码的。
22.权利要求21的蛋白，该蛋白是由一个插入了至少四个密码子的DNA顺序编码的。
23.权利要求20的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所插入的密码子是编码甘氨酸的密码子。
24.权利要求23的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所插入的密码子是插在1175-1285位之间的位置上。
25.权利要求24的蛋白，编码该蛋白的DNA顺序中，所插入的密码子是插在1200-1230位之间的位置上。
26.权利要求1的蛋白，该蛋白的促有丝分裂效力至多为rPMT的75%，这是通过测定该蛋白对NIH3T3细胞的增殖作用而测定的，所述测定包括第一步，根据含约20ng/ml PMT悬浮液连续稀释液的PE测定结果制做标准曲线，并按下式计算PEPEx= (Nx-No)/(Npmt-N0) x100%其中Nx是装有样品稀释液x的三个培养皿中的平均细胞数，Npmt是装有大肠杆菌SPE1036全细胞提取液的三个培养皿中的平均细胞数，所述大肠杆菌SPE1036携有编码PMT的pSPE680，所述提取液含有终浓度为20ng/ml的PMT，N0是装有大肠杆菌DH5α全细胞提取液的三个培养皿中的平均细胞数，所述培养皿装有汇合单层NIH3T3细胞;第二步，测定蛋白含量在1-100ng/ml范围的悬浮液的PE，并利用所述标准曲线计算相对于PMT的PE。
27.权利要求26的蛋白，该蛋白如权利要求26所述计算的促有丝分裂效力至多为50%，优选至多为35%，更为优选的是至多25%，最优选的是至多10%，特别是至多5%。
28.权利要求1的蛋白，该蛋白用权利要求5所述的纯化方法至少90%可纯化。
29.权利要求28的蛋白，该蛋白至少95%可纯化。
30.权利要求1的蛋白，该蛋白在权利要求5所述的阴离子交换纯化步骤中在约700mM NaCl处洗脱。
31.权利要求1的蛋白，该蛋白腹膜内给予小鼠时测得的LD50至少为51.2μg。
32.权利要求1的蛋白，该蛋白在以含至少1.0μg/ml吸附在氢氧化铝凝胶上的蛋白的疫苗制备物，以两周的间隔两次给予小鼠时，能保护至少80%的小鼠免受在第二次给予疫苗两周后腹膜内注射的250ng PMT的致死作用。
33.权利要求32的蛋白，该蛋白在以如权利要求31所述并含有5.0μg/ml吸附蛋白的疫苗制备物施用时，能保护100%的小鼠。
34.权利要求1的蛋白，该蛋白选自4HX、△H1223、+GG1203和1132″β-gal。
35.权利要求1的蛋白，该蛋白在以如权利要求5所述的含1.0μg/ml蛋白的疫苗组合物给予小鼠时，产生至少为6.2的抗rPMT滴度，这是如权利要求5所述测定的。
36.权利要求35的蛋白，该蛋白在以如权利要求5所述的含1.0μg/ml蛋白的疫苗组合物给予小鼠时，产生至少为9的抗rPMT滴度，这是如权利要求5所述测定的。
37.权利要求1的蛋白，该蛋白是由一个DNA顺序编码的融合蛋白，所述DNA顺序包含一个第一基因和一个第二基因，第一基因编码一种能与一种抗体反应的免疫原性蛋白，所述抗体则能与由toxA基因编码的出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)反应，所述基因是由包含toxA基因的复制子通过所述toxA基因的一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到的;第二基因编码第二免疫原性蛋白，第一和第二蛋白可作为融合蛋白表达。
38.权利要求37的蛋白，其中第一免疫原性蛋白的计算分子量至少为140kD。
39.权利要求37的蛋白，其中第二免疫原性蛋白是由一种病原生物表达的，该蛋白对由出血败血性巴斯德氏菌和所述病原生物引起的疾病产生预防作用。
40.一种制备重组突变蛋白的方法，该蛋白能够与针对出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)而产生的抗体结合，其分子量至少为140kD，所述方法包括如下步骤(ⅰ)分离出DNA顺序(a)或(b)，顺序(a)包含编码出血败血性巴斯德氏菌溶骨毒素(PMT)的toxA基因，包括编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78 PMT的基因;顺序(b)所含的一个顺序的基因产物能够与针对出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78 PMT而产生的抗体发生反应;(ⅱ)对所述DNA顺序进行透变处理，造成一个或更多个密码子的置换、缺失或插入，得到编码重组突变蛋白的突变DNA顺序;(ⅲ)将所得的突变DNA顺序插入到一个复制子中;(ⅳ)用该复制子转化一种细胞，在该细胞中，所述复制子能够复制，编码重组突变蛋白的突变DNA顺序能够表达;(ⅴ)在表达突变DNA顺序的条件下培养转化细胞;(ⅵ)从培养物中收集重组突变蛋白。
41.权利要求40的方法，其中步骤(ⅰ)中所分离的DNA顺序是编码出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)的toxA基因。
42.权利要求41的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成所述基因中一个独特EcoRI位点下游的一个或更多个密码子的置换、缺失或插入。
43.权利要求40的方法，其中步骤(ⅱ)中所得到的突变DNA顺序是编码分子量至少为141kD的重组突变蛋白的顺序。
44.权利要求43的方法，其中步骤(ⅱ)中所得到的突变DNA顺序是编码分子量至少为143kD的重组突变蛋白的顺序。
45.权利要求41的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成以编码不同氨基酸的密码子置换至少一个编码1131-1285位间氨基酸的密码子。
46.权利要求45的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少二个密码子(例如至少三个密码子)的置换。
