专利名称：编码肿瘤排斥抗原前体dage的分离的核酸分子及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子，更具体地说，本发明涉及这样的基因，其肿瘤排斥抗原前体被加工成至少一种由HLA-A24分子呈递的肿瘤排斥抗原。所说的肿瘤排斥抗原前体，或″TRAP″可以被加工成由其他MHC分子(如HLA-A1和其等位体，HLA-A2，HLA-Cw*1601，HLA-B44等)呈递的附加肽。所说的基因显示出不与其它已知肿瘤排斥抗原前体编码序列相关，被各种肿瘤表达，并且除了睾丸，卵巢和子宫内膜细胞外，不被正常细胞表达。发明背景和现有技术哺乳动物免疫系统识别外源物质和与外源物质反应的过程是一个复杂过程。该系统的的一个重要方面是T淋巴细胞，或″T细胞″应答。该应答要求T细胞识别细胞表面分子(称作人类白细胞抗原(″HLA″)，或主要组织相容性复合物(“MHCs”))和肽的复合物并与其相互作用。所说的肽类是由也呈递HLA/MHC分子的细胞加工从较大分子衍生的，这一点参见Male等，高等免疫学(J.P.Lipincott公司，1987)，6-10章。T细胞和HLA/肽复合物的相互作用是受到限制的，要求T细胞对HLA分子和肽的特定组合是特异性的。如果特异性T细胞不存在，即使它的配体复合物存在，也没有细胞应答。同样地，如果特异性复合物不存在，仅T细胞存在也没有应答。这种机制涉及到在自身免疫病理学中和细胞异常反应中的免疫系统对外源物质的应答。许多工作曾集中于蛋白质加工成HLA结合肽的机制上。在这一点上，参见，Barinaga，科学257880(1992)；Fremont等，科学257919(1992)；Matsumura等，科学257927(1992)；Latron等，科学257964(1992)。
T细胞识别细胞异常的机制也牵涉进癌中。例如，在PCT申请PCT US/92/04354(申请日1992年5月22日，
公开日1992年11月26日，本文一并参考)中公开了一族基因，它们被加工成肽，所述肽其后依次在细胞表面上表达，导致肿瘤细胞被特异性CTLs胞溶性T淋巴细胞，或以下称“CTLs”溶解。所说的基因被认为编码″肿瘤排斥抗原前体″或″TRAP″分子，其肽衍生物被称作“肿瘤排斥抗原”或″TRAs″，参见Traversari等，免疫遗传学35145(1992)；van derBruggen等，科学2541643(1991)，有关这个基因族的其它信息，也参见美国专利5,342,774(申请号807,043，申请日1991年12月12日，本文一并参考)。这一专利中公开了肿瘤排斥抗原前体“MAGE”族。
美国专利5,405,940(申请号938,334其公开的内容本文一并参考)阐述了编码肿瘤排斥抗原前体的MAGE-I基因，所述前体被加工成由HLA-A1分子呈递的九肽(nonapeptides)。结合到HLA-A1上的九肽遵循基序适合的结合“规则”。这一点，参见例如PCT/US93/07421；Falk等，自然351290-296(1991)；Engelhard，免疫学年度回顾，12181-207(1994)；Ruppert等，细胞74929-937(1993)；Rotzschke等，自然348252-254(1990)；Bjorkm等，自然329512-518(1987)；Traversari等，实验医学杂志1761453-1457(1992)。这些参考文献教导了假定已知特定肽对特定HLA分子的特异性，人们应预期结合到一种HLA分子上(而不是其它分子上)的特定肽，这一点是重要的，因为不同的个体具有不同的HLA表型。结果，经管鉴别作为特异性HLA分子的配体的特定肽具有诊断的和治疗用途，但这些仅仅与具有该特定的HLA表型的个体相关。在这一领域需要作进一步的工作，因为细胞异常不限于一种特定的HLA表型，定向疗法需要一些异常细胞表型的知识。
美国专利申请008,446(申请日1993年1月22日，本文一并参考)描述了MAGE-1表达产物被加工成第二种TRA的事实。这一第二种TRA由HLA-Cw*1601分子呈递。这一公开表明给定的TRAP能产生许多TRA，每一种都符合结合到MHC分子上的基序规则。
美国专利申请994,928(申请日1992年12月12日，本文一并参考)阐述了酪氨酸酶，即一种由一些正常细胞(例如，黑素细胞)产生的分子，在肿瘤细胞中被加工成由HLA-A2分子呈递的肽。
美国专利申请08/032,978(申请日1993年3月18日，本文一并参考)指出第二种TRA(不是从酪氨酸酶衍生的)由HLA-A2分子呈递，所述TRA是从TRAP衍生的，但是被非MAGE基因编码。这一公开说明某一特定HLA分子可以呈递从不同来源衍生的TRAs。
美国专利申请08/079,110(申请日1993年6月17日，本文一并参考)描述了非相关肿瘤排斥抗原前体，所谓的“BAGE”前体，其不与MAGE族相关。
美国专利申请08/096,039和08/250,162(两者本文一并参考)也描述了非相关TRAP前体GAGE。
由以上引用的论文，专利和专利申请所呈递的工作大部分涉及MAGE族基因以及非相关的BAGE和GAGE基因。然而，现在已发现，还有一些另外的肿瘤排斥抗原前体由细胞表达。这些肿瘤排斥抗原前体称作″DAGE″肿瘤排斥抗原前体。它们不显示出与MAGE族基因，BAGE基因或GAGE基因的同源性。这样本发明涉及编码这样的TRAP的基因，肿瘤排斥抗原前体本身以及两者的应用。
