专利名称：含有枯草芽胞杆菌的活菌制剂及其在烧伤治疗中的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一株新的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)和含有该菌株活菌的微生态制剂，以及该菌株及其微生态制剂在烧伤治疗中的应用。
近年来，随着微生态学的发展，微生物菌体制剂的开发和其在临床医学中的利用出现一个新的飞跌。已报导的微生态制剂，包括利用乳酸杆菌、双歧杆菌等用于防治肠道致病菌群过渡繁殖引起疾病的制剂，已在临床应用中显示出良好效果(康白正常菌群在防治肠道传染病中的意义，中国微生态学杂法1989年专利康白论文集，PP28-30，1989)。
创伤和烧伤感染是造成创面不能愈合或修复，甚至导致脓毒败血症的主要原因，因此对创面的处理在临床治疗中具有重要作用。治疗创面感染的措施很多，例如全身和/或局部使用抗生素、激素、免疫排斥作用的抑制剂等。这些药物在其有限范围内发挥治疗作用的同时，也往往会导致局部正常微生物群与其寄生的生态平衡失调，进而出现新的耐药菌株，使药物治疗，特别是抗生素治疗难以得到预期的效果。另外，研究表明，正常菌群不仅在其内部各成员间具有共生和拮抗等方面作用，而且对外来细菌(致病菌)的对宿主的入侵具有强烈的拮抗作用。
我们由此得到启发，产生了寻找一种非致病性微生物，用以预防和控制创伤或烧伤创面感染的设想，并期望以此来克服和避免因产生耐药菌株而给临床治疗带来的困难。最初，我们成功从健康人的皮肤上分离到一株枯草芽胞杆菌BS224菌株，经过多年大量实验室研究，结果令人惊厅地发现，将由该菌株可培养液制成悬浮组合物喷洒于创伤或烧伤表面上后，可在短时间内明显防治包括绿脓杆菌在内的其他致病菌的感染，并有利创面结痂的形成及愈合，而未见任何明显的毒付作用。(参见齐涵等，“抑菌生的研究总结报告”，中国微生态学杂志，第3卷第4期，1-11页，1991)。在此基础上，本发明人进一步分离并筛选了另一株新的枯草芽胞杆菌，该菌株与BS224相比，具有更好繁殖和抑制致病菌生长的特性，并具有使之更易于被鉴定的特殊的遗传学标记。动物实验和临床试用结果表明，该菌株具有更加突出的临床使用效果和价值。
本发明的一个目的是提供一株新的枯草芽胞杆菌菌株，其特征在于该菌株为不溶血的腺嘌呤缺陷型菌株，并带有多粘菌素B抗性标记。
根据本发明的菌株，其被命名为枯草芽胞杆菌菌株BS874。
根据本发明的菌株，其中所说的腺嘌呤缺陷为该菌株固存的腺嘌呤营养缺陷型遗传标记。
根据本发明的菌株，其中所说多粘菌素B抗性标记是利用化学诱变剂)进行人工诱变获得的，赋予对高浓度多粘菌素B的抗性的新的遣传标记。
本发明的另一个目的是提供含有非致病性芽胞杆菌属细胞的活菌制剂，所说的非致病性枯草芽胞杆菌不溶血，对人和动物没有任何毒付作用，且所说的细菌选自枯草芽胞杆菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞杆菌(B Licheniforinis)、短小芽胞杆菌(B Pumilis)、软化芽胞杆菌(B macerans)、多粘芽胞杆菌(B.Polymyxa)和环形芽胞杆菌(B.Cirulans)。
根据本发明的活菌制剂，其中所说的非致病性芽胞杆菌属细菌较好是枯草芽胞杆菌，且最好是枯草芽胞杆菌菌株BS874。
根据本发明的活菌制剂，该制剂可以是喷雾剂、乳剂、冻干制品、悬浮剂、软膏和薄膜贴敷剂。
本发明的再一个目的是提供一种利用非致病性芽胞杆菌属细菌，制成不同剂型的微生物制剂，用于抑制创伤和烧伤表面致病病感染的方法，该方法包括将培养所说的非致病性芽胞杆菌属细菌所得到的活菌液与适当的载体和/或赋形剂混合，制成不同的外用活菌制剂，并将所说的制剂施用于创伤或烧伤表面上。