47.权利要求46的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少四个密码子的置换。
48.权利要求45的方法，其中被置换的密码子是编码选自丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的氨基酸的密码子。
49.权利要求45的方法，其中步骤(ⅱ)诱变处理造成以编码不同氨基酸的密码子置换至少一个编码1175-1285位间氨基酸的密码子。
50.权利要求49的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少一个编码1200-1230位间氨基酸的密码子的置换。
51.权利要求41的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少一个编码1131-1285位间氨基酸的密码子的缺失。
52.权利要求51的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少二个密码子(例如至少三个密码子)的缺失。
53.权利要求52的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少四个密码子的缺失。
54.权利要求53的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少七个密码子的缺失。
55.权利要求51的方法，其中所缺失的密码子是编码选自赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密码子。
56.权利要求51的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少一个编码1175-1285位间氨基酸的密码子的缺失。
57.权利要求56的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少一个编码1215-1285位间氨基酸的密码子的缺失。
58.权利要求41的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成编码1131-1285位间氨基酸的密码子下游至少一个密码子的插入。
59.权利要求58的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少二个密码子(例如至少三个密码子)的插入。
60.权利要求59的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成至少四个密码子的插入。
61.权利要求58的方法，其中至少一个所插入的密码子是编码甘氨酸的密码子。
62.权利要求58的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成编码1175-1285位间氨基酸的密码子下游至少一个密码子的插入。
63.权利要求62的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理造成编码1200-1230位间氨基酸的密码子下游至少一个密码子的插入。
64.权利要求40的方法，其中步骤(ⅱ)的诱变处理是定位诱变，包括如下步骤构建能够与步骤(ⅰ)中分离的DNA顺序杂交的突变特异性引物顺序，用聚合酶链反应(PCR)法扩增所述引物顺序，然后切下所分离的DNA顺序中的一个片段，并用经过扩增的引物顺序置换。
65.权利要求40的方法，其中步骤(ⅲ)中插入了突变DNA顺序的复制子是一种质粒。
66.权利要求65的方法，其中所述质粒选自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003和pSPE1038。
67.权利要求40的方法，其中步骤(ⅳ)中所转化的细胞是一种细菌。
68.权利要求67的方法，其中所述细菌是革兰氏阴性菌。
69.权利要求68的方法，其中所述细菌是大肠杆菌。
70.权利要求40的方法，其中收集突变重组蛋白的方法是分离细胞，对分离出的细胞进行超声处理，并除去细胞碎片，得到含蛋白的细胞粗提液。
71.权利要求70的方法，该方法还包括纯化细胞粗提液的步骤。
72.权利要求71的方法，其中纯化过程包括阴离子交换色谱，包括用含0-1000mM NaCl的递增梯度缓冲液进行的洗脱步骤。
73.权利要求72的方法，其中纯化过程还包括一个疏水性相互作用色谱步骤，包括用含0-1000mM NaCl的递增梯度缓冲液进行的洗脱步骤。
74.权利要求72或73的方法，其中由洗脱步骤得到的流出液中突变重组蛋白的含量，按起始物的总蛋白含量计算至少为50%(重量)。
75.权利要求74的方法，其中突变重组蛋白的含量至少为75%(重量)。
76.权利要求75的方法，其中突变重组蛋白的含量至少为90%(重量)。
77.权利要求76的方法，其中突变重组蛋白的含量至少为94%(重量)。
78.权利要求77的方法，其中突变重组蛋白的含量至少为98%(重量)。
79.权利要求71的方法，其中突变重组蛋白的产率按细胞粗提液的总蛋白含量计算至少为1%(重量)。
80.权利要求79的方法，其中突变重组蛋白的产率按细胞粗提液的总蛋白含量计算至少为2%(重量)。
81.权利要求80的方法，其中突变重组蛋白的产率按细胞粗提液的总蛋白含量计算至少为3.5%(重量)。
82.一种DNA顺序，该顺序包含一个编码分子量至少为140kD的蛋白的基因，所述蛋白能够与一种抗体反应，所述抗体能与由toxA基因编码的出血败血性巴斯德氏菌出血败血亚种45/78毒素(PMT)反应，所述DNA顺序由含toxA基因的复制子通过所述toxA基因中一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到。
