专利名称：预防或治疗癌症的抗癌组合物的制作方法
技术领域：
本发明基于惊人的发现-未变性乳清蛋白浓缩物具有免疫增强作用，更具体的说，本发明涉及口服未变性乳清蛋白浓缩物可提高宿主对化学因素诱发癌症的抵抗力，以及这类口服可抑制化学因素诱发的癌。
在美国专利申请298，971，1988年12月23日递交，和美国专利申请417，246，1989年10月4日递交，(本申请是该两申请的部分继续和分案申请)，并且，在Bounous等的“食物中乳清蛋白抑制二甲肼诱发肿瘤的发展”(1)一文中，我们报道的实验显示，经24周用二甲肼(DMH)诱发肿瘤的小鼠，连续以乳清蛋白(WPC)食物喂养，可使小鼠结肠中肿瘤细胞的发展(包括肿瘤细胞数及大小)受到抑制。这种抗肿瘤作用可能是由于增强靶细胞对致癌物的抵抗力和/或WPC对肿瘤细胞的直接抑制作用。在随后进行的一系列实验(2)中，在用DMH处理的开始的20周给动物喂Purina饲料，在用DMH处理的后8周改喂WPC饲料，结果显示WPC对肿瘤细胞有某种抑制作用。
最近，一组法国科学家(3)在体外证实了WPC对人体癌细胞的直接抑制作用。与此相似的对人乳腺癌细胞的体外研究也已表明牛血清白蛋白(BSA)是抑制癌细胞增殖的因素(4)。
我们已证明，WPC的这种活性特别依赖于WPC(U.S.＃563，794)的BSA组分中存在的谷氨酰半胱氨酸基团(还原型谷胱甘肽(GSH)合成所需的底物)。有趣的是，在培养物中加入半胱氨酸释放系统OTZ(过氧噻唑烷-4-羧酸酯，ozothiazolidine-4-carboxilate)，可使正常细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)水平增加，但却能反馈抑制人体肿瘤细胞中的GSH合成(5)。OTZ的这种不同的作用最近在体内得到证实(6)。因此，前面提到的WPC(3)和更具体的BSA(4)的直接抑制作用便可解释为在培养体系中释放了一种如谷氨酰半胱氨酸那样的有效的半胱氨酸释放系统。
因此我们可得出下列结论1)BSA是我们发现的WPC中主要具有促进GSH合成活性的蛋白质组分。我们相信这种活性是WPC增强免疫和抗癌作用的基础，这种活性特别依赖于WPC(U.S.＃563，794)的BSA组分中存在的谷氨酰半胱氨酸基团(Gly-Cys，合成GSH的底物)。
2)BSA的分子量(MW)是66，267，因此完全不同于Villadsen已得专利的抗癌因子的MW(分子量为500-20，000)(7)。
3)我们以前的工作(1，2)可以被解释为在DMH处理中，WPC食物通过增加细胞GSH，保护靶细胞抵抗致癌物的攻击，此外，GSH合成底物的增加可能抑制已形成的癌细胞的增殖。
4)我们现在已明确了WPC中高水平的BSA对于提供GSH合成底物的重要意义。我们可以作出结论食物中未变性状态、含BSA≥10%的WPC起到了抗肿瘤作用。
附图简解
图1雄性C57BL/6N1A小鼠在10周、17、20和21月龄时喂以未变性乳清蛋白(U-Lacp)、未变性乳清蛋白(D-Lacp)、酪蛋白、卵清蛋白或Purina食物对肝脏谷胱甘肽含量的影响。
图2雄性C57BL/6N1A小鼠在10周、17、20和21月龄时喂以未变性乳清蛋白(U-Lacp)、变性乳清蛋白(D-Lacp)、酪蛋白、卵清蛋白或Purina食物对心脏谷胱甘肽的含量的影响。
图3饲料中加入(20g/100g饲料)不同来源的WPC和酪蛋白对小鼠脾脏空斑形成细胞(PFC)应答的影响(绵羊红细胞注射量为5×106)。
详细描述我们首先叙述1988年12月23日递交的美国专利申请298，971及1989年10月4日递交的美国专利申请417，246中进行的实验，本申请作为以上申请的一个部分继续申请。
定义(a)乳清蛋白乳清蛋白是在pH4.6、20℃条件下去除酪蛋白后在“乳血清”或乳清中维持可溶的一组乳蛋白质。奶牛乳汁中的主要乳清蛋白是β-乳球蛋白(βL)，α-乳清蛋白(αL)，免疫球蛋白和血清白蛋白(SA)。
采用工业化过程从乳清中分离出的这些蛋白产物称为乳清蛋白浓缩物(WPC)或提取物。我们早期大部分实验中所用的WPC来源于牛奶(由DanmarkProteinA.S.提供的Lacprodan-80)。未变性状态WPC以U-Lacp表示;其变性状态以D-Lacp表示。乳清蛋白(L)是WPC的传统定义。
(b)C＝酪蛋白;
(c)SRBC＝绵羊红血细胞;
(d)PFC＝空斑形成细胞(脾)计数脾PFC用于检测对注射SRBC产生的体液免疫应答;
(e)GSH＝谷胱甘肽(L-γ-谷氨酰-L半胱氨酰甘氨酸);
(f)DMH＝1，2，-二甲肼;
(g)试验用限定的饲料配方其中仅改变蛋白质的种类;
(h)每升牛奶乳清中约含6g蛋白质，大部分乳糖、矿物质和水溶性维生素。
