专利名称：作为抗血栓形成的化合物的3-哌啶甲酸衍生物的制作方法
背景技术：
本发明是1994年12月27日提交的序列号为08/364,896的申请的部分继续申请，而序列号为08/364,896的申请又是1994年3月16日提交的序列号为08/213,772的申请的部分继续申请。
血小板聚集是对减少因血管损伤而引起的出血的最初的止血反应。然而，这种正常的止血过程的病理学蔓延可以导致血栓形成。血小板聚集的决定性的、常见的途径是纤维蛋白原与活化的、暴露的血小板GPIIb/IIIa的结合。因此，阻碍纤维蛋白原与血小板糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)结合的试剂抑制血小板聚集。因而，这些试剂可用于治疗血小板介导的血栓形成疾病，例如动脉和静脉血栓形成、急性心肌梗塞形成、不稳定绞痛、溶解血栓疗法和血管成形术后的再闭塞、炎症以及各种血管闭塞疾病。纤维蛋白原受体(GPIIb/IIIa)是由刺激物活化的，所述刺激物为例如ADP、胶原蛋白和凝血酶，其结合区暴露于维蛋白原的两个不同肽区α链Arg-Gly-Asp(RGD)和γ-链His-His-Leu-Gly-Gly-Ala-Lys-Gln-Ala-Gly-Asp-Val(HHLGGAKQAGDV，γ400-411)。因为这些肽片段本身已表明可拮抗(抑制)纤维蛋白原与GPIIb/IIIa结合，所以这些片段的仿制品也可用作拮抗剂。实际上，在本发明之前，有效的基于RGD或模拟RGD的拮抗剂曾被人披露过，它们既可抑制纤维蛋白原与GPIIb/IIIa的结合又可抑制血小板聚集。这些试剂中的一些也已显示出作为抗血栓形成剂的体内功效，而且在某些情况下，还已被用于与溶解纤维蛋白疗法相结合(例如t-PA或链激酶)。
本发明的公开内容本发明涉及下面通式(I)所代表的化合物 其中X1、X2、Y、Z、R2和A如下文所定义。基于纤维蛋白原γ400-411的结构特征的这些化合物是用于治疗血小板介导的血栓形成疾病的血小板聚集抑制剂，所述血小板介导的血栓形成疾病有例如动脉和静脉血栓形成、急性心肌梗塞形成、溶解血栓疗法和血管成形术后的再闭塞、炎症和不稳定绞痛和各种血管闭塞疾病。这些化合物还可用作抗血栓形成剂，用于与溶解纤维蛋白疗法相结合(例如t-PA或链激酶)。含有这些化合物的药物组合物也是本发明的一部分。
本发明的详细描述更具体地讲，本发明涉及下列式(I)化合物
其中X1和X2可相同或不同，并且选自H2或O。优选X1和X2各自均为O。
Y是(CH2)m、CH(NHCOR3)(CH2)m或CH(NH2)(CH2)m。
A为NHR1、C(NH)NH2或环中含有一个氮的环烷基环，其中该环选自哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吡咯烷-2-基和吡咯烷-3-基中的任何一个。更优选的是，该环选自哌啶-2-基、哌啶-3-基或哌啶-4-基中的任何一个。
Z为(CH2)n或CH(CO2R4)(CH2)n，优选Z为(CH2)2。
R1为H、烷基或CH(NH)NH2。更优选R1为H或烷基。最优选R1为氢。
R2为H或烷基。优选R2为氢。
R3为烷氧基或烷基。优选R3为叔丁氧基或甲基。最优选R3为叔丁氧基。
R4为烷基或芳烷基，例如苄基。优选R4为甲基。
R6为H、烷基或芳烷基，例如苄基。若R6不为H；则其为前药形式。
m为整数0、1、2或3。
n为整数0、1或2。
除非另外指出，本发明中作为单独的基团或一个取代基的一部分所用的烷基和烷氧基包括具有1-8个碳原子的直链或支链。例如，烷基包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-(2-甲基)丁基、2-戊基、2-甲基丁基、新戊基、正己基、2-己基和2-甲基戊基。烷氧基是从先前所述的直链或支链烷基形成的含氧醚类。环烷基含有5-8个碳原子，并且优选6-7个碳原子。
本文中单独或与其它术语结合使用的术语“芳基”是指芳族烃基，例如苯基或萘基。术语“芳烷基”是指被芳基取代的烷基。
本发明的化合物还可以以可药用盐的形式存在。所述可药用盐一般呈这样的形式，其中1-哌啶取代基上的氮用无机或有机酸质子化。然而若X2为H2，则环氮可以形成盐。代表性的有机或无机酸包括盐酸、氢溴酸、氢碘酸、高氯酸、硫酸、硝酸、磷酸、乙酸、丙酸、乙醇酸、乳酸、琥珀酸、马来酸、富马酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、苯甲酸、扁桃酸、甲硫酸、羟基乙磺酸、苯磺酸、草酸、双羟萘酸、2-萘磺酸、对甲苯磺酸、环己烷氨基磺酸、水杨酸、糖酸或三氟乙酸。
特别优选的本发明化合物包括下式所代表的化合物 R＝H m＝3 n＝2 R5＝L-NHBoc R6为苄基(Bn)(CP#1)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝L-NHBoc R6是H(CP#2)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝D-NH-Boc R6是H(CP#3)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝L-NH2R6是H(CP#4).R＝H m＝3 n＝2 R5＝H R6是H(CP#5)；R＝H m＝3 n＝1 R5＝L-NHAcR6是H(CP#6)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝L-NHAc R6是H(CP#7)；R＝C(NH)NH2m＝2 n＝2 R5＝L-NHBoc R6是H(CP#8)；R＝H m＝3 n＝3 R5＝L-NHBoc R6是H(CP#9)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝D-NH2R6是H(CP#10)；R＝H m＝3 n＝3 R5＝D-NHBoc R6是H(CP#11)；R＝H m＝3 n＝1 R5＝D-NHBoc R6是H(CP#12)；R＝H m＝3 n＝2 R5＝D-NHAc R6是H(CP#13)；CP#3的3-S-异构体R6是H(CP#14)；R＝i-Prm＝3n＝2XL-NHBoc R2是H(CP#15)；CP#3的3-R-异构体R6是H(CP#16)； 本发明化合物可以从可商购的起始原料开始按下列反应路线AA、AB、AC和AD 来制备。
其中X1和X2各自均为氧的本发明化合物可以按下列路线AA来制备。在该路线中，3-哌啶甲酸(外消旋混合物或任何一种单独的对映体)可以用低级烷基醇及催化量的酸在约室温至回流温度下处理，得到作为酸盐的酯衍生物AA1。典型的醇类(包括乙醇、甲醇、异丙醇和丁醇)可以与诸如对甲苯磺酸、HCl或硫酸等酸性催化剂匹配。优选的试剂是甲醇和HCl。衍生物AA1可以在环氮上用各种酰化剂酰化，得到衍生物AA2。典型的反应条件包括将AA1用酰化剂和一当量的有机碱在惰性溶剂中在室温下处理15分钟至2小时。优选的酰化剂为用偶合剂例如DCC(1，3-二环己基碳化二亚胺)和BOP-Cl(双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯活化的氨基被保护的氨基酸或者氨基被保护的氨烷基羧酸类。但氨基被保护的酸衍生物例如酸酐类、N-羟琥珀酰亚胺类、以及酰氯类也可以使用。适宜的保护基团包括氨基甲酸低级烷基酯类、氨基甲酸支链烷基酯类、氨基甲酸苄酯类、乙酰胺类和取代的乙酰胺类。对酰化剂及其氨基保护基团的选择是决定其中X1和X2为氧的式I化合物中取代基Y和R1的因素。在路线AA中，保护的氨基酸是式NH(Boc)CHCO2H(CH2)nN(Cbz)的二氨基酸，它可以在该路线的后面对这两个氨基进行选择性保护。这种选择仅用于说明本发明而不是用于限制本发明。
衍生物AA2可以用碱和适宜的溶剂混合物处理，得到盐衍生物AA3。适宜的无机碱包括NaOH、KOH、Mg(OH)2、LiOH、Na2CO3和NaHCO3，所述无机碱可以与THF和水的混合物在室温下混合1～6小时，得到所需产物。可以使用的有机碱包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺和四甲基胍。这些碱可以与有机溶剂一起使用，在室温至回流温度下进行1-6小时，得到盐AA3。
优选的反应条件(即所说明的条件)是将AA2用LiOH、水和THF在室温下处理1小时。可以使用的其他适宜无机碱为例如NaOH、KOH、Mg(OH)2、NaCO3和NaHCO3。若使用其他的上述碱，则AA3中的Li当然就会被适当的金属取代基置换。衍生物AA3可以用羧基被保护的羧基烷基胺或羧基被保护的氨基酸在标准的氨基酸偶合条件下处理，得到二取代的3-哌啶甲酸衍生物AA4。可接受的偶合条件包括使用肽偶合剂例如DCC、BOP-Cl和EDC(乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺·HCl)。适宜的羧基保护基团包括氨基甲酸苄酯类、取代的氨基甲酸苄酯类、氨基甲酸烷基酯类和氨基甲酸支链烷基酯类，其中保护基团的选择对于化学合成方面熟练的技术人员来讲是显而易见的。在举例说明的实例中使用NH2(CH2)nCO2-(Bzl)作为被保护的氨基酸。对于氨基酸及其羧基保护基团的选择又决定着其中X1和X2均为氧的式I化合物中的取代基R2和Z。按照氨基或羧基保护基团的需要，可以使衍生物AA4选择性地去保护。在举例说明的实例中，3-羧基上的保护基团及一个氨基上的保护基团通过采用Pd/C在H2气氛中催化氢化而同时除去，得到衍生物AA5。
