专利名称：预防和治疗视网膜疾病的药物组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种预防和治疗视网膜疾病的药物组合物。
根据其病因和疾病的发作方式的不同，视网膜疾病是各种各样的。视网膜疾病的实例是由全身性疾病例如糖尿病、高血压、动脉硬化、贫血、白血病、结缔组织疾病(例如全身性红斑狼疮、硬皮病等)、先天性代谢异常疾病(例如家族黑蒙性白痴、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的视网膜血管疾病和炎性损害或变性性损害，以及视网膜局部疾病例如视网膜血管疾病(例如早熟视网膜病、视网膜静脉梗阻、视网膜动脉梗阻、视网膜静脉周炎等)、由视网膜脱离或创伤引起的视网膜炎症或变性、伴随老化的视网膜变性性疾病例如老年性盘状斑变性、先天性视网膜变性性疾病等。
下文进一步描述了具有代表性的这些视网膜疾病。
在由全身性疾病引起的视网膜疾病中，糖尿病源性视网膜病被认为是一种糖尿病源性微血管病，其为糖尿病的严重并发症。在初期，观察到毛细管微观动脉瘤和点状出血。此后观察到由微血管梗阻引起的棉絮斑以及由血管渗透性过高引起的视网膜水肿、硬渗出物或类似物。作为症状出现伴随新血管形成的病变过度。在最后阶段，在玻璃体中生长的结缔组织的牵引作用引起视网膜脱离。另外还可引起虹膜发红和新血管性青光眼，而导致失明。
高血压患者的视网膜出现高血压病变例如小动脉狭窄或出血、渗出性斑、视网膜水肿以及视乳头盘水肿等；巩膜病变例如小动脉硬化、动静脉交叉现象、动脉狭窄、管径不均等。
白血病引起的视网膜损害包括视网膜静脉的显著扩张、静脉周组织中出现渗出物以及后极周围各种大小和形状的出血。另外还可观察到模的(modular)渗出物、由微血管梗阻引起的棉絮斑，以及视网膜水肿。
全身性红斑狼疮是一种自身免疫性疾病，其表现出全身性损害例如发疹、急性肾炎或类似疾病。具有这种疾病的患者的视网膜出现棉絮斑及后极周围的散发性视网膜出血。另外，有时还观察到视乳头盘水肿和末梢血管炎症。
先天性代谢异常疾病例如家族黑蒙性白痴、Vogt-Spielmeyer疾病有时显示出眼病以及全身性症状。典型的视网膜症状为桃红色斑或色素损害，并且有时并发视神经萎缩。
在视网膜局部疾病中，视网膜静脉梗阻可根据梗阻的位置划分成视网膜中央静脉梗阻和视网膜分支静脉梗阻，视网膜中央静脉梗阻引起视乳头盘充血和水肿，在视乳头盘表面经常会观察到血斑，视网膜变得水肿并且不久出现棉絮斑。在视网膜分支静脉梗阻中，在该区域内会见到辐射状出血并出现视网膜水肿和棉絮斑。
在视网膜动脉梗阻中还有视网膜中央动脉梗阻与视网膜分支动脉梗阻。在动脉梗阻发生后不久，视网膜变得轻微的不透明，数小时后观察到乳白色和水肿的视网膜浊斑并于梗阻后20-30分钟内变为不可逆的。数周后上述浊斑消失，并且视网膜的内层被透明的神经胶质组织取代。作为全身性疾病的高血压或动脉硬化有时会引起视网膜动脉或静脉梗阻的形成。
视网膜静脉周炎是于视网膜静脉的末梢分支上产生的一种炎症。可以观察到例如静脉扩张、弯曲、管径不均，血管末梢渗出性斑、出血、新血管形成等结果。
早熟视网膜病是一种在将作为早产婴儿出生的婴儿置于密封的早产婴儿保育箱中并暴露于高浓度的氧中所引起的一种疾病。其结果产生伴随血管内皮细胞增生的不可逆梗阻，随后导致玻璃体内新血管形成和视网膜脱离。
视网膜脱离是一种感觉视网膜与视网膜色素上皮分离的疾病。包括有由视网膜裂缝引起的裂源性视网膜脱离以及在其它疾病过程中产生的或由其他疾病引起的继发性视网膜脱离。除非立即施行手术治疗例如光致凝固法治疗，否则这些视网膜脱离会导致视网膜变性，以至失明。
对于老年性盘状斑变性，由脉络膜经脉络膜基底层直至视网膜色素上皮下面的黄斑上会产生新血管形成。新生血管生长并且还会透过视网膜下腔。来自血管的血清渗出物会导致视网膜色素上皮脱离和盘状斑脱离。主要在含有新生血管的病灶中重复出血并导致病灶产生伤疤。
视网膜先天性色素变性发生于儿童中。可观察到夜盲，并逐渐发生视野狭窄和视力下降。眼底病变的特点是色素损害、视乳头盘黄色萎缩、视网膜血管狭窄，特别是视网膜动脉狭窄。
