专利名称：：修饰的凝血因子vii的制作方法
技术领域：
：本发明涉及作为抗凝剂有用的蛋白质。更具体地说，本发明涉及抑制血凝固和组织因子之凝血因子VII的修饰的形式。
背景技术：
：血凝固是由各种血液组分或因子的复杂的相互作用组成的过程。其最终导致产生血纤维蛋白凝块。一般来说，参与到已被称作血凝固“级联”的过程中的血液组分是酶原(proenzymes或zymogens)，在激活物作用下转化成为蛋白水解酶的酶促非活蛋白质，其本身是一种激活的凝结因子。经历了这种转化的血凝固因子被称为“活性因子”，用添加小写“a”后缀表示(例如凝血因子VIIa)。激活的凝血因子X(“Xa”)需要将凝血酶原转化成凝血酶，然后，作为形成血纤维蛋白凝块的最后阶段，凝血酶将血纤维蛋白原转化成血纤维蛋白。启动凝血因子激活作用有两种系统或途径。″内途径″指通过利用仅在血浆中存在的因子导致凝血酶形成的那些反应。一系列蛋白酶-介导的激活最终导致产生凝血因子IXa，其与凝血因子VIIIa一起使凝血因子X裂解为凝血因子Xa。在血凝固的″外途径″中，相同的蛋白水解由凝血因子VIIa和其辅因子、组织因子引起。组织因子是一种膜结合蛋白质，通常不在血浆中循环。然而，一旦脉管破坏，在钙离子和磷脂存在下，它就与凝血因子VIIa复合催化凝血因子X的激活或凝血因子IX的激活(Nemerson和Gentry，生物化学，254020-4033(1986))。在止血中两种血凝固途径的相对重要性尚不清楚，近年来发现凝血因子VII和组织因子在血凝固的调节中起着关键的作用。凝血因子VII是作为单链酶原在血液中循环的微量血浆糖蛋白。酶原是酶促非活性的(Williams等，生物化学杂志，2647536-7543(1989)；Rao等，美国科学院学报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA.)，856687-6691(1988))。单链凝血因子VII在体外可以经凝血因子Xa、凝血因子XIIa、凝血因子IXa或凝血酶转化成为双链凝血因子VIIa。凝血因子Xa被认为是凝血因子VII主要的生理激活物。与几种止血中涉及的其它血浆蛋白质一样，凝血因子VII的活性依赖于维生素K，它是多谷氨酸残基的γ-羧化所需的，所述的谷氨酸残基簇集在蛋白质的氨基末端上。这些γ-羧化的谷氨酸是凝血因子VII及磷脂的与金属相关的相互作用所需的。在裂解大约位于分子中部的内肽键时出现酶原凝血因子VII向激活的双链型分子的转化。在人类凝血因子VII中，激活裂解位点在Arg152-Ile153上(Hagen等，美国科学院学报，832412-2416(1986)；Thim等，生物化学，277785-7793(1988)，两者本文一并参考)。牛凝血因子VII由类似的Arg152-Ile153键的裂解激活(Takeya等，生物化学杂志，26314868-14877，1988)。在组织因子、磷脂和钙离子存在下，双链凝血因子VIIa经有限蛋白酶解迅速激活凝血因子X或凝血因子IX。在病人中常常需要选择性阻断凝结级联。在例如肾组织断离期间或处理深部静脉血栓、分散性血管内血凝固(DIC)和许多其它疾病的治疗中，可以使用抗凝剂，例如肝素、香豆素、香豆素衍生物，2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物或其它药剂。例如，肝素治疗或者采用柠檬酸离子的体外治疗(美国专利4,500,309)可以用于组织断离中以预防处理过程中的凝结。肝素也可以用于在接受外科手术的病人中预防深部静脉血栓形成。然而，采用肝素和其它抗凝剂的治疗具有不期望的副作用。可供使用的抗凝剂一般通过整个身体起作用，而非在凝块位点特异性地起作用。肝素可以导致例如严重的出血。而且，由于约80分钟的半衰期，肝素被迅速从血液清除，必须频繁的给药。因为肝素充当抗凝血酶III(ATIII)的辅因子，在DIC治疗中ATIII迅速被耗尽，保持适当的肝素剂量常常是困难的，必须连续不断地监控ATIII和肝素水平。如果ATIII损耗达到极点，则肝素也是无效的。此外，延长肝素的使用也增加血小板凝固和减少血小板计数，并且与骨质疏松的发展有关。2，3-二氢-1，3-茚二酮衍生物也有毒副作用。除了以上简述的抗凝剂之外，也发现几种天然产生的蛋白质具有抗凝剂活性。例如Reutelingsperger(美国专利4,736,018)从牛主动脉和人脐静脉动脉分离了抗凝剂蛋白质。Maki等(美国专利4,732,891)公开了人胎盘来源的抗凝剂蛋白质。此外，ATIII已被建议作为治疗抗凝剂(Schipper等，Lancet1(8069)854-856(1978)；Jordan，美国专利4,386,025；Bock等，美国专利4,517,294)。平滑肌细胞(SMCs)在脉管壁中的增殖是在脉管再构或对其它脉管损伤作出反应后形成动脉粥样硬化脉管损伤中的重要因素。例如动脉粥样硬化的治疗常常包括经血管成形术、动脉内膜切除术、减少的atherectomy、分流术移植和外科手术清理阻塞的脉管，其中，动脉粥样硬化症经导管插入术(血管成形术)、通过从动脉壁切除(动脉内膜切除术)的剥离法和采用天然或合成移植物的分流术来减轻和消除。这些方法除去脉管内皮，扰乱下面的内膜层和导致内侧SMCs死亡。这一损伤后，内侧SMC增殖并转移到内膜上，其特征性地出现在损伤后开始的几周到6个月，到覆盖的内皮层重新形成后停止。这些损伤由大约20％的细胞和80％细胞外基质组成。在大约30％或更多的接受血管成形术、动脉内膜切除术或分流术移植的患者中，内膜中的血栓形成和/或SMC增殖造成脉管的再闭塞，由此使再构性外科手术失败。这一外科手术后的脉管闭合被称为再狭窄。本领域仍然需要具有抗凝剂活性的改进的组合物，其可以以相对较低的剂量给药，不产生与抗凝剂组合物相关的不期望的副作用。通过提供特异性地在损伤位置起作用的抗凝剂，本发明解决了这一需要，此外，本发明还提供了其它相关的优点。发明概述本发明提供了包含具有抗凝剂性质的修饰的凝血因子VII的新组合物。