路线AA
路线AB说明了其中X2为O且X1为H2的式I化合物的制备。3-哌啶甲酸(外消旋混合物或单独的对映体之一)可以用烷基醇和催化量的酸在约室温至回流温度下处理，得到酸盐形式的酯衍生物AB1。典型的醇类包括乙醇、甲醇、异丙醇和丁醇。酸催化剂包括对甲苯磺酸、HCl和硫酸，其中优选的试剂为甲醇和HCl。衍生物AB1可以在环氮上用各种酰化剂进行酰化，得到衍生物AB2。典型的反应条件包括将AB1用酰化剂和一当量的有机碱在惰性溶剂中在室温下处理15分钟至2小时。优选的酰化剂为用偶合剂例如DCC(1，3-二环己基碳化二亚胺)和BOP-Cl(双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯)活化的氨基被保护的氨基酸或氨基被保护的氨烷基羧酸类。但氨基被保护的酸衍生物例如酸酐类、N-羟琥珀酰亚胺类和酰氯类也可以使用。适宜的保护基团包括氨基甲酸低级烷基酯类、氨基甲酸支链烷基酯类、氨基甲酸苄酯类、乙酰胺类和取代的乙酰胺类。氨基酸及其氨基保护基团的选择是决定式I化合物中取代基Y和R1的因素。在路线AB中，被保护的氨基酸是式NH(Boc)CHCO2H(CH2)nN(Boc)的二氨基酸，所述选择只用于说明本发明而不用于限制本发明。衍生物AB2可以用碱和适宜的溶剂混合物水解，得到衍生物AB3。适宜的无机碱包括NaOH、KOH、Mg(OH)2、LiOH、Na2CO3和NaHCO3，所述碱可以与THF和水的混合物在室温下混合1-6小时，得到所需产物。可以使用的有机碱包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺和四甲基胍，这些碱可以与有机溶剂一起使用，在室温至回流温度下进行1-6小时，得到AB3。通过使用若干反应条件，可以将衍生物AB3的3-羧基还原，得到醛衍生物AB4。这些条件包括在-78～0℃下使用二异丙基氨基化锂，用HMPT/THF作溶剂；在-78℃下使用氯化N，N-二甲基氯代甲亚铵和氢化叔丁氧基铝锂，用吡啶作溶剂；以及标准的Rosenmund还原条件。优选的反应条件在-10℃使用N，N＇-羰基二咪唑、接着使用氢化二异丁基铝，得到醛衍生物AB4。AB4可以用羧基被保护的羧基烷基胺或羧基被保护的氨基酸然后用还原剂处理，得到二取代的3-哌啶甲酸衍生物AB5。适宜的羧基保护基团包括氨基甲酸苄基酯类、取代的氨基甲酸苄酯类、氨基甲酸低级烷基酯类和氨基甲酸支链烷基酯类，其中保护基团的选择对化学合成领域的技术人员来讲是显而易见的。还原剂包括氰基硼氢化钠、氰基硼氢化锂、钠-9-氰基-9-氢化-硼杂二环[3.3.1]壬烷、氰基硼氢化四丁铵及Pd/C与酸性溶剂的混合物，其中还原剂的选择是由所用的保护基团来决定的。举例说明的实例使用NH2(CH2)nCO2Bzl作为被保护的氨基酸以及使用氰基硼氢化钠作为还原剂。氨基酸及其羧基保护基团的选择决定着化合物中的取代基R2和Z，这种选择是说明性的，并不用于限制本发明。按照氨基或羧基保护基团的需要可以使衍生物AB5选择性地去保护。作为举例说明的实例，3-羧基和两个氨基上的保护基团可以通过采用Pd/C在H2气氛中催化氢化而同时除去，得到衍生物AB6。
路线AB
其中X1为氧且X2为H2的本发明化合物可以按下列路线AC制备。在该路线中，3-哌啶甲酸(外消旋混合物或单独的对映体)可以用低级烷基醇和催化量的酸在约室温至回流温度下处理，得到作为酸盐的酯衍生物AC1。典型的醇类包括乙醇、甲醇、异丙醇和丁醇。酸催化剂包括对甲苯磺酸、HCl和硫酸。甲醇和HCl是所选试剂。衍生物AC1可以在环氮上用烷基化剂烷基化，得到衍生物AC2。烷基化剂包括卤代烷基胺合成纤维例如溴代烷基邻苯二甲酰亚胺类和溴代烷基腈类或通过还原胺化方法(条件参见路线AD)所得的脱去保护的氨基醛类。典型的反应条件包括将AC1用碱例如氢化钠或相转移催化剂(例如氟化四丁铵)和烷基化剂在惰性溶剂中在室温下处理15分钟至2小时，接着用任何上述适宜的保护基团按常规方法保护3-取代基的氨基。烷基化剂及其氨基保护基团的选择是决定取代基Y和R1的因素。在路线AC中，1位用(CH2)NH(Cbz)取代，这种选择仅用于说明本发明，而不用于限制本发明。衍生物AC2可以用碱和适宜的溶剂混合物处理，得到盐衍生物AC3。正如在路线AA中所示的那样，路线AC表明使用了优选的LiOH。然而，其他适宜的无机碱包括NaOH、KOH、Mg(OH)2、Na2CO3和NaHCO3，所述碱可以与THF和水的混合物在室温下混合1-6小时，得到所需产物。可以使用的有机碱包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺和四甲基胍。这些碱可以与有机溶剂在室温至回流温度下一起使用1～6小时，得到盐AC3。优选的反应条件(所说明的条件)是用LiOH、水和THF在室温下处理AC2 1小时。衍生物AC3可以用羧基被保护的羧基烷基胺或羧基被保护的氨基酸在标准的氨基酸偶合条件下处理，得到二取代的3-哌啶甲酸衍生物AC4。可接受的偶合条件包括使用肽偶合试剂例如DCC、BOP-Cl和EDC(乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺·HCl)。适宜的羧基保护基团包括氨基甲酸苄酯类、取代的氨基甲酸苄酯类、氨基甲酸烷基酯类和氨基甲酸支链烷基酯类，其中保护基团的选择对于化学合成领域的技术人员来讲是显而易见的。举例说明的实例使用了NH2(CH2)nCO2Bzl作为被保护的氨基酸。氨基酸及其羧基保护基团的选择又决定着式I化合物中的取代基R2和Z。衍生物AC4可以按照氨基或羧基保护基团的需要进行选择性保护。在举例说明的实例中，3-羧基和1-氨基上的保护基团是通过采用Pd/C在H2气氛中催化氢化而同时除去的，得到衍生物AC5。
路线AC
其中X1和X2各自均为H2的本发明化合物可以按下列路线AD来制备。在该路线中，3-哌啶甲酸(外消旋混合物或单独的对映体)可以用低级烷基醇和催化量的酸在约室温至回流温度下处理，得到酸盐形式的酯衍生物AD1。典型的醇类包括乙醇、甲醇、异丙醇和丁醇。酸催化剂包括对甲苯磺酸、HCl和硫酸。优选的试剂是甲醇和HCl。衍生物AD1可以在环氮上用烷基化剂烷基化，得到衍生物AD2。烷基化剂包括卤代烷基胺合成纤维，例如溴化烷基邻苯二甲酰亚胺类和溴代烷基腈类或通过还原胺化方法(条件参见路线AD)保护的氨基醛类。典型的反应条件包括将AD1用碱例如氢化钠或相转移催化剂(例如氟化四丁铵)和烷基化剂在惰性溶剂中在室温下处理15分钟至2小时，接着用任何上述适宜的保护基团对氨基进行常规保护。烷基化剂及其氨基保护基团的选择是决定取代基Y和R1的因素。在路线AD中，1位用(CH2)NH(Cbz)取代，这一选择是仅用于说明本发明的。衍生物AD2可以用碱和适宜的溶剂混合物水解，得到衍生物AD3。适宜的无机碱包括NaOH、KOH、Mg(OH)2、LiOH、Na2CO3和NaHCO3，所述碱可以与THF和水的混合物在室温下混合1-6小时，得到所需产物。可以使用的有机碱包括三乙胺、三丁胺、二异丙基乙胺和四甲基胍，这些碱可以与有机溶剂在室温至回流温度下一起使用1-6小时，得到AD3。衍生物AD3的3-羧基可以通过使用若干反应条件而被还原成醛衍生物AD4。条件包括在-78～0℃下使用二异丙基氨基化锂，用HMPT/THF作溶剂；在-78℃下使用氯化N，N-二甲基氯代甲亚铵和氢化叔丁氧基铝锂，用吡啶作溶剂；和标准Rosenmund还原条件。优选的反应条件使用N，N＇-羰基二咪唑接着在-10℃下使用氢化二异丁基铝，得到醛衍生物AD4。
衍生物AD4可以用羧基被保护的羧基烷基胺或羧基被保护的氨基酸然后用还原剂处理，得到二取代的3-哌啶甲酸衍生物AD5。适宜的羧基保护基团包括氨基甲酸苄酯类、取代的氨基甲酸苄酯类、氨基甲酸低级烷基酯类和氨基甲酸支链烷基酯类，其中保护基团的选择对化学合成领域的技术人员来讲是显而易见的。还原剂包括氰基硼氢化钠、氰基硼氢化锂、钠-9-氰基-9-氢化-硼杂二环[3.3.1]壬烷、氰基硼氢化四丁铵及Pd/C与酸性溶剂的混合物，其中还原剂的选择是由所用的保护基团来决定的。举例说明的实例使用NH2(CH2)nCO2Bzl作为被保护的氨基酸以及氰基硼氢化钠作为还原剂。氨基酸及其羧基保护基团的选择决定着化合物中的取代基R2和Z，这种选择是说明性的，并不用于限制本发明。按照氨基或羧基保护基团的需要可以使衍生物AD5选择性地去保护。作为举例说明的实例，3-羧基和两个氨基上的保护基团可以通过采用Pd/C在H2气氛中催化氢化而同时除去，得到衍生物AD6。
路线AD
至于所有路线的起始原料，制备A为NHR1的化合物所需的绝大多数氨基酸和氨基烷基羧酸类是可商购的，并且仅需对保护基团进行处理就能得到所需的式I化合物。然而，为了制备其中A为含有氮的环烷基的本发明化合物，1-取代基(哌啶)在加入之后必须进行修饰，以便得到所需的式I化合物。为了制备其中1-取代基是C(O)(CH2)2-4-基哌啶的化合物，将衍生物AA1或AB1用上述酰化方法用3-(4-吡啶基)丙烯酸酰化，得到酰化了的衍生物AA2和AB2。将这些衍生物按各路线中所述方法转化得到AA4和AB5。衍生物AA5和AB6可以制备如下将AA4和AB5用适宜的还原剂处理，此时，该还原剂除去3位羧基上的保护基团，并且还原亚乙基取代的吡啶，得到所需化合物。优选的还原/去保护剂是PtO2。2-基和3-基哌啶可以通过按常规方法修饰丙烯酸衍生物来制备。