作为治疗上述各种疾病的方法，对于由全身性疾病引起的视网膜疾病可使用全身病因疗法。其实例为给药抗高血压的低血压剂、给药抗糖尿病等的低血糖剂。但是仅使用这些疗法总是不能缓解视网膜损害。另外，对于自身免疫性疾病和先天性代谢异常疾病，病因疗法有时是非常困难或不可能的。因此需要对视网膜局部损害进行治疗。在这种情况下，可对糖尿病、高血压或视网膜动脉或静脉梗阻引起的视网膜血管损害施用血管舒张药、血管壁稳定剂或碎裂血栓剂进行药物治疗。但是，这些药物治疗只能根据症状进行并且是非决定性的，而目前对这些疾病的治疗经常依赖于手术治疗。
如上所述，对于预防和治疗上述视网膜疾病目前仍无决定性药剂，在这些情况下，本发明的发明人经过专心研究得到了一种可预防或治疗上述视网膜疾病的药剂。
如上所述，视网膜疾病表现出各种症状，包括炎症例如视网膜血管疾病、血管形成、视网膜水肿以及原发性或继发性视网膜变性等。每一种疾病或多或少地导致视网膜功能障碍。因此，本发明的发明人从下列两种观点进行了研究。第一种观点是，上述视网膜疾病的发生和发展可能基于或者与下列状态有关局部缺血或缺氧状态以及由这些状态诱导的过氧化作用。第二种观点是，考虑到视网膜功能的具体特点，即视力是通过接受光表现出的，光过度可能是引起这些视网膜疾病的一种危险因素。
关于第一种观点，糖尿病视网膜病中的血管损害是对组织缺氧或局部缺血状态的反应这一理论最近已变得具有权威性。另外，已有报道表明，被认为是由于局部缺血而诱导的过氧化作用会提高患者血清中脂类过氧化物水平(KiyoshiIshikawa,MasayukiOshitari等人，Lipidperoxidesandretinalischemiaindiabeticretinopathy(Ⅰ),FoliaOphthalmologicaJaponica28321-325(1977))。而且，导致局部缺血和过氧化作用的视网膜动静脉梗阻也被认为与这种情况有关。
关于第二种观点，已有报道表明，当在无光条件下喂养先天性视网膜营养不良的大鼠时，则可阻滞视网膜变性的发展(Dowling,J.E.和Sidman,R.L.:Inheritedretinaldystrophyintherat;J.CellBiol.14:73-109(1962)。对于这些大鼠，视网膜变性是由具有视觉能力的视网膜视细胞外段新生的视网膜色素上皮细胞的吞噬作用失调造成的。在失去代谢平衡的状态中，已证明光本身促进了视细胞的破坏。已有报道表明，正常状态下的动物因过度暴露于光下则引起视网膜变性(Shahinfar,S.,Edward,D.P.和Tso,M.O.M.:Apathologicstudyofphotoreceptorcelldeathinretinalphoticinjury;Cuur.EyeRes.10:47-59(1991))。也可以说过度的光是引起视网膜疾病的一个危险因素。
另外，最近已有下列报道。这些报道涉及具有2-位取代基的抗坏血酸衍生物的合成及它们的抗氧化活性(见EP-A-0146121)；利用抗坏血酸衍生物的清除游离基活性改善循环系统作用例如抗心律失常活性、抗心肌梗塞形成活性、抗大脑梗塞形成活性、对于老年性痴呆的预防作用(EP-A-0202589)；还涉及部分上述抗坏血酸衍生物对白内障的治疗作用以及它们的生物利用度和制剂(见JP-A63-301818)。
由上述两点可以看出，本发明发明人已研究得到的化合物可抑制视网膜的过氧化作用或由光引起的视网膜疾病。结果发现在上面EP-A-0146121和EP-A-0202589中所述化合物包括具有上述两种惊人的优良作用的化合物。因而完成了本发明。
本发明的主要目的是提供一种用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种制备上述药物组合物的方法。
由下列说明以及参考附图，本发明的这些目的和其它目的以及优点对于本领域技术人员将是显而易见的。
图1的图解表明在实验1(B-2)中在玻璃体内注射亚铁离子后大鼠的ERG的a-波幅度。横座标为时间(小时)，纵座标为相对于起始幅度的百分比(%)。在图1至5中，化合物(Ⅰ)是2-0-十八烷基抗坏血酸。
图2的图解表明在实验1(B-2)中在玻璃体内注射亚铁离子后大鼠的ERG的b-波潜伏期(latency)。横座标为时间(小时)，纵座标为相对于起始幅度的百分比(%)。
