专利名称：含基因的组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及含基因的组合物。更具体地说，本发明涉及用于把一基因导入妊娠母体所带的胎儿以表达该基因的含基因的组合物。本发明还涉及一种用于把一基因导入包括实验动物、家畜、经济动物在内的动物的胎儿的方法。
近年来，已开发出几种直接把外源基因导入动物或人体内的方法，希望将这些方法应用于治疗基因组异常所引起的疾病用的基因治疗。
象先天性基因缺陷这样的由先天性基因异常引起的疾病最好在产前阶段治疗。就把基因导入产前受治疗者而言，在动物试验中对受精卵进行微量注射是目前唯一的有效方法[Palmitter，R.D.&Brinster，R.L.Annu.Rev.Genet.，20，465-499(1986)]。
尽管用于受精卵的微量注射法为把基因导入胚胎发育早期开辟了道路，但尚未开发出把外源基因导入胎儿的手段。此外，微量注射法不能用于人体妊娠情况下胎儿的基因治疗。
因此，本发明的一个目的是提供一种用于把外源基因导入发育期胎儿的方法；本发明的另一目的是提供一种用于该方法中的含基因的组合物。
本发明人对用于把目的基因通过胎儿母体导入胎儿的方法进行了各种研究，结果发现，当把基因和特定运输因子一起导入母体时，它们能穿过作为胎儿和母体间血液屏障的胎盘基底膜；还发现，基因可以导入胎儿细胞以进行原位表达。这些发现导致本发明的完成。
因此，本发明提供一种包括一种基因和一种运输因子的含基因的组合物，所述运输因子能够把该基因从妊娠母体运输到胎儿细胞。
本发明还提供了一种通过将上述含基因的组合物导入妊娠母体而把基因导入胎儿细胞的方法。
附图简述
图1表示用本发明的组合物给药后胎儿和母体肝脏的基因组DNA的Southern印迹分析结果。
图2表示只用外源基因给药后胎儿和母体肝脏的基因组DNA的Southern印迹分析结果。
图3表示交媾后第3、6、9、12和15天用本发明组合物给药时的胎儿基因组DNA的Southern印迹分析结果。
图4表示交媾后第9天用本发明组合物给母体给药时从小鼠胎儿、新生小鼠、一月龄幼鼠收集的基因组DNA的Southern印迹分析结果。
图5表示从图4中所示一月龄幼鼠的器官收集到的基因组DNA的狭线印迹分析结果。
图6表示交媾后第9天用本发明组合物给母体给药时从小鼠胎儿和新生小鼠收集到的RNA的Northern印迹分析结果。
图7表示收集自已导入了SV40-CAT基因的小鼠和新生小鼠的蛋白质的CAT活性。
图8表示用X-gal染色获得的组织化学切片图，以及β-肌动蛋白-lacZ的表达。所述β-肌动蛋白-lacZ已通过在交媾后第8.5天用本发明的组合物给母体给药而导入胎儿中。
图9表示小鼠胎儿(已导入的β-肌动蛋白-lacZ在其中得到表达)的组织切片。
图10表示已导入SR-α-HST-1基因的2周龄小鼠及其母鼠的血小板数目(其中，血采自心脏)。
图11表示已导入SR-α-HST-1基因的3周龄小鼠及其母鼠的血小板数目(其中，血采自眶静脉)。
图12表示已导入SR-α-HST-1基因的3周龄小鼠及其母鼠血清中的HST-1蛋白浓度。
本发明中“运输因子”这一术语用来指帮助基因运输至靶细胞的物质。本发明中所用的运输因子能把基因从母体导入其胎儿细胞。更具体地说，当把该运输因子导入带有胎儿的妊娠母体时，它能将基因导入胎儿细胞。运输因子的例子有阳离子脂多胺。其中，双C10-C20烷基酰胺甘氨酰基精胺是优选的，而双十八烷基酰胺甘氨酰基精胺是特别优选的。
对本发明中所用的基因没有特别限制，只要该基因能用于最好在胎儿期治疗或预防的疾病即可，或者能用于为饲养象实验动物、家畜和宠物这样的经济动物而进行的基因导入即可。