为了制备其中1-取代基为C(O)(CH2)2-3-基吡咯的化合物，将衍生物AA1或AB1用上述酰化方法用3-(1-苄基吡咯烷-3-基)丙烯酸酰化，得到酰化了的衍生物AA2和AB2。该取代的吡咯丙烯酸衍生物可以通过用酸水溶液水解相应的腈衍生物得到。3-(1-苄基吡咯烷-3-基)丙烯腈是按照美国专利4002643中所述方法合成的，该文献并入本文作为参考。按上述方法处理这些衍生物(就六元情况而言)，得到其中A为环中含有氮的五元环的本发明化合物。
为了制备其中含有Boc-D-Lys和R-或者S-3-哌啶甲酰基(nipecotyl)的非对映体富集的最终化合物(参见化合物14和16)，在合成的开始时，使用相应的对映体富集的3-哌啶甲酸甲酯类化合物。对映体富集的3-哌啶甲酸甲酯类化合物是按所公开的方法(A.M.Akkerman，Rec.Trav.Chim.Pays-Bas 1951，70，899)通过外消旋物质的手性拆分进行分离的。
为了制备本发明的药物组合物，将作为活性成分的一种或多种本发明的式(I)化合物或其盐与药物载体按照常规药物配制技术进行充分掺混，所述载体可以依据给药(例如口服或胃肠外例如肌内)所需的制剂剂型的不同而呈各种形式。在制备口服剂型中的组合物时，可以使用任何通常的药物介质。因而，对于液体口服制剂例如悬浮液、酏剂和溶液而言，适宜的载体和添加剂包括水、二元醇、油类、醇类、调味剂、防腐剂、着色剂等；对于固体口服制剂例如粉剂、胶囊剂、caplets、gelcaps和片剂而言，适宜的载体和添加剂包括淀粉类、糖类、稀释剂、成粒剂、润滑剂、粘合剂、崩解剂等。由于片剂和胶囊剂易于施用，所以片剂和胶囊剂代表着最有利的口服单位剂量形式，在这种情况下，明显地要使用固体药物载体。如果必要，片剂可以按标准技术包糖衣或肠溶衣。对于胃肠外给药，所述载体通常包含无菌水，但为了例如助溶或用于防腐的目的，可以包括其他成分。也可以制备注射用悬浮液，在此情况下可以使用适合的液体载体，悬浮剂等。本发明的药物组合物的每个剂量单位(例如片剂、胶囊、粉剂、注射液、茶匙等)含有传递上述有效剂量所需量的活性成分。本发明的药物组合物每剂量单位(例如片剂、胶囊剂、粉剂、注射液、栓剂、茶匙等)含有约0.03mg至100mg/kg(优选0.1～30mg/kg)，并且可以以约0.1～300mg/kg/天(优选1～50mg/kg/天)的剂量给药。然而，所述剂量可以依据患者需要、所治疗病症的严重程度和所用化合物的不同而变化。可以进行每日给药或周期性给药(post-periodicdosing)。
药理学本发明化合物阻碍纤维蛋白原与血小板糖蛋白IIb/IIIa(GPIIb/IIIa)的结合，因而抑制血小板聚集。所以，所述化合物可用于治疗血小板介导的血栓形成疾病，例如动脉和静脉血栓形成、急性心肌梗塞形成、溶解血栓疗法和血管成形术后的再闭塞和各种血管闭塞疾病。因为在正常血小板聚集中的决定性、常见途径是纤维蛋白原与活化的、暴露的GPIIb/IIIa结合，抑制这种结合是一种可行的抗血栓形成的方法。受体是用刺激物来激活的，所述刺激物为例如ADP、胶原蛋白和结合区暴露于纤维蛋白原的两个不同肽区的凝血酶，所述两个不同肽区为α-链Arg-Gly-Asp(RGD)和γ-链400-411。正如下文所述药理学研究结果所证实的那样，本发明化合物具有阻断纤维蛋白原与离析的GPIIb/IIIa(IC50为3-5800nM)结合在各种血小板刺激物存在下体外抑制血小板聚集的能力，并且抑制动物模型中离体(ex vivo)血小板聚集。
体外固相纯化的糖蛋白IIB/IIIA结合测定在96孔Immulon-2微滴度板(Dynatech-Immulon)上，每孔涂铺50μl溶于10mM HEPES、150mM NaCl、1mM pH7.4中的RGD-亲合纯化的GPIIb/IIIa(有效范围0.5～10μg/ml)。覆盖该板，并在40℃培养过夜。弃去GPIIb/IIa溶液，加入150μl 5％BSA，并在室温下培养1-3小时。该板用改性的Tyrodes缓冲液彻底洗涤。向含有两倍于最终浓度的试验化合物(25μl/孔)的各孔中加入两倍于最终浓度的生物素化的(biotinylated)纤维蛋白原(25μl/孔)。覆盖该板，并在室温下培养2-4小时。培养完全前20分钟，在搅拌下向5ml改性的Tyrodes缓冲液混合物中加入-滴Reagent A(Vecta Stain ABC Horse Radish PeroxidaseKit，Vecbor Laboratories，Inc.)和一滴Reagent B并静置，弃去配体溶液，用改性的Tyrodes缓冲液洗涤(5×200μl/孔)板。加入Vecta Stain HRP-Biotin-Avidin试剂(50μl/孔，如上所制备)，并在室温下培养15分钟。弃去Vecta Stain溶液，各孔用改性的Tyrodes缓冲液(5×200μl/孔)洗涤。加入显色缓冲剂(10ml 50mM柠檬酸盐/磷酸盐缓冲液@(pH5.3)、6mg邻苯二胺、6μl 30％ H2O250μl/孔)，并在室温下培养3-5分钟，然后加入2N H2SO4(50μl/孔)。在490mM处读出吸光度。结果列于表I。
体外抑制凝血酶诱导的凝胶过滤的血小板聚集测定血小板聚集百分数是以经化合物处理的血小板浓缩物的透光率相对于对照组处理的血小板浓缩物的透光率的增加来计算的。从不含药物的正常供血者取血，加入到含有0.13M柠檬酸钠的试管中。血小板富集的血浆(PRP)是通过将全血在200xg条件下在25℃离心10分钟收集的。将PRP(5ml)经Sepharose 2B(床体积50ml)进行凝胶过滤，并将血小板计数调整到每个样品2×107个血小板。将下列组分加入到硅氧烷化的比色杯中浓缩的血小板滤液和Tyrode缓冲液(0.14M NaCl、0.0027M KCl、0.012M NaHCO3、0.76mMNa2HPO4、0.0055M葡萄糖、2mg/ml BSA和5.0mM HEPES@pH7.4)，其用量分别等于350μl、50μl 20mM钙和50μl试验化合物。加入激动剂(凝血酶50μl，1单位/m1)后，在BIODATA集合度计上监测血小板聚集3分钟，结果列于表I。
离体狗研究成年杂种狗(3-13kg)用戊巴比妥钠(35mg/kg，i.v.)麻醉，并进行人工呼吸。用一个插入股动脉中的Millar catheter-tip压力换能器测量动脉血压和心率。将另一Millar换能器通过颈动脉置于左心室(LV)中，以便测量LV端舒张压和心肌收缩性指标。从肢电极记录导程II心电图。将导管置于股动脉和静脉中，以分别取血和输入药物。用一Modular Instruments数据获取系统连续监测反应。
将动脉血样(5-9μl)吸进含有3.8％柠檬酸钠的试管中，以便制备血小板富集的血浆(PRP)并测定对凝固参数的作用凝血酶原时间(PT)和活化的部分促凝血酶原激酶时间(APTT)。将单独的血样(1.5ml)吸入EDTA中，以测定血细胞比容和细胞计数(血小板，RBC细胞和白细胞)。模板出血时间是从颊表面使用symplate切口装置和Whatman滤纸获得的。
PRP凝聚是使用BioData集合度计进行的。全血的凝聚使用Chronolog阻抗集合度计。PT和APTT是在BioData或ACL 3000+凝结分析器测定的。细胞用Sysmex K-1000计数。
将化合物17溶于少量的二甲基甲酰胺(DMF)中，并用盐水稀释至最终浓度为10％DMF。化合物17经静脉内途径用Harvard输注泵施用，对每一动物以累积方式给予剂量0.3、1、3和10mg/kg。每一剂量以0.33ml/分钟的恒定速度在15分钟时间内施用。在每次给药后及施药后30及60分钟获得数据。
化合物17引起了对离体血小板聚集反应的明显抑制。因此，在全血中，化合物17在剂量为0.3～10mg/kg时抑制了胶原蛋白刺激的聚集，在10mg/kg剂量时明显抑制胶原蛋白刺激的血小板ATP释放。在PRP中，化合物17在0.3mg/kg的剂量时也以显著的活性抑制胶原蛋白刺激的血小板聚集。在3.0mg/kg以上的剂量时抑制γ-凝血酶诱导的PRP的聚集。在PRP和全血中，血小板功能在30-60分钟内开始恢复，表明药物作用的相对短的持续时间。化合物17在静脉内剂量最高达10mg/kg时没有可测量的血液动力学作用。在3与10mg/kg时，所述药物引起模板出血时间的增加，而治疗后迅速恢复。在治疗过程中没有观察到对凝结(PT或APTT)的作用，而血小板、白细胞和RBC计数在化合物17为任何剂量时均无变化。
上述结果表明，化合物17在以0.3～10mg/kg剂量静脉内给药后是离体血小板聚集的广谱的有效抑制剂(以胶原蛋白和凝血酶途径进行拮抗)。抗聚集作用相对不足，并且在较高剂量时伴有出血时间增加。没有观察到其他血液动力学或血液学作用。
表1化合物编号结合IC50(μM) 血小板聚集@50μM1 20.1 20％2 0.74 67％3 0.021 0.60μM*4 2.6 21％5 0.013 1.6μM*6 24％@50μM4％7 0.074 86％8 2.7 28％9 59％@50μM2％100.76 75％117.6 43％125049％130.34 78％140.028 78％1520％@5μM 4％160.008 73％170.003 0.13μM*180.029 87％195.80 85％*表示IC50