这些研究所用饲料(参见表3)饲料按以下方式制备20g选择的纯蛋白质，56g去除蛋白质的80056饲料粉，其中含玉米浆、玉米油、薯类淀粉、维生素和矿物质(由美国Mead-Johnson公司生产)，18g玉米淀粉，2g麸皮，0.05gNutramigen(维生素、铁等混合物，Bristol-Myers，Ontario，Canada)，2.65gKCl;0.84gNaCl。我们的饲料配方中碳水化合物和脂类成分都不变。在各种提纯饲料中唯一改变的是蛋白质的种类(20g蛋白/100g饲料)。在这种饲料含量下，所有试验用不同种类的蛋白质都提供了小鼠成长每日所必需的氨基酸的量(8)。维生素和矿物质在各批实验中都相同，其加入量必须保证小鼠生长每日所需量(9，10)。表1列出了各种推荐的小鼠饲料维生素需要量及我们一些配方中这些维生素的含量。由此可知我们实验所用的所有配方的设计都是根据可提供机体正常生长所需的充足营养、并保证血清蛋白的正常含量(9)，不致出现脱毛、皮炎、白内障、运动失调、脂肪肝等，后面几种症状在衰老小鼠中经常出现，与衰老过程有关。
表1试验饲料中维生素和矿物质含量(每100g饲料所含)JACKSON(10)试验饲料(JacksonLaboratoriesAIN76(9)饲料推荐量范围)维生素:
维生素A,IU1295180024-55.0400维生素D,IU26036014-506100维生素E,IU11.6181-2.75.0维生素K,mg0.060.09-0.005维生素B1,mg 0.34 0.63 0.22-0.99 0.60维生素B2,mg 0.38 0.69 0.24-1.1 0.60维生素B6,mg 0.26 0.36 0.1-0.55 0.70维生素B12,mg 0.0012 0.054 0.0039-0.0055 0.001烟酸,mg5.19.22.6-14.33.0叶酸,mg0.0630.120.05-0.270.2泛酸,mg1.933.381-5.51.6生物素,mg0.0310.0580.019-0.1650.02维生素c,mg53.365--胆碱,mg447649-145100肌醇,mg19.819.8--矿物质:AIN76钙,mg430#520磷,mg260#400镁,mg63.2#50铁,mg7.93.5锌,mg3.57#3.0铜,mg0.47#0.60碘,mg0.0230.02钠,mg232100钾,mg997360＃经矿物质分析(9)，(10)见参考文献空斑检测试验的免疫喂养的小鼠由静脉注射5×106个洗净的SRBC免疫，该品由Institut Armand-Frappier，Laval des Rapides，Quebec，Canada每周提供。
空斑形成细胞(PFC)的检测用于检测IgM PFC的方法基本上是由Cunningham和Szenberg(11)描述的方法，略作修改。脾细胞悬液的制备轻轻挤压脾，使其通过一个50目的不锈钢网筛，收集细胞于缓冲盐溶液(BSS)中，该溶液中加有10%热灭活的牛血清(Grand Island Biological Company，Montreal Quebec，Canada生产)。用BSS冲洗脾细胞并配成15ml悬液。脾红血细胞经2次冲洗后配成浓度为20%的悬液。豚鼠血清(Grand Island Biological Company，Montreal，Quebec，Candada生产)作为补体来源，用BSS稀释15倍。所有溶液均保存于冰水中备用。该试验包括在一试管中37℃加0.15ml SRBC和0.75ml补体溶液并混合，整个混合物混匀后立即取出，滴加于载玻片的小格中，用温石蜡密封后放在37℃孵育40-60min，计数空斑形成细胞数，每个脾的总数估计为一个样本(0.05ml脾细胞)PFC数×300。结果以每个脾而不是以106脾细胞表示，因为这样表示能更准确地反映脾自身的功能状态。
小鼠对SRBC的PFC应答通常在免疫后第5天检测，此时应答最强;或者，在动力学研究中分别于免疫后第3、4、5和6天检测。
统计处理各饲料组的平均PFC值的比较用Student′s检验(2组比较)或ANOVA方差分析(2组以上比较)。由于组间存在先天性差异，用Brown和Forsythe方法校正结果。
脾谷胱甘肽含量用MettlerPM-300天平称取90mg小鼠脾脏，各样品重量与90mg的差距小于5mg(5%)样品在5-磺基水杨酸(5%，W/V)中，制成匀浆，在微型离心机上以10000×g离心5min。取上清液在当天按Anderson的方法(12)测定，数据以μmol/g湿重组织表示。