所述的修饰的凝血因子VII组合物也抑制组织因子，该凝血因子VII顺序具有至少一种氨基酸修饰，其中选择所述的修饰，以实质上降低激活的凝血因子VII催化血浆凝血因子X或IX激活作用的能力，并由此能够抑制凝固活性。新的凝血因子VII具有被至少一个氨基酸取代修饰的活性位点，其修饰的形式能够结合组织因子，所述修饰的凝血因子VII组合物典型地是实质上纯化的的形式。当配制成药物组合物时，本发明的组合物在治疗患者的方法中特别有用，其可以对患有多种疾病的患者给药，以治疗血凝固相关疾病。这种修饰的凝血因子VII分子能够结合组织因子但具有实质上降低的催化凝固级联中其它因子激活作用的能力，其可以具有较长的血浆半衰期，因而与其它抗凝剂相比具有较长的抗凝剂活性。本发明组合物所适用的病症是通常用抗凝剂治疗的那些，例如，深部静脉血栓、肺栓塞、突发病、分散性血管内血凝固(DIC)、与革兰氏-阴性内毒素血症有关的肺和肾血纤维蛋白沉淀、以及心肌梗塞。所述的组合物可以用于抑制继发于机械性脉管损伤的脉管再狭窄，所说的机械性损伤例如囊血管成形术、动脉内膜切除术、减少的atherectomy、移植片固定模置入、激光治疗或rotablation引起的损伤。由此，所述的组合物可以用于抑制血小板沉淀和相关的疾病。因此，抑制血凝固、脉管再狭窄或血小板沉淀的方法包括例如用药抑制血凝固、脉管再狭窄或血小板沉淀有效量的包含修饰的凝血因子VII的组合物对病人给药，所述修饰的凝血因子VII例如具有在Ser344、Asp242和His193催化三联体(triad)中的至少一个氨基酸取代的。所述的方法也可以很好的用于在个体中治疗冠状动脉急性闭合，其包括用修饰的凝血因子VII(包括DEGR-凝血因子VII)与组织血纤维蛋白溶酶原激活物或者链激酶一起给药，所述方法也可以加速tPA诱导血的栓溶解。一般地讲，对人给药的药物组合物包括修饰的人凝血因子VII蛋白质和药学上可接受的载体和缓冲液。在人类和牛凝血因子VII的优选的实施方案中，修饰活性位点残基Ser344，以甘氨酸、蛋氨酸、苏氨酸，或更优选地以丙氨酸取代之。这一取代可以单独进行或者与在催化三联体其它位点上(包括His193和Asp242)的取代相结合。另一方面，本发明涉及包含两个可操作连接的序列编码区的多核苷酸分子，所述编码区分别编码维生素K-依赖性血浆蛋白质的前肽原(pre-propeptide)与gla区和无gla区(gladomain-less)的凝血因子VII蛋白质，表达时，所述的多核苷酸编码修饰的凝血因子VII分子，该分子不能有效地激活血浆因子X或IX，并且能够结合组织因子。由这种多核苷酸表达的修饰的凝血因子VII分子是生物学活性的抗凝剂，即，它能够抑制血凝固级联和因此形成的血纤维蛋白沉淀或者凝块。为了表达修饰的凝血因子VII，将所述的多核苷酸分子转染进哺乳动物细胞系，例如，BHK、BHK570或293细胞系。附图简要说明图1说明Ser344Ala修饰的凝血因子VIIDNA序列的表达载体的构建。所使用的符号包括0-1，得自腺病毒5的0-1限制图单位序列；E，猿猴病毒40增强子；MLP，腺病毒2主要晚期启动子；SS，一组剪切位点；和pA，得自猿猴病毒40的后面的聚腺苷酸化信号。图2显示与盐水处理对照比较，对切除动脉内膜的狒狒主动脉大剂量注射DEGR-凝血因子VIIa对血栓形成(血小板沉淀)的作用。在60分钟内测量动脉。在这一急性脉管损伤的灵长类模型中，DEGR-凝血因子VIIa很好地抑制富血小板血栓的发展。图3显示狒狒平滑肌细胞与增加浓度的VIIa(空心方框)或DEGR-VIIa(在恒定量的VIIa(5nM)存在下)(实心方框)一起培养时获得的结果。其后利用产色底物S-2222测定X激活水平。数据以在5nMVIIa单独存在下产生的百分活性为酰胺分解活性给出的。图4描述与对照动物比较，颈动脉动脉内膜切除和用DEGR-凝血因子VIIa治疗7或30天后狒狒内膜区的大小。图5说明在气囊损伤和以DEGR-凝血因子VIIa治疗后，狒狒股动脉内膜区对内膜+血管中层区的比率，其中对照组包括5个脉管，7天治疗检查11个脉管，30天治疗检查2个脉管(N检查的脉管数量)。特定实施方案的描述本发明提供了具有抗凝剂活性的新的修饰的凝血因子VII。所述的修饰的凝血因子VII可以是酶原的形式(即单链分子)或者可以在其激活位点切开。这样，所谓“修饰的凝血因子VII”包括结合组织因子并且抑制凝血因子IX至IXa和凝血因子X至Xa激活作用的修饰的凝血因子VII和修饰的凝血因子VIIa分子。修饰的凝血因子VII的组合物适于对各种哺乳动物(特别是人类)给药，以抑制凝结级联。修饰的凝血因子VII也可以与其它抗凝剂化合物一起对病人给药或替代其它抗凝剂化合物。凝血因子VII在凝结级联中具有重要的作用，特别是其涉及到所述的外途径。作为失活的单链酶原蛋白质存在于循环血浆中的凝血因子VIIa一旦被激活，就与组织因子和钙离子一起激活凝血因子X至Xa和激活凝血因子IX至IXa，最后形成血纤维蛋白凝块。通过由凝血因子VIIa阻止或者是以其它方式抑制凝血因子X和IX，本发明的组合物提供了抑制血凝固级联中系列事件的能力。本发明的凝血因子VII蛋白质具有催化位点，其可被修饰以降低凝血因子VIIa的催化活性，但分子保留结合组织因子的能力。修饰的凝血因子VII分子就结合组织因子与天然凝血因子VII和/或VIIa竞争。结果，凝血因子X和IX的激活受到抑制。在本发明的一个方面，凝血因子VIIa的催化活性被催化中心或三联体的化学衍生抑制。衍生化作用可以通过例如将凝血因子VII与不可逆抑制剂反应或者经酰化来完成。所述的不可逆抑制剂例如有机磷(organophosphor)化合物、磺酰氟化物，肽卤甲基酮，以及氮杂肽(azapeptide)。