体内狗研究在下列体内狗模型中测试了化合物16，以测定其治疗功效。
外科手术用制剂将任何性别的成年杂种狗(9-13kg)用戊巴比妥钠(35mg/kg，i.v.)麻醉，并通过一个气管内导管(12搏动/分钟，25ml/kg)与室内空气进行换气。为测定动脉压，左颈动脉插入充有盐水的聚乙烯导管(PE-200)，并与Statham压力换能器(P231D，Oxnard，CA)连接。平均动脉舒张血压、心率是使用心率计(Biotach，GouldElectronics，Cleveland，OH)(它通过肢导程产生的导程II心电图触发)来监测的。在颈静脉中插入套管(PE-200)进行给药。在左股动脉和左股静脉中插入用硅处理的(Sigmacote，Sigma ChemicalCo.，St.Louis，MO)、充有盐水的聚乙烯管(PE-200)，并与一个5cm的硅处理管(PE-240)部分连接，形成体外动静脉分路(A-V)。分路开放用Doppler流动体系(VF-1型，Crystal BiotechInc.，Hopkinton，MA)在接近分路的位置进行监测。所有参数均在多种指记器记录仪(Gould TA-4000，Oxnard CA)以10mm/分钟的纸速连续监测。
原始记录经过术后15分钟的稳定期后，通过向分路中引入凝血酶原表面(0编丝线，长5cm，Ethicon Inc，Somerville，NJ)形成闭塞血栓。使用4个连续的15分钟分路周期，第一个周期包括输注载体，接着以浓缩药团形式给药浓度逐渐增加的化合物16、SC-47643、含有DMF的盐水或含有柠檬酸的盐水，然后在插入凝血酶原表面前5分钟开始输注，并再连续输注15分钟。在每一15分钟分路周期结束时，将丝线小心地取出并称重。全部累积治疗剂量后，立即用第五个分路评价开放时间，这是由达到全部闭塞的时间指示的。血栓重量的计算是用从分路中取出的丝线的总重量减去放置前丝线的重量。在第一个分路之前及每次分路周期之后取动脉血，测定全血胶原蛋白诱导的血小板聚集、凝血酶诱导的血小板脱粒(血小板ATP释放)，凝血酶原时间及血小板计数。在进入到每一分路周期10分钟时开始记录模板出血时间。
血液学研究血小板、WBC和RBC计数及血细胞比容的测定是在收集在2mg/mlEDTA二钠盐中的全血上采用SysmexTMK1000(Baxter Laboratories，McGraw Park，IL)进行的。
全血小板聚集与ATP释放用lumi一集合度仪(Chrono-Log，Havertown，PA)通过记录保持于37℃的搅拌着的(1000rpm)全血悬浮液的阻抗(血小板聚集)和透光率(ATP-释放)的变化来测量的。将血样收集在0.01M柠檬酸钠溶液中，并用含有0.5mM Ca(25μl 0.02M CaCl2和20μl luciferol(ChroRo-log，Havertown，PA))的盐水稀释50％。最终体积为1ml。用胶原蛋白(2μg/ml)诱导聚集，同时在另一样品中，用凝血酶(0.5U/ml)(Chrono-log，Havertown，PA)监测血小板脱粒，并将阻抗和发光的变化记录6分钟。凝血酶原时间(PT)用微量样品凝结分析仪(Ciba Corning 512，Corning，NY)监测。模板出血时间是通过在树胶(gum)(Surgicutt，ITC Corp，Edison，NJ)中造一个切口并监测到达凝块形成的时间来完成的。
药物化合物16；1＋0.03，3＋0.1和5＋0.3mg /kg，i.v.(浓缩药团)+mg/kg/hr，i.v.(输注)，将其溶于含有DMF(5％)的盐水中，并连续稀释至达到适合的浓度，以母体化合物表示。
统计学分析结果列于表2-4。所有数值均以平均值与平均值的标准误差来表示。变化值的统计学意义是基于与方差分析的基线的变化和“学生”t检验来评价的。当P＜0.05时，认为差异明显。
表2表2.在治疗期间和累积给药后闭塞性血栓形成的发病率。所给数值是每组的动物数目，其中发生了零短路血流，并且短路不再开放。在治疗后的恢复期内监测狗60分钟。
表3表3化合物16对血栓重量和出血时间的影响治疗组N分路 血栓重量出血时间周期 (mg)(秒)对照组4基线 119±18DMF 5％ 41-载体 58±5 116±2742-剂量156±5 120±1543-剂量255±6 104±1544-剂量363±5 121±27化合物16 4基线 101±1141-载体 68±5 84±842-剂量152±3 94±743-剂量227±1*122±1444-剂量319±2*241±23*对照组5基线 103±14柠檬酸51-载体 80±5 80±652-剂量169±4 88±1053-剂量265±7 93±18所有数值均以平均值±SEM表示。所有参数均在每次短路周期后立即记录，以评价治疗效果。
*“学生”t检验对治疗前，P＜0.05。
表4化合物16对血小板计数、y-凝血酶诱导的血小板聚集胶原蛋白诱导的血小板聚集血压和心率的影响治疗组N分路血小板计数 γ-凝血酶诱 胶原蛋白诱导 血压 心率周期(×1000μl) 导的血小板聚 的血小板聚集 (mmHg)(心跳/集(％抑制)(％抑制)分钟)对照组4基线 299±25 159±5168±3DMF 5％ 41-载体313±20 6±4 3±3159±6168±342-剂量1 273±23 7±7 5±5162±5162±543-剂量2 278±35 8±8 6±6169±3160±744-剂量3 253±15 4±3 2±2163±5155±243 0分钟后 252±32 5±4 6±4460分钟后 212±43 7±3 6±4化合物#16 4基线 409±27 137±13 141±741-载体380±26 9±6 9±9141±11 143±642-剂量1 352±20 8±5 14±3147±8146±643-剂量2 353±22 34±8*99±1*141±10 138±444-剂量3 358±26 72±8*100±10*141±9136±7430分钟后 339±25 21±882±13*460分钟后 360±22 11±557±14*对照组5基线 317±36 未作 133±9154±9柠檬酸51-载体315±35 5±3133±9154±952-剂量1 313±34 0±8131±8152±853-剂量2 313±44 18±5133±8151±11所有数值均以平值±SEM表示。所有参数均在每次分路周期后立即记录以评价治疗效果。
*“学生”t检验对治疗前，P＜0.05。
实施例被保护的氨基酸购自Bachem Bioscience Inc。使用氨基被保护的N-羟基琥珀酰亚胺酯免除了使用BOP-C1(参见化合物14的合成)。对映体富集的3-哌啶甲酸甲酯类是通过按所公开(A.M.Akkerman，Rec.Tvav.Chim.Pays-Bas1951，70，899)的外消旋物质的手性拆分法分离的。所有其他化学药品购自Aldrich ChemicalCompany，Inc.。高磁场1H NMR谱是在Bruker AC-360分光计上于360MHz记录的，偶合常数以赫兹给出。熔点是在Mel-TempII熔点仪上测定的，并未经校正。微量分析是在Robertson MicrolitLaboratories，Inc.，Madison，New Jarsey或The R.W.JohnsonPharmaceutical Research Institute Analytical Department进行的。最终化合物是用常见有机溶剂进行重结晶/沉淀和/或用Mercksilica gel-60柱色谱法纯化的。纯度是在联合Beckman/WatersHPLC System和Phenomenex-Ultracarb 5ODS(30)柱(100×4.6mm)上使用含水的乙腈流动相(一般为10％MeCN/90％水)评价的。在各实施例及本申请全文中，下列缩写具有下述意义。
Ac＝乙酰基Bn或Bzl＝苄基Boc＝叔丁氧羰基BOP-Cl＝双(2-氧代-3-噁唑烷基)次膦酰氯Cbz＝苄氧羰基CP＝化合物DiBAL＝氢化二异丁基铝EDC＝乙基二甲氨基丙基碳化二亚胺EDTA＝乙二胺四乙酸
HOBT＝羟基苯并三唑i-Pr＝异丙基NMM＝N-甲基吗啉Nip＝3-哌啶甲酰基(除非另外指出，在3位是外消旋的)PTSA＝对甲苯磺酸RT＝室温TFA＝三氟乙酸实施例1 Nα-Boc-D-Lys-S-(+)-Nip-β-Ala-OH(CP#14)在5C下向Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-OH(2.9g，7.74mmol)和CH2Cl2(80ml)的混合物中加入BOP-Cl(1.96g，7.7mmol)和NMM(0.83ml，7.7mmol)。将该混合物搅拌3 0分钟，用S-(+)-3-哌啶甲酸甲酯盐酸盐(1.39g，7.7mmol)和NMM(0.83ml)处理，在5℃搅拌2小时，并用饱和NH4Cl(50ml)稀释。将有机层与水层分离，用MgSO4干燥有机层，并蒸发得到玻璃状固体。该固体经快速色谱法(4％EtOH/CH2Cl2)纯化，得到白色泡沫状Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-Ome1H NMR(CDCl3)δ7.30(m，5H)，5.50(m，1H)，5.09(s.2 H)，4.61(m，1H)，3.92(m，1H)，3.66(s，3H)，3.20(m，4H)，2.79(m，1H)，2.51(m，1H)，2.12(m，1H)，1.50-1.80(m，10H)，1.39(s，9H)；MS m/e506(MH+).