图3的图解表明在实验1(B-2)中在玻璃体内注射亚铁离子后大鼠的ERG的b-波幅度。横座标为时间(小时)，纵座标为相对于起始幅度的百分比(%)。
图4的图解表明在实验2[B-2][方法1]中光照射3天后大鼠的ERG的b-波幅度。横座标为光照射后的时间(天)，纵座标为b-波幅度(mV)。
图5的图解表明在实验2[B-2][方法2]中光照射20小时后大鼠的ERG的a-波潜伏期。横座标为光照射后的时间(天)，纵座标为a-波潜伏期(毫秒)。
本发明提供了一种治疗视网膜疾病的药物组合物，该药物组合物包含式(Ⅰ)化合物
其中n为8-20的整数。下文中式(Ⅰ)化合物有时称为化合物(Ⅰ)。
在上述式(Ⅰ)化合物中，n所表示的整数优选为9-17的整数，特别优选17。这些化合物可任意的是D-异构体、L-异构体和这些异构体的混合物，特别优选的是L-异构体。
EP-A-0146121中描述了式(Ⅰ)化合物的物理和化学性质及其制备方法。如下文实验3中所示式(Ⅰ)化合物具有非常低的毒性，因而可安全地给药本发明用于治疗视网膜疾病的药物组合物。
当式(Ⅰ)化合物用作治疗视网膜疾病的药物时，其通常可按照本身已知的方法例如口服(如片剂、胶囊剂、粒剂等)或非肠道方法(如滴眼剂、眼软膏、注射液等)，并以根据本身已知的方法通过将其与本身已知的可药用添加剂如载体、赋形剂或稀释剂混合制备的药物组合物形式给药。
对于口服给药时，成人的日剂量通常为10mg-500mg，优选50mg-250mg。例如片剂通常通过下述方法制备。首先将与稀释剂(如乳糖等)、粘合剂(如糖浆、阿拉伯胶、明胶、山梨糖醇、黄蓍胶、聚乙烯吡咯烷酮等)、崩解剂(如马铃薯淀粉等)和其它适宜添加剂均匀或非均匀混合的化合物(Ⅰ)制成颗粒。将所得颗粒与添加剂如润滑剂(如硬脂酸镁、滑石、聚乙二醇、硅石等)混合并压制成所期望的形状与大小。
这些颗粒剂通常通过将化合物(Ⅰ)或上述混合物压制并碾碎成颗粒，或者通过向化合物(Ⅰ)或上述混合物中加入润湿剂(如十二烷基硫酸钠等)，制粒并干燥来制备。在每一剂型中，本发明组合物可以含有任意其它的药物活性成分，除非它们与本发明的目的不适宜。
对于滴眼剂，可向基质中加入约0.001-3%(w/v)，优选约0.01-1%(w/v)的化合物(Ⅰ)以制得水溶液或悬浮液。本发明滴眼剂的pH值应调至约4-10，优选约5-9。
本发明滴眼剂可进行灭菌处理以制得无菌的最终产物。灭菌过程可在制备滴眼剂的任一步骤进行。给药时，根据患者的病情以每日约1-4次的频率向眼中滴注，每一剂量一至数滴。
这种滴眼剂还含有可药用添加剂例如缓冲剂(如磷酸盐缓冲剂、硼酸盐缓冲剂、柠檬酸盐缓冲剂、酒石酸盐缓冲剂、乙酸盐缓冲剂、氨基酸等)、等渗剂(如糖类例如山梨糖醇、葡萄糖、甘露糖醇等；多羟基醇例如甘油、聚乙二醇、丙二醇等；盐例如氯化钠等)、防腐剂(如氯苄烷铵；氯化苄乙氧铵；对羟基苯甲酸酯如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯等；苄醇；苯乙醇；山梨酸；山梨酸盐；乙基汞硫代水扬酸钠；氯丁醇等)、pH调节剂(如盐酸、乙酸、磷酸、氢氧化钠等)，增稠剂(如羟基乙基纤维素、羟基丙基纤维素、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素及其盐等)、螯合剂(如乙二胺四乙酸钠、柠檬酸钠、缩聚磷酸钠等)、增溶剂(如乙醇、聚氯乙烯氢化蓖麻油、吐温80、聚乙二醇4000等)。
眼软膏可通过将活性成分以约0.001-3%(w/w)，优选0.01-1%(w/w)的浓度与常规眼软膏基质混合制备。当制备本发明眼软膏时，优选采用将化合物(Ⅰ)粉碎并将组合物灭菌处理的方法。根据患者病情的不同每日可给药1-约4次眼软膏。
作为眼软膏基质可以提及的有凡士林，聚乙二醇和羧甲基纤维素等。
除化合物(Ⅰ)外，本发明药物组合物还可进一步含有至少一种抗视网膜疾病的治疗活性成分，除非其与本发明目的不适宜。
另外，本发明组合物可含有任意其它药理学活性成分，除非它们与本发明目的不适宜。