GAGE肿瘤排斥抗原前体的其它特征是它们被肿瘤细胞的表达比以前描述的其它肿瘤排斥抗原前体更普遍。这一点在以下证明。而且，所述基因族被正常细胞的表达再一次被限制在睾丸，卵巢和子宫内膜细胞。这样，有比以前更多的检测转化细胞存在的一般性方法可以使用。这一点从实施例可以看出。
本发明进一步由随后的描述说明。附图简要描述
图1共同描述51Cr释放，溶胞研究。具体地说图1A显示细胞系LB33-MEL.B-1的溶解；图1B显示由EBV病毒转化的LB33B细胞的溶解。这些是自体细胞。
图1C显示在NK靶K562上的溶胞研究。在每种情况之下，效应细胞均是CTL克隆LB33-CTL-269/17。
图2表示在抗-HLA-A24单克隆抗体的存在下，由胞溶性T细胞引起的溶胞抑制研究。研究是在存在或不存在30倍稀释的产生HLA-A24特异性单克隆抗体之杂交瘤的培养基下进行。
图3A和3B显示在用序列Hi2转染LB804-ALL细胞后的溶胞实验的结果。
图4显示在用CTL269/17进行的TNF释放测定中获得的结果。刺激物细胞是LB330---MEL.B-1，COS-7细胞，用编码HLA-A24的cDNA序列转染的COS-7细胞或用编码HLA-A24的cDNA序列和编码依据本发明的肿瘤排斥抗原前体的cDNA两者转染的COS-7细胞。
图5比较用从DAGE衍生的各种肽引起的溶胞作用。
图6显示在各种组织样品中DAGE的表达。优选实施方案的详细描述实施例1黑素瘤细胞系LB33-MEL.B是用标准的技术从转移病人LB33衍生的。然后通过限制稀释克隆肿瘤细胞，形成此后使用的克隆LB33-MEL.B-1。
从病人采取含单核血细胞的样品(包括B-淋巴细胞)的LB33。将克隆LB33-MEL.B-1样品与单核血细胞样品接触。观察混合物的LB33-MEL.B-1细胞溶解。这一溶解表明样品中存在对由细胞呈递的肽和HLA分子复合物特异性的胞溶性T细胞(“CTLs”)。
所使用的溶解测定法是按照下列Herin等(国际癌杂志390-396(1987)，其公开的内容本文一并参考)的铬释放测定法。然而，本文描述了该测定法。使靶黑素瘤细胞离体生长，在标记之前，在50U/毫升IFN-γ的存在下培养这些细胞48小时以便增加HLAI类分子的表达。然后以107细胞/毫升将所述细胞悬浮在补充有10mM HEPES和30％FCS(即，胎牛血清)的DMEM中，于37℃与200μCi/毫升Na(51Cr)O4一起培养45分钟。用补充有10mM Hepes的DMEM洗涤标记细胞三次。然后将它们悬浮到补充有10mM Hepes和10％FCS的DMEM中。此后，将含103细胞的100ul试样分布于96孔微量培养板。添加在100ul相同的培养基中的含PBL的样品，测定进行双份。平板在100g下离心4分钟，于37℃在5.5％二氧化碳氛围中培养四小时。
再离心平板一次，收集100ul样品的上清液，并计数。按下式计算51Cr释放的百分比
其中ER是观察到的实验的51Cr释放，SR是在200ul培养基中单独培养103标记细胞测得的自发释放，MR是最大释放，是通过添加0.3％Triton X-100到靶细胞获得的。
经限制稀释扩增和克隆那些显示高CTL活性的单核血细胞样品，并用相同的方法再筛选一次。
将相同的方法用于测试靶K562细胞。当使用EBV-B细胞时，唯一的变化是用补充有5％FCS的Hank’s培养基替代DMEM培养基。
这些实验导致从病人LB33分离出CTL克隆LB33-CTL-269/17。如图1A-1C所说明的，这一CTL克隆溶解LB33-MEL.B-1肿瘤细胞，但不溶解EBV转化的病人LB33的B细胞，也不溶解K562细胞。当靶细胞与对HLA-A24特异性的单克隆抗体一起培养时，溶解被抑制，说明任何涉及的TRA肽由HLA-A24呈递。图2显示了这些结果。
第二种CTL克隆(称作LB33-CTL-269/1)溶解LB33-MEL.B-1，但不溶解EBV-B转化的B细胞，也不溶解K562细胞。这说明相同的靶抗原被识别。由LB33-CTL-269/1引起的溶解也被抗-HLA-A24单克隆抗体抑制。
实施例2由于存在的MHC分子已被鉴别为HLA-A24，因此进行鉴别所述蛋白质编码序列的研究，所述蛋白质此后称作“肿瘤排斥抗原前体”或″TRAP″分子，其是被呈递的肽的来源。
为此，从细胞系LB33-MEL.B-1分离总RNA。根据熟知的技术用寡脱氧胸苷结合试剂盒分离mRNA。一旦mRNA可靠，就再次用标准方法将它转录成cDNA。依据制造商的说明将cDNA连接到EcoRI衔接子，并克隆进质粒pcDNA-I/Amp的EcoRI位点。然后将重组质粒电穿孔进DH5α大肠杆菌(电穿孔条件冲在25μfarads，2500V下1个脉冲)。
转染细菌以氨苄青霉素(50μg/毫升)选择，然后分成400份，每份100个克隆。各份代表约50种不同的cDNA，因为分析显示所有质粒包含插入物并且克隆不是定向的，将各份扩增至饱和，按照Maniatis等(分子克隆实验室手册(Cold Spring Harbor，N.Y.)，1982)的方法经碱裂解，醋酸钾沉淀以及酚抽提分离质粒DNA。不使用铯梯度离心。