在室温下于3分钟时间内向Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-Ome(3.52g，7.0mmol)的THF(25ml)溶液中滴加氢氧化锂水溶液(0.19g溶于15ml水中)。将该溶液搅拌6小时并蒸发得到白色泡沫体。使该泡沫体在CH2Cl2(80ml)中于室温下成浆，并衣次用H-β-Ala-OBn·PTSA(2.43g，7.0Hol)、HOBT(5mg)、EDC·HCl(1.98g，10.4mmol)和NMM(0.76ml，7.0mmol)处理，将该混合物搅拌13小时，用饱和NH4Cl(50ml)稀释，并分层。有机层用MgSO4干燥，并蒸发得到白色泡沫体。该泡沫体用快速色谱法(3-4％ EtOH/CH2Cl2)纯化，得到Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-β-Ala-OBn，为白色泡沫体1H NMR(CDCl3)δ7.35(m，10H)，6.29(m，1H)，5.45(m，1H)，5.12(s，2H)，5.05(s，2H)，5.00(m，1H)，4.55(m，1H)，4.32(m，1H)，3.48(m，2H)，3.19(m，4H)，2.53(m，3H)，2.21(m，1H)，1.84(m，1H)，1.48-1.72(m，9H)，1.42(s，9H)；MS m/e 653(MH+).
在Parr瓶中于氮气氛下向Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-S-(+)-Nip-β-Ala-OBn(0.80g，1.22mmol)的THF(15ml)溶液中加入AcOH(5ml)、水(10ml)和Pd/C(10％，0.09g)。将该混合物在50psi/RT下氢化21小时，用硅藻土过滤，并蒸发至约5ml。该溶液用Et2O(60ml)处理，得到白色ppt，将其过滤并冻干得到无色絮片体14mp52-60C；1H NMR(DMSO-d6)δ7.85(m，1H)，6.83(d，J＝7，1H)，4.34(d，J＝12，1H)，4.22(m，1H)，3.60(m，2H)，3.41(m，2H)，2.98(t，J＝11，1H)，2.88(m，1H)，2.69(m，2H)，2.35(m，2H)，2.12(m，1H)，2.03(m，1H)，1.70(m，2H)，1.4-1.6(m，8H)，1.35 and 1.38(pr.s，8.51，9H)，1.16(m，2H)；IR(KBr)3450-2860，1709，1641cm-1；MS m/e 429(MH+)；[α]25D-15.20°(c 0.63，MeOH)。元素分析计算值C20H36N4O6·C2H4O2(488.6)C，54.08；H，8.25；N，11.47.实测值C，54.64；H，8.26；N，10.79.实施例2 Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn(CP#1)将按实施例1所述方法以Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯为原料制得的化合物1分离成玻璃状物1HNMR(CDCl3)δ7.29(m，10H)，6.51(m，1H)，5.39(m，1H)，5.11(s，2H)，5.06(s，2H)，4.94(m，1H)，4.54(m，2H)，4.18(m，1H)，4.02(d，J＝10，1H)，3.61(m，1H)，3.48)m，2H)，3.17(m，4H)，2.54(m，3H)，2.20(m，1H)，1.83(m，1H)，1.67(m，2H)，1.51(m，4H)，1.39(s，9H)；MS m/e 653(MH+)；元素分析计算值C35H48N4O8·1.5H2O(679.8)C，61.84；H，7.56；N，8.24.实测值C，62.00；H，7.25；N，8.23.实施例3Nα-Boc-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#2)将按实施例1所述方法经氢解化合物1而制得的化合物2分离成白色泡沫体1H NMR(DMSO-d6)δ 8.00(m，1H)，7.86(m，1H)，4.29(m，2H)，3.82(m，1H)，3.11(m，3H)，2.70(m，2H)，2.53(m，1H)，2.31(m，2H)，2.17(m，2H)，1.4-1.9(m，10H)，1.34and1.36(pr.s，11，9H)，1.23(m，2H)；MSm/e 429(MH+)；[α]25D+0.85°(c0.82，MeOH).元素分析计算值C20H36N4O6·1.5H2O(518.6)C，53.27；H，8.16；N，10.80.实测值C，53.61；H，8.18；N，10.47.实施例4Nα-Boc-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#3)将按实施例1所述方法以外消旋3-哌啶甲酸甲酯和Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-OH为原料制得的Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-3-Ala-OBn分离成白色泡沫体1H NMR(CDCl3)δ7.32(m，10H)，6.59(m，1H)，5.45(m，1H)，5.12(s，2H)，5.07(s，2H)，4.94(m，1H)，4.56(m，1H)，4.12(m，1H)，3.51(m，2H)，3.17(m，3H)，2.57(m，2H)，2.21(m，1H)，1.89(m，1H)，1.45-1.79(m，11H)，1.41(s，9H)；MS m/e653(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn制得的化合物3分离成无色絮片体mp 48-54℃.1H NMR(DMSO-d6)δ7.96(m，1H)，6.82(m，1H)，4.30(m，2H)，3.81(m，1H)，3.12(m，4H)，2.69(m，2H)，2.56(m，1H)，2.33(m，2H)，2.14(m，2H)，1.80(m，2H)，1.4-1.7(m，9H)，1.32and1.34(pr.s，11，9H)，1.22(m；2H)；1R(KBr)3580-2770，1711，1642 cm-1；MS m/e 429(MH+)；[α]25D-7.78°(c1.71，MeOH).元素分析算值C20H36N4O6·2C2H4O2·0.5H2O(557.6)C，51.69；H，8.13；N，10.05.实测值C，51.46；H，8.11；N，10.10.实施例5Nα-Boc-D-Lys-Nip-L-Asp-OMe(CP#18)将按实施例1所述方法由H-L-Asp(OBn)-OMe和Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-OH制得的Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-L-Asp(OBn)-OMe分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.36(m，10H)，6.84(m，1H)，5.40(m，1H)，5.14(s，2H)，5.09(s，2H)，4.88(m，2H)，4.54(m，1H)，4.30(m，1H)，3.68(s，3H)3.19(m，3H)3.03(m，1H)，2.89(m，1H)，2.29(m，1H)，1.43-2.06(m，12H)，1.40(s，9H)；MS m/e 711(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-L-Asp(OBn)-OMe制得的化合物18分离成白色泡沫体1H NMR(DMSO-d6)δ 8.33(m，1H)，6.77(d，J＝7，1H)，4.32(m，3H)，3.82)m，1H)，3.59(s，3H)，2.96(m，2H)，2.73(m，3H)，2.46(m，2H)，2.34(m，1H)，1.79(m，3H)，1.4-1.7(m，8H)，1.34 and 1.37(pr.s，1∶1，9H)，1.27(m，2H)；MSm/e 487(MH+)；[α]25D-3.57°(c0.56，MeOH).元素分析计算值C22H38N4O8·C2H4O2·H2O(564.6)C，51.05；H，7.85；N，9.92.实测值C，50.89；H，7.88；N，9.74.实施例6H-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#4)在室温下向化合物2(0.30g，0.70mmol)的甲醇(10ml)和水(10ml)溶液中加入HCl(0.50ml，浓盐酸)。