根据本发明的方法，其中所说的非致病性芽胞杆菌属细菌选自枯草芽胞杆菌、地衣芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)、短小芽胞杆菌(B.puinilis)、多粘芽胞杆菌(B.pohymyxa)和环状芽胞杆菌(B.circulans)。
根据本发明的方法，其中所说的非致病性芽胞杆菌是枯草芽胞杆菌。
根据本发明的方法，其中所说的非致病性芽孢杆菌是枯草芽孢杆菌菌株BS874。
根据本发明的方法，其中所说的活菌制剂的剂型选自喷雾剂、乳剂、冻干剂、悬浮剂、软膏和薄膜贴敷剂。
根据本发明的其中所说的创伤是包括切割伤、机械创伤和枪弹伤。
烧伤创面感染是烧伤后全身感染的主要原因。烧伤感染的主要致病菌是绿脓杆菌和耐药性金黄色葡萄菌。由于抗生素的广泛应用，导致抗药菌株的出现，给烧伤创面感染的临床治疗带来困难。临床上，虽然不断有新的抗生素如磺胺咪隆和磺胺嘧啶银等出现和应用，但从外伤，特别是烧伤治疗学发展的角度看，仍存在潜在不利影响。随着微生态学基础和应用研究的进展，人们逐步认识到，人和高等哺乳动物体内存在的正常菌群，不仅其中各成员间具有共生和拮抗作用，而且对外来的其他菌种，特别是对入侵肌体的非正常菌群具有强烈营养斗争和生态拮抗作用。作用有理由推测，如果使从自然界正常菌群中，找到一种适合在皮肤表面生长、生命能力强、营养条件要求不高的非致病菌种，施用于人或动物的开放出创伤和烧伤表面，即有可能借助该菌种生长速度、生命力顽强的特征，利用菌种间的生态拮抗作用，抑制已将要侵入创伤和烧伤表面的致病性微生物的生长，从而达到预防和治疗创面感染的目的。
为此目的，我们选择了属于芽孢杆菌属的非致病性微生物，试验结果发现，多种芽孢杆菌对某些致病菌或条件致病菌具有生态环境和营养条件两方面的竞争性抑制与拮抗作用。这些芽孢杆菌属的细菌包括但不只仅于枯草芽孢杆菌(Bacillus Subtilis)、地衣形芽孢杆菌(B.lichcmiformis)、短芽孢杆菌(B.brenis)和软化芽孢杆菌(B.macerans)。虽然上述细菌均可使用，但其中最好枯草芽孢杆菌。为此，我们首先从健康人皮肤上分离了一株不含溶血毒素的枯草芽孢杆菌，即BS224菌株。经过大量的动物试验和临床试用，结果表明将含有该菌株发孝液喷洒于烧伤或开放性创伤伤口上，基于该菌株的生物学特性，可立即在伤面表面形成一层保护膜，在创面上迅速繁殖，不仅对创面构成一个强大的生物屏障，而且可强有力地抑制包括先侵入或继后侵入的致病菌，如金黄色葡萄菌、绿脓杆菌及大肠杆菌等的生长，达到预防和控制感杂、清洁创面，并促进早期愈合的目的。
本发明人在上述发现的基础上，进一步使人体皮肤分离到一株新的枯草芽孢杆菌菌株。该菌株除具有不含溶血素这一细菌学性质外，还具以下三个重要的遗传特征(1)具有腺嘌呤营养缺陷型遗标记；(2)具有人工诱变的多粘菌素抗性遗传标记；该菌株被定名为枯草芽孢杆菌BS874菌株，并于1995年6月13日保藏在中国专利局指定的微生物保藏机构，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏登记号为CGMCC，NO.022F。现将该菌株的细菌学性质和生物学特性详细描述如下。
一、形态学及染色特征1.形态学为竹节杆菌，大小为0.7-0.8×2.0-3.0μm。芽胞位于菌体中央，成椭圆形。无荚膜，有动力。菌体单个游离或成短链状排列。
2.染色革兰氏染色阳性。
二、培养特性需氧。在普通琼脂培养基上易于生长。在7％Nacl和PH5.7培养基中生长良好。在血液琼脂平板上生长24小时后未见，溶血环。