例如，当已经证实胎儿缺少某一基因时或当很清楚胎儿因其家族史而缺少某一基因时，这类基因就可用于本发明。此外，也可使用用于治疗胎儿患有的先天性疾病的基因。
下表显示了先天性遗传病和缺陷基因产物之间的关系。
表1先天性遗传病缺陷基因产物家族性高胆固醇血症 低密度脂蛋白受体脂质中的代谢错误载脂蛋白苯丙酮尿症 苯丙氨酸羟化酶血友病甲因子VIII血友病乙凝固因子IX鸟氨酸转氨甲酰酶缺乏鸟氨酸转氨甲酰酶基因高酪氨酸血症富马酰乙酰乙酸羟化酶囊性肺纤维化通过囊性肺纤维化的跨膜传导调节因子假肥大性肌营养不良 小肌营养不良蛋白基因产物Li-Fraumeni综合症 p53蛋白成视网膜细胞瘤 RB蛋白Lesch-Nyhan综合症 次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶腺苷脱氨酶缺陷 腺苷脱氨酶Nieman-Pick病 鞘磷脂磷酸二酯酶ITay-Sacks病 氨基己糖苷酶Aα1-抗胰蛋白酶缺陷 α1-抗胰蛋白酶抗凝血酶III缺陷 抗凝血酶III氨甲酰磷酸合成酶缺陷氨甲酰磷酸合成酶生长激素缺陷(IA型)生长激素甲状腺球蛋白缺陷 甲状腺球蛋白21-羟化酶缺陷 21-羟化酶(先天性肾上腺增生)丙酮酸脱氢酶缺陷 丙酮酸脱氢酶另外，通过把本发明的组合物和方法用于患自发遗传病的动物或敲除的动物(用人工方法使其具有基因功能障碍的动物)，它们就可用于基因导入模型。而且，在病毒性肝炎或婴儿恶性肿瘤的治疗中，一些反义寡核苷酸在病毒性肝炎(甲、乙或丙肝)存在下抑制病毒性基因产物，其它一些反义寡核苷酸抑制癌基因(癌基因导致象维尔姆斯瘤和成神经细胞瘤这样的婴儿恶性肿瘤)和造成其它疾病的基因的表达。
被导入动物体内的基因的例子有(1)用于在动物体内产生药物的基因，(2)用于改善动物肉、物理成分、毛、乳质量的基因，(3)通过将基因从胎生动物中剔除或将基因导入胎生动物而对基因功能进行研究的基因材料，(4)用于恢复基因在基因缺陷(造成子宫中死胎)动物中的表达的基因材料。
胎儿包括除人之外的哺乳动物如狗、牛、马、山羊、绵羊、猴、猫、猪、小鼠和大鼠的胎儿，也包括人的胎儿。
对所采用的基因形式没有特别限制。然而，就导入和表达的容易程度而言，为表达基因而构建的质粒是特别优选的。一个强有力的启动子和/或增强子和一个基因的组合更为优选，因为促进了表达。如果使用高度器官特异性的启动子，所谓的器官击靶(organtargeting)也是可能的，其中基因在特定器官中表达。
在本发明的含基因的组合物中，基因和运输因子可以混合物的形式存在。也可以这样的形式存在，即把混溶状态的运输因子与基因相混合。此外，也可以把已形成脂质体的运输因子与基因相混合。如果运输因子已形成一种脂质体，那么基因最好存在于脂质体内部、其膜中或膜的表面中。用来形成脂质体的方法例如有涡动处理、超声处理、反相蒸发、冷冻干燥、增湿、采用多元醇的方法、机械化学法、脂溶法以及喷雾干燥法。制备脂质体时，下列成分可以作为成膜成分添加磷脂如双十四酰基磷脂酰甘油、磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇、磷脂酸等，胆固醇，α-生育酚，磷酸三十二烷基酯以及十八烷胺。
基因和运输因子的比例根据它们的性质而有所变化。通常优选的是，每μg DNA中掺入1-100nmol、特别是5-10nmol的运输因子。
本发明的组合物优选通过注射方法给妊娠母体给药，特别优选的是动脉注射或静脉注射。此外，本组合物可以通过导管给药到母体的血管中。如果在妊娠期的话，对给药时间就没有特别的限制。不过，特别优选的是，在器官发生期间(organogenic period)用本组合物给药。