正如下述实验清楚地说明，本发明用于预防和治疗视网膜疾病的药物组合物具有优良的抗氧化活性(游离基清除活性)以及由光引起的视网膜疾病的抑制活性。因此该组合物可作为药物用于预防或治疗各种视网膜疾病，这些疾病包括由全身性疾病如糖尿病、高血压、动脉硬化、贫血、白血病、结缔组织疾病(例如全身性红狼疮、硬皮病等)、先天性代谢异常疾病(例如家族黑蒙性白痴、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的视网膜血管疾病和炎性损害或变性性损害，以及视网膜局部疾病例如视网膜血管疾病(例如早熟视网膜病、视网膜静脉梗阻、视网膜动脉梗阻、视网膜静脉周炎等)、由视网膜脱离或创伤引起的视网膜炎症或变性、伴随老化的视网膜变性性疾病例如老年性盘状斑变性、先天性视网膜变性性疾病等。
下列实施例和实验进一步详细地说明了本发明，但不应理解为对本发明的范围的限定。
实施例1片剂2-0-十八烷基抗坏血酸50g玉米淀粉90g乳糖25g羟基丙基纤维素25g硬脂酸镁5g共195g首先将50g2-0-十八烷基抗坏血酸与90g玉米淀粉、25g乳糖和25g羟基丙基纤维素制成颗粒。将所得颗粒与5g硬脂酸镁混合，并压制成片剂。
成人每日服用1-3片。
实施例2眼用溶液(滴眼剂)(w/v)%2-0-十八烷基抗坏血酸0.1硼酸1.7硼酸钠0.4乙二胺四乙酸钠0.02氯苄烷铵0.005无菌纯化水加至100.0将17g硼酸、4g硼酸钠、0.2g乙二胺四乙酸钠和0.05g氯苄烷铵溶于800ml无菌纯化的水中。向如此获得的溶液中加入1g2-0-十八烷基抗坏血酸以制成水溶液。然后向此溶液中再加入无菌纯化水直至总体积为1000ml。过滤灭菌后，将溶液装入滴眼瓶中以得到眼用溶液。
实施例3眼用悬浮液(滴眼剂)(w/v)%2-0-十八烷基抗坏血酸1.0聚乙烯醇0.5磷酸氢二钠(十二水合物)0.5磷酸二氢钠(二水合物)0.2乙二胺四乙酸二钠0.02氯化钠0.7氯苄烷铵0.007无菌纯化水加至100.0将5g聚乙烯醇、5g磷酸氢二钠、0.2g乙二胺四乙酸二钠和7g氯化钠溶于约800ml无菌纯化水中。将溶液通过过滤灭菌后，在无菌条件下向上述所得溶液中加入10g2-0-十八烷基抗坏血酸和0.07g氯苄烷铵。搅拌下加入无菌纯化水直至总体积为1000ml。将如此得到的悬浮液装入滴眼瓶中以制得眼用悬浮液。
实施例4眼软膏(w/v)%2-0-十八烷基抗坏血酸0.5液体石蜡1.0白凡士林加至100.0
在无菌条件下，将1g无菌液体石蜡和0.5g2-0-十八烷基抗坏血酸倾入到研钵中并接着进行充分研磨(粉碎)。在研磨条件下向混合物中逐渐加入白凡士林直至总重量达到100g。将如此得到的产物加到眼用药管中以得到眼软膏。
实验12-0-十八烷基抗坏血酸对亚铁离子诱导的视网膜过氧化作用的作用(A)用牛视网膜匀浆进行体外实验检查2-0-十八烷基抗坏血酸对通过向牛视网膜匀浆中加入氯化亚铁诱导的过氧化作用的作用。
方法(1)由牛眼球(1/2眼)中分离出视网膜。向视网膜中加入生理盐水以制备牛视网膜匀浆。
(2)向每份如上所得视网膜匀浆中加入氯化亚铁(0.5mM，溶于蒸馏水中)。再分别向所得匀浆中加入2-0-十八烷基抗坏血酸和α-生育酚直至反应混合物的最终浓度达到10-4M。然后向每份匀浆中加入蒸馏水以调节总体积至1ml。将2-0-十八烷基抗坏血酸和α-生育酚溶解并用乙醇稀释。这样将所有反应混合物中乙醇的最终浓度调至1%。然后将混合物于37℃反应1小时。
(3)向上述(2)中所得的反应混合物或视网膜匀浆标准溶液中加入0.35%硫巴比土酸(下文称作TBA)试剂(50%乙酸水溶液)(1ml)。将混合物于100℃于沸水中反应1小时。水冷却后加入正丁醇(2ml)并将混合物振摇5分钟，并于3000rpm下离心10分钟。测定正丁醇层的荧光强度(激发波长515nm，发射波长553nm)。用Bio-RadProteinAssayKit(商品名称)检测蛋白质。
结果结果列于表1中。
表1视网膜:TBA值抑制率(nM丙二醛/mg蛋白质)(%)空白(1%乙醇)0.34±0.01(2)100氯化亚铁(对照)5.65±0.13(3)02-0-十八烷基抗 10-4M 0.61±0.04(3)* 94.9坏血酸α-生育酚 10-4M 2.38±0.12(3)* 61.6注在上表中每一“视网膜TBA值”的数值是指平均值±S.D.。数值后面圆括号内的数字表示样品编号。符号“＊”表明与对照实验比较有显著区别。P＜0.001。