表2氨基酸组成(g/100g蛋白质)氨基酸 WPC*卵白蛋白**天冬氨酸11.37.9苏氨酸7.24.4丝氨酸6.17.9谷氨酸20.114.1脯氨酸6.63.8甘氨酸2.03.7丙氨酸5.47.6结氨酸6.57.8异亮氨酸6.76.5亮氨酸11.28.8酪氨酸2.94.2苯丙氨酸3.16.4赖氨酸9.56.0组氨酸1.92.2精氨酸2.75.9甲硫氨酸2.23.9半胱氨酸2.42.4色氨酸1.71.5＃Lacprodan-80来自Danmark Protein A/S，Copenhagen，Denmark，1986年用于我们实验中。
＃根据1957年U.S.D.A.“食物氨基酸含量”计算，半胱氨酸含量用Sigma分析为2.38g/100g蛋白，本室样品为2.4g/100g蛋白。
组织中谷胱甘肽测定90mg小鼠心或肝加5-磺基水杨酸(5%，W/V)制成匀浆，在微型离心机上以10000×g离心5min，取上清液于当天按Anderson法(12)测定，结果以μmol/g湿重组织表示。
在小鼠17月龄时开始在饲料中加入不同蛋白质，3个月后喂养U-Lacp(未变性乳清蛋白Lacprodan-80)组小鼠肝、心的GSH含量高于喂养D-Lacp(变性乳清蛋白Lacprodan-80)组、酪蛋白组、卵白蛋白组和Purina饲料各对照组(图1，2)。喂Purina实验室饲料的小鼠在10周、17、20和21月龄时心、肝组织中GSH含量相似。在连续3-4个月喂U-Lacp饲料后，小鼠心、肝GSH含量高于“正常”值(图1，2)。
此外，U-Lacp饲料喂养后3周，刚成年C3H/Hen小鼠在抗原刺激淋巴细胞无性扩增的同时，脾脏GSH含量上升;而作为对照的D-Lacp、酪蛋白、卵白蛋白饲料组脾GSH含量下降。在老龄C57BL/6N1A小鼠，长期以U-Lacp饲料喂养可使肝、心组织GSH水平适中但持续地增加(图1，2)，WPC使GSH增加的活性只限于未变性型(U-Lacp)，这一性质并不仅仅是因为WPC中半胱氨酸含量高，因为具有相似的半胱氨酸含量的卵白蛋白(表2)作为蛋白质来源就没有此种生物活性。U-Lacp的这种性质并不特别地依赖于其用体重、血清蛋白、饲料消耗来衡量的营养效能，而似乎取决于这种蛋白质在天然状态下的一级、二级和三级结构。
一些以前报道过的增加细胞内GSH水平的方法或者有毒性(13)，或者有初始消耗GSH的危险(14，15)。这些方法包括使用γ-谷氨酰半胱氨酸(16)，噻唑烷(17)或谷胱甘肽酯(18)(美国专利＃4，784，685)它们提供了短期调节的可能性。然而，并未见到使细胞GSH稳定增加的远期效果，也未能证实长期使用不存在毒性。实际上，已发现GSH和谷胱甘肽二硫化物在很多短期试验的常规使用时有致癌和致畸变作用(13)。与我们的发明有关的是，近来研究表明，与老龄动物GSH缺乏有关的是GSH前体半胱氨酸的缺乏而不是生物合成酶的降低(19)。同样，长时间酒精喂养的大鼠的肝细胞中GSH的降低似乎并不是因为γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶活性受到限制(20)。
图1，2的数据显示对照的Purina饲料组小鼠肝、心GSH含量一直保持在很稳定的水平，另一方面，营养相等的U-Lacp组小鼠组织中GSH则出现适中但持续地增加。在尿中仅能检出极少量的谷胱甘肽但没有能易转成谷胱甘肽的分解的产物发现(21)。所得到的细胞GSH含量的变化非常有限，可能反映了这一分子特殊重要性和严格的调控。GSH本身作为GSH合成酶的一个负反馈调节物，这显然限制了增加GSH含量的细胞能力(22)。谷胱甘肽还原酶使还原型谷胱甘肽(GSH)保持优势(≥90%)。这既可维持其功能状态又可限制细胞内浓度，因为还原型谷胱甘肽(GSH)不能通过细胞膜，而氧化型谷胱甘肽(GSSG)可通过细胞膜并的确流出，而使谷胱甘肽总量下降。除这些酶外，γ-谷氨酰转肽酶(GGT)在GSH代谢中有重要作用。GGT在细胞膜水平上为谷氨酰部分提供了一条补救途径，将谷氨酰送回胞液以便用于GSH合成。该酶活性的增加与几种细胞系和恶性组织中GSH含量上升有关(23，24)。
饲料中含有的维生素B1有利于GSH的增加。维生素B1参与产生NADPH的戊糖磷酸旁路中的转羟乙醛酶反应，GSSG可被NADPH和谷胱甘肽还原酶还原为GSH。
维生素B2也有利于GSH的增加，由维生素B2依次生成的黄素单核苷酸(FMN)和黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)也参与谷胱甘肽还原反应。
有些牛奶，特别是产自新西兰的牛奶，含硒量很低，硒包含在谷胱甘肽过氧化酶中，缺硒的哺乳动物的过氧化酶活性明显低下。因此，有利于抗癌的GSH形成需要适量的硒。
如果假定每日摄入60g未变性乳清蛋白，其中维生素B1、维生素B2和硒的水平为维生素B11.5-2.0mg维生素B21.7-2.2mg甲硫氨酸硒40-60mcg。
