专利名称：造血前体细胞保护剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种造血前体细胞保护剂及其用途。更具体地说，涉及一种以凝血酶致敏蛋白(Thrombospondin，简称TSP)或其活性片段为有效成分的造血前体细胞保护剂及其在治疗抗肿瘤药物诱发的血细胞减少症和扩增造血干细胞、祖细胞中的应用。
现在最常用的治疗肿瘤的方法是化学疗法，即，使用一些抗肿瘤药物将异常增殖的肿瘤细胞杀死。由于抗肿瘤药物在杀死肿瘤细胞的同时，对正常细胞特别是骨髓造血细胞也有杀伤作用，造成血细胞减少，而白细胞减少会使机体抵御外来感染的能力降低，红细胞减少会造成贫血，血小板减少则可导致机体出血。目前治疗化学疗法导致的血细胞减少的主要方法包括输血和输血液成份、使用能促使血细胞增殖的因子如G-CSF、GM-CSF、EPO和TPO等。
已知造血多能干细胞在一定的条件下能向粒单细胞、红细胞或巨核细胞的祖细胞分化，进一步增殖产生成熟的白细胞、红细胞或巨核细胞，每个巨核细胞又能产生数千个有功能的血小板。
造血细胞的增殖和分化受许多因子的调节，这些因子包括白细胞介素3、6、11、13和SCF、GM-CSF、TPO、MPO以及EPO。它们单独使用或合用能刺激一个系列或多个系列造血细胞的生长和分化。在正常情况下，造血干细胞和祖细胞主要存在于骨髓中，新生儿脐带血和胚胎肝脏中含量也较丰富，人末梢血中含量较低。骨髓、脐带血、胚胎肝脏以及末梢血都可用作造血干细胞的来源，但上述来源十分有限，而且，骨髓、脐带血和末梢血中可采集的造血干祖细胞绝对数较低，不能满足移植的需要。
已知TSP是血小板α颗粒的主要成份之一，在内皮细胞、平滑肌细胞、成纤维细胞和一些肿瘤细胞中也有合成。TSP在细胞与基质、细胞与细胞的相互作用中起重要作用，还能促使包括造血干细胞在内的许多细胞粘附到基质上。此外，TSP还有抗血管形成作用。TSP是由同源三聚体构成的糖蛋白，分子量450Kd，含有几个功能区域，其中最令人注意的是能与肝素结合的区域，这些区域能促使TSP结合在细胞表面的硫酸肝素糖聚蛋白(proteoglycans)上，有调节细胞的功能。
本发明的目的在于提供一种造血前体细胞保护剂及使用该保护剂治疗抗肿瘤药物诱发的血细胞减少症以及体外扩增造血前体细胞的方法。
本发明所述的造血前体细胞保护剂是以凝血酶致敏蛋白(TSP)和/或其活性片段作为有效成分的。
上述凝血酶致敏蛋白及其活性片段可以是天然的、基因重组的或它们的混合物。
凝血酶致敏蛋白的活性片段的具体例子包括由凝血酶致敏蛋白N末端的第1至第174个氨基酸残基组成的片段，简称TSP1-174。
上述造血前体细胞是指造血多能干细胞(stem cell)和各系列定向祖细胞(progenitor cells)，包括HPP-CFC(高增殖潜能集落形成细胞)、CFU-Mix或CFU-GEMM(混合集落形成单位)、CFU-MK(巨核细胞集落形成单位)、CFU-GM(粒单细胞集落形成单位)、BFU-E(红细胞集落形成单位)等，其来源包括人脐带血、骨髓、末梢血和胚肝。
本发明是以下述发现为基础的观察到TSP和其含肝素结合区域的片段TSP1-174对造血多能干细胞(HPP-CFC和CFU-GEMM)和巨核细胞祖细胞(CFU-MK)生长有抑制作用，这种抑制作用是可逆性的，用TSP或其活性片段作用过的造血前体细胞经洗涤后，可在新的细胞培养液中增殖分化。另外，TSP及其活性片段的抑制作用能完全被肝素中和。
利用TSP及其活性片段对造血前体细胞有可逆性作用这一特点，本发明者设想以TSP或其活性片段作为造血前体细胞保护剂预处理造血前体细胞，使处理后的细胞因其增殖一时性受抑，对随后加入的抗肿瘤药物的敏感性降低，从而不被抗肿瘤药物杀死。由此设计的一系列实验的结果完全证实了TSP和其活性片段能降低造血干、祖细胞对抗肿瘤药物的敏感性，保护它们免受抗肿瘤药物的杀伤。
在本发明的一个实施例中，将TSP先注射入小鼠体内，然后再注射抗肿瘤药物。实验结果发现，预先注射过TSP的小鼠，其造血功能的恢复较对照组小鼠快。这些体内结果与上述体外结果相符合，表明TSP确实对骨髓造血前体细胞有保护作用，可预防或缓解化学疗法诱发的骨髓衰竭和血细胞减少症。