由表1中的结果可清楚地看出，与空白样相比向牛视网膜匀浆中加入氯化亚铁导致TBA值提高约17倍。当反应在2-0-十八烷基抗坏血酸存在下进行时，既使在10-4M的低浓度下得到的对视网膜匀浆的过氧化作用的抑制作用比在α-生育酚存在下更好。
(B)通过给大鼠玻璃体内注射亚铁离子进行体内实验(B-1)用视网膜TBA值评估检查口服2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液(30mg/kg)对通过给大鼠玻璃体内注射硫酸亚铁诱导的视网膜过氧化作用的抗氧化作用。
方法将前一天开始禁食的7周大的SD大鼠分成两组。分3次给一组口服5%阿拉伯胶溶液(对照)(2ml/kg)。分3次给另一组口服1.5%2-0-十八烷基抗坏血酸(30mg/kg)悬浮液(2ml/kg)。首次给药后2小时，用克他命盐酸盐将大鼠全身麻醉。向每只大鼠左眼玻璃体内注射5mM硫酸亚铁溶液(5μl)，并向每只大鼠右眼玻璃体内注射生理盐水(5μl)。每次注射均采用微量调节注射器。注射后1和4小时，再次给药2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液或5%阿拉伯胶溶液。第三次给药后2小时(即注射亚铁离子后6小时)，将大鼠处死。分出眼球，由此制得视网膜匀浆，并测定TBA值及蛋白质。
结果结果列于表2中。
表2视网膜:TBA值(nM丙二醛/mg蛋白质)右眼左眼阿拉伯胶溶液0.48±0.14(5)0.65±0.06(5)(对照)1.5%2-0-十八烷0.36±0.06(6)0.47±0.11(6)*基抗坏血酸悬浮液注在上表中每一“视网膜TBA值”的数值是指平均值±S.D.。数值后面圆括号内的数字表示样品编号。符号“＊”表示与对照实验比较有显著区别。P＜0.01。
由表2中的结果可清楚地看出，口服1.5%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液(30mg/kg)可显蒸地抑制由向玻璃体内注射亚铁离子诱导的视网膜的TBA值的提高。在给药5%阿拉伯胶组中，在注射生理盐水的5只眼中的2只中，可观察到可能是在注射期间发生的玻璃体大量出血。它们的TBA值比其它注射生理盐水的眼的TBA值高。
(B-2)通过视网膜电图(下文称作ERG)测定评估口服2-0-十八烷基抗坏血酸(30mg/kg)，检查其对通过给大鼠玻璃体内注射硫酸亚铁诱导的ERG变化的作用。
方法将12只SD大鼠(7周大)于前一天开始禁食。给每只大鼠左眼玻璃体内注射7.5mM硫酸亚铁溶液(5μl)。在注射亚铁离子之前2小时先口服1.5%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液(30mg/kg)或5%阿拉伯胶溶液(对照)，此后每3小时给药3次，然后每5小时给药3次。在注射亚铁离子后6、9和24小时测定ERG并评估a-波和b-波的潜伏期和幅度。
结果在向玻璃体内注射亚铁离子后大鼠的ERG测定结果如图1(向玻璃体内注射亚铁离子后大鼠ERG的a-波幅度)、图2(向玻璃体内注射亚铁离子后大鼠ERG的b-波潜伏期)和图3(向玻璃体内注射亚铁离子后大鼠ERG的b-波幅度)所示。
结果，注射亚铁离子后6小时在两组中可观察到a-波和b-波潜伏期的延迟和幅度降低十分明显。既使在24小时后检测发现幅度仍未复原。在注射亚铁离子后9小时检测可观察到给药2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组比对照组抑制a-波和b-波幅度降低的趋势更为显著，并可显著地抑制b-波潜伏期的延迟(参见图1至3)。
讨论上述结果表明，由于对由亚铁离子引起的视网膜过氧化作用和ERG变化有抑制活性，2-0-十八烷基抗坏血酸可用于预防和治疗因视网膜过氧化作用引起的各种视网膜疾病，这些疾病包括由全身性疾病如糖尿病、高血压、动脉硬化、贫血、白血病、结缔组织疾病(例如全身性红斑狼疮硬皮病等)、先天性代谢异常疾病(例如家族黑蒙性白痴、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的视网膜血管疾病和炎性损害或变性性损害，以及视网膜局部疾病例如视网膜血管疾病(例如早熟视网膜病、视网膜静脉梗阻、视网膜动脉梗阻、视网膜静脉周炎等)、由视网膜脱离或创伤引起的视网膜炎症或变性、伴随老化的视网膜变性性疾病例如老年性盘状斑变性、先天性视网膜变性性疾病等。