83.权利要求82的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过所述基因中一个独特EcoRI位点下游的一个或更多个密码子的置换、缺失或插入而得到。
84.权利要求82的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过用编码不同氨基酸的密码子置换至少一个编码1135-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
85.权利要求84的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过置换至少二个密码子(例如至少三个密码子)而得到的。
86.权利要求85的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过置换至少四个密码子而得到的。
87.权利要求84的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过置换至少一个编码选自丝氨酸、组氨酸、谷氨酰胺和苏氨酸的氨基酸的密码子而得到的。
88.权利要求84的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过置换所述toxA基因中至少一个编码1175-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
89.权利要求84的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过置换所述toxA基因中至少一个编码1200-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
90.权利要求82的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过缺失至少一个编码1131-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
91.权利要求90的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过缺失至少二个密码子(例如至少三个密码子)而得到的。
92.权利要求91的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过缺失至少四个密码子而得到的。
93.权利要求92的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过缺失至少七个密码子而得到的。
94.权利要求90的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过缺失至少一个编码选自赖氨酸、谷氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、缬氨酸和天冬氨酸的氨基酸的密码子而得到的。
95.权利要求90的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过缺失至少一个编码1175-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
96.权利要求90的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过缺失至少一个编码1215-1285位间氨基酸的密码子而得到的。
97.权利要求82的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过在编码1131-1285位间氨基酸的密码子下游插入至少一个密码子而得到的。
98.权利要求97的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过插入至少二个密码子(例如至少三个密码子)而得到的。
99.权利要求98的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子通过插入至少四个密码子而得到的。
100.权利要求97的DNA顺序，其中所插入的至少一个密码子是编码甘氨酸的密码子。
101.权利要求97的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过在编码1175-1285位间氨基酸的密码子下游插入至少一个密码子而得到的。
102.权利要求101的DNA顺序，该顺序是由含toxA基因的复制子，通过在编码1200-1230位间氨基酸的密码子下游插入至少一个密码子而得到的。
103.一种携有权利要求82的DNA顺序的复制子。
104.权利要求103的复制子，它是一种质粒。
105.权利要求104的复制子，它是一种选自pSPE680、pSPE888、pSPE900、pSPE1003、pSPE1038、pSPE1020、pSPE1134和pSPE1234的质粒。
106.权利要求105的复制子，它是编码突变重组蛋白4HX的质粒pSPE1038，该质粒保藏在DSM，保藏号为DSM7221。
107.一种用权利要求103的复制子转化的细胞，在该细胞中，所述复制子能够复制。
108.权利要求107的细胞，该细胞是一种细菌。
109.权利要求108的细胞，该细胞是一种革兰氏阴性菌。
110.权利要求109的细胞，该细胞是大肠杆菌。
111.权利要求1的突变重组蛋白作为疫苗的应用，所述疫苗用于预防由出血败血性巴斯德氏菌引起的疾病。
全文摘要
能够与针对出血败血性巴斯德氏菌毒素而产生的抗体结合的新的突变重组蛋白，该蛋白可作为疫苗用于预防由出血败血性巴斯德氏菌引起的疾病，也有可能用于预防其他疾病。该蛋白稳定性好并易于用简单纯化方法纯化。
文档编号A61K39/102GK1091773SQ93114440
公开日1994年9月7日 申请日期1993年9月30日 优先权日1992年9月30日
发明者S·彼得森, O·C·汉森, H·K·里曼, L·B·尼尔森 申请人:生物技术研究院