优选的肽卤甲基酮包括PPACK(D-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮；参见美国专利4,318,904，本文一并参考)，D-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸和苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮；和DEGRck(丹磺酰-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲基酮)。另一个方面，凝血因子VIIa的催化活性也可以通过取代、插入或缺失氨基酸受到抑制。在优选的实施方案中，氨基酸的取代在凝血因子VII催化三联体(本文限定为包含对凝血因子VIIa催化位点起作用的氨基酸区)的氨基酸序列中进行，在催化三联体中的取代、插入或者缺失一般在形成催化位点的氨基酸上或其相邻的氨基酸上。在人类和牛凝血因子VII蛋白质中，形成催化″三联体″的氨基酸是Ser344，Asp242和His193(下标数字表示在序列中的位置)。其它哺乳动物物种的凝血因子VII中的催化位点可以采用目前可利用的技术确定，这些技术中包括蛋白质分离和氨基酸序列分析。催化位点也可以通过把序列与其它丝氨酸蛋白酶序列对比来确定，所述蛋白酶特别是胰凝乳蛋白酶，其活性位点已被确定(Sigler等，分子生物学杂志，35143-164(1968)，本文一并参考)，因此从所说的序列对比确定类似的活性位点残基。进行氨基酸的取代、插入或者缺失，以便阻止或以其它方式抑制凝血因子X和/或IX被凝血因子VIIa激活。如此修饰的凝血因子VII也应该保持在血凝固级联中就结合组织因子与原始凝血因子VII和/或凝血因子VIIa竞争的能力。这种竞争可以容易地通过例如本文描述的凝固测定，或者采用例如具有细胞表面组织因子之细胞系(如人类膀胱癌细胞系J82)的竞争结合测定确定。(Sakai等，生物化学杂志，2649980-9988(1989)，本文一并参考)。凝血因子VII中形成催化位点的氨基酸，如在人类和牛凝血因子VII中的Ser344、Asp242和His193可以被取代或被缺失。在本发明内，仅改变单个氨基酸是优选的。这样最大限度地减少增加分子的抗原性的可能性或抑制其结合组织因子的能力，然而也可以进行两个或更多个氨基酸改变(取代，添加或缺失)，或者也可以同时进行取代、添加和缺失。在人类和牛凝血因子VII的一个优选的实施方案中，Ser344较好的是由丙氨酸取代，但是甘氨酸、蛋氨酸、苏氨酸或其它氨基酸能将被取代。用谷氨酸取代天冬氨酸和用赖氨酸或精氨酸取代组氨酸是优选的。一般来说，选择的取代要尽可能小地破坏三级蛋白质结构。本文一并参考的Dayhoff等的模型(在1978蛋白质结构图谱中，Nat’lBiomed.Res.Found.，华盛顿D.C.)可以用来指导选择其它氨基酸取代。人们可以按以上所述在人类、牛或其它物种的合适的凝血因子VII序列之催化位点中引入残基改变，并如本文的描述就催化活性的抑制的所需水平和形成的抗凝剂活性对所形成的蛋白质进行试验。对修饰的凝血因子VII而言，其催化活性实质上受到抑制，其催化活性一般不到相应物种野生型凝血因子VII的约5％，更优选是不到约1％。本发明的蛋白质可以通过采用重组体DNA技术产生。一般来说，修饰克隆的野生型凝血因子VIIDNA序列以编码所需的修饰蛋白质。然后，将这种修饰的序列插入到表达载体中，并依次将其转化或者转染进宿主细胞。高等真核细胞(特别是培养的哺乳动物细胞)作为宿主细胞是优选的。人类凝血因子VII完整的核苷酸和氨基酸的序列是已知的。参见美国专利4,784,950，本文一并参考，其中描述了重组人类凝血因子VII的克隆与表达。Takeya等，生物化学杂志，26314868-14872(1988)描述了牛凝血因子VII序列，本文一并参考。可以用各种技术完成氨基酸序列的改变。可以用位点特异性诱变进行DNA序列的修饰。诱变位点特异性技术是本领域已知的，例如由Zoller和Smith(DNA3479-488，1984)描述。这样，利用凝血因子VII的核苷酸和氨基酸序列，可以引入选择的变化。根据本发明的修饰的凝血因子VII包括这样一些蛋白质，其具有由维生素K-依赖性血浆蛋白质凝血因子IX、凝血因子X、凝血酶原、蛋白质C、蛋白质S或蛋白质Z之一的gla区取代的氨基末端部分(gla区)。维生素K-依赖性血浆蛋白质的gla区的特征是存在γ羧基谷氨酸残基，并且一般长度为约30到约40个氨基酸，其具有相应于各基因外显子-内含子界线位置的C-末端。美国专利4,784,950(本文一并参考)公开了产生具有异源gla区的凝血因子VII的方法。用于本发明的DNA序列典型地编码凝血因子VII蛋白质氨基-末端上的前肽原，以获得适当的转移后加工(例如，谷氨酸残基的γ-羧化作用)和从宿主细胞分泌。所述前肽原可以是凝血因子VII或其它维生素K-依赖性血浆蛋白质(如凝血因子IX、凝血因子X、凝血酶原、蛋白质C或蛋白质S)的。本领域技术人员明白，可以在修饰的凝血因子VII的氨基酸序列中进行其它修饰，其中这些修饰不明显削弱所述蛋白质作为抗凝剂的能力。例如在催化三联体中修饰的凝血因子VII也可被在激活断裂位点中修饰，以抑制酶原凝血因子VII转化成其激活的双链形式，如美国专利5,288,629(本文一并参考)中所描述的。用于实施本发明的表达载体包含能够控制克隆基因或cDNA转录的启动子。用于培养哺乳动物细胞的优选的启动子包括病毒启动子和细胞启动子。病毒的启动子包括猿猴病毒40启动子(Subramani等，分子细胞生物学，1854-864，1981)和CMV启动子(Boshart等，细胞，41521-530，1985)。一个特别优选的病毒启动子得自腺病毒2的主要晚期启动子(Kaufman和Sharp，分子细胞生物学，21304-1319，1982)。细胞启动子包括小鼠卡巴粒基因启动子(Bergman等，美国科学院学报，817041-7045，1983)和小鼠VH启动子(Loh等，细胞，3385-93，1983)。一个特别优选的细胞启动子是小鼠金属硫蛋白-I启动子(Palmiter等，科学，222809-814，1983)。