细胞中GSH含量少量增加的作用比预料的要大。例如有很多关于人及小鼠体外选择的肿瘤细胞系对不同的化疗药物有抗性的报道。这些细胞系细胞内GSH水平比对药物敏感的亲代细胞系增加了2倍，尽管事实上抗药性常常更大，如可高达30倍(24，25，26)。在这些细胞系，由选择性地抑制GSH合成使GSH减少，可恢复该抗性细胞对药物的敏感性。只有在整个药物治疗期都使GSH持续消耗才有这种效果。
由于实际上细胞GSH受严密的调控，2倍的增加可能是极限水平，而GSH水平少量增加的作用可能被大量GSH应用酶(如谷胱甘肽过氧化酶，谷胱甘肽-S-转移酶)所放大了，在喂富含乳清饲料的动物上观察到了GSH含量可重复的变化，可能有重要的生物学意义。这种增加的长期性可以极大地有助于这种效果。
我们的发现表明，酪蛋白饲料组小鼠与Purina饲料对照组比，DMH诱发的结肠癌的数目及大小分别减少了0.3和0.4(表3)。但是具有相似营养效果的WPC饲料组小鼠与Purina对照组比降低了4倍(表3)。DMH诱发的结肠肿瘤就其损害的种类和化疗应答特征来看都与某些人类肿瘤相似(27，28)。我们以前的研究(1)已报道了乳清蛋白与酪蛋白相比有较好的抗癌效果。牛奶中大约80%的蛋白质是酪蛋白，只有20%是乳清蛋白(29，30)。此外，用传统的制备酪蛋白的方法，牛奶中乳清蛋白总量的40%-60%与酪蛋白共沉淀(31)。因此可以相信，所观察到的酪蛋白的较小的抗癌作用可能是由于相对少量的与酪蛋白共沉淀的乳清蛋白。从上述研究中可知，奶制品的抗癌活性，正如我们的发现所表明的，在于其蛋白质部分，特别是牛奶中的乳清蛋白成分。
这种WPC补给食料部分或全部取代了病人从其它来源的蛋白质摄入量，其有益效果得到增强。
存活研究生物活性取决于WPC中的天然构象(a)老龄小鼠在一定期限的存活我们研究表明，经6-7个月有限时间的观察，当雄性C57BL/6N1A
表3
小鼠有55%死亡时，从21月龄时开始给U-Lacp饲料的小鼠与等营养Purina饲料对照组比，平均存活期延长了30%。酪蛋白组小鼠的存活曲线与Purina对照组非常相似。然而，在接下来的4个月，用D-Lacp代替U-Lacp喂养，在这一期间，剩余的乳清蛋白喂养的小鼠的死亡时间与酪蛋白及Purina组相似。在整个研究过程中，多次测定了PFC，证实宿主免疫性的增强与WPC的未变性状态有关(图3)。在以上研究的第二阶段，尽管D-lacp仍保留了营养性，当存活曲线的差异变小时，WPC增强免疫的活性也消失了。整个研究中，在热量摄取、体重方向各组间未见明显差异。由于寿命主要取决于个体的基因组，在有限时间内延迟死亡不太可能影响整个寿命。然而至少在该饲料增进免疫作用的意义上，本研究可以被认作从试验组(U-Lacp)到对照组(D-Lacp)的单一方面的变换，表明WPC对老龄小鼠生存的作用取决于其未变性状态，并与本研究中PFC测定结果相吻合(图3)。
(b)DMH诱发的结肠癌小鼠短期及长期存活率在DMH处理的小鼠中，我们注意到，到28周末为止的死亡率和至实验结束时的存活时间因蛋白种类不同而存在区别。在研究开始的头7个月，U-Lacp饲料喂养的小鼠无一死亡，而此时酪蛋白和Purina对照组小鼠死亡率为33%;在后来的4个月，用D-Lacp取代U-Lacp喂养小鼠，这4个月D-Lacp与酪蛋白比，似乎没有延长生存的作用(表4)。在整个研究中多次测脾PFC，以证明以前报道的这些饲料对免疫功能的生理作用和这些效果的稳定性。U-Lacp饲料在实验的前7个个月都很有效，而在后4个月换成D-Lacp后，先前在U-Lacp喂养时看到的小鼠免疫增强效果消失了。U-Lacp和D-Lacp喂养小鼠的PFC应答值与图3所提供的那些值相一致。因此，这一研究证明了一个假设，即WPC延长患瘤小鼠存活时间的生物活性取决于其天然状态，这与我们研究中采用的PFC测定结果直接相关。
表4饲料中的牛奶蛋白对致癌物DMH作用24周的A/J小鼠短期及长期存活率的影响饲料组b乳清蛋白d酪蛋白 Purina对照28周时死亡率a0% 33% 33%存活时间c(周) 40 41 30a)经方差分析乳清蛋白组比Purina组比酪蛋白为p＜0.05。
b)各组原有小鼠数为12。
c)存活时间从开始给致癌剂算起。乳清蛋白及酪蛋白两组与Purina组比差异显著，Mantel-Cox检验p＜0.01。
d)第3-28周为未变性乳清蛋白饲料;28周后改用变性乳清蛋白饲料。
有关上述实验结果列于表3，4，U-Lacp来源为Lacprodan80。
我们现在在符合公认的无菌污染安全标准的前提下，赞成对牛奶采用最温和的处理方式制成未变性状态的WPC。极高的溶解度指数说明溶液中的蛋白质基本上未变性，因而表明了超滤方法(31)的温和性。尽管经检测来自其它商业途径的浓缩物中的蛋白质大多处于未变性状态，正如浓缩物具有相对高的溶解度所表明，但这些混合物中的血清白蛋白和免疫球蛋白未达到一定的活性标准(31)。当使用高温进行巴斯德灭菌时，这些对热非常敏感的蛋白质则变性，因此沉淀并部分从乳清中丢失。