实验2检查2-0-十八烷基抗坏血酸对光引起的视网膜疾病的作用(A)用牛视网膜匀浆进行体外实验检测在血卟啉(下文称作HPP)存在下2-0-十八烷基抗坏血酸对由光照射牛视网膜匀浆引起的过氧化作用的抗氧化作用。
方法(1)将HPP(100μM，溶于乙醇中)、2-0-十八烷基抗坏血酸(10-4M)和水加到以与上述实验1(A)方法(1)相同的方法制备的视网膜匀浆中。混合物用荧光灯(日光灯，15W，3000勒克司)从20cm上方照射1小时。将反应混合物中乙醇的最终浓度调至2%。
(2)光照射后1小时，按照与上述实验1(A)方法(3)所述相同的方法，通过TBA反应测定脂类过氧化物并用Bio-RadProteinAssayKit(商品名称)测定蛋白质。
结果结果列于表3中。
表3视网膜:TBA值抑制率(nM丙二醛/mg蛋白质)(%)空白(HPP,1%乙醇)0.59±0.10(3)100HPP,光(对照)2.22±0.06(3)02-0-十八烷基抗1.31±0.21(3)*55.8坏血酸(10-4M)注在上表中每一“视网膜TBA值”的数值是指平均值±S.D.。数值后面圆括号内的数字表示样品编号。符号“＊”表示与对照实验比较有显著区别。P＜0.001。
由表3中的结果可以清楚地看出，向牛视网膜匀浆中加入HPP并随后用光照射导致与空白实验相比其TBA值提高约4倍。当反应在2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液存在下，于10-4M浓度下进行时可观察到显著的抑制作用(抑制率约56%)。
(B)光照射大鼠的体内实验(B-1)由视网膜病理组织及视紫质的量评估方法将大鼠进行暗适应72小时。然后用绿色荧光灯(10W，490-580nm)(其照明强度被调节至2000-2400勒克司)，将大鼠连续照射12小时。在光照射当天一天口服3次(90，300mg/kg/天)并在此后每天口服1次(30，100mg/kg/天)1.5%或5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液。按照相同方式给对照组给药5.0%阿拉伯胶溶液(对照实验)。光照射完成后，将大鼠于暗室中喂养并于第5天将其处死。将右眼用墨水在上部标记并用2%多聚甲醛和2%戊二醛溶液固定。用光学显微镜进行病理组织学评估并测定视网膜(整个视网膜层和核外层)的厚度。将左眼于-20℃冷冻条件下贮存，以用于在除去角膜、晶状体和玻璃体后测定视紫质。
视紫质如下述方法测定。首先，于暗室中在红灯下将视杯切片，并用0.1M磷酸盐缓冲剂(pH7.2)制备视网膜匀浆。于15，000rpm离心15分钟后，将沉淀用4%钾明矾溶液处理。洗涤后，用1%EmulphogenBC-720(商品名称)萃取视紫质。用离心了的上清液作样品测定在500nm的吸收率。样品用黄色灯进行光照射5分钟漂白，再次测定在500nm的吸收率。由漂白前后吸收率的差值计算得视紫质的量(摩尔吸收系数42，000)。
结果用光学显微镜得到的病理组织学评估结果列于表4(5.0%阿拉伯胶溶液)、表5(1.5%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液)和表6(5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液)中。在表4-6中的符号具有下列意义。
-未观察到，±略微观察到+可观察到，++明显观察到表45.0%阿拉伯胶溶液(对照)动物编号12345视网膜色素上皮的+++++空泡形成视细胞内外段的紊+++++++++乱或空泡形成巨噬细胞渗入物+++++++++核外层细胞致密变+++++++++化和核消失整个视网膜层变薄-++++++++
表51.5%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液动物编号12345视网膜色素上皮的+++++空泡形成视细胞内外段的紊+++++++++乱或空泡形成巨噬细胞渗入物++++-++++核外层细胞致密变++++±++++化和核消失整个视网膜层变薄++++-++++