将该溶液搅拌1小时，并蒸发至约2ml由状物。该油状物用MeCN(20ml)处理，过滤，用Et2O(3×20ml)洗涤，并干燥得到白色粉末4mp65-75C；1H NMR(DMSO-d6)δ8.23(m，3H)，8.06(m，3H)，4.33(m，2H)，3.73(m，4H)，3.25(m，2H)，3.01(m，1H)，2.72(m，2H)，2.44(m，1H)，2.34(m，2H)，1.5-1.8(m，6H)，1.35(m，4H)；MS m/e 329(MH+)；元素分析计算值C15H28N4O4·2HCl·2H2O(437.4)C，41.19；H，7.84；N，12.81.实测值C，40.97；H，7.75；N，12.44.实施例7N-(Nε-氨基己酰基)-Nip-β-Ala-OH(CP#5)将按实施例1所述方法以外消旋3-哌啶甲酸甲酯和Nε-Boc-氨基己酸N-羟丁二酸酯为原料制得的N-(Nε-Boc-氨基己酰基)-Nip-β-Ala-OBn分离成油状固体1H NMR(CDCl3)..34(m，5H)，6.51(m，1H)，5.12(s，2H)，4.60(m，1H)，4.39(m，1H)，3.90(m，1H)，3.71(t，1H)，3.52(m，3H)，3.19(m，4H)，2.59(m，2H)，2.30(m，2H)，1.85(m，3H)，1.63(m，2H)，1.51(m，2H)，1.42(s，9H)，1.34(m，2H)；MSm/e 504(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解然后酸解N-(Nε-Boc-氨基己酰基)-Nip-β-Ala-OBn制得的化合物5分离成玻璃状物1H NMR(DMSO-d6)δ8.18(t，J＝5，1H)，8.04(br.s，3H)，4.28(m，2H)，3.78(m，2H)，3.20(m，3H)，2.99(t，J＝12，1H)，2.71(d，J＝6，2H)，2.39(m，2H)，2.31(m，2H)，2.16(m，1H)，1.79(m，1H)，1.61(m，4H)，1.42(t，J＝6，2H)，1.28(m，2H)，1.19(m，1H)；MS m/e 314(MH+)；元素分析计算值C15H27N3O4·2HCl(386.3)C，46.04；H，7.57；N，10.88.实测值C，45.91；H，7.63；N，11.17.实施例8N-[3-(4-哌啶丙酰基)]-Nip-β-Ala-OH(CP#17)将按实施例1所述方法由3-(4-吡啶)丙烯酸和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的N-[3-(4-吡啶丙烯酰基)]-Nip-β-Ala-OBn分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ8.61(d，J＝4Hz，2H)，7.52(d，J＝15Hz，1H)，7.35(m，7H)7.03(d，J＝15Hz，1H)，6.58(m，1H)，5.12(s，2H)，4.40(m，1H)，3.89(m，1H)，3.51(m，2H)，3.33(m，2H)，2.60(t，J＝6Hz，2H)，2.31(m，1H)，1.97(m，2H)，1.74(m，1H)，1.56(m，1H)；MS m/e 422(MH+).
在氮气氛下向N-[3-(4-吡啶丙烯酰基)]-Nip-β-Ala-OBn(0.56g，1.33mmol)的乙醇(20ml)和水(10ml)溶液中加入HCl(0.66ml，4.0M二噁烷溶液)和氧化铂(IV)(0.060g)。将该混合物在50psi/RT条件下氢化22小时，用硅藻土过滤，并蒸发至约5ml。该溶液经乙腈(30ml)处理，过滤，用Et2O(3×20ml)洗涤，干燥，得到浅黄色泡沫体171H NMR(DMSO-d6)δ9.02(br.s.2H)，8.03(m，1H)，7.46(m，1H)，4.28(t，J＝7，1H)，4.11(m，1H)，3.79(m，1H)，3.44(t，J＝7，1H)，3.19(m，3H)，3.06(t，J＝12，1H)，2.75(d，J＝11，1H)，2.53(m，1 H)，2.32(m，4 H)，2.12(m，1H)，1.77(m，2H)，1.4-1.7(m，7H)，1.27(m，2H)，1.18(t，J＝6，1H)；MSm/e 340(MH+)元素分析计算值C17H29N3O4·2HCl(412.4)，C，49.52；H，7.58；N，10.19.实测值C，49.15；H，7.02；N，10.48.精确质子化质量计算值C17H29N3O4340.2236amu。实测值340.2245amu。实施例9Nα-Ac-L-Lys-Nip-Gly-OH(CP#6)将由Nα-Ac-L-Lys(Boc)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-Gly-OBn(参见14)分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.35(m，5H)，6.97(m，1H)，6.38(m，1H)，5.14(s，2H)，4.70(m，1H)，4.46(m，1H)，4.06(dd，J＝5，16Hz，2H)，3.71(m，1H)，3.10(m，2H)，1.99(s，3H)，1.91(m，2H)，1.64(m，1H)，1.41-1.60(m，1H)，1.39(s，9H)；MS m/e 547(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-Gly-OBn、然后经TFA介导除去Boc(其方法参见M.Bodanszky ThePractice of Peptide Synthesis，Springer-VerlagNew York，1984)制得的化合物6分离成褐色粉末mp40-55℃；1H NMR(DMSO-d6)δ8.24(t，J＝6，1H)，8.03(d，J＝8，1H)，7.75(br.s，3H)，4.24(m，1H)，3.72(t，J＝6，2H)，3.61(m，2H)，2.72(m，2H)，1.83(s，3H)，1.78(m，2H)，1.63(m，2H)，1.4-1.6(m，8H)，1.28(m，4H)；MS m/e357(MH+)；元素分析计算值C16H28N4O5·3C2HF3O2(698.5)C，37.83；H，4.47；N，8.02.实测值C，37.91；H，4.89；N，8.47.实施例10Nα-Ac-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#7)将按实施例1所述方法由Nα-Ac-L-Lys(Boc)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-β-Ala-OBn分离成白色泡沫体1H NMR(CDCl3)δ7.34(m，5H)，6.53(m，2H)，5.12(s，2H)，4.58(m，1H)，4.10(m，1H)，3.72(m，1H)，3.54(m，2H)，311(m，3H)，2.59(m，2H)，2.24(m，1H)，2.01(s，3H)，1.88(m，1H)，1.73(m，2H)，1.52(m，8H)，1.40(s，9H)，1.31(m，1H)；MS m/e 561(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Ac-L-Lys(Boc)-Nip-β-Ala-OBn、然后按实施例6所述方法进行酸解制得的化合物7分离成白色泡沫体mp 53-67℃；1H NMR(DMSO-d6)δ8.13(m，1H)，8.00(m，1H)，7.91(d.J＝15，3H)，4.64(m，1H)，4.36(m，1H)，3.87(m，1H)，3.66(m，2H)，3.23(m，3H)，2.99(m，1H)，2.68(m，2H)，2.59(m，1H)，2.38(m，2H)，2.11(m，1H)，1.80(s，3H)，1.63(m，1H)，1.4-1.6(m，5H)，1.24(m，3H)；MS m/e 371(MH+)元素分析计算值C17H30N4O5·2HCl·2H2O(479.4)C，42.59；H，7.57；N，11.69.实测值C，43.83；H，7.79；N，10.91.实旋例11Nα-Boc-L-Arg-Nip-β-Ala-OH(CP#8)将按实施例1所述方法由Nα-Boc-L-Arg(Cbz2)-OSu和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Boc-L-Arg(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，10H)，6.69(m，1H)，5.70(m，1H)，5.13(s，2H)，5.03(s，2H)，4.59(m，1H)，4.29(m，1H)，3.52(m，2H)，3.28(m，1H)，3.09(m，3H)，2.60(m，3H)，2.18(m，1H)，1.49-1.90(m，11H)，1.42(s，9H)；MS m/e 681(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-L-Arg(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn制得的化合物8分离成白色泡沫体mp 47-55℃；1H NMR(DMSO-d6)δ9.53(m，1H)，7.85(m，2H)，6.96(m，1H)，4.32(m，2H)，3.84(m，1H)，3.38(m，2H)，3.03(m，4H)，2，20(m，3H)，1.74(m，2H)，1.4-1.7(m，8H)，1.35(s，9H)，1.24(m，2H)；MS m/e457(MH+)；元素分析计算值C20H36N6O6·1.5C2H4O2(546.6)C，50.54；H，7.74；N，15.37.