本发明的组合物给药到母体后穿过胎盘基底膜，然后到达脐带，最后到达胎儿，这样就将基因导入了胎儿细胞。已经证实，被导入的基因在产出后的新生儿细胞中存在并得以表达。
因此，本发明的组合物在把基因导入胎儿的实验中、在预防基因缺陷婴儿的出生中、在胎儿基因缺陷的预防和治疗中都很有用。该组合物也可用于饲养经济动物和宠物。
实施例下面将通过实施例更具体地描述本发明。这些实施例不能被理解成对本发明的限定。实施例1(1)用于导入的质粒采用SV40-氯霉素乙酰转移酶(CAT)质粒[4752bp，Promega的产品]。(2)运输因子采用双十八烷基酰氨基甘氨酰基精胺(DOGS)[Proc.Natl.Acad.Sci.USA86(1989)p6983](Transfectum，Biosepra Inc.的产品)。(3)本发明组合物的制备向133μgSV40-CAT质粒中加入250μl 0.3M NaCl水溶液以制备质粒溶液。另外，把20μl96％乙醇加入500μgDOGS中并在室温下保温5分钟。向所得溶液中加入180μl纯化水以制备DOGS溶液。向含有200μl DOGS溶液和250μl纯化水的溶液中加入质粒溶液。将混合物在涡流混合器中机械摇动，以获得本发明的组合物。(4)基因的导入i)在交媾后(P.C.)第9.5天，把按上述方法制备的组合物注射到每只妊娠雌性小鼠(体重约30g，Charles River Co.)的尾静脉中。七天后(交媾后第16.5天)取出母体肝脏。同样，用剖腹产术分离出胎儿。从肝脏和胎儿收集基因组DNA，对其进行Southern印迹分析检查CAT基因的存在。按Pro.Natl.Acd.Sci.USA83，4993-4997(1986)所述方法收集基因组DNA。通过在1％琼脂糖凝胶上进行电泳来分离被限制酶SalI完全消化的DNA和未被消化的DNA，然后将DNA印迹到Hybond-N+nylon膜(Amersham的产品)上。采用由32P标记过的SV40-CAT片断(1908bp，Hind III片断)作探针，将印迹杂交。在放射自显影图上检测特定区带。
结果证实，如图1所示，外源基因即SV40-CAT质粒被导入胎儿细胞。
图1中，线1和2是对照SV40-CAT质粒(33pg)的基因组DNA，线3和4得自未处理过的母体肝脏，线5和6来自未处理过的胎儿，线7和8来自用本发明组合物给药过的母体肝脏，而线9和10来自处理过的胎儿。ii)结果示于图2，该结果是在这样的实验中获得的，即未与运输因子混合的纯SV40-CAT质粒以类似于i)中所述的方式给妊娠小鼠药给。从图2可清楚地看出，在没有运输因子的情况下SV40-CAT质粒不能有效地导入胎儿细胞中。图2中，线1和2是来自对照SV40-CAT质粒(33Pg)的基因组DNA，线3和4来自只用质粒给药的母体肝脏，而线5和6来自其胎儿。iii)图3表示在类似于上述i)的实验中获得的结果，该实验中在不同的时刻用本发明组合物给药。从图3可清楚地看出，当在交媾后第3～6天期间给药时，几乎没有基因被导入；交媾后大约9天后给药基因开始能被导入；交媾后大约第9天导入基因的效率最高。图3中，线1和2是来自对照SV40-CAT质粒(33pg)的基因组DNA，线3和4来自在交媾后第3天导入了基因的胎儿，线5和6来自在交媾后第6天导入了基因的胎儿，线7和8来自在交媾后第9天导入了基因的胎儿，线9和10来自在交媾后第12天导入了基因的胎儿，而线11和12来自在交媾后第15天导入了基因的胎儿。实施例2以类似于实施例1中所述的方式，在交媾后第9天用实施例1(3)中获得的本发明组合物给小鼠给药。从交媾后第16.5天的胎儿、新生小鼠、1月龄小鼠收集基因组DNA。进行Southern印迹分析。