我们研究还表明当用S(正丁基)高半胱氨酸磺酰亚胺(S(n-butyl)homocysteinesulfoximide)使脾谷胱甘肽降低一半，同时显著降低乳清蛋白喂养小鼠的体液免疫应答。这也为饲料中乳清蛋白中的谷胱甘肽对增强免疫的重要作用提供了进一步的证据(32)。
给予γ-谷氨酰半胱氨酸可使组织中谷胱甘肽含量增加，小鼠皮下(S.C.)注射后40-60min，肾脏的细胞内谷胱甘肽增加约50%，2小时后回到对比值(33)。注射的γ-谷氨酰半胱氨酸被完整地转运并作为谷胱甘肽合成酶的底物(33)。
食物蛋白中氨基酸序列的进化允许我们研究乳清蛋白中谷氨酰半胱氨酸(Gly-Cys)基团的出现及其与促进GSH形成的可能的关系。确实，来自牛奶的WPC含有大量Gly-Cys，酪蛋白与此不同，喂养酪蛋白没有增加小鼠组织GSH(35)。Gly-Cys基团主要存在于血清白蛋白部分(每个蛋白分子中有6组)。在可食用的动植物蛋白中Gly-Cys含量极低。对可食用蛋白氨基酸序列所有可得数据进一步分析，结果显示，具有二硫键的Gly-Cys基团仅存在于某些乳清蛋白中，至于卵白蛋白的卵类粘蛋白，在30000mol重量分子中仅含2个Gly-Cys基团。
我们最近的数据(31)进一步证明，喂养饲料的溶解度最高(天然构象)的WPC饲料的小鼠体液免疫应答最高，更重要的是，这些WPC中含有较高浓度的不耐热的牛血清白蛋白(≥10%)和免疫球蛋白，此外，喂这WPC饲料的小鼠具有较高的组织GSH含量。Gly-Cys基团和与分子的天然构象有关的分子内的键被认为是蛋白质混合物促进GSH生成活性的关键因素。
日本最近的实验(36)表明，用我们的未变性乳清蛋白浓缩物(商标为“Immunocal”)(25g/100g饲料)喂养4周的BALB/C小鼠脾细胞体外SRBC免疫应答增加，与对照组(25g纯酪蛋白/100g等热饲料)比，L3T4+细胞数也增加(12.58×106±1.36对3.69×106±0.50)，类似地，脾脏L3T4+/LYt-2+比率在未变性WPC喂养组是1.36±0.07;酪蛋白喂养对照组为0.55±0.77(p＜0.001)。从经较低温度巴斯德灭菌的牛奶WPC中能得到较高含量的热敏感血清白蛋白和免疫球蛋白，这可能更接近天然牛奶的成分。这些资料支持这一假设天然构象的血清白蛋白含有不耐热的Gly-Cys是WPC生物活性的关键成分。
“ServicederecherchesurlesalimentsduMinisteredel'agricultureduQuebec”(inSt-Hyacinthe，Quebec，Canada)已制出适用的牛WPC，它具有以下特点纯蛋白质含量达75%(其余主要是乳糖，还有一些脂肪和水)，溶解度指数在pH4.6时为99.5%。经聚丙烯酰胺凝胶电泳分析，整个乳清蛋白中的蛋白组合物如下β-乳球蛋白59.1±4.0;α-乳清蛋白6.6±0.7;血清白蛋白9.7±1.0;免疫球蛋白24.6±2.6(平均值±标准差)。溶解性指数最好为99%以上。
约占该乳清蛋白总量10%的血清白蛋白含量几乎是已测定的其它商品WPC的血清白蛋白含量的2倍。可以相信，血清白蛋白水平≥10%对改善免疫系统很有帮助。
血清白蛋白含有大量的Gly-Cys，后者是机体合成GSH的底物。GSH的作用在“食物中未变性乳清蛋白的生物活性;谷胱甘肽的作用”(Clin.InvestMed14296-309，1991)一文中已有详细讨论，该文全文引作参考。
在乳清蛋白的总量中免疫球蛋白含量达25%-30%也有重要意义。在72℃经13秒钟巴斯德灭菌后免疫球蛋白水平可达28±2%。我们已发现在72℃巴斯德灭菌13秒有可能使血清白蛋白含量高达14±1%。
据细菌学分析，按“ServicederecherchesurlesalimentsduMinisteredel'agricultureduQuebec”制备的WPC或经72℃、13秒巴斯德灭菌后的WPC样品中均未检出葡萄球菌、沙门菌、BCereus或大肠杆菌。其它样品由在63℃加热牛奶30min，其结果也不错。
用30ml肝素化的血液来测定血液中单核细胞中谷胱甘肽的含量。将已计数的单核细胞悬浮在磷酸盐缓冲的盐水中，调至每管含有107个细胞。离心后加入900μl水至沉淀中，使细胞全都溶解。向每份中加入30%的磺基水杨酸至终浓度为每1ml含有3%。保温15分钟后，离心样品，上清液按照Anderson(37)的方法进行生化试验。所测值以纳摩尔(nMol)每GSH(谷胱甘肽)/107细胞表示。血液淋巴细胞亚群可由流式细胞光度术测得。
血清蛋白总量，包括白蛋白和免疫球蛋白可以用Biruet方法测得。免疫球蛋白A(IgA)，免疫球蛋白G(IgG)和免疫球蛋白M(IgM)可由免疫比浊法测定。