菌落扁平，粗糙、呈灰白色，不透明，无光泽、边缘不整齐。
三、生物化学反应<
>按照伯杰氏细菌学鉴定手册(1984年第八片第132-735页)，并以标准枯草芽胞杆菌P.C.I.209.6633为标准菌株，确定本发明的菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus，subtilis)。
四、遗传学特性1.腺嘌呤黄养缺陷型标记本发明的枯草芽胞杆菌BS874菌株在每升含有10g旦白胨、5g素母粉、10gNacl，PH7.2的LB培养基中生长良好，但在每升含有14gD2HO4、6gKH2PO4、0.2g MgSo4·7H2O、2g(NH4)2SO4、1g柠檬酸钠、PH7.0的基本培养基中不能生长。从而确定该菌株为腺嘌呤缺陷型菌株。试验中使用的对照菌株为色氨酸缺陷型枯草芽胞杆BS168(trp-)菌株；在平行的试验中，该对照菌株只有在补充了色氨酸的基本培养基中才得以生长。
2.抗多粘菌素B抗药遗传标记及其产生为了增加本发明枯草芽胞杆菌的遗传学标记，并使本发明的BS874菌株的存活性不致因治疗中同时使用多粘菌素B而受到影响，我们使用化学诱变剂硫酸二乙脂(DES)处于对数生长期活菌株60分钟，使菌株逐步适应度能耐受高浓度多粘菌素(300μg/ml)，并在继续传代中仍较稳定地保留这一人工诱变获得的抗药性遗传性状。但这里应顺便指出的是这一获得性遗传标记对于该菌株的临床就用来说，并不是必要的。
基于上述结果，目前可以证明本发明的菌株是一株新的不同于天然任何已知菌株的新菌株。为了证明该菌株的悬浮培养液用作烧伤和创伤表面感染预防和治疗剂的可行性，我们已进行体外生物拮抗试验、皮肤过敏试验、安全性试验、动物烫伤创面致病菌感染的治疗试验等一系列试验。结果表明，本发明的菌株对活体动物无任何毒付作用，安全性可靠，局部应用和腹腔注入均不会对动物造成致病性感染。特别是该菌侏用于创伤和烧(烫)伤局部，可强有力地抑制或阻止其他致病性细菌的侵入与生长，使之适于用作创伤和烧伤感染的预防与治疗剂(详见实施例部分)。
为临床应用目的，可将本发明的活菌制剂制成冻干制品和乳剂制品。
为制备冻干制剂，将本发明的枯草杆菌BS874菌株高密度接种于每升含有28g营养肉汤、5.5琼脂并加无菌蒸馏水到1升的营养琼脂培养基上，35-37℃培养24-48小时后，用生理盐水将琼脂培养基表面上生长的菌苔洗下。离心沉淀(3000rpm，30分钟)后，弃去上清后，将沉淀物与适量的2％蔗糖(W/V)混合均匀，用Mcfarland法测标准管比浊(JF.Mcfarland，医学细菌生化试验鉴定手册，P173，人民卫生出版社，1985年版)，并用常规滴注培养法进行活菌计数。将菌液浓度释至10’5活菌/ml后，加入等量3％低分右旋糖并混匀，按每支1ml体积分装到小安瓶中，真空下冷冻干燥，即得到冻干制品。
为了制备本发明枯草杆菌BS874株活菌的乳剂制品，首先取硬脂酸140g、单硬脂酸甘油酯50g、加热混溶后冷却至70℃。同时取氢氧化钾5g、甘油180g溶解后混匀。在70℃水溶中，在持续搅拌下将如此得到的水相缓慢加入上述油相中，直至凝固。然后加入按前述方法培养增殖得到的BS874活菌体沉淀物，充分混匀成乳剂，并将活菌浓度适当调整到每克乳剂约含5×108个活菌。将所得乳剂置4℃下保存。
本发明枯草杆菌制剂可以在由种子培养增殖后，直接制成每毫升约含5×108个活细菌的喷雾剂，亦可将按前述方法制得的冻干制品进行复苏后，加适当无菌盐水制成菌浓度为每毫升约含5×108个活细菌的喷雾剂。