表65.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液动物编号123视网膜色素上皮的-++空泡形成视细胞内外段的紊±+++乱或空泡形成巨噬细胞渗入物--++核外层细胞致密变±+++化和核消失整个视网膜层变薄-+++由表4-6中所示结果可以清楚地看出，在由光照射所引起的视网膜损害中，在每一对照组和给药1.5%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中5个实施例中的4个中以及在给药5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中3个实施例中的1个中可以明显地观察到核外层细胞致密变化和核消失、视细胞内外段的紊乱和空泡形成、进入外段的巨噬细胞渗入物以及整个视网膜层变薄。也就是说，在给药5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中的损害不如对照组中的严重。
表7和表8分别表示整个视网膜层和核外层的厚度的测定结果。
表7整个视网膜层的厚度损害在视乳头盘附近阿拉伯胶溶液81.5±6.5(5)121.0±15.9(5)(对照)1.5%2-0-十八烷88.5±22.3(5)135.5±27.9(5)基抗坏血酸悬浮液5.0%2-0-十八烷84.2±16.3(3)161.7±3.8(3)*基抗坏血酸悬浮液注在上表中每一“整个视网膜层厚度”的数值为平均值±S.D.。数值后圆括号内的数字表示样品编号。符号“＊”表示与对照实验相比有显著区别。P＜0.05。
表8核外层的厚度损害在视乳头盘附近阿拉伯胶溶液17.0±5.1(5)25.5±11.5(5)(对照)1.5%2-0-十八烷16.0±7.2(5)39.0±8.8(5)基抗坏血酸悬浮液5.0%2-0-十八烷19.2±11.3(3)48.3±1.4(3)基抗坏血酸悬浮液注在上表中每一“核外层厚度”的数值为平均值±S.D.。数值后圆括号内的数字表示样品编号。
由表7中所示结果可以清楚地看出，在给药5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中在视乳头盘附近的整个视网膜层的厚度明显比对照组的大。由表8中所示结果可以清楚地看出，在给药2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中在视乳头盘附近的核外层的厚度也明显比对照组的大。
表9列出了视网膜视紫质的测定结果。
表9视网膜视紫质的量(nM/眼)阿拉伯胶溶液0.43±0.19(5)(对照)1.5%2-0-十八烷0.51±0.20(5)基抗坏血酸悬浮液5.0%2-0-十八烷0.69±0.14(3)基抗坏血酸悬浮液注在上表中每一“视网膜视紫质的量”的数值为平均值±S.D.。数值后圆括号内的数字表示样品编号。
由表9中可清楚地看出，在给药2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中视网膜视紫质的测定中可观察到对光照射引起的视紫质的量降低的抑制趋势。
(B-2)由ERG测定评估(方法1)将大鼠进行暗适应24小时。用绿色荧光灯(490-580nm)(将其照明强度调节至600-700勒克司)，连续3天重复照射，每日连续照射20小时。每日光照射完成后暗适应2小时后连续3天测定ERG。此后，将大鼠于暗室中喂养，并于光照射后第7天测定ERG，并评估a-波和b-波的幅度及a-波潜伏期。从光照射前一天起，在光照射当天每日口服2次(200mg/kg/天)而在其余各天每日口服1次(100mg/kg/天)5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液或5.0%阿拉伯胶溶液(对照实验)。
结果光照射3天后大鼠ERG的测定结果为图4(b-波幅度)所示。