结果证实，如图4所示，所有情况下都存在导入的基因。图4中，线1和2是来自对照SV40-CAT质粒(33pg)的基因组DNA，线3和4来自交媾后第16.5天的胎儿，线5和6来自新生小鼠，线7和8来自1月龄小鼠。然后，从1月龄小鼠的各种器官提取基因组DNA并进行狭线印迹分析。发现基因已被导入各器官。图5中，线1是来自大脑的基因组DNA，线2来自甲状腺，线3来自胸腺，线4来自心脏，线5来自肺，线6来自肝脏，线7来自脾，线8来自胰，线9来自肾，线10来自小肠，线11来自子宫，而线12来自肌肉。实施例3通过Northern印迹分析证实了如实施例1-i)所述导入的基因SV40-CAT的表达。
简言之，从胎儿或新生小鼠的全身提取RNA，所述胎儿或新生小鼠已按类似于实施例1-i)的方式、采用同工基因(isogen)(Nippongene)导入了基因。通过1％琼脂糖凝胶电泳分离RNA(20μg)，然后印迹到硝化纤维素膜(Nitroplus Cellulosemembrane，Micron Separations Inc.的产品)上。以类似于实施例1所述的方式，采用由32P标记的SV40-CAT片断作探针进行杂交。结果在所有的胎儿及新生小鼠中都发现，导入的基因转录到RNA上。图6中，线1代表未处理的胎儿，线2代表已导入了基因的胎儿，而线3代表已导入了基因的新生小鼠。
接着，从如实施例1-i)中所述导入了基因的胎儿和新生小鼠的全身提取蛋白质样品，然后分析外源基因的表达，即分析CAT的酶活性。简言之，使每一样品中的蛋白量彼此相等，并使样品在60℃下热处理5分钟以使CAT固有抑制因子失活。用已知方法分析CAT活性(Zhu，N.，Liggitt，D.，Liu，Y.&Debs，R.，Science 261，209-211(1993)；以及Gorman，C.M.，Moffat，L.F.&Howard，B.H.，Mol.Cell.Biol.2，1044-1051(1982))。通过把200nmol乙酰辅酶A加入用0.1μCi14C(55mCi/mmol)标记的终体积为150μl的氯霉素中来测定酶活性。
结果证实，导入的基因在所有胎儿和新生小鼠中都得到表达，这表明CAT蛋白已经产生。图7中，线1表示未处理的胎儿，线2表示已导入了外源基因的胎儿，线3表示已导入了外源基因的新生小鼠，而线4表示0.2μU CAT的对照CAT。实施例4把含有小鸡β-肌动蛋白启动子的lac Z质粒(Sakura，H.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86，5758-5762(1989))用作待导入的质粒。用133μg lac Z质粒和400nmol DOGS，按类似于实施例1(3)中所述的方式制备本发明的组合物。
把这样获得的组合物注射到交媾后第8.5天的每只妊娠雌性小鼠的尾静脉中以导入基因。在交媾后第10.5天分离胎儿。采用Cheng′s方法通过用X-gal染色来检测β-肌动蛋白-lac Z活性(Cheng，T.C.，Wallace，M.C.，Merlie，J.P.&Olsow，E.N.，Science 201，215-218(1993))。把染色胎儿浸于含20％蔗糖和0.2％葡萄糖的4℃磷酸缓冲盐水中之后，制备冷冻切片。把连续切片切成30μm厚，为用核坚牢红进行复染选择合适的切片。获得了染色的切片。