根据创面的特点和病情需要，亦可按常规方法将本发明的枯草杆菌制剂制成悬浮液剂，软膏或薄膜贴敷剂，制备这些不同剂型制剂所使用的载体、赋形剂或添加剂是本领域普通技术人员熟知的，制备方法亦可从许多药剂学教科书和其他专业文献中查找到。
虽然本发明的枯草杆菌制剂可制成多种剂型，但从方便临床应用的角度考虑，最好是使用喷雾剂。
使用本发明的枯草杆菌喷雾制剂预防或治疗创伤、烧伤或烫伤时，一般是首先常规清除创面的污染物、渗出物和分泌物，必要时作简单地创面消毒处理，然后将该喷雾剂均匀地喷洒在创面上，由于制剂中基质中含有适当的营养琼脂(约0.5％)，故喷洒后很容易在创面表面形成一层薄膜。喷洒量一般为每平方厘米约0.1ml。治疗早期每天喷洒2-3次。待结痂形成后每天喷洒一次。喷洒时，雾液喷口离创面的距离应不超过5厘米。喷洒后无须包扎或用敷料附盖创面。
在特殊病例的治疗中，可根据具体情况，将本发明的枯草杆菌制剂与适当的抗生素混合使用，以进一步提高治疗效果。
本发明的枯草杆菌活菌制剂，通过喷洒或涂敷植入创面后，活菌体作为优势菌在创面上迅速生长，形成菌膜构成创面上的有力生物屏障，进而通过营养和生存竞争抑制致病菌的侵入和/或生长，并借助其复杂的代谢产物保护创面和促进创面早期愈合。
以下结合实施例，进一步说明本发明枯草杆菌制剂的临床适用性、使用效果及优点。
实施例7本实施例旨在证明本发明的枯草芽胞杆菌SB874菌株微生态制剂对三种常见致病菌的体外拮抗作用。
使用金黄色葡萄球菌ATCC25923、绿脓杆菌ATCC27853和大肠杆菌ATCC25922三种烧伤临床中常见的致病菌作为体外生物拮抗试验的靶细菌。
首先将各靶细菌分别接种于5ml肉肠培养基中，37℃培养12小时，并计数每种细菌的数目。然后在各靶细菌的12小时肉汤培养基中接入细菌总数不超过靶细菌数的枯草芽胞杆菌并置过28℃(大致相当于人体表感染创面的温度)培养。以不加BS874菌液的单一靶细菌培养物作为对照。
在培养开始后12、18、24和48小时分别取样(对照生长期菌液0.2ml)经用生理盐水(1.8ml)稀释后接种于琼脂平板上37℃培养，并分别计数菌落形成单位。结果如1所示。
表1 BS874菌株对三种致病靶细菌的拮抗效应
*活菌数/ml＝4滴菌液的总细菌数÷4×50(0.2ml/滴)×稀释倍数**栏内所有数据均为菌落形成单位(CFU)数logn/ml。
上述实验结果表明，本发明的BS874菌株在体外对烧伤和创伤表面的三种常见致病菌有明显的拮抗作用。该拮抗作用从按一同体温后18小时出现，24小时后达到高峰。作用机理可能是多方面的，其中包括BS874菌株高快速生长对致病菌的营养和竞争，以及BS874菌株产生的多种酶类对致病菌及其生态环境的破坏作用等。
实施例2本实施例的目的在于实验证明本发明枯草芽胞杆菌活菌制剂的使用安全性。
1.局部过敏试验选取体重为2.5-3.0kg的新西兰纯系雄性兔10只，分别皮下注射SB874菌株的细菌培养液4ml(5×108活细菌/ml)，正常饲养条件下观察10天，结果所有被试动物健康状态良好，注射局部未见任何异常。
2.全身性过敏试验取体重18-20g的昆明纯系健康小鼠，每天经腹腔注射上述SB874菌液0.5ml(5×108活细菌/ml)，连续注射7天，未见任何全身或局部不良反应，平均体重约增5％。第8天处死动物，分离心脏、肺、肝、肾、脑等主要器官，进行病理学检查，结果这些脏器均未见明显的组织学病理改变。
3.体外溶血试验将BS874活菌制剂用生理盐水作5、15、20和25倍稀释。各取2ml稀释液，分别与2％免经细胞悬液2ml混合，并于37℃保温24小时。结果显微镜下检查未见溶血现象。