实施例3
然后将扩增质粒转染进真核细胞。用补加有10％胎牛血清的Dulbecco’s改进的Eagles培养基(“DMEM“)以15,000个细胞/孔将COS-7细胞样品接种到组织培养平底微孔中。于37℃培养细胞一夜，除去培养基，然后用30微升/孔包含10％Nu血清，400微克/毫升DEAE-葡聚糖，100μM氯奎，100纳克质粒pcDNA-I/Amp-A2A，和100纳克以上描述的cDNA文库的一份DNA的DMEM培养基替代。质粒pcDNA-I/Amp-A24包含LB33-MEL.B的HLA-A24基因，其被鉴别为等位基因HLA-A*2402。于37℃培养四小时后，除去培养基，并且用50微升包含10％DMSO的PBS替代。两分钟后，除去这一培养基，并用200微升补加有10％FCS的DMEM替代。
在如此变化培养基后，在37℃下培养COS细胞48小时。然后弃去培养基，添加在100微升含10％库集人血清的Iscove’s培养基中的所述的CTL克隆269/1的2000个细胞，24小时后，除去上清液，按Traversari等免疫遗传学35145-152(1992)(其公开的内容本文一并参考)所描述的方法在WEHI细胞测定中测定TNF含量。
在试验的400份中，一份是阳性。
实施例4将阳性的一份细菌亚克隆。从600个单个菌落抽提质粒DNA，用与以上描述相同的方法与pcDNA-I/Amp-A24一起共转染进COS细胞的新样品。就CTL269/1的刺激作用再一次测试细胞。发现一个阳性克隆，识别为“5E10”。
从阳性克隆抽提质粒，用本领域已知技术测序。
所鉴别的序列长度为1554个碱基对(参见SEQ ID NO1)。这一序列包含编码518个氨基酸的一个开放读框。
发现在1310-1413位置上的104个核苷酸与Genbank登记的113个碱基对的序列L25344(HOMRBCESTC“人(克隆17)”红白血病(erythroleukemic)表达序列尾端(EST)mRNA片段)的104个起始碱基对相同，然而，没有发现相应于SEQ ID NO1序列之序列。
实施例5在以上描述的5E10分离后，将其在标准的Northem印迹法中用作为探针，所述印迹法用LB33-MEL的总RNA和标准的技术。
结果显示出大约2.5千碱基的带，其当然比探针自身更长。这说明克隆5E10是完全的。
结果，再一次用cDNA5E10作为探针筛选从LB33-MEL细胞的RNA制备的相同的cDNA文库。鉴别出一个2148个碱基对的cDNA克隆，并且测序。其被称为Hi2。除了在254位碱基Hi2是胞嘧啶，而5E10是胸腺嘧啶而外，5E10的序列完全包括在Hi2的序列中。
实施例6在分离Hi2后，进行一组试验以证实Hi2是肿瘤排斥抗原前体编码序列。具体地说，使用HLA-A24阳性白血病细胞系LB804-ALL，因为以上描述的预先的实验曾显示269/17不溶解这一细胞系。
用表达载体pEF-BOS-puro.PL3转染白血病细胞系的细胞，所述载体携带赋予嘌呤霉素抗性的基因，并且cDNAHi2被克隆进其中。选择并分离嘌呤霉素抗性群。这些被证实对CTL269/17敏感，这表明抗原LB33-E的表达不依赖于从COS-7转染产生的高拷贝数。
图3A和3B显示这些结果，其中图3A显示转染之前白血病细胞系，而CTL269/17是效应器(responder)。
SEQ ID NO2提供了Hi2的序列。当将其与在数据库中的其它序列比较时，发现核苷酸1486-1589相同于髓细胞样(myeloid)白血病细胞系K562中表达的113碱基对序列(GenBankL25344)的104个碱基。核苷酸1983-2128相同于早幼粒细胞白血病细胞系表达的147碱基对的146个碱基。而HL-60(DDBJD20455)，核苷酸1736-2067与在人睾丸细胞中发现的332碱基对cDNA(Gen BankT19428)的325个碱基有97％的同源性。
对Hi2的序列分析显示出一个编码509个氨基酸的推定的蛋白质的开放读框，其没有信号序列。没有发现与数据库中其它蛋白质序列有明显的同源性。
实施例7
然后将Hi2用于分离编码相关蛋白质的基因组DNA。收集人类基因组DNA文库的12组70000个粘粒的DNA，按标准的方法用5E10与它们杂交。所述克隆杂交到一个粘粒组上。亚克隆后，鉴别了一个与cDNA克隆5E10杂交的粘粒。序列通过用从cDNA序列推断的引物确证。所述序列存在6个外显子，具有跨越3-6个外显子的开放读框。
实施例8SEQ ID NO1中的信息足以使得可以经聚合酶链反应(PCR)分析基因表达。
采用下列引物5’-GCCTGCTGAAGGATGAGGCC-3’(SEQ ID NO3)5’-GGTGCTGCAGGAGACTCTGC-3’(SEQ ID NO4)这些分别相应于SEQ ID NO1的157-176位和1328-1347位核苷酸。
PCR进行28个循环，(1个循环94℃1分钟，65℃的2分钟，在72℃3分钟)。在进行PCR时，将2.5ul cDNA模板(如以上描述制备的)与2.5ul10x Dynazyme缓冲液，0.25ul各dNTP(10mM)，0.5ul各种引物(20mM)，0.5U Dynazyme(0.25ul贮存液，2U/毫升)，以及18.5ul水混合。以下表1给出了结果，注意一些变化的肿瘤样品以及肿瘤细胞系上的表达，表明这不是细胞培养物的假象。而且，除了睾丸例外以外，在正常的组织中绝对没有表达。