在治疗由抗肿瘤药物诱发的血细胞减少症时，本发明的造血前体细胞保护剂除可单独使用外，还可以与其它能促进血细胞生长的药物合用，产生相加或协同作用。所述促进血细胞生长的药物也即造血细胞生长因子的例子包括白细胞介素3(IL3)、白细胞介素6(IL6)、白细胞介素11(IL11)、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)、粒单细胞集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、血小板生成素(c-Mpl Ligand)、巨核细胞生成素(MPO)以及粘多糖等。
在本发明的另一实施例中，先注射TSP到小鼠体内，然后注射抗肿瘤药物，最后再注射细胞生长因子G-CSF。实验结果表明，合用TSP和生长因子，其加速化疗后造血功能恢复的作用优于TSP或生长因子的单独使用。
将TSP单独地或与上述造血细胞生长因子联合使用，能在体外扩增造血干细胞和祖细胞，特别是巨核细胞及其祖细胞。其基本方法是将骨髓或脐带血细胞和作为营养源的供体血清与TSP单独地或加生长因子共孵育若干时间，或先经生长因子孵育，后加入TSP再孵育若干时间，促使早期干细胞向祖细胞分化繁殖，同时阻止祖细胞进入G2/M期进行分裂增殖，从而使造血干细胞和祖细胞的比例和绝对值大大增高，获得大量的造血干细胞和祖细胞。通过使用不同的造血细胞生长因子，可定向扩增不同的造血干细胞和祖细胞以及巨核细胞和血小板。
CD 34＋细胞通常被公认为造血祖细胞，因为CD34抗原只在CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM和BFU-E等造血祖细胞中表达。在本发明的又一实施例中，采用从人脐带血分离出来的CD 34＋细胞作为研究对象，将TSP与CD34＋细胞共孵育3天，然后再加入抗肿瘤药物孵育24小时。与对照组相比，TSP对人脐带血CD 34＋细胞具有明显的保护作用，表明TSP对小鼠的作用同样适用于人体。
本发明的造血前体细胞保护剂可用于治疗肿瘤和其它疾病的化学治疗或放射治疗诱发的血细胞减少，特别是血小板减少，还可促使大剂量化学疗法的开展，促进肿瘤的治愈。本发明的造血前体细胞保护剂还可用作体外扩增造血干细胞试剂，从人脐带血、骨髓或胚肝细胞中大量扩增造血干细胞和祖细胞，用于供者本人或其他人在患血细胞或血小板减少症、各种骨髓移植适应症时输注或移植等临床治疗使用，或冷冻保存，建立细胞库待用。
本发明实施例中使用的TSP系按Dubernard和Legrand的方法(J.Lab.&Clin.Med.，118446-457，1991)分离得到。TSP1-174为用大肠杆菌(E.Coli)表达的基因重组蛋白质，由以色列Biotech-nology General Ltd.提供。
下面通过实施例进一步具体说明本发明，但本发明并不局限于这些实施例。实施例1取Balb/c小鼠的骨髓细胞，用血浆凝块法(Han等，Br.J.Haematol，811-5，1992和J.Lab.&Clin.Med.，123610-6，1994)，将细胞(2×105/培养皿)加入含2-巯基乙醇10％、氯化钙10％、牛血清白蛋白10％、猪血清5％、牛血浆10％的α-培养液中，于37℃在CO2孵箱中培养，分析TSP单独或与小分子量肝素(Fraxiparin)合用对不同的造血祖细胞生长的影响，结果见表1。从表1可以看出，TSP和TSP1-174对CFU-MK、CFU-GEMM以及HPP-CFC有抑制作用，这种作用可被小分子肝素完全中和。表1.凝血酶致敏蛋白(TSP)和其片断TSP1-174单独或与小分子量肝素合用对不同的小鼠造血祖细胞体外生长的影响
结果以每105个种植骨髓单个核细胞所获集落的平均数±标准误表示，数据来自三个以上的独立实验。