WPC的血清白蛋白组分中含有的Gly-Cys基因被认为是未变性WPC蛋白混合物具有促成GSH和增加免疫活性的关键因素。我们的实验室研究表明，其它来源的WPC虽具有相似的营养价值，但并不产生有意义的生物活性。这些WPC中血清白蛋白的含量(%，平均值±标准差)分别为Promod(Ross实验室)4±1;Alacen855(NewZealandDairy)4±1;Lacprodan-80(DanmarkProtein，1989年产)4.8±1;Sapro(Sapro，Montreal)4±0.1;Savorpro-75(GoldenCheese，CA)4±1;Bioisolate(Lesueur，Isolates，Minneapolis)(8)5±1;Promix(Dumex，Quebec)4.3±1。类似地，其它热敏感蛋白含量，免疫球蛋白约为本发明所用未变性WPC中含量的一半。
结果表明，未变性乳清蛋白，由于可为免疫细胞中补充GSH提供特殊原料，因此可以作为其它治疗方法的一种佐剂。
从历史上及迄今为止，都是用加热处理(巴斯德灭菌)来减少牛奶中的细菌和芽孢。该方法在高效的同时不能避免蛋白质变性，因此，使血清白蛋白、免疫球蛋白中大量对热敏感和推测具有生物活性的成分沉淀和损失在凝乳中。
我们的目标是获取一种WPC，该WPC所含蛋白质的比例和构象尽可能接近于原始牛奶，并符合公认的细菌含量安全标准。到现在为止，我们采用最低的可接受的牛奶热处理水平，以保留对热敏感的乳清蛋白。
加热处理的另一种方法是基于膜微滤。由于使用了Bactocatch(Alfa-lavalLtd.Scarborough，Ontari生产)，我们可以通过特殊的微滤膜过滤脱脂牛奶，使得到的滤出液中细菌含量低于原始进料的0.5%。
这种滤液再用粗品凝乳酶处理，并采用一种温和的步骤浓缩乳清上清液中的蛋白质，以获取所要的未变性WPC。膜微滤的构思是别于牛奶热处理以保护热敏感蛋白的一种适用的方法，尽管技术和设备方面可能在一定时间内会进一步改进。
表5和表6为制备改进的未变性WPC方法的示意流程，该未变性WPC的商标为Immunocal。表7列出了Immunocal与其它来源WPC性质的比较以及食用3周的效果。
表6、图4产品的检测聚丙烯酰胺凝胶电泳分析血清白蛋白10±1%;
β-乳球蛋白57.8±0.9%;
α-乳清蛋白11.4±0.6%;
免疫球蛋白22±0.7%。
就我们的工作结果可总结如下未变性WPC既具有预防癌，如化学诱导的癌，典型的诸如致癌物如DMH诱发的结肠癌的作用，还可用于治疗有癌细胞如化学诱导癌细胞的病人，抑制癌细胞的增殖。人每日用量约为8～40g，每日20～40g更好，最好为30～40g/天。已经发现使用含血清白蛋白至少为10%±1的WPC特别有好处。因此血清白蛋白含量至少为9%，最好为至少9.5%。
正如公开的文献中所表明的，小鼠实验中DMH诱发的结肠肿瘤在损害类型及对化疗的反应上与人类的结肠癌相似(27，28)。
已经发现在晚期癌证病例中粒细胞/淋巴细胞(G/L)比例增加并与病人的条件相关(38)，这促使人们对能影响这个重要指标的因素产生了兴趣。
例如，利用体外循环消耗粒细胞可明显缩小兔移植瘤的体积(39)。最近的小鼠实验表明，有可能通过饲料影响G/L平衡的第2个指标。给小鼠喂WPC(这种WPC保留了大多数对热最敏感的乳清蛋白的天然未变性状态，如血清白蛋白)饲料，表现出增强的免疫应答(35)，这种应答，部分地是通过增加对肺炎球菌感染(40，1)的抵抗力及对致癌剂诱发癌症(1)的抵抗力来表明。
这种产物称为未变性WPC。已发现以未变性WPC喂养的小鼠的免疫反应性增加在体外移植的自然细胞中继续保留(36)。血清白蛋白含有6对Gly-Cys(31)，因此可为合成GSH提供特异的底物(33，34)。Gly-Cys在食物蛋白中极为少见(31)。动物实验中未变性WPC的有益作用是与持续增加组织GSH水平有关(41)。然而更有说服力的是脾细胞在抗原驱动的淋巴细胞无性增殖时的反应(32)这些实验清楚地显示了增强免疫的活性，例如，未变性WPC饲料喂养的小鼠淋巴细胞的增殖与观察到的淋巴细胞GSH合成增加有关，而在酪蛋白饲料对照组，在同样抗原刺激下GSH降低(32)。GSH是存在于几乎所有细胞中的含巯基的三肽，是主要的氧自由基清除剂(42)。更具体地说，淋巴细胞GSH含量似乎与调节细胞增殖的氧化剂和硫醇的能力有关(43)。在这个意义上，调节细胞内GSH可能对免疫反应产生影响。
这些实验进一步证明，当存在激活淋巴细胞增殖的抗原刺激物时，饲料中乳清蛋白对淋巴细胞的促进作用更为明显。