表达载体也可以包含位于凝血因子VII序列自身启动子下游和插入位点上游的一组RNA剪切位点。优选的RNA剪切位点也可以从腺病毒和/或免疫球蛋白基因获得。也包含在表达载体中的是位于插入位点下游的聚腺苷酸化信号。特别是优选的聚腺苷酸化信号包括猿猴病毒40的早期或晚期聚腺苷酸化信号(Kaufman和Sharp，同上)、腺病毒5E1b区的聚腺苷酸化信号、人生长激素基因终止子(DeNoto等，核酸研究，93719-3730，1981)或人类凝血因子VII基因或牛凝血因子VII基因的聚腺苷酸化信号。所述的表达载体也可以包括非编码性病毒前导序列(如位于启动子和RNA剪切位点之间的腺病毒2三联前导序列)和增强子序列(如猿猴病毒40增强子)。克隆的DNA序列也被引入进培养的哺乳动物细胞中，所采用的方法例如，磷酸钙-介导的转染(Wigler等，细胞，14725-732，1978；Corsaro和Pearson，体细胞遗传学，7603-616，1981；Graham和VanderEb，病毒学，52d456-467，1973)或电穿孔(Neumann等，EMBO杂志，1841-845，1982)。为了鉴别和选择表达外源DNA的细胞，一般将赋予选择性表型(选择性标记)的基因与兴趣cDNA基因一同引入到细胞中。优选的选择性标记包括赋予药物(如新霉素，潮霉素和氨甲蝶呤)抗性的基因。所述的选择性标记可以是可扩增的选择性标记。一个优选的可扩增的选择性标记是二氢叶酸还原酶(DHFR)序列。Thilly(哺乳动物细胞技术，Butterworth出版社，Stoneham，MA，本文一并参考)综述了选择性标记。对选择性标记的选择完全在本领域技术人员的知识范围内。选择性标记可以用分开的质粒与兴趣基因同时引入到细胞中，或者它们也可以引入到相同的质粒中。如果在相同的质粒中，则选择性标记和所述的基因可以受不同的启动子控制。后一排列产生双顺反子(dicistronic)信息。这种类型的构建体是本领域已知的(例如，Levinson和Simonsen，美国专利4,713,339)。将被称为″载体DNA″的附加DNA添加到引入进细胞的混合物中也是有利的。在细胞取得DNA后，使它们在适当的生长培养基中生长，典型地是生长1-2天，以使其开始表达兴趣基因。本文使用的术语“适当的生长培养基”指包含营养物和细胞生长和修饰的凝血因子VII基因表达所需的其它组分的培养基。培养基一般包括碳源、氮源、必需氨基酸、必需糖、维生素、盐类、磷脂、蛋白质和生长因子。对γ-羧化的修饰的凝血因子VII的产生而言，所述的培养基包含维生素K，优选的浓度是大约0.1微克/毫升到大约5微克/毫升。然后药物选择用于以稳定的方式表达选择性标记之细胞的生长选择。对已由可扩增的选择性标记转染的细胞而言，可以增加药物浓度，以选择增加的克隆序列的拷贝数，进而增加表达水平，接着就修饰的凝血因子VII的表达筛选稳定转染细胞的克隆。用于本发明的优选的哺乳动物细胞系包括COS-1(ATCCCRL1650)，幼仓鼠肾(BHK)和293(ATCCCRL1573；Graham等，J.Gen.Virol.3659-72，1977)细胞系。一个优选的BHK细胞系是tk-ts13BHK细胞系(Waechter和Baserga，美国科学院学报，791106-1110，1982，本文一并参考)，本文此后称作BHK570细胞。BHK570细胞系已以ATCC保藏号CRL10314保藏在美国典型培养物保藏中心，12301ParklawnDr.，Rockville，MD20852。tk-ts13BHK细胞系可以以保藏号CRL1632从ATCC获得。此外，一些其它细胞系可以用于本发明中，这些细胞系包括大鼠HepI(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1600)、(大鼠HepII(大鼠肝细胞瘤；ATCCCRL1548)、TCMK(ATCCCCL139)、人肺(ATCCHB8065)、NCTC1469(ATCCCCL9.1)、CHO(ATCCCCL61)和DUKX细胞(Urlaub和Chasin，美国科学院学报，774216-4220，1980)。在本发明内，转基因动物技术可以用于产生修饰的凝血因子VII。在宿主雌性哺乳动物乳腺内产生所述的蛋白质是优选的。在乳腺中表达和接下来目标蛋白质分泌到奶中克服了从其它来源分离蛋白质的所遇到的许多困难，奶容易被收集，可大量获得，完全确定了其生物化学特征。而且，主要的奶蛋白质以高浓度(典型地从大约1至15g/l)存在于奶中。从商业观点看，很明显，较好的是采用大量产奶的物种作为宿主细胞。但可以使用较小的动物，如小鼠和大鼠(在证据和原理上是优选的)。在本发明的范围内，使用家畜哺乳动物(包括但不限于猪、山羊，绵羊和牛)是优选的。绵羊是特别优选的，这是由于在这一物种上原先具有转基因的历史，以及奶产量、价格和收集绵羊奶的设备易于获得等因素。参见WIPO公开WO88/00239中有关影响宿主物种选择的因素的比较。一般来说，选择已用于乳酪农场饲养的宿主动物(如EastFriesland绵羊)品种，或者经后期繁殖转基因种系引入乳酪农场品种中是比较理想的。在任何情况下，应使用已知的健康状况良好的动物。为了获得在乳腺中表达，使用源于奶蛋白质基因的转录启动子。奶蛋白质基因包括那些编码酪蛋白(参见美国专利5,304,489，本文一并参考)、β-乳球蛋白、a-乳清蛋白和乳清酸性蛋白的基因。β-乳球蛋白(BLG)启动子是优选的。在羊β-乳球蛋白基因的情况下，一般使用该基因的5’侧翼序列的至少近接的406bp的区。虽然5’侧翼序列的更大的部分(至大约5kbp)是优选的，如包含β-乳球蛋白基因5’侧翼启动子和4.25kbpDNA片断。参见Whitelaw等，生物化学杂志，28631-39(1992)。其它物种启动子DNA的类似片段也是合适的。β-乳球蛋白基因的其它区也可以掺合进构建体中，因为可以有被表达的基因组区。