表1相应于cDNA克隆5E10的基因在肿瘤和正常组织中的表达正常组织肝脏 0/1胃 0/1结肠 0/1肺脏 0/1脾 0/1心脏 0/1乳腺 0/1膀胱 0/1前列腺 0/1胸腺 0/1骨髓 0/1血液淋巴细胞 0/1成纤维细胞 0/1睾丸 2/2肿瘤样品黑素瘤 5/5淋巴瘤 2/5慢性髓细胞样白血病 1/2慢性淋巴样白血病 1/5急性髓细胞样白血病 0/6肾癌 3/6肉瘤 2/3乳腺癌 2/5肿瘤细胞系黑素瘤 11/15白血病 3/6Burkitt淋巴瘤2/4实施例9基于TNF(肿瘤坏死因子)释放，进行第二种测定。在这一测定中，用携带HLA-A24cDNA的质粒pcDNAI/Amp(如上所述)转染或者用该质粒与包含SEQ ID NO1的质粒pcDNAI/Amp(如上所述)共转染COS-7细胞(10000个细胞/微孔)。在转染之后的二十四小时，向转染体添加CTL269/17的3000个细胞。在对照中，使用相同数量的LB33-MEL.B-1细胞。细胞培养基中释放的TNF的浓度在24小时之后用TNF敏感细胞系WEHI164c13测量。
结果在图4中给出。它们说明CTLs的TNF释放仅仅在采用由表达HLA-A24和SEQ ID NO1的载体共转染的COS细胞时被激发。COS细胞本身不存在HLA-A24，它们也不表达本发明的序列。然而，当被共转染时，它们能够激发TNF释放，几乎达到自体细胞系LB33-ME1.B1的水平。
如图3所示，结果不仅显示SEQ ID NO1的物质确实编码在加工后刺激CILs的肿瘤排斥抗原前体，也显示(如以上所说明的)人们可以经排除非转化细胞测定对肿瘤细胞特异性的CTLs的存在，以便形成的转染体表达HLA-A24和DAGE两者。
实施例10因为完全确信TRAP被加工成较小的肿瘤排斥抗原，所以进行实验以鉴别从所描述的序列产生的肿瘤排斥抗原。
用核酸内切酶NsiI部分消化5E10的cDNA，将如此截短的cDNA克隆共转染进具有HLA-A24cDNA克隆的COS-7细胞。然后通过添加CTL269/17并测定TNF的产生测试转染体对LB33-E的表达。
结果在图5中给出。发现相应于Hi2 cDNA的1047-1260位核苷酸之核苷酸编码相关抗原。在这个区中的四种序列是可能的，所述序列(i)9或10个氨基酸长，(ii)在位置2有酪氨酸或苯丙氨酸，和(iii)在C-末端有苯丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，或色氨酸之一。这是由Kubo等，免疫学杂志1523913(1994)；Meier，等，免疫遗传学40306-308(1994)描述的HLA-A24结合的基序。合成这些序列，并与MHC I类阴性B-细胞淋巴母细胞样细胞系C1R(已用以上描述的HLA-A24cDNA克隆转染)一起培养。发现一种肽Leu Tyr Val Asp Ser Leu Phe Phe Leu(SEQ ID NO5)，使转化的C1R-A24细胞对抗LB33-E CTLs的溶解敏感，在500nM具有半数最大作用。
进行比较试验，其中使用包含一个附加N-或C-末端氨基酸并且其中的C-末端亮氨酸被缺失的肽。SEQ ID NO7使细胞对溶解敏感，尽管其程度不如SEQ ID NO5。如图6所示，SEQ ID NO8和9在敏化细胞中具有非常低的敏感性。使用的肽在N-末端用丙氨酸扩展SEQ ID NO5(SEQ ID NO7)，并且缺失C-末端亮氨酸(SEQ ID NO8)。精氨酸添加至C末端导致产生SEQ ID NO9。在这些实验中，将51Cr标记的C1R-A24细胞在所示肽浓度(CTLs以E/T10∶1比率添加)存在下培养30分钟，4小时之后测定铬释放。
实施例11然后，用公知的逆转录酶聚合酶链反应(“RT-PCR”)进行试验，以测定本发明基因的表达。表2示出了结果。
较高比例的阳性肿瘤是黑素瘤(91％)，肺鳞片癌(78％)，腺癌(46％)，以及肾癌(43％)，肉瘤(40％)，和急性白血病(33％)。
在正常的组织中也有某些表达。在睾丸，卵巢，和子宫内膜中的表达均为在的在细胞系LB33-MEL中的表达的约10％，在皮肤，脑，心脏，肾，和肾上腺组织中发现较低水平的表达。参见表2和图6。
表2DAGE基因被肿瘤组织的表达肿瘤样品脑肿瘤1/7结肠直肠癌2/514％胃癌 1/2痣9/18黑素瘤 初期损伤 43/49 88％转移 144/152 95％视觉的 5/9成神经细胞瘤 2/3头和颈鳞片癌 17/44 39％肺癌 SCLC1/4NSCLC 腺癌12/26 46％鳞片癌 51/65 78％前列腺的癌2/20肾癌 24/56 43％膀胱癌 外表 4/3611％渗入 9/4221％肉瘤 10/25 40％乳房癌45/169 27％甲状腺癌 3/5急性白血病21/63 33％肿瘤细胞系黑素瘤72/74 97％肉瘤 4/5肺癌 SCLC 19/27 70％NSCLC2/2间皮瘤2/18头和颈肿瘤2/17膀胱瘤2/3结肠直肠癌1/15肾癌 9/12EBV转化的淋巴母细胞样B细胞系 0/8