*表示经t检验，与对照组比较，p＜0.05。实施例2取Balb/c小鼠骨髓单个核细胞，将部分细胞立即作血浆凝块法和甲基纤维素法(即，将细胞(10％)加入含甲基纤维素20％、胎牛血清20％、生长因子10％的IMDM培养液中，于37℃在CO2孵箱中培养)培养，分析祖细胞含量。以每毫升106个细胞的浓度将细胞加入含10％胎牛血清、1％再障猪血清(作为生长刺激因子的来源)、1％牛血清白蛋白和10-4M 2-巯基乙醇的培养液中，在37℃、含5％CO2的培养箱中第一次孵育3天。实验组细胞加TSP，对照组加等体积磷酸盐缓冲液(PBS)。孵育结束后，将细胞用培养液洗涤，取一部分作血浆凝块法和甲基纤维素法培养，分析祖细胞含量。将另一部分细胞与5-氟尿嘧啶(0.30μg/ml)共孵育24小时，然后洗涤，培养分析祖细胞含量，具体结果见表2。
表2.凝血酶致敏蛋白(TSP)对骨髓造血干细胞的保护作用
表中各种祖细胞数为总数。其中CFU-GEMM、CFU-GM和BFU-E采用甲基纤维素培养方法分析，CFU-MK则采用血浆凝块法分析。*表示与PBS再孵育一天组比较，p＜0.01。从表2可以看出，TSP对造血细胞的抑制作用是可逆性的，TSP孵育后的细胞经洗涤后仍可继续生长，经TSP预处理的细胞对5-氟尿嘧啶的敏感性减低。这些结果表明，TSP能保护造血干细胞不受化疗药物损伤，因此，可用于肿瘤化疗期间的骨髓保护。实施例3取8周龄Balb/c小鼠12只，分成二组，每组6只。在一组小鼠腹腔注射TSP，剂量为每只5微克，每小时一次，连续注射2次；将另一组小鼠作为对照，腹腔注射等体积PBS，注射次数和时间与实验组的相同。第二次注射后20小时，对所有小鼠注射一次5-氟尿嘧啶(5-FU)，剂量为150毫克/公斤体重。5-氟尿嘧啶注射后第8天，对所有小鼠从眼眶静脉取血约0.4毫升，作血象分析，然后取其股骨，采集骨髓细胞，培养分析造血祖细胞含量(Han等，C.R.Acad Sci.Paris 313553，1991)。
表3是三次实验的平均数据。从中可以看出，经TSP预处理的小鼠骨髓中的CFU-GEMM、CFU-MK、CFU-GM、单个巨核细胞数和末梢血中的血小板、白细胞数均比对照组高，说明TSP有保护造血细胞不被抗肿瘤药物5-氟尿嘧啶杀伤、加速造血功能恢复的作用。
表3.TSP对5-FU处理小鼠骨髓造血前体细胞和末梢血细胞的体内保护作用HPP-CFC CFU-GEMM CFU-GMCFU-MK 巨核细胞 白细胞 血小板/股骨 ×103/股骨 ×109/L ×109/L对照组10±25±210±24.5±130±47±21050±305-FU组203±16 9±24±1 9.6±146±43±1750±25TSP＋5-FU 462±24*14±2△ 12±2*16±2*65±5*5±1△ 980±20△表中数据均以平均值±标准误表示。HPP-CFC、CFU-MK和巨核细胞是用血浆凝块培养法分析。CFU-GEMM和CFU-GM是用甲基纤维素培养法分析。
末梢血白细胞和血小板数是用自动血细胞计数仪(Coulter T890型)测定。
*和△分别表示与5-FU组比较，经t检验，p＜0.01和p＜0.05。实施例4取8周龄Balb/c小鼠20只，分成4组，每组5只。除G-CSF外，按与实施例3相同的注射剂量和时间，1)在TSP组小鼠腹腔注射二次TSP后，再注射一次5-FU；2)在与TSP组相同的时间，先在G-CSF组小鼠腹腔注射二次PBS，再注射一次5-FU，注射5-FU 24小时后，再注射G-CSF，每天一次，每次每鼠5微克，共注射5天；3)对TSP和G-CSF组小鼠，与TSP组同样，先注射二次TSP，再注射一次5-FU，在注射5-FU 24小时后，与G-CSF组同样，注射G-CSF5天；4)与G-CSF组同样，在5-FU组小鼠腹腔，先注射二次PBS，再注射一次5-FU。在5-FU注射后第6天和第8天，按与实施例3相同的方法，对所有小鼠采集末梢血，作血象分析；采集股骨，取骨髓细胞作造血前体细胞分析。表4为一次实验的数据，从中可以看出，TSP与G-CSF合用，有相加或协同作用，能明显加速化疗后造血功能的恢复。