然而，未变性WPC与淋巴细胞增殖间的不寻常的关系也表现在正常的、未经免疫的小鼠上，按一定配方的饲料喂养小鼠3周后，喂20g或30g未变性WPC/100g饲料的小鼠与其它组(100饲料中含20或30g酪蛋白或大豆蛋白或鱼蛋白)小鼠比较，脾重及脾重/体重比值均较高(46)，更具体地说，每个脾的细胞数是喂养未变性WPC组小鼠高于其它对照组小鼠(35)。更详细的研究显示喂25%未变性WPC饲料的小鼠与对照的喂25%酪蛋白饲料的小鼠比，脾有核细胞数明显升高。有意义的是，观察到的变化是特别地与T细胞增加了一倍有关特别是L3T4+亚群增加了4倍，而B细胞数无改变(36)。这后一个发现与另外一些研究一致，这些研究显示未变性WPC并不主要表现在骨髓初级B淋巴细胞的增殖速率，而且免疫增强作用主要见于对抗原依赖的T细胞的应答(47)。
上述未变性WPC对淋巴细胞的作用可以很好地解释已观察到的这种饲料配方对实验肿瘤的抑制作用。最近的实验表明，对于用DMH诱导24周的小鼠，连续用未变性WPC饲料喂养可抑制结肠肿瘤细胞的发展(包括细胞数和肿瘤大小)(1)。这种抗癌作用可能是因为增加了靶细胞对致癌剂的抵抗力和/或是未变性WPC对肿瘤生长的直接抑制作用。在后来的一系列实验中(2)，在DMH处理28周的前20周动物用标准实验室饲料喂养;后8周改用未变性WPC饲料喂养，结果表明未变性WPC饲料对癌细胞有明显的抑制作用。
值得注意的是，未变性WPC对正常动物周围淋巴组织的促进作用并不与血淋巴细胞总数的显著变化相关(36，46)。在健康人也未观察到循环淋巴细胞总数的改变(OtsukaPharmaceuticalCo.Ltd)。
未变性WPC中Gly-Cys对细胞GSH合成的诱导效果可构成这种产品在癌症病人上的另一个有意义的作用。确实，加入半胱氨酸释放系统OTZ(ozothiazolidine-4-carboxilate)，而在正常细胞GSH水平增加导致在人癌细胞中GSH循环的反馈抑制(5)。
日本的OtsukaPharmaceuticalCo.Ltd开展了一些临床试验，由MaxakazuAdachi博士指导。实验对象包括5名晚期癌症病人，结果列于表8;4名病人的血细胞和GSH水平的实验室数据列于表9。每个病人的用量为30g/天。
表9中PreImmu免疫前After免疫后Patient病人Cancer癌day(s)天Byeast乳腺Esophag食管Lung肺Uterus子宫PMN中性多形核白细胞RBC红细胞WBC白细胞Lymp淋巴细胞Gran粒细胞G/L粒细胞/淋巴细胞Plt血小板Mono单核细胞
如表8所示，在未变性WPC治疗期间所有病人的淋巴细胞均增加了。另有2名晚期病人因消化原因中止了试验。以前有报道认为，癌症病人淋巴细胞数一旦下降，不大可能再恢复正常。淋巴细胞数增加具有重要意义，因为这对改善粒细胞/淋巴细胞比例有潜势。
表8与表9的结果可与健康人(对14名健康人进行的实验)进行比较，健康人各项指标通常为GSH/中性多形核白细胞0.34±0.02;GSH/红细胞0.066±0.006;白细胞6640±1700;淋巴细胞2200±460;粒细胞/淋巴细胞1.85±0.45;血小板25.4±3.3。
表10列出了在表8和表9所述实验中采用的未变性WPC的细菌学分析、蛋白质分布和溶解度。
总之，看来患癌病人服用WPC可增加血淋巴细胞和降低粒细胞/淋巴细胞比例。淋巴细胞浓度开始非常低，然后倾向于转回正常值。基于前述实验证据(38，39)，观察到的WPC的作用表现出抑制癌细胞生长。
继表8和表9中描述的实验后所做的未变性WPC实验中，作了下列观察(1)病人F在腹部有固态肿瘤，这可以由体检验明。她已接受化学治疗。她食用该未变性WPC有困难，准备放弃治疗。但发现只要她继续食用该未变性WPC，她的淋巴细胞数就增加，而且肿瘤标记的增加数也表现出下降的迹象。
(2)病人G因放射治疗后癌的局部复发而又治疗。她在1992年11月接受放射治疗。12月4日开始服用未变性WPC。12月3日至1993年1月20日之间，她的淋巴细胞已从960增加到1310。2月3日起，不再复发，她的淋巴细胞是1370，而粒细胞/淋巴细胞(G/L)是3.1。
(3)病人H因局部肿瘤接受放射治疗。1992年12月16日开始服用未变性WPC。那时的试验结果如下白细胞2700淋巴细胞480G/L4.6P/t9.512月24日的结果癌胚抗原11.0白细胞4320淋巴细胞910G/L3.7P/t10.71月20日的结果癌胚抗原7.1白细胞3420淋巴细胞830P/t11.52月3日的结果癌胚抗原5.2白细胞33.3
淋巴细胞86.0G/L2.5P/t11.5可以发现该病人的进展良好。
(4)病人Ⅰ在纵隔、颈部和整个大脑处接受放射治疗。1992年12月1日，开始服用未变性WPC。他的淋巴细胞从11月26日的340增加到1月13日的930。他的G/L比例从12.1降到4.4，而白细胞从4500增加到5100。