以上实施例显示了编码肿瘤排斥抗原前体的核酸分子的分离。然而，这一“TRAP”编码分子不与以上指出的参考资料所描述的任何以前公开的MAGE，BAGE或GAGE编码序列同源。因此，本发明的一个方面是具有SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核苷酸序列的分离的核酸分子以及表达TRAs的SEQ ID NO1或SEQ ID NO2的那些部分，如编码由MHC分子(如HLA-A24)呈递的并从DAGE衍生的SEQ IDNO5，7和9的那些部分。这一序列不是MAGE，BAGE或GAGE编码序列，这一点可以通过将其与所引用的参考文献中描述的这些基因比较看出。本发明的另一部分是也编码非MAGE，非BAGE或非MAGE肿瘤排斥抗原前体但在严格条件下与具有SEQID NO1和/或2的核苷酸序列的核酸杂交的那些核酸序列。本文使用的“严格条件”指本领域熟悉的参数。更具体地说，本文使用的严格条件指在1M NaCl，1％SDS和10％葡聚糖硫酸盐中杂交。其后于室温下在2xSSC中洗涤滤膜两次(每次5分钟)，在2xSSC，0.1％SDS中洗涤一次(30分钟)。其它条件，试剂，等可以使用，它们导致相同或更高的严格程度。本领域技术人员将熟悉这些条件，因此本文不作描述。
这一基因表达的广泛分布(发现8种类型肿瘤中的7种表达它)说明所说的分离的核酸分子可以用作诊断探针用以确定转化细胞的存在。黑素瘤的鉴别是100％，所以在非常基础的水平，所说的分离的核酸分子可以用于确定黑素瘤是否存在。本领域技术人员可以用许多方法证实肿瘤样品是黑素瘤样品，此时不需要重复。而且，肿瘤鉴别中的成功率与测定细胞转化的基于核酸的诊断方法一致。
也可以从实施例看出本发明包括在表达载体中的序列的用途，所述载体可以用来转化或转染宿主细胞和细胞系，它们是原核细胞(例如，大肠杆菌)或真核细胞(例如CHO或COS细胞)。所述表达载体需要相关序列(例如以上描述的那些)可操作连接到启动子上。因为现已发现人类白细胞抗原HLA-A24呈递源于这些基因的肿瘤排斥抗原，所以表达载体也可以包括编码HLA-A24的核酸序列。在载体包含两种编码序列的情况下，其可以用来转化或转染通常不表达其中任何一个的细胞。当例如宿主细胞已经表达HLA-A24时，可以单独使用肿瘤排斥抗原前体编码序列。当然，对可以使用的宿主细胞没有限制。因为如果需要，包含两种编码序列的载体可以用于HLA-A24呈递细胞，所以肿瘤排斥抗原前体的基因可以用于不表达HLA-A24的宿主细胞。
本发明也包括所称的表达试剂盒，其使得技术人员可以制备的所需的的表达载体。这样的表达试剂盒包含至少各自独立的每种前面所讨论的编码序列部分。如果需要，可以添加其它组分，只要包含以上提及的所需的序列。
为了将本发明的核酸分子和TRAP与以前描述的MAGE，BAGE和GAGE材料相区别，本发明也称作DAGE基因族和TRAP。因此，只要本文中使用″DAGE″，它就指由前述序列编码的肿瘤排斥抗原前体。″DAGE编码分子″和类似的术语，用来描述核酸分子本身。
如本文所描述的，本发明具有许多用途，其中一些在此描述。首先，本发明使得技术人员可以诊断以表达TRAP为特征的紊乱。这些方法包括测定TRAP基因的表达，和/或从其衍生的TRAs，如由HLA-A24呈递的TRA。在前一种情形下，这样的测定可以经任何标准的核酸测定方法进行，包括聚合酶链反应，或用标记的杂交探针测定。在后一种情形下，用TRA和HLA的复合物的结合配体(如抗体)的测定是尤其优选的。一种替换性的测定方法是以上所述类型的TNF或51Cr释放测定。
TRAP基因的分离也使得分离TRAP分子(尤其是包含由SEQ ID NO2编码的氨基酸序列的TRAP分子)本身成为可能。当以TRA或TRA与HLA的复合物(如HLA-A24)存在时，这些分离分子可以与佐剂之类的物质组合产生在治疗以表达TRAP分子为特征的紊乱中有用的疫苗。此外，可以从在其表面呈递TRA/HLA复合物的细胞(如非增殖性癌细胞，非增殖性转染体，等等)制备疫苗。在细胞用作疫苗的所有情况下，这些细胞可以是用提供CTL反应所需的一种或两种组分之编码序列转染的细胞，或者是不经转染表达两种分子的细胞。此外，TRAP分子，其相关的TRAs，以及TRA和HLA的复合物可以用来经本领域已知的标准技术产生抗体。
当″紊乱″用于本文时，它指其中表达肿瘤排斥抗原前体的任何病理状态，这样一种紊乱的例子是癌，特别是黑素瘤。黑素瘤是公知的色素产生细胞癌。
基于所公开的内容的治疗方法以受治疗者免疫系统反应导致TRA呈递细胞(如HLA-A24细胞)溶解为前提。体外开发这样一种CTLs在本领域技术人员的知识范围内。具体地说，将细胞(如血液细胞)样品与呈递复合物和能够激发特异性CTL增殖的细胞接触。靶细胞可以是转染体，如以上描述的类型的COS细胞。这些转染体在其表面上存在所需的复合物，并且在与感兴趣的CTL结合时，刺激它的增殖。COS细胞(如本文所使用的那些)和其它适合宿主细胞一样是广泛可获得的。