实施例3本实施例的目的旨在在基础试验的基础上，将本BS874菌株的活菌制剂植入被金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌感染的大鼠烫伤动物模型的创面上，分别观察其在活体动物的创面上抑制这些致病菌感染的效果。
健康大鼠(Wistar品系)90只(体重200-250g)，分成9组。分设三个实验组，即金黄色葡萄球菌感染组、绿脓杆菌感染组、大肠杆菌感染组。与三个实验组对应的三个对照组；以及三个相应的磺胺密啶银霜(Ag-SD)治疗组。
大鼠背部经用硫化钠脱毛及乙醚吸入麻醉后，将动物背部浸入99℃沸水中12秒钟，造成局部烫伤。10分钟后各实验组及相应对照组和Ag-SD组动物分别在烫伤部位接种金黄色葡萄球菌、绿脓杆菌和大肠杆菌悬液1ml，造成感染动物模型。
感染4小时后，给实验组动物创面喷洒本发明的BS874活菌喷雾剂各1ml；给对照组动物喷洒不含活菌的本发明喷雾剂的基质材料各1ml；给Ag-SD霜剂，厚度2mm，每日涂2次。
全部动物分笼饲养1-4天，每天分别用75％酒精消毒创面后，于无菌条件下划区切取痂下组织，按常规滴注培养法进行细菌定量检查。结果如下列表2所示。
表2被感染动物经处理后结痂下组织致病菌定量分析结果<
>*统计学分析结果表明，各对照组和Ag-SD组的检测数据P值均＜0.01。
从上表可以看出，本发明的枯草杆菌BS874菌株活菌制剂，在活体动物烫(烧)伤模型中，可有效地抑制三种常见致病菌的生长和繁殖。而且，使用本发明的活菌制剂抑制烫(烧)伤局部致病菌感染，其效果明显优于目前常用的抗菌抑菌药剂磺胺嘧啶银(Ag-SD)。
实施例4本实施例旨在举例说明本发明的枯草芽胞杆菌BS874菌株活菌制剂(喷雾剂)，在治疗人体II°烧伤中的试用效果及优点。
权利要求
1.新的枯草芽胞杆菌菌株，特征在于该菌株为不溶血的腺嘌呤缺陷型菌株，并带有多粘菌素B遗传标记。
2.根据权利要求1的菌株，特征在于该菌株的起始野生菌是从健康人的皮肤上分离并纯化的。
3.根据权利要求1的菌株，其为保藏登记号为C2MCC N0.0227的枯草芽孢杆菌BS874菌株。
4.根据权利要求1的菌株，其中所说的腺嘌呤缺陷为该菌株固有的腺嘌呤营养缺陷型遗传标记。
5.根据权利要求1的菌株，其中所说的多粘菌素B抗性标记是经用化学诱变剂进行人工诱变获得的，赋予对高浓度多粘菌素B的抗性的新的遗传标记。
6.一种含有非致病性的芽胞杆菌属细菌的活菌制剂，所说的非致病性芽胞杆菌属细菌选自枯草芽胞杆菌、地衣形芽胞杆菌、短小芽胞杆菌、软化芽胞杆菌、多粘芽胞杆菌和环化芽胞杆菌，特征在于将所说的芽胞杆菌属细胞的活菌液与适当的载体和/或赋形剂混合，制成不同剂型的外用活菌制剂。
7.根据权利要求6的活菌制剂，其中所说的非致病性芽胞杆菌是不溶血的非致病性枯草芽胞杆菌。
8.根据权利要求7的活菌制剂，其中所说的非致病性枯草芽胞杆菌是保藏号为CGMCC N2.0227的枯草芽胞杆菌BS874菌株。
9.根据权利要求6的活菌制剂，特征在于该制剂选自喷雾剂、冻干剂、悬浮剂、软膏和薄膜贴敷剂。
10.根据权利要求6至9中任一项的活菌制剂在预防和治疗开放性创伤感染中的应用。
11.根据权利要求6至9中任一项的活菌制剂在预防和治疗烧伤或烫伤感染中的应用。
全文摘要
本发明提供了一新的枯草芽胞杆菌菌株BS874，该菌株不产生溶血毒素，具有腺嘌呤营养缺陷型和多粘菌素B抗性遗传标记，其保藏登记号为CGMCC No.0227。本发明还提供了含有枯草芽胞杆菌菌株BS874的活菌制剂及其在预防和治疗创伤和烧伤创面感染中的应用。
文档编号A61K35/66GK1120585SQ9510679
公开日1996年4月17日 申请日期1995年6月30日 优先权日1995年6月30日
发明者齐涵, 王淑芬 申请人:齐涵