缺乏内含子的构建体是本领域可接受的，例如，与包含这种DNA序列的那些构建体比较表达及低的构建体(参见Brinster等，美国科学院学报，85836-840(1988)；Palmiter等，美国科学院学报，88478-482(1991)；Whitelaw等，转基因研究，13-13(1991)；WO89/01343；以及WO91/02318，各文献本文一并参考)。在这一点上，如有可能，利用包含编码目标蛋白质或多肽之基因的所有或部分天然内含子的基因组序列一般是优选的，由此，还至少包含某些(例如β-乳球蛋白基因的)内含子是优选的。一种这样的区是源于羊β-乳球蛋白基因3’非编码区的提供内含子剪切和RNA聚腺苷酸化的DNA片断。当取代基因的天然3’非编码序列时，这种羊β-乳球蛋白片断能提高和稳定目标蛋白质或多肽的表达水平。在其它实施方案中，修饰的凝血因子VII序列的起始ATG周围的区由奶特异性蛋白质基因的相应的序列替代。这样的替代提供了提高表达的推定的组织-特异性起始环境。用例如BLG基因取代完整的修饰的凝血因子VII的预-前(pre-pro)和5’非编码序列是方便的，虽然更小的区可以被取代。对于修饰的凝血因子VII在转基因动物中的表达而言，编码修饰的凝血因子VII的DNA片断可操作连接到其表达所需的与附加DNA片段上，以产生表达单位。这样的附加片断包括以上提及的启动子以及提供mRNA转录终止和聚腺苷酸化的序列。所述的表达单位还包括编码分泌信号序列DNA片断，其可操作连接到编码修饰的凝血因子VII的片段上。所述的分泌信号序列可以是一种天然凝血因子VII分泌信号序列，或者可以是其它蛋白质的所述序列，所述蛋白质例如奶蛋白质，参见，例如，vonHeinje，核酸研究，144683-4690(1986)；和Meade等，美国专利4,873,316，两者本文一并参考。提供将修饰的凝血因子VII序列插入到包含附加DNA片段的质粒或噬菌体载体中可以方便地进行用于转基因动物的表达单位的构建，尽管可以经实质上任何序列的连接构建表达单位。提供包含编码奶蛋白质的DNA片段的载体和用修饰的凝血因子VII多肽的编码序列替代奶蛋白质的编码序列(从而产生基因融合体，该融合体包含奶蛋白质基因的表达控制序列)是特别方便的。在任何情况下，在质粒或其它载体中克隆表达单位有利于扩增修饰的凝血因子VII序列。扩增可以在细菌(例如大肠杆菌)中方便的进行，因此，所述的载体典型地包括在细菌宿主细胞中功能性的复制起点和选择标记。然后，将表达单位引入进所选择的宿主物种的受精卵(包括早期胚胎)。异源DNA的引入可以经几种途径之一来完成，所述的方法包括微注射(例如，美国专利4,873,191)，逆转录病毒感染(Jaenisch，科学，2401468-1474(1988))或者是利用胚干(ES)细胞的位点-定向整合(Bradley等，生物技术，10534-539(1992))。将所述卵移植进假妊娠输雌性动物的输卵管或子宫中，使其发育至足月。在其种系中携带有所引入的DNA的后代按孟德尔法则一般可以将该DNA遗传给其子代，使转基因兽群生长繁殖。产生转基因动物的一般方法是本领域已知的。参见，例如，Hogan等，操作小鼠胚实验室手册，冷泉港实验室，1985；Sirnons等，生物技术6179-183(1988)；Wall等，生物学报告，32645-651(1985)；Buhler等，生物技术，8140-143(1990)；Ebert等，生物技术，9835-838(1991)；Krimpenfort等，生物技术，9844-847(1991)；Wall等，细胞生物化学杂志，4911.3-120(1992)；美国专利4,873,191和4,873,316；WIPO公开WO88/00239，WO90/05188，WO92/11757；和GB87/00458，这些文献本文一并参考。用于引入外源DNA序列到哺乳动物和其种系细胞的技术最初在小鼠中开发，参见例如，Gordon等，美国科学院学报，777380-7384(1980)；Gordon和Ruddle，科学，2141244-1246(1981)；Palmiter和Brinster，细胞，41343-345(1985)；Brinster等，美国科学院学报，824438-4442(1985)；和Hogan等(同上)。这些技术后来被采用到较大动物上，包括家畜类物种(参见例如，WIPO公开WO88/00239，WO90/05188和WO92/11757；和Simons等，生物技术，6179-183(1988)。为了总结出现今用于产生转基因小鼠或家畜最有效的途径，按照已建立的技术将几百个兴趣DNA线性分子注射到受精卵前核之一中。也可以将DNA注射进接合子的细胞质中。转基因植物的产生方法也可以采用。表达可以是全部的或针对特定器官(例如块茎)的。参见Hiatt，自然，344469-479(1990)；Edelbaum等，干扰素研究杂志，12449-453(1992)；Sijmons等，生物技术，8217-221(1990)；和欧洲专利公开EP255378。按照本发明产生的修饰的凝血因子VII可以在抗凝血因子VII抗体柱上经亲和色谱纯化，如Wakabayashi等，生物化学杂志，26111097-11108(1986)和Thim等，生物化学，277785-7793，(1988)(本文一并参考)所述使用钙依赖性单克隆抗体是特别优选的。也可以经常规的化学方法进行进一步的纯化，所述的方法例如高效液相色谱法。其它纯化方法，包括柠檬酸钡沉淀法是本领域已知的，可以用于纯化本发明的新的修饰的凝血因子VII(一般性的情况参见，Scopes，R.，蛋白质纯化，Springer-Verlag，N.Y.，1982)。对药物上的用途而言，至少约90-95％同质性的实质上纯化的修饰的凝血因子VII是优选的，98-99％或更高的同质性是更优选的。一旦部分纯化或纯化至所需的同质性，修饰的凝血因子VII就可以用于治疗中。在本发明的实施方案中，将修饰的凝血因子VII在其激活位点裂解使其转化成双链形式。