所述治疗方法具体说来，指过继转移(Greenberg，免疫学杂志136(5)1917(1986)；Riddel等，科学257238(7-10-92)；Lynch等，欧洲免疫学杂志211403-1410(1991)；Kast等，细胞59603-614(11-17-89))，存在所需复合物的细胞与CTLs结合导致CTLs特异性增殖。然后将增殖的CTLs施用于具有以某些异常细胞呈递特定复合物为特征的细胞异常的受治疗者，其中所述的复合物包含相关HLA分子。然后CTLs溶解异常细胞，进而达到所需的治疗目的。
以上疗法假定至少某些受治疗者的异常细胞呈递相关的HLA/TRA复合物。这可以十分容易地测定，因为本领域十分熟悉用于鉴别呈递特定的HLA分子之细胞的方法，以及如何鉴别表达相关序列(在这种情况下是DAGE序列)的DNA的细胞的方法。一旦经上述筛选方法鉴别出呈递相关复合物的细胞，它们就可以与患者的包含CTLs的样品结合。如果呈递复合物的细胞被混合CTL样品溶解，则可以假定呈递GAGE衍生的肿瘤排斥抗原，所述的患者就是以上提出的治疗方法的合适的候选者。
按照本发明过继转移不是仅有的治疗形式。也可以用一些方法体内刺激CTLs。以上已阐述了一种方法，即采用表达复合物的非增殖细胞。用于这一方法中的细胞可以是通常表达复合物的那些，如照射过的黑素瘤细胞或用呈递复合物所需的一个或两个基因转染的细胞。Chen等，Proc.Natl.Acad.Sci.美国88110-114(1991年1月)以例子说明了这种方法，显示了在治疗方案中采用表达HPV E7肽的转染细胞。可以使用各种细胞类型。同样地，可以使用携带一个或两个兴趣基因的载体，病毒或细菌载体是尤其优选的。在这些系统中，感兴趣基因由例如，痘苗病毒和细菌BCG携带，所说的材料“感染”宿主细胞。所产生的细胞存在存在感兴趣的复合物，并被自体CTLs识别，CTL然后增殖。一种类似的影响可以通过将肿瘤排斥抗原或其前体与佐剂相结合以有利于掺合进存在HLA-A24的细胞，其然后呈递感兴趣的HLA/肽复合物。TRAP被加工产生HLA分子的肽配体，而TRA无须进一步加工而被呈递。
本发明的另一个特征是从DAGE TRAP衍生的分离的肽类，其遵从MHC分子呈递规则。例如，在PCT申请PCT/US93/07421(本文一并参考)中，若干基序被描述为与不同的MHC分子相关。这些基序(本文一并参考)以及下列文献教导的那些被作为鉴别从DAGE基因可获得的或可衍生的合适的肽的基础，上述文献例如Falk等，自然351290-296(1991)；Engelhard，免疫学年评12181-207(1994)；Ruppert等，细胞74929-937(1993)；Rbtzschke等，自然348252-254(1990)；Bjorkm等，自然329512-518(1987)和Traversari等，J.Exp.Med.1761453-1457(1992)，所有这些本文一并参考。在现在所描述的本发明的另一方面，这些肽可以单独或混合使用。这些的例证性例子如下。就HLA-A2而言，结合的基序是Xaa Leu Xaa Gly(Xaa)nLeu(SEQID NO10)，其中n是4或5。SEQ ID NO1的120-128位氨基酸相应于这一基序。HLA-A2的第二种基序以缬氨酸代替末端亮氨酸(SEQ ID NO3)，氨基酸375-384符合这一基序。就HLA-A3而言，基序是Xaa Leu(Xaa)6(Lys或Tyr)(SEQ ID NO11和SEQ ID NO12)。SEQ ID NO1的氨基酸48-56，100-108，138-146，214-222，257-265完全满足这一基序。对于HLA-A11，基序(Xaa)7Lys Lys(SEQ ID NO13)是已知的，氨基酸169-178，214-223和223-232将符合它。对于HLA-A24，已知基序是Xaa Tyr(Xaa)6，Leu，(SEQ ID NO13)，氨基酸274-282，467-475，以及SEQ ID NO5符合它。对于HLA-B7，基序是Xaa Pro Arg(Xaa)5Leu(SEQ ID NO14)，氨基酸68-76符合它。对于HLA-B8，基序是(Xaa)2Lys Xaa Lys(Xaa)3Leu(SEQ ID NO15)，氨基酸176-184以及218-226满足它。对于HLA-B44，基序是Xaa Glu(Xaa)3Asp(Xaa)2Phe(SEQ ID NO16)，氨基酸204-212符合它。对于HLA-Cw*1601，氨基酸60-68和395-403符合它。
存在许多相应于HLA基序的序列事实建议了本文的被称作″混合物″治疗和诊断用途。可以预期在一典型的对肿瘤细胞的CTL应答中，对一种以上的肽和HLA分子复合物特异性的CTLs将增殖。例如，它可以是这样一种情况，对呈递HLA-A24的细胞，对HLA-A24和氨基酸序列467-475特异性的CTLs将增殖。这样，在试图鉴别CTLs时，人们可以用两种肽优化测定。同样地，可以通过利用HLA-A24结合肽优化治疗方法。
众所周知个体的HLA分子不是“单价”的，因为细胞存在一种以上的HLA。因此，在诊断测定中人们可以通过组合以上描述的多种肽来最大化诊断和/或治疗以确定CTLs或用以上的治疗法治疗病人。
任何假阳性的担心都被认为是不必要的，因为如上所述，本发明的核酸分子仅在肿瘤细胞中表达，因此CTLs对HLA和肽的存在必定是在过去的一些时间存在癌或转化病症的事实上的证据。这样，可以制备本发明的肽的混合物。混合物的组分测定并不困难，因为所有需要的仅是考察个体的一种或多种HLA类型。HLA分型是十分标准的技术，本领域公知；完全在本领域技术人员的知识范围内。