实测值C，50.24；H，7.96；N，15.26.实施例1 2Nα-Boc-L-Lys-Nip-γ-氨基丁酸(CP#9)将由Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-γ-氨基丁酸苄酯(参见1-1，1-2)分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，10H)，6.48(m，1H)，6.16(m，1H)，5.40(m，1H)，5.11(s，2H)，5.08(s，2H)，4.89(m，1H)，4.58(m，1H)，4.07(m，1H)，3.22(m，5H)，2.52(m，1H)，2.40(m，2H)，1.50-2.30(m，12H)，1.42(s，9H)，1.33(m，1H)；MS m/e 667(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-γ氨基丁酸苄酯制得的化合物9分离成白色泡沫体mp65-71C；1H NMR(DMSO-d6)δ8.25(m，1H)，6.87(m，1H)，4.31(m，3H)，3.74(m，2H)，3.15(m，2H)，2.98(m，3H)，2.69(m，2H)，2.10(m，3H)，1.76(m，3H)，1.4-1.7(m，9H)，1.31(s，9H)，1.21(m，2H)；MS m/e 443(MH+)；元素分析计算值C21H38N4O6·2C2H4O2(562.7)C，53.37；H，8.24；N，9.96.实测值；C，53.94；H，8.17；N，9.70.实施例13H-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#10)将按实施例6所述方法经酸解3制得的化合物10分离成米色粉末mp108-128C；1H NMR(DMSO-d6)δ8.28(m，3H)，8.05(m，3H)，4.31(m，2H)，3.84(m，2H)，3.25(m，2H)，3.09(m，2H)，2.72(m，3H)，2.37(m，3H)，1.80(m，1H)，1.5-1.7(m，6H)，1.33(m，4H)；MS m/e329(MH+)；元素分析计算值C15H28N4O4·2HCl·C2H4O2(461.4)C，44.26；H，7.43；N，12.14.实测值C，43.98；H，7.27；N，12.29.实施例14Nα-Boc-D-Lys-Nip-γ-氨基丁酸(CP#11)将接实施例1所述方法由Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制备的Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-γ-氨基丁酸苄酯分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.31(m，10H)，6.51(m，1H)，6.15(m，1H)，5.48(m，1H)，5.10(s，1H)，5.06(s，2H)，4.90(m，1H)，4.55(m，1H)，4.10(m，1H)，3.59(m，1H)，3.23(m，5H)，2.39(m，2H)，2.23(m，1H)，1.84(m，2H)，1.45-1.80(m，10H)，1.38(s，9H)，1.32(m，1H)；MS m/e667(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-γ-氨基丁酸苄酯制得的化合物11分离成褐色粉末mp50-57℃；1H NMR(DMSO-d6)δ7.97(m，1H)，6.91(m，1H)，4.32(m，1H)，4.22(m，1H)，3.82(m，1H)，3.02(m，3H)，2.71(m，2H)，2.52(m，1H)，2.29(m，1H)，2.17(m，2H)，1.84(m，5H)，1.4-1.7(m，9H)，1.33(s，9H)，1.19(m，2H)；MS m/e 443(MH+)；元素分析计算值C21H38N4O6·C2H4O2·0.5H2O(571.7)C，52.53；H，8.29；N，9.80.实测值C，52.91；H，8.21；N，9.39.实施例15NαBoc-D-Lys-Nip-Gly-OH(CP#12)将按实施例1所述方法由Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-Gly-OBn分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.39(m，10H)，6.87(m，1H)，5.42(m，1H)，5.19(s，2H)，5.13(s，2H)，4.93(m，1H)，4.60(m，1H)，4.20(m，1H)，4.09(m，1H)，3.40-4.00(m，3H)，3.21(m，2H)，2.61(m，1H)，2.43(m，1H)，1.45-2.20(m，10H)，1.39(s，9H)；MS m/e 639(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-Nip-Gly-OBn制得的化合物12分离成白色絮片体mp 66-80℃；1H NMR(DMSO-d6)δ7.82(m，1H)，6.81(d，J＝7，1H)，4.34(m，2H)，4.09(m，1H)，3.77(m，1H)，3.48(m，1H)，3.16(m，2H)，2.70(m，3H)，2.44(m，2H)，2.28(m，1H)，1.78(m，2H)，1.4-1.7(m，8H)，1.32和1.35(pr.s，11，9H)，1.23(m，2H)；MS m/e415(MH+)；元素分析计算值C19H34N4O6·2C2H4O2(534.6)C，51.67；H，7.92；N，10.48.实测值C，52.06；H，8.33；N，10.19.实施例16Nα-Ac-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#13)将按实施例1所述方法由Nα-Ac-D-Lys(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Ac-D-Lys(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.32(m，10H)，6.54(m，1H)，6.36(m，1H)，5.10(s，2H)，5.02(s，2H)，4.89(m，2H)，4.48(m，1H)，4.04(m，1H)，3.69(m，1H)，3.52(m，2H)，3.17(m，3H)，2.57(m，2H)，2.20(m，1H)，1.98(s，3H)，1.25-1.90(m，10H)；MS m/e595(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Ac-D-Lys(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn制得的化合物13分离成玻璃状物mp 46-59℃；1H NMR(DMSO-d6)δ8.11(m，3H)，4.70(m，1H)，4.33(m，1H)，3.74(m，1H)，3.38(m，1H)，3.19(m，4H)，3.00(m，1H)，2.68(m，2H)，2.21(m，4H)，1.82(s，3H)，1.76(m，2H)，1.4-1.7(m，7H)，1.24(m，2H)；MS m/e371(MH+)；元素分析计算值C17H30N4O5·2.5C2H4O2(520.6)C，50.76；H，7.74；N，10.76.实测值C，51.12；H，8.04；N，10.75。实施例17Nα-Boc-L-Lys(i-Pr)-Nip-β-Ala-OH(CP#15)将按实施例1所述方法由Nα-Boc-L-Lys(i-Pr)(Cbz)-OH和外消旋3-哌啶甲酸甲酯制得的Nα-Boc-L-Lys(i-Pr)(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn分离成玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，10H)，6.58(m，1H)，5.10(s，2H)，5.08(s，2H)，4.55(m，1H)，4.21(m，1H)，3.73(m，1H)，3.50(m，2H)，3.17(m，3H)，2.55(m，2H)，2.18(m，1H)，1.50-2，00(m，13H)，1.40(s，9H)，1.13(d，J＝8Hz，6H)；MS m/e695(MH+).