可以按本领域已知的的方法进行激活，所述方法例如以下文献公开的方法Qsterud等，生物化学，112853-2857(1972)；Thomas，美国专利4,456,591；Hedner和Kisiel，J.Clin.Invest.711836-1841(1983)；或Kisiel和ujikawa，BehringInst.Mitt.7329-42(1983)，这些文献本文一并参考。然后，按以下描述将形成的分子配制成药物和进行给药。本发明的修饰的凝血因子VII分子和其药物组合物在给药于人以治疗涉及脉管内凝结的多种疾病上特别有用。例如，尽管可以用常规的抗凝剂治疗深部脉管血栓症和肺栓塞，但本文所描述的修饰的凝血因子VII可以用于在鉴别为高风险病人(例如接受外科手术的那些病人和具有充血性心脏病的病人)中预防血栓栓塞并发症的出现。此外，修饰的凝血因子VII可以作为抗凝剂用于组织因子介导的血凝固的诱导，由此阻断凝血酶的产生和后续的血纤维蛋白的沉淀。由此，修饰的凝血因子VII可以用于抑制组织因子活性，导致例如抑制血凝固、血栓形成血小板沉淀。本发明的修饰的凝血因子VII在治疗内膜增生或由急性脉管损伤引起的再狭窄上特别有用。急性脉管损伤与长期发展的慢性损伤(例如动脉硬化症)相反，是迅速发作的那些(即几天到几个月)。急性脉管损伤常常需要外科方法治疗，其中采用血管成形术、动脉内膜切除术、atherectomy、脉管移植物置入等。作为对移植物置入和器官移植的反应，也可以出现增生。因为修饰的凝血因子VII比肝素更具有选择性，一般仅结合暴露在损伤位点的组织因子，并且因为修饰的凝血因子VII不消除其它血凝固蛋白质，所以当预防性地用于预防深部脉管血栓形成时，其比肝素更有效或有较少引起出血并发症的可能性。用于预防深部脉管血栓形成的修饰的凝血因子VII的剂量对70公斤病人而言，在约50微克到500毫克/天，更典型地是在约1毫克到200毫克/天，更优选的是约175毫克/天的范围内，至少应在外科手术前约6小时开始给药，并至少持续到病人能走动。治疗再狭窄的修饰的凝血因子VII的剂量随不同的病人而变化，但一般在以上所建议的那些的范围内。治疗冠状血管病上最近的进展包括，为了使足够的血流再度通过冠状动脉，对除去的或移去的讨厌的血小板物质进行机械性处理。尽管采用多种形式的机械性处理，这些技术的有效性在治疗后6个月内限制在约40％再狭窄率内，所述的机械性处理包括囊血管成形术、减少的atherectomy、脉管移植片固定模置入、激光治疗或rotoblator。再狭窄被认为是复杂的生物学过程的相互作用的结果，这些过程包括血小板沉淀和血栓形成，趋化性及致有丝分裂的因子的释放，脉管平滑肌细胞迁移和增殖至膨胀的动脉区段的内膜上。在人类患者中，在机械性损伤位点上的血小板积累的抑制作用可以限制再狭窄的比率。单克隆抗体对血小板GpIIb/IIIa的治疗性使用可以在人类患者中限制再狭窄的水平(Califf等，N.Engl.J.Med.，330956-961(1994))。抗体能够结合到血小板表面上的GpIIb/IIIa受体上。这些信息说明在人类冠状动脉中在机械性损伤位点上的血小板积累的抑制作用有利于最终发生的愈合反应。血小板的累积出现在急性脉管损伤的位点上，在这些位点上的凝血酶的产生可以是对血小板激活和其后续累积的反应。如实施例中所显示的，本发明的修饰的凝血因子VII能够结合固定细胞表面组织因子。例如DEGR-凝血因子VIIa以与野生型凝血因子VIIa相等的或更高的亲和性结合细胞表面组织因子。然而，DEGR-凝血因子VIIa没有酶促活性，它也结合组织因子，同时充当野生型凝血因子VIIa的竞争性拮抗剂，由此抑制导致凝血酶产生的血凝固外途径中的后续步骤。保持组织因子结合活性的本发明的修饰的因子VII分子通过阻断凝血酶产生和后续的血纤维蛋白的沉淀在脉管损伤位点抑制血小板积累。由于DEGR-凝血因子VII在急性脉管损伤位点阻断凝血酶产生和限制血小板沉淀的能力，保持组织因子结合活性但缺乏凝血因子VIIa酶促活性的本发明的修饰的因子VII分子可以用于抑制脉管再狭窄。这样，本发明的组合物和方法具有多种用途，例如，在冠状或外周脉管疾病治疗中，在对除去的或移去的讨厌的血小板物质进行处理特别是机械性处理后，其特别有用，如与以下方法结合使用或在它们之后使用囊血管成形术、减少的atherectomy、脉管移植片固定模置入、激光治疗或rotoblation等。所述的化合物典型地是在进行所述的处理前24小时内给药，此后给药7天或更长的期限。可以采用本文将进一步描述的多种方法给药。本发明的化合物可以全身性给药或在脉管移植物置入(例如经包覆合成的或修饰的天然动脉脉管移植物)、在接合位点、动脉内膜切除术(典型地是颈动脉动脉内膜切除术)、分流术移植等中局部给药。修饰的因子VII和VIIa在抑制与器官移植有关的(例如，骨髓移植后)内膜增生、加速的动脉粥样硬化和静脉堵塞疾病上也有用。在治疗形成的深部静脉血栓症和/或肺栓塞中，对70千克病人，修饰的因子VII的剂量范围是以约50微克到500毫克/天，更典型的是1毫克到200毫克/天，更优选的是10毫克到约175毫克/天为给药和维持剂量，取决于病人的重量和疾病的严重程度。由于输注修饰的凝血因子VII引起出血并发症的低的可能性，在结合血栓切除术或者栓子切除术的外科手术期间或之后，可以用修饰的凝血因子VII替代肝素或降低其剂量。本发明的修饰的凝血因子VII组合物在预防心原性栓子上和在治疗血栓形成的中风上也具有实质性的用途。由于其引起出血并发症的低的潜力和其选择性，修饰的凝血因子VII可以给予到中风病人，并且可以预防堵塞的动脉血栓的扩展。给药的修饰的凝血因子VII的量将随不同的病人变化，取决于中风的性质和严重程度，但一般在以下所建议的剂量范围内。本发明提供的包含DEGR-凝血因子VII的修饰的凝血因子VII药物组合物在急性心肌梗塞的治疗中是有用的，这是由于修饰的凝血因子VII具有体内抑制血凝固的能力。在心肌梗塞的急性阶段，修饰的凝血因子VII可以作为佐剂与纤溶酶原激活物或链激酶一起给药，并可以加速TPA-诱导的血栓溶解。