已完全确定患有肿瘤的个体的血液通常包含针对MHC分子和呈递的肽的复合物的胞溶性T细胞(“CTLs”)。参见，例如，Robbins等，癌研究543124-3126(1994)；Topoli等，免疫学杂志1423714-3725(1989)；Coulie等，国际癌症杂志50289-297(1992)，所有这些本文一并参考。也，参见Kawakami等，实验医学180347-352(1994)；Hom等，免疫治疗杂志10153-164(1991)，Darrow等，免疫学杂志142(9)3329-3335(1989)；Slovin等，免疫学杂志131(9)3042-3048(1986)，所有这些本文一并参考。所有这些论文给出了CTL增殖测定在诊断癌上的有效性。一般而言，人们可以从受试者取得包含外周血液淋巴细胞(PBL)的样品。假定患者确实具有肿瘤，或受治疗者的细胞开始经历转化，则样品中就包含对转化细胞特异性的CTLs。经与存在相关MHC分子和所呈递的肽的复合物的靶细胞接触，这些CTLs可被刺激增殖。例如，如以上所示的，DAGE衍生的肿瘤排斥抗原(″TRAs)由HLA-A24细胞呈递。这样，通过把PBL样品与呈递HLA-A24的细胞靶和肽类(其源于TRAP并由HLA-A24呈递)相混合，人们可以观察CTL增殖，并且由此诊断转化细胞的存在。这些细胞可以是所谈论的通常存在MHC分子的细胞，但是也可以是由HLA编码序列转化的细胞。所说的细胞可以是肿瘤细胞，或正常细胞。测定CTL增殖的各种方法是已知的，包括TNF释放测定，和51Cr释放测定。其它方法也可使用。这样，本发明的一个方面包括把带有源于DAGE TRA并由靶细胞样品的MHC分子呈递的肽或肽混合物的靶细胞样品和受治疗者的PBLs相混合。然后就CTL增殖试验混合物。
所示的肽或肽混合物也可以与刺激更显著的CTL应答的一种或多种佐剂组合，这样的佐剂的例子是皂苷和它们的衍生物，如Kensil等的美国专利5,057,540(本文一并参考)或者Scatt等的PCT申请PCT/US92/03579(本文也一并参考)公开的那些。当然，也可以使用标准佐剂，如弗氏完全佐剂，或弗氏不完全佐剂。
本发明的其它方面将对本领域技术人员是显而易见的，不必在此重复。
已使用的术语和表达是用来描述但不作为限制的术语，也无意于排除所示的和所描述的特征和其部分的任何等价物。应认识到在本发明的范围内进行各种修改是可能的。DNA序列 15b.p. GACTGAGACCTA... TCTATGACCCGG line| 10 | 20 | 30 | 40 | 50 | 601 GACTGAGACC TAGAAATCCA AGCGTTGGAG GTCCTGAGGC GAGCCTAAGT CGCTTCAAAA 6061 TGGAACGAAG GCGTTTGCGG GGTTCCATTC AGAGCCGATA CATCAGCATG AGTGTGTGGA 120121 CAAGCCCACG GAGACTTGTG GAGCTGGCAG GGCAGAGCCT GCTGAAGGAT GAGGCCCTGG 180181 CCATTGCCGC CCTGGAGTTG CTGCCCAGGG AGCTCTTCCC GCCACTCTTC ATGGCAGCCT 240241 TTGACGGGAG ACACAGCCAG ACCCTGAAGG CAATGGTGCA GGCCTGGCCC TTCACCTGCC 300301 TCCCTCTGGG AGTGCTGATG AAGGGACAAC ATCTTCACCT GGAGACCTTC AAAGCTGTGC 360361 TTGATGGACT TGATGTGCTC CTTGCCCAGG AGGTTCGCCC CAGGAGGTGG AAACTTCAAG 420421 TGCTGGATTT ACGGAAGAAC TCTCATCAGG ACTTCTGGAC TGTATGGTCT GGAAACAGGG 480481 CCAGTCTGTA CTCATTTCCA GAGCCAGAAG GAGCTCAGCC CATGACAAAG AAGCGAAAAG 540541 TAGATGGTTT GAGCACAGAG GCAGAGCAGC CCTTCATTCC AGTAGAGGTG CTCGTAGACC 600601 TGTTCCTCAA GGAAGGTGCC TGTGATGAAT TGTTCTCCTA CCTCATTGAG AAAGTGAAGC 660661 GAAAGAAAAA TGTACTACGC CTGTGCTGTA AGAAGCTGAA GATTTTTGCA ATGCCCATGC 720721 AGGATATCAA GATGATCCTG AAAATGGTGC AGCTGGACTC TATTGAAGAT TTGGAAGTGA 780781 CTTGTACCTG GAAGCTACCC ACCTTGGCGA AATTTTCTCC TTACCTGGGC CAGATGATTA 840841 ATCTGCGTAG ACTCCTCCTC TCCCACATCC ATGCATCTTC CTACATTTCC