专利名称：利用酶化软骨治疗风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎的制作方法
技术领域：
本发明属生物制药领域发明的背景中国传统医学＂以脏治脏＂的原理已被广泛地应用于多种疾病的治疗。近几年对于“口服耐受性”(Oraltolerence)的免疫学研究从另一侧面揭示了这一有效的治疗的分子生物学和细胞生物学原理(1·2)。但是动物软骨一直没有被有效地应用于对各种骨关节及其它软骨疾病的治疗，其原因是传统的煎制方法不能有效地提取软骨中的主要有效成分。
软骨蛋白的主要成分是胶原，胶原蛋白现在已发现有十八种，其共同的特征是含有由三条蛋白链构成三股螺旋结构(3)。软骨中的胶原蛋白是II型·IX型和XI型·II型胶原由三条相同的蛋白链组成，而IX型和XI型胶原由三条不同的蛋白链组成，这三种胶原一起构成软骨胶原纤维(4)。胶原纤维除了维持软骨的机械强度外，还通过其RGD氨基酸序列和细胞表面的细胞外基质受体(INTEGRIN)结合，所传递的信号保证了软骨细胞的生存、生长和分化(5，6)。
软骨细胞合成的前胶原(PROCLLAGEN)在细胞外被转化为成熟的胶原分子，胶原分子近一步组装成胶原纤维。在胶原纤维中，胶原分子非螺旋的羰基和氨基末端的赖氨酸和羟赖氨酸被氧化后会和另一分子的赖氨酸、羟赖氨酸发生缩合反应形成分子间的共价结合。经过一系列的缩水和重排，这一分子间的交联转化为更加稳定的键合(7)。从而使胶原纤维中分子间的结合变得非常稳定。在软骨中，胶原纤维还被透明质酸和硫酸软骨素所包埋(8)。因此软骨胶原的可溶性极低。
风湿性关节炎的发病机制还不清楚。患者关节红肿、疼痛并发生变形，其主要病理特征是胶原纤维降解和关节软骨坏死。再发性多发性软骨炎可以发生于身体的任何软骨，包括耳软骨和鼻软骨，其特征是所患组织红肿变形并发生坏死。它们的共同特征是免疫细胞大量侵入和患者有抗自身软骨胶原蛋白的自身免疫抗体(9)。
METHOTREXATE，CYCLOSPORIN A和AZATHIOPPINE已被用于治疗风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎。它们都是非特异性的免疫抑制药物，具有细胞毒性，长期服用会降低患者的免疫功能。激素类药物也被用于这两种疾病的治疗，但是长期服用会导致毒性副作用。中医对于风湿性关节炎的治疗主要是祛风除湿散寒止痛，所用药以虫类药为主。它们的主要功能是调节免疫系统。其特征也是缺乏特异性，治疗效果并不理想。
根据中医的“以脏治脏”及现代免疫学的“口服耐受性”的原理，软骨尤其是所含的胶原蛋白可能具有治疗风湿性关节炎和再发性多发性软发炎的功能。本发明利用蛋白酶消化使软骨胶原纤维转变为可溶性的胶原分子，并将酶化软骨应用于对风湿性关节炎及再发性多发性软骨炎的治疗。
发明的详细内容胶原分子因其含有三股螺旋结构而非常稳定，在低温下不会被胃蛋白酶或胰白酶所消化。具有非螺旋结构的羰基和氨基末端却可以被这两种酶所消化，因而胃蛋白酶和胰蛋白酶消化可以切断胶原纤维中分子间的交联。在本发明中，我首先将匀浆后的软骨在低浓度醋酸中溶胀，然后利用胃蛋白酶在酸性缓冲液或胰蛋白酶在中性缓冲液中进行消化。利用这一方法，百分之五十到百分之九十的软骨被溶解。软骨胶原蛋白的回收率可达百分之六十到百分之八十，软骨的溶解率和胶原蛋白的回收率随组织的年纪增加而降低。所提取得胶原蛋白含有II型、IX型和XI型胶原。利用我们报道的逐级盐沉淀的方法(10)，这三种胶原可以被分离纯化。它们都表现出典型的电泳蛋白图谱(图一)。II型胶原是软骨胶原的主要成分，胚胎软骨百分之八十的胶原为II型胶原，其所占比例随软骨的年龄增加而增加。酶化软骨中的II型胶原的理化性质鉴定如表一所列。这些数据显示了胶原在酶化软骨中保持了它们的三股螺旋结构的完整性。
表一酶化软骨中的II型胶原的解旋温度(Tm)赖氨酸和脯氨酸的羟基化以及羟基赖氨酸的糖化(GGHGlc-Gal-Hyl，GHGal-Hyl
根据中国传统医学的“以脏治脏”及现代免疫学的“口服耐受性”的原理，酶化软骨可以被用于防治风湿性关节炎和再发性多发软骨炎。酶化软骨可以特异性地抑制与这两种疾病有关的自身免疫反应。酶化软骨可制成水剂、片剂、胶囊、冲剂供患者服用。
参考文献(1).Chen Y.，Inobe J.，Marks R.，Gonnella P.，Kuchroo V.K.and Weiner H.(1995)，Nature Vol376，177-180(2).Whitacre C.G.，Gienapp I.E.，and Bitar D.(1991)，J.immun.Vol 147，2155-2163b(3).Piez K.A.and Sherman M.R.(1975)，Nature，Vol 258，87-90(4).Yang C.L.，Notbohm H.，Acil Y.，Rui H.F.andMuller P.K.(1995) ，Biochem.J.Vol 306，871-875(5).Zachary I.and Rozengurt E.(1992)，Cell，Vol 71，891-894(6).Juliano R.L.and Haskill S.(1993)，J.Cell Biol.，Vol 120，577-585(7).Eyre D.R.and Oguchi H.(1980)，Biochem.Biophys.Res.Commun.Vol 92，403-410(8).Harnegard D.(1977)，J.Biol.Chem.Vol 252，1980-1989.(9).Yang C.l.et al(1993)，Arch Dermotol.Res.Vol285，245-249(10).Yang C.L.et al(1991)，Eur.J.Biochem.Vol 202，1141-114权利要求
本发明属生物制药领域。本发明的主要成果是利用限制性蛋白酶技术有效地提取软骨中的有效成分。并根据中国传统医学“以脏治脏”的原理，将酶化软骨应用于对风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎的治疗。本发明的技术特征是利用生物酶解技术从动物软骨中制备治疗风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎的有效组分。本发明的权利要求和请求保护的范围是1、酶化软骨的制备技术利用限制性蛋白酶消化溶解软骨并保持其胶原成分的结构完整性，蛋白酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶。2、利用酶化软骨治疗风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎酶化软骨或从酶化软骨分离出的单一组分或多组分制成可供口服的剂型，用于治疗风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎。
全文摘要
本发明属生物制药领域。本发明的主要成果是利用限制性蛋白酶消化技术有效地提取软骨中的有效成分。并根据中国传统医学“以脏治脏”的原理，将酶化软骨应用于对风湿性关节炎和再发性多发性软骨炎的治疗。
文档编号A61K35/32GK1134818SQ9511606
公开日1996年11月6日 申请日期1995年10月11日 优先权日1995年10月11日
发明者杨春林 申请人:张小宁