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图1和2中雄性C57BL/6NIA小鼠平均值±标准差(n＝10)U-LACP未变性乳清蛋白浓缩物D-LACP变性乳清蛋白浓缩物EGGWHITE卵白蛋白CASEIN酪蛋白各组间在食物消耗、体重、血清蛋白方面无差异U-LACP＞Purina酪蛋白、卵白蛋白P＜0.05(ANOVA.Sheffe检验)U-LACP＞D-LACPP＜0.01(ANOVA.Sheffe检验)图3中乳清蛋白变性的间接指数D-LACPSigmaPromodSaproU-LacpU-LAD溶解度82.8%0%93.7%91.6%94.5%--(3%P)PH6.4PH4.8PH5.9PH6.2PH6.5--透光率49.7%19.3%68.6%63.6%79.0%--(750nm,0.15%p)溶解度指数72.8%0%84.7%83.892.0%--(PH4.6,3.0%P)喂养3星期的效果Promod和Sapro比D-LACP和Sigma，P＜0.05U-LACP比Promod和Sapro，P＜0.0权利要求
1.一种治疗癌症的组合物，包含有效量的未变性乳清蛋白浓缩物，以增加淋巴细胞数，该浓缩物含至少9%的血清白蛋白。
2.权利要求1的组合物，其中血清白蛋白至少为9.5%。
3.权利要求2的组合物，用以降低粒细胞/淋巴细胞比率。
4.权利要求1的组合物，其中每日剂量水平为8～40g。
5.权利要求2的组合物，其中每日剂量水平为20～40g。
6.权利要求5的组合物，其中每日剂量水平为30～40g。
7.权利要求2的组合物，其中未变性乳清蛋白浓缩物含大量全部以天然状态存在的蛋白质。
8.一种治疗因二甲肼诱导的结肠损害类型的癌症的组合物，包含有效量的未变性乳清蛋白浓缩物，以增加淋巴细胞数，该浓缩物含至少9%的血清白蛋白。
9.权利要求8的组合物，其中未变性乳清蛋白浓缩物含有血清白蛋白水平约为10%或更多。
10.权利要求8的组合物，其中所述损害与二甲肼引起的损害相似的结肠损害。
11.权利要求8的组合物，其中每60g未变性乳清蛋白浓缩物，另包含硒40～60mcg(以甲硫氨酸硒计算)。
12.权利要求8的组合物，其中每60g未变性乳清蛋白浓缩物，另包含维生素B1约为1.5～2.0mg。
13.权利要求8的组合物，其中每60g未变性乳清蛋白浓缩物，另包含维生素B2约为1.7～2.2mg。
14.权利要求8的组合物，其中每60g未变性乳清蛋白浓缩物，另包括维生素B1约1.5～2.0mg维生素B2约1.7～2.2mg硒约40～60mcg(以甲硫氨酸硒计算)
15.一种预防二甲肼在哺乳动物上诱导的化学诱导结肠癌的组合物，包括用含至少9.5%血清白蛋白的未变性乳清蛋白浓缩物，每日用量范围为8～40g。
16.未变性乳清蛋白浓缩物的应用，该浓缩物包含至少9.5%的血清白蛋白，其用量要足以增加患癌病人的淋巴细胞数。
17.未变性乳清蛋白浓缩物的应用，该浓缩物包含至少9.5%的血清白蛋白，其用量要足以减少患癌病人的粒细胞/淋巴细胞的比例。
18.未变性乳清蛋白浓缩物的应用，该浓缩物包含至少9.5%的血清白蛋白，在制备治疗患癌病人的药物中，其用量要足以增加淋巴细胞数。
19.未变性乳清蛋白浓缩物的应用，该浓缩物包含至少9.5%的血清白蛋白，在制备治疗患癌病人的药物中，其用量要足以减少粒细胞/淋巴细胞的比例。
20.权利要求16～19的任一项应用，其中每日用量为20～40克。
21.权利要求16～19的任一项应用，其中每日用量约为30克。
22.权利要求16～21的任一项应用，其中该未变性乳清蛋白浓缩物由牛奶制备，并基本上包含所有在原料牛奶存在的蛋白质。
23.权利要求16～22中任一项应用，进一步包含维生素B1，其含量为每60g未变性乳清蛋白浓缩物中有约1.5～2.0mg。
24.权利要求16～23中任一项应用，进一步包含维生素B2，其含量为每60g未变性乳清蛋白浓缩物中有约1.7～2.2mg。
25.给患癌病人服用以使患癌病人增加淋巴细胞数和降低粒细胞/淋巴细胞比例的组合物，包含20～40g由牛奶制备的未变性乳清蛋白浓缩物，该浓缩物含至少9.5%血清白蛋白和基本上所有在原料牛奶中存有的蛋白质。
26.制备给患癌病人服用以使该病人增加淋巴细胞数和降低粒细胞/淋巴细胞比例的组合物的方法，包括在足够低的温度下和足够短的时间内对脱脂牛奶进行巴斯德灭菌，以保持最终产物中血清白蛋白的含量至少9.5%，而且基本上消除葡萄球菌、沙门菌、Bcereus和大肠杆菌，过滤并浓缩以得到未变性乳清蛋白浓缩物粉末。
全文摘要
本发明是有关因癌细胞导致病人损害的一种治疗方法及抗癌组合物——未变性乳清蛋白浓缩物的应用方法。
文档编号A61K33/24GK1088095SQ9311622
公开日1994年6月22日 申请日期1993年8月13日 优先权日1992年8月13日
发明者菲尔·戈尔德, 古斯塔夫·邦纳斯 申请人:免疫技术研究公司