图8表示出导入了基因的小鼠的全身染色结果。切片染色的结果示于图9。如图所示，在胎儿的各种器官中β-肌动蛋白-lac Z活性都得到表达。图8中，a-e表示已导入基因的胎儿，f表示未处理过的对照胎儿。图9中，g表示沿纵向切开的胎儿的全身切片，h表示通过心脏切开的胎儿的全身前部切片，i表示右眼泡切片(放大图)，j表示胰芽切片(放大图)，k表示左前肢芽切片(放大图)，FB指前脑，H指心脏，MT指中肾小管，Nc指脊索，IRS指视网膜内的空间，PB指胰芽，D指背面，V指腹面。实施例5把HST-1基因用作待导入的基因。使用时，构建含HST-1cDNA和SR-α启动子的重组表达载体，将其导入妊娠母体。研究后代小鼠中HST-1基因是否得以表达。因为已经知道HST-1基因产物能增加血小板数量，所以通过血小板计数来检测表达与否。(1)待导入的基因采用含有与SR-α启动子连接的HST-1基因的表达质粒。(2)制备本发明的组合物重复实施例1(3)的步骤，所不同的是采用133μg SR-α-HST-1基因。(3)基因的导入把如上述制备的组合物注射到交媾后第10.5天的每只妊娠雌性小鼠的尾静脉中以导入该基因。在后代小鼠出生后第2周和第3周测定其血小板数目。同时也测定其母体的血小板数目。结果示于图10和11。图10表示从心脏采集的血的结果，而图11表示从眶静脉采集的血的结果。
从这些结果可以清楚地看出，导入了HST-1基因的幼鼠的血小板数目高于对照小鼠血小板数目。这表明，HST-1基因被导入幼鼠体内，并且该基因在小鼠中得到表达。
用ELISA测定3周龄小鼠血清中的HST-1蛋白。简言之，用采自每只3周龄小鼠的50μl血清和已知方法进行ELISA以测定HST-1蛋白量(Proc.Natl.Acad.Sci.USA，Vol.91，pp12368-12372，December1994)。结果示于图12。图12中的数据表明，在由导入了HST-1基因的母体生产的幼鼠的血液中检测到HST-1蛋白。
用本发明的组合物给妊娠母体给药时，可以防止有基因缺陷的后代的出生，而且可以在妊娠期间治疗基因缺陷。在动物实验中，在胚胎发生期把未知基因导入动物中，可以研究该基因在个体发育中的作用。此外，该组合物可用于产生生理活性物质(如动物体内的药物)或提高这类物质的产量。因此，可通过改善物理成分、改善肉、乳和毛的质量而用于饲养动物。
权利要求
1.一种包括基因和运输因子的含基因的组合物，所述运输因子能把该基因从母体运输到胎儿细胞。
2.根据权利要求1的组合物，通过用该组合物给母体给药而将该基因导入胎儿。
3.根据权利要求1或2的组合物，其中运输因子是双C10-C20烷基酰胺甘氨酰基精胺。
4.根据权利要求1或2的组合物，其中运输因子是双十八烷基酰胺甘氨酰基精胺。
5.根据权利要求1-4中任一项的组合物，它被用于防止有基因缺陷的婴儿的出生、防止和治疗胎儿的基因缺陷、饲养动物。
6.一种用于通过给妊娠母体给药而将基因导入胎儿细胞的含基因的组合物，该组合物是通过把含基因的溶液和含双十八烷基酰胺甘氨酰基精胺的溶液混合并用机械摇动法摇动而获得的。
7.一种把基因导入胎儿细胞的方法，该方法包括用权利要求1-6中任一项定义的含基因的组合物给妊娠母体给药。
全文摘要
一种包括基因和运输因子的含基因的组合物，所述运输因子能把该基因从母体运输到胎儿细胞。用本发明的组合物给妊娠母体给药时，可以防止有基因缺陷的后代的出生，而且可以在妊娠期间治疗基因缺陷。在动物实验中，在胚胎发生期把未知基因导入动物中，可以研究该基因在个体发育中的作用。此外，该组合物可用于饲养象宠物、经济动物和家畜这样的动物。
文档编号A61K48/00GK1166788SQ9519565
公开日1997年12月3日 申请日期1995年8月31日 优先权日1994年10月14日
发明者本真, 落谷孝广, 吉田尚, 杉村隆, 寺田雅昭 申请人:第一制药株式会社