表4.TSP和G-CSF体内合用对5-FU处理小鼠造血系统的影响HPP-CFC CFU-GEMM CFU-GM CFU-MK 巨核细胞 白细胞 血小板/股骨 ×103/股骨×109/L×109/L第6天5-FU组 320±16 12±3 2±1 3±121±3 2±1220±25TSP组460±22*22±3*6±2△ 7±2*40±5*4±1△ 320±30△G-CSF组 280±30 8±2 7±2△ 2±123±4 5±2△ 250±40TSP加G-CSF组 450±40*21±4*8±2*6±2*46±6*7±2*460±30*第8天5-FU组 194±22 10±2 8±2 10±2 40±5 3±1720±46TSP组436±30*18±2*19±3*17±3*64±4△ 5±2△ 990±30△G-CSF组 201±24 12±2 20±3*9±238±3 7±2△ 760±40TSP加G-CSF组 440±22*22±2*22±4*21±3*56±5△ 9±3*1100±40*表中数据均以平均值±标准误表示，测定方法与实施例3相同。实施例5将按免疫磁珠法(Xi等，Br.J.Haematol，90921-922，1995)分离得到的CD34＋细胞分成等量二管，每管2×104细胞，细胞浓度为104/500微升。在其中一管内加TSP，使其最终浓度为5μg/ml，在另一管内加等体积PBS作为对照。将细胞与TSP在37℃、含5％CO2的培养箱中孵育3天。孵育结束后，用培养液洗涤细胞，再加入5-氟尿嘧啶(0.3μg/ml)，共孵育24小时。然后洗涤，用甲基纤维素法和血浆凝块法培养分析祖细胞含量，具体结果见表5。表5.凝血酶致敏蛋白(TSP)对人脐带血CD34＋细胞的保护作用CFU-GEMM CFU-GMCFU-MKPBS＋5-FU组242±12 450±22 335±12TSP＋5-FU组427±18*640±17*742±24*本实验共做三次，表中结果为总的细胞数。其中，CFU-GEMM和CFU-GM是用甲基纤维素法分析，CFU-MK是用血浆凝块法分析。
*表示与PBS＋5-FU组比较，p＜0.05。
上述具体实施例的描述揭示了本发明的一般性质，从而使本领域的技术人员应用目前的知识，为了各和应用，能容易地修饰和/或改动这些具体实施例，代之以其它形式的实施例而不背离本发明的基本构思和内涵。这些改动和修饰因此应属于这些公开例子的等价事例的范围。应理解，此处所采用的措辞和术语是为了便于描述而不起限制作用。
权利要求
1.一种造血前体细胞保护剂，其特征在于，以凝血酶致敏蛋白和/或其活性片段为有效成分。
2.如权利要求1所述的保护剂，其特征在于，所述活性片段至少含凝血酶致敏蛋白N-末端第1至第174个氨基酸残基。
3.如权利要求2所述的保护剂，其特征在于，所述活性片段由凝血酶致敏蛋白N-末端第1至174个氨基酸残基组成。
4.如权利要求1所述的保护剂在体外扩增造血前体细胞中的应用，其特征在于，将所述保护剂与造血前体细胞共孵育。
5.如权利要求1所述的保护剂在体外扩增造血前体细胞中的应用，其特征在于，将所述保护剂和造血细胞生长因子与造血前体细胞共孵育。
6.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述造血前体细胞为造血多能干细胞和/或各系列定向祖细胞。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述造血多能干细胞和/或各系列定向祖细胞包括高增殖潜能集落形成细胞、混合集落形成单位、巨核细胞集形成单位、粒单细胞集落形成单位和红细胞集落形成单位。
8.如权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述造血前体细胞为来自人脐带血或骨髓、末梢血和胚肝的造血前体细胞。
9.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述造血细胞生长因子为选自白细胞介素3、白细胞介素6、白细胞介素11、粒单细胞集落刺激因子、粒细胞集落刺激因子、干细胞因子、血小板生成素、巨核细胞生成素以及粘多糖中的一种或多种。
全文摘要
一种以凝血酶致敏蛋白(TSP)或其活性片段为有效成分的造血前体细胞保护剂。可作为治疗抗肿瘤药物诱发的血细胞减少症。单独地使用或与细胞生长因子合用，能体外或EX VIVO扩增造血干细胞和祖细胞。
文档编号A61K38/36GK1151322SQ95121410
公开日1997年6月11日 申请日期1995年12月8日 优先权日1995年12月8日
发明者韩忠朝 申请人:上海贝特生物技术有限公司