结果，在第一天测定ERG时可观察到a-波潜伏期的延迟和a-波幅度的降低。第2天，a-波的畸形进一步发展，而新近观察到b-波幅度降低。在给药5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组中，可观察到抑制b-波幅度降低的趋势(参见图4)，在连续光照射3天过程中ERG的每一波都逐渐减弱。在光照射后第7天，a-波潜伏期已经复原。
(B-2)ERG测定的评估(方法2)将大鼠进行暗适应12小时并在与(方法1)所述相同的条件下用光连续照射20小时。将大鼠进行暗适应2小时后测定ERG。在光照射之前7天起每天口服1次(100mg/kg/天)而仅在光明照射当天每天口服2次(200mg/kg/天)5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液或5.0%阿拉伯胶溶液(对照试验)。
结果光照射20小时后大鼠ERG的测定结果如图5(a-波潜伏期)所示。
在两组中a-波和b-波的幅度均有所降低，而给药5.0%2-0-十八烷基抗坏血酸悬浮液组明显抑制了a-波潜伏期的延迟(参见图5)。
讨论上述结果表明2-0-十八烷基抗坏血酸可抑制由光照射所引起的大鼠视网膜组织及功能性疾病。在这些试验中由光引起的视网膜疾病是较为严重的实例，但是，光是导致各种视网膜代谢和功能性疾病的危险因素之一，所以2-0-十八烷基抗坏血酸可用于预防和治疗各种视网膜疾病，该视网膜疾病包括由全身性疾病如糖尿病，高血压、动脉硬化，贫血、白血病，结缔组织疾病(例如全身性红狼疮、硬皮病等)、先天性代谢异常疾病(例如家族黑蒙性白痴、Vogt-Spielmeyer疾病等)引起的视网膜血管疾病和炎性损害或变性性损害，以及视网膜局部疾病例如视网膜血管疾病(例如早熟视网膜病、视网膜静脉梗阻、视网膜动脉梗阻、视网膜静脉周炎等)、由视网膜脱离或创伤引起的视网膜炎症或变性、伴随老化的视网膜变性性疾病例如老年性盘状斑变性、先天性视网膜变性性疾病等。
实验32-0-十八烷基抗坏血酸的急性毒性试验于小鼠身上进行2-0-十八烷基抗环血酸的急性毒性试验。结果，既使口服1000mg/kg也未有小鼠死亡。因此该化合物具有低毒性。
权利要求
1.一种治疗视网膜疾病的药物组合物，该药物组合物包含式(Ⅰ)化合物 其中n为8-20的整数。
2.根据权利要求1的药物组合物，其为口服给药剂型。
3.根据权利要求1的药物组合物，其为片剂。
4.根据权利要求1的药物组合物，其为滴眼剂。
5.根据权利要求1的药物组合物，其为眼软膏。
6.根据权利要求1的药物组合物，其中n为17。
7.根据权利要求1的药物组合物，其中视网膜疾病是由全身性疾病所引起的视网膜疾病。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中全身性疾病选自糖尿病、高血压、贫血、白血病、全身性红斑狼疮、硬皮病、家族黑蒙性白痴以及Vogt-Spielmeyer疾病。
9.根据权利要求1的药物组合物，其中视网膜疾病为视网膜局部疾病。
10.根据权利要求9的药物组合物，其中视网膜局部疾病选自早熟视网膜病、视网膜静脉梗阻、视网膜动脉梗阻、视网膜静脉周炎、视网膜脱离以及老年性盘状斑变性。
11.一种制备用于治疗视网膜疾病的药物组合物的方法，该方法包含将式(Ⅰ)化合物与可药用添加剂混合 其中n为8-20的整数。
12.根据权利要求11的方法，其中将式(Ⅰ)化合物与可药用添加剂混合，并将所得溶液或悬浮液的pH值调至4-10并灭菌以得到滴眼剂。
13.根据权利要求11的方法，其中将式(Ⅰ)化合物与眼软膏基质混合并粉碎，灭菌得到眼软膏。
14.根据权利要求11的方法，其中将式(Ⅰ)化合物与稀释剂、粘合剂和崩解剂一起制粒，向所得颗粒中加入润滑剂，并压制成所期望的形状和大小从而得到片剂。
15.一种治疗视网膜疾病的方法，该方法包含给需要此种治疗的受治疗者给药有效量的式(Ⅰ)化合物 其中n为8-20的整数。
全文摘要
本发明公开了一种用于预防或治疗视网膜疾病的药物组合物，该药物组合物包含式(I)化合物，其中n为8—20的整数。
文档编号A61K31/365GK1099611SQ94101050
公开日1995年3月8日 申请日期1994年2月2日 优先权日1993年2月2日
发明者加藤金芳, 栗山裕, 中裕亮 申请人:武田药品工业株式会社, 千寿制药株式会社