在心肌梗塞的治疗中，对70千克病人而言，对病人的给药剂量是以至少约50微克到500毫克/天，更典型的是1毫克到200毫克/天，更优选的是10毫克到约175毫克/天为给药和维持剂量。修饰的凝血因子VII在给药溶解血栓剂如组织血纤维蛋白溶酶原激活物之前给药，或与其一起给药或在其给药之后不久给药。本发明的修饰因子VII在治疗分散性血管内血凝固(DIC)和其它与革兰氏阴性菌血症相关的其它疾病中是有用的，具有DIC特征的病人具有广泛分布的微循环血栓，并常常存在严重的出血现象(其导致必要的凝固因子的消耗)。由于其选择性，修饰的凝血因子VII不加重与DIC有关的出血现象，这一点与常规的抗凝剂一样，但它阻碍或者是抑制附加的微脉管血纤维蛋白沉淀的形成。这样，本发明的修饰的因子VII，包括DEGR-凝血因子VII和DEGR-VIIa，在抑制与内毒素血症和内毒素休克有关的血纤维蛋白沉淀并且由此也节制革兰氏-阴性菌血症的作用中有用。DEGR-凝血因子VIIa显示出在兔中证明对阻断血纤维蛋白在肾和肺中沉淀有剂量反应性作用，在狒狒中延长被治疗的动物的存活。在急性菌血症、毒素血症或者是DIC病人的情况下，对70千克病人而言，给药给病人的负荷剂量是至少约50微克到500毫克/天，更典型的是1毫克到200毫克/天，更优选的是10毫克到约175毫克/天，此后对70千克病人而言的维持剂量在50微克到500毫克/天，典型地是1毫克到200毫克/天。所述的药物组合物对预防性和/或治疗性治疗而言，预期肠胃外或局部给药。优选地，所述药物组合物肠胃外给药，例如，静脉内、皮下或肌内给药。由此，本发明提供了供肠胃外给药的组合物，其包括溶解在可接受的载体(优选的是含水载体)中的修饰的凝血因子VII的溶液。可以使用多种含水载体，例如，水、缓冲水、0.4％盐水、0.3％甘氨酸等。修饰的凝血因子VII分子也可以配制成供运送或者导向到损伤位点上的脂质体制剂。脂质体制剂在例如美国专利4,837,028、美国专利4,501,728、和美国专利4,975,292(本文一并参考)中有一般性地描述。所述组合物可以由经常规的已知的灭菌技术灭菌。所形成的含水溶液可被包装供使用，或者在无菌条件下被过滤和冷干，冷干制剂在给药前与无菌水溶液混合。所述组合物可以包含药学上可接受的接近生理条件所需的辅助物质，如pH值调节和缓冲剂、张力调节剂等，例如，醋酸钠、乳酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙等。修饰的因子VII在这些制剂中的浓度可以广泛地变化，例如，从重量百分比低于0.5％，通常在或至少1％到高达20％，主要按照所选择的特定的给药模式根据液体体积和粘度等选择。这样，一种典型的供静脉内输注的药物组合物可以制备成包含250毫升无菌林格氏溶液和10毫克修饰的凝血因子VII。实际制备可肠胃外给药的混合物的方法是本领域技术人员已知的，详细的内容在例如以下文献中有描述Remington’s药物科学，第16版，Mack出版公司出版，Easton，PA(1982)，本文一并参考。包含修饰的凝血因子VII分子的组合物可给药，以便进行预防性地或治疗性地治疗。在治疗性地使用时，以足以治疗或至少部分阻止疾病和其并发症的量给患有如上所述的疾病的病人给药。足以完成这一目标的量被定义为”治疗有效量”，这一用途有效的量取决于疾病或损伤的严重程度和病人的重量和总的状态，但对70千克病人而言，一般的范围从大约0.05毫克至大约500毫克/天修饰的因子VII，更普遍地使用大约1.0毫克到大约200毫克/天修饰的因子VII的剂量。必须记住本发明的物质一般可用于严重的疾病或损伤状态，即，有生命危险或潜在的生命危险的情形。在这样的情况，鉴于最小化地存在外源物质和修饰的人凝血因子VII缺乏免疫原性，治疗医生实质上用过量的修饰的凝血因子VII组合物给药是可能的和可能是合乎需要的。在预防性使用中，将包含修饰的凝血因子VII的组合物对易患或具有患所述疾病或损伤的病人给药，以增强病人抗凝结的能力。这种量被定义为“预防有效量”。在这样的使用中，准确的量也取决于病人的健康状况和体重，但一般的范围是每70千克体重从大约0.05毫克至大约500毫克，更普遍地使用大约1.0毫克到大约200毫克。可以按治疗医生选择的剂量水平和给药方式单次或多次给药所述的组合物。对于能步行的患者需要日维持水平，所述的修饰的凝血因子VII可以经例如便携式泵连续输注。也可以进行修饰的凝血因子VII的局部运送，例如，经灌注、双囊导管、移植片固定模、掺合进脉管移植物或移植片固定模、用于包覆囊导管的水凝胶或其它已知的方法。在任何情况下，所述的药物制剂应提供足以有效治疗病人的本发明的修饰的凝血因子VII的量。以说明性方式而不是以限制性方式给出下列实施例。实施例ISer344→Ala344因子VII的表达为了产生Ser344→Ala344因子VII活性位点突变体，用XbaI和KpnI消化质粒FVII(565+2463)/pDX(美国专利4,784,950本文一并参考；以保藏号40205保藏在美国典型培养物保藏中心)，然后回收所形成的0.6kb的片段，该片段包含丝氨酸344编码区。如附图所示，将这一片段克隆进XbaI，KpnI-消化的M13mp19中。一般按照标准方法(按例如Maniatis等，分子克隆实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，N.Y.(1982)(本文一并参考)所描述的，)进行这一操作和以下描述的后续步骤。利用诱变低聚核苷酸ZC1656(5’TGGGCCTCCGGCGTCCCCCTT3’)和″通用″第二引物ZC87(5’TCCCAGTCACGACGT3’)，按照Zoller和Smith(同上)的方法在M13模板上进行诱变。采用激酶(kinased)ZC1656筛选反应产物，挑取阳性噬斑，从在1077上的的PstI位点到在1213上的KpnI位点制备模板DNA并测序。序列分析证实存在所需的突变。该突变体克隆指定为1656。