CCGGAGAAGG 900901 AAGAGCAGTA TATCGCCCAG TTCACCTCTC AGTTCCTCAG TCTGCAGTGC CTGCAGGCTC 960961 TCTATGTGGA CTCTTTATTT TTCCTTAGAG GCCGCCTGGA TCAGTTGCTC AGGCACGTGA 10201021 TGAACCCCTT GGAAACCCTC TCAATAACTA ACTGCCGGCT TTCGGAAGGG GATGTGATGC 10801081 ATCTGTCCCA GAGTCCCAGC GTCAGTCAGC TAAGTGTCCT GAGTCTAAGT GGGGTCATGC 11401141 TGACCGATGT AAGTCCCGAG CCCCTCCAAG CTCTGCTGGA GAGAGCCTCT GCCACCCTCC 12001201 AGGACCTGGT CTTTGATGAG TGTGGGATCA CGGATGATCA GCTCCTTGCC CTCCTGCCTT 12601261 CCCTGAGCCA GTGCTCCCAG CTTACAACCT TAAGCTTCTA CGGGAATTCC ATCTCCATAT 13201321 CTGCCTTGCA GAGTCTCCTG CAGCACCTCA TCGGGCTGAG CAATCTGACC CACGTGCTGT 13801381 ATCCTGTCCC CCTGGAGAGT TATGAGGACA TCCATGGTAC CCTCCACCTG GAGAGGCTTG 14401441 CCTATCTGCA TGCCAGGCTC AGGGAGTTGC TGTGTGAGTT GGGGCGGCCC AGCATGGTCT 15001501 GGCTTAGTGC CAACCCCTGT CCTCACTGTG GGGACAGAAC CTTCTATGAC CCGG 1554| 10|20|30 | 40|50 | 60SEQ ID NO.1
SEQ ID NO.权利要求
1.一种基本上由SEQ ID NO1所示的核苷酸序列组成的分离的核酸分子。
2.一种基本上由SEQ ID NO2所示的核苷酸序列组成的分离的核酸分子。
3.一种分离的核酸分子，该分子在严格条件下杂交到SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的核酸分子上，并且编码一种肿瘤排斥抗原前体，条件是所说的分离的核酸分子不编码任何MAGE肿瘤排斥抗原前体、BAGE肿瘤排斥抗原前体或者GAGE肿瘤排斥抗原前体。
4.一种由SEQ ID NO1的1-1554位核苷酸组成的分离的核酸分子。
5.一种分离的mRNA分子，该分子互补于权利要求1的核酸分子。
6.一种由权利要求1的核酸分子转染或者转化的宿主细胞。
7.一种由权利要求3的核酸分子转染或者转化的宿主细胞。
8.一种由权利要求4的核酸分子转染或者转化的宿主细胞。
9.一种表达载体，该载体包含可操作连接到启动子上的权利要求1或权利要求2的分离的核酸分子。
10.一种表达载体，该载体包含可操作连接到启动子上的权利要求3的分离的核酸分子。
11.一种表达载体，该载体包含可操作连接到启动子上的权利要求4的分离的核酸分子。
12.权利要求6的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是表达HLA-A24的哺乳动物细胞。
13.权利要求7的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是表达HLA-A24的哺乳动物细胞。
14.权利要求8的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是表达HLA-A24的哺乳动物细胞。
15.权利要求9的表达载体，该载体还包含编码HLA-A24的核酸分子。
16.权利要求10的表达载体，该载体还包含编码HLA-A24的核酸分子。
17.权利要求11的表达载体，该载体还包含编码HLA-A24的核酸分子。
18.包含每种以下各自独立的部分的表达试剂盒(i)权利要求1或权利要求2的分离的核酸分子，和(ii)编码HLA-A24的核酸分子。
19.包含每种以下各自独立的部分的表达试剂盒(i)权利要求3的分离的核酸分子，和(ii)编码HLA-A24的核酸分子。
20.包含每种以下各自独立的部分的表达试剂盒(i)权利要求4的分离的核酸分子，和(ii)编码HLA-A24的核酸分子。
21.一种分离的肿瘤排斥抗原前体，该前体由权利要求1、2、3或4的核酸分子编码。
22.SEQ ID NO5或SEQ ID NO7的分离的肽。
全文摘要
本发明提供了一族新的肿瘤排斥抗原前体，编码它们的核酸分子。这些肿瘤排斥抗原前体被称作DAGE肿瘤排斥抗原前体，编码它们的核酸分子被称作DAGE编码分子。本发明还提供了所说编码序列、肿瘤排斥抗原和其前体分子的各种诊断和治疗用途。
文档编号A61K48/00GK1159811SQ95195364
公开日1997年9月17日 申请日期1995年9月21日 优先权日1994年9月30日
发明者皮埃尔·库利耶, 池田秀之, 蒂尔瑞·博恩-法勒尔 申请人:路德维格癌症研究所