将按实施例1所述方法经氢解Nα-Boc-L-Lys(i-Pr)(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn制得的化合物15分离成白色絮片体mp90-123℃；1HNMR(DMSO-d6)δ7.93(m，1H)，6.81(d，J＝7，1H)，4.36(m，1H)，4.24(m，1H)，3.60(m，1H)，3.37(m，1H)，3.10(m，1H)，2.91(m，3H)，2.62(m，3H)，2.39(m，2H)，2.14(m，1H)，2.05(m，1H)，1.4-1.8(m，9H)，1.34 and 1.37(pr.s，11，9H)，1.26(m，3H)，1.13(d，J＝5，6H)；1R(KBr)3500-2830，1704，1638cm-1；MS m/e471(MH+)；元素分析计算值C23H42N4O6·2C2H4O2(590.7)C，54.90；H，8.53；N，9.48.实测值C，54.67；H，8.65；N，9.79.实施例18Nα-Boc-D-Lys-R-(-)-Nip-β-Ala-OH(CP#16)将按实施例1所述方法由Nα-Boc-D-Lys(Cbz)-OH和R-(-)-3-哌啶甲酸甲酯制得的化合物16分离成无色絮片体mp42-51℃；1H NMR(DMSO-d6)δ7.95(m，1H)，6.82(d，J＝7，1H).4.33(m，1H)，4.19(m，1H)，3.79(m，1H)，3.25(m，1H)，3.04(t，J＝10，2H)，2.69(m，2H)，2.34(m，1H)，2.21(m，1H)，2.14(m，2H)，1.78(m，2H)，1.71(m，2H)，1.4-1.6(m，9H)，1.34和1.38(pr.s，18，9 H)，1.20(m，2H)；MSm/e 429(MH+)。元素分析计算值C20H36N4O4·2.5C2H4O2(578.7)C，51.89；H，8.01；N，9.68.实测值C，52.05；H，7.98；N，9.58.实施例19N-(Nε-氨基己酰基)-3-哌啶甲基氨基丙酸(CP#19)向N-(Nε-Boc-氨基己酰基)-3-哌啶甲酸(3.1g，9.0mmol)和THF(50ml)的溶液中加入1，1-羰基二咪唑(1.45g，9.0mmol)。将该溶液搅拌1小时，冷却至-10℃，用DiBAL(36.0ml，1.0M的甲苯溶液)逐滴处理20分钟，再搅拌2小时。该溶液用柠檬酸水溶液(5.0g溶于40ml水中)处理，用CHCl3(200ml)稀释，分离所得各层。水层用CHCl3(100ml)萃取。合并的有机层经干燥、蒸发并进行快速色谱法(4％EtOH/CH2Cl2)纯化，得到N-(Nε-Boc-氨基己酰基)哌啶-3-甲醛，为玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ9.65(d，J＝8Hz，1H)，4.58(m，1H)，4.10(m，1H)，3.65(m，1H)，3.45(m，1H)，3.22(m，1H)，3.14(m，2H)，2.46(m，2H)，2.33(t，J＝7Hz，1H)，2.09(m，1H)，1.5-1.8(m，7H)，1.39(s，9H)，1.33(m，2H)；MS m/e327(MH+).
在室温下，向N-(Nε-Boc-氨基己酰基)哌啶-3-甲醛(0.69g，2.12mmol)的甲醇(10ml)溶液中加入H-β-Ala-OBn.PTSA(0.74g，2.12mmol)和NaCNBH3(0.13g，2.12mmol)。将该混合物搅拌2.5小时，并蒸发得到白色固体。将该固体分配于饱和NaHCO3(10ml)和CH2Cl2(50ml)中，并分离各层。水层用CH2Cl2(2×50ml)萃取，合并的有机层经干燥、蒸发并进行快速色谱法(0.5％NH4OH/4～10％EtOH/CH2Cl2)纯化，得到N-(Nε-Boc-氨基己酰基)-3-哌啶甲基氨基丙酸苄酯，为玻璃状物1H NMR(CDCl3)δ7.33(m，5H)，5.13(s，2H)，4.61(m，1H)，4.28(m，1H)，3.70(m，1H)，3.11(m，3H)，2.85(m，3H)，2.5(m，4H)，2.31(t，J＝7Hz，2H)，1.5-1.9(m，8H)，1.42(s，9H)，1.29(m，3H)，3.89(m，1H)；MS m/e490(MH+).
在室温下，向N-(Nε-Boc-氨基己酰基)-3-哌啶甲基氨基丙酸苄酯(0.28g，0.57mmol)和THF(10ml)的溶液中加入HCl水溶液(3.4ml，1.0N)。将该混合物搅拌22小时，蒸发得到玻璃状固体，用Et2O(3×25ml)研制，干燥，得到白色粉末。将该粉末溶于THF(5ml)和水(10ml)中，将其在氮气氛下转移至Parr瓶中，并用Pd/C(0.04g，10％)处理。将该混合物在50psi/RT条件下氢化20小时，用硅藻土过滤，并蒸发至约5ml。该溶液用MeCN(25ml)处理，过滤，用Et2O(2×25ml)洗涤，干燥，得到无色玻璃状物19(HPLC纯度＞95％)mp65-7℃；1H NMR(DMSO-d6)δ9.31(m，2H)，8.12(br.s，3H)，4.18(m，2H)，3.70(m，1H)，3.04(m，2H)，2.67(m，5H)，2.51(m，1H)，2.35(m，3H)，1.87(m，2H)，1.58(m，4H)，1.42(m，2H)，1.30(m，4H)；MS m/e300(MH+)。精确质子化质量计算值C15H29N3O3·2HCl(372.3)300.2287 amu.实测值300.230权利要求
1.通式(I)所代表的化合物或其对映体或可药用盐 其中X1和X2可相同或不同，并且选自H2或O；其中Y选自(CH2)m、CH(NHCOR3)(CH2)m或CH((NH2)CH2)m中的任何一个基团；其中A选自下列基团中的任何一个基团NHR1、C(NH)NH2或环中含有氮的环烷基环，该环选自哌啶-2-基、哌啶-3-基、哌啶-4-基、吡咯烷-2-基和吡咯烷-3-基中的任何一个基团；其中Z选自(CH2)n或CH(CO2R4)(CH2)n中的任何一个基团；其中R1选自H、烷基或CH(NH)NH2中的任何一个基团；其中R2选自H或烷基中的任何一个基团；其中R3选自烷氧基或烷基中的任何一个基团其中R4为烷基或芳烷基；其中R6为H、烷基或芳烷基；其中m为整数0、1、2或3；其中n为整数0、1或2。
2.权利要求1所述的化合物，其中Z为(CH2)2。
3.权利要求1所述的化合物，其中R1为H。
4.权利要求1所述的化合物，其中R2为H。
5.权利要求1所述的化合物，其中R3为叔丁氧基。
6.权利要求1所述的化合物，其中R4为甲基。
7.权利要求1所述的化合物，其中Z为CH(CO2R4)(CH2)。
8.权利要求1所述的化合物，所述化合物选自下列化合物中的任何一个Nα-Boc-L-Lys(Cbz)-Nip-β-Ala-OBn(CP#1)；Nα-Boc-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#2)；Nα-Boc-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#3)；H-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#4)；N-(Nε-氨基己酰基)-Nip-β-Ala-OH(CP#5)Nα-Ac-L-Lys-Nip-Gly-OH(CP#6)；Nα-Ac-L-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#)；Nα-Boc-L-Arg-Nip-β-Ala-OH(CP#8)；Nα-Boc-L-Lys-Nip-γ-氨基丁酸(CP#)H-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#10)；Nα-Boc-D-Lys-Nip-γ-氨基丁酸(CP#11)Nα-Boc-D-Lys-Nip-Gly-OH(CP#12)；Nα-Ac-D-Lys-Nip-β-Ala-OH(CP#13)；Nα-Boc-D-Lys-S-(+)-Nip-β-Ala-OH(CP#14)；Nα-Boc-L-Lys(i-Pr)-Nip-β-Ala-OH(CP#15)；Nα-Boc-D-Lys-R-(-)-Nip-β-Ala-OH(CP#16)；N-[3-(4-哌啶丙酰基)]-Nip-β-Ala-OH(CP#17)Nα-Boc-D-Lys-Nip-L-Asp-OMe(CP#18)；或N-(Nε-氨基己酰基)-3-哌啶甲基氨基丙酸(CP#19)。
全文摘要
公开了式(I)的3-哌啶甲酸衍生的化合物，该化合物可用于治疗血小板介导的血栓形成疾病。
文档编号A61P43/00GK1128022SQ95190367
公开日1996年7月31日 申请日期1995年3月14日 优先权日1994年3月16日
发明者M·P·比弗斯, P·安德雷-戈登, W·赫斯特拉 申请人:邻位药品公司