然后用克隆1656构建表达载体，从载体M13以约0.14kbPstI-KpnI片段分离诱变的序列。如图所示，将这一片段连接到FVII(565+2463)/pDX的1.7kbHindIII-XbaI片段、FVII(565+2463)/pDX的0.5kbXbaI-PstI片段和FVII(565+2463)/pDX的4.3kbKpnI-HindIII片段上。所需突变序列的存在由以下方法证实用PstI消化突变体和野生型克隆，用KpnI和XbaI消化M13中的突变凝血因子VII插入物，制备消化DNA的Southern印迹，用放射性标记的ZC1656探查印迹。用1656表达载体的两个分离物(指定为#544和#545)转染幼仓鼠肾细胞系BHK570(以保藏号10314保藏在美国典型培养物保藏中心)。通过将BHK570细胞的铺满的10cm平板1∶10稀释到5个非选择性培养基中的10cm平板上，所述培养基是包含10％胎牛血清和1％PSN抗生素混合物〔GIBCOLifeTechnologies，Gaithersburg，MD〕的Dulbecco改进的Eagle’s培养基(DMEM)。在24小时之后，当细胞铺满20-30％时，将它们用编码1656突变的表达载体的分离物，质粒p486共转染，所述载体包含腺病毒5ori、SV40增强子、腺病毒2主要晚期启动子、腺病毒2三联前导序列、5’和3’剪切位点、pML-1中的DHFRrcDNA和SV40聚腺苷酸化信号(Lusky和Botchan，自然，293，79-81(1981)，如表1所示。将DNA添加到15毫升试管中，然后添加0.5毫升2XHepes(25gHepes，40gNaCl，1.8gKCl，0.75gNa2HPO42H2O，5g葡萄糖，用蒸馏水稀释成2.5升，将pH调节至6.95-7.0)，混合试管。通过添加0.5ml0.25MCaCl2沉淀，同时用巴氏吸管经DNA/Hepes溶液通入空气。然后涡旋试管，在室温下温育15分钟，并再涡旋。用吸管将DNA混合物逐滴添加到细胞平板上。使平板成漩涡，并在37℃培养4-6小时。培养后，向各板添加2毫升用三盐水(0.375gKCl，0.71gNa2H2PO4，8.1gNaCl，3.0gTris-HCl，0.5g蔗糖，以总体积1升稀释，pH调节至7.9)稀释的20％甘油。使平板成漩涡，置于室温下2分钟。然后从平板上除去培养基，并用2毫升三盐水替换。将平板置于室温下2分钟，然后除去三盐水，用10毫升非选择性培养基替代。将平板在37℃培养2天。表1转染*544545544对照545对照质粒名称克隆54415μl---15μl---克隆545---30μl---30μlp4861.5μl1.5μl------载体DNA1.6μl1.6μl1.6μl1.6μl*使用的DNA浓度是克隆544，0.7μg/μl；克隆545，0.3μg/μl；p486，1.49μg/μl。在两天培养之后，以选择培养基(包含10％透析胎牛血清，1％PSN抗生素混合物和150nM氨甲蝶呤的DMEM)稀释细胞，并以1∶100、1∶250和1∶500稀释度在大平板上平板接种。将平板在37℃培养一周。一周后改变培养基，用选择培养基替代，检查平板的菌落形成。在菌落形成8天后，从#544和#545转染平板的1∶5000稀释平板随机选择12个菌落。将各克隆平板接种到6孔平板的一个孔中，在选择培养基中生长。7天后，长满平板，将各克隆分开到选择培养基的10cm平板上。用35S-乙硫氨酸-半胱氨酸蛋白质标记混合物(NENDuPont生物技术系统，Wilmington，DE)代谢标记转染过以表达野生型凝血因子VII的以上所述的克隆和对照细胞。在选择培养基中使克隆生长并制备来供脉冲标记实验。用磷酸盐缓冲盐水(Sigma，St.Louis，MO)冲洗细胞，在20μCi/ml35S-Cys-35S-Met中脉冲4小时。4小时后，收获上清液和细胞。基本上按Lenk和Penman(细胞，16289-302，(1979))的方法裂解细胞，400微升各裂解物用50微升葡萄球菌属A(Sigma，St.Louis，MO)预清除。通过首先与6微升抗凝血因子VII多克隆抗血清一起培养4小时放射免疫沉淀代谢标记细胞的样品。60微升洗涤过的葡萄球菌蛋白质A添加到各样品，于4℃摇动样品1.5小时，离心样品，除去上清液。在0.7MRIPA缓冲液(10mMTris，pH7.4，1％脱氧胆酸〔CalbiochemCorp.，LaJolla，CA〕，1％曲通X-100，0.1％SDS，5mM乙二胺四乙酸，0.7MNaCl)中洗涤离心沉淀两次，在0.15MRIPA缓冲液(10mMTris，pH7.4，1％脱氧胆酸〔CalbiochemCorp.，LaJolla，CA〕，1％曲通X-100，0.1％SDS，5mM乙二胺四乙酸，0.15MNaCl)中洗涤一次。将100微升1xSDS染料(50mMTris-HCl)，pH值6.8，100mM二硫苏糖醇，2％SDS，0.1％溴酚蓝，10％甘油)添加到样品中，煮沸样品5分钟，其后离心除去蛋白质A。在10％聚丙烯酰胺凝胶上处理50微升各样品。结果显示10个克隆中的9个分泌修饰的凝血因子VII。实施例II修饰的凝血因子VII的抗凝剂活性用野生型凝血因子VII作为对照在一期(one-stage)凝固测定中测定修饰的凝血因子VII蛋白质抑制凝固的能力。基本上如上所述从在包含5微克/毫升维生素K的培养基中培养的细胞制备重组蛋白质。不同量的修饰的凝血因子VII(得自克隆544)或重组野生型凝血因子VII用50mMTrispH值7.5，0.1％BSA稀释成100微升。将混合物与100微升凝血因子VII-缺失血浆(GeorgeKingBio-MedicalInc.，OverlandPark，KS)和200微升组织促凝血酶原激酶C(Dade，Miami，FL；包含兔脑组织促凝血酶原激酶和11.8mM钙离子)一起培养。凝固测定在一个自动血凝固定时器(MLAElectra800凝结，医学实验室自动化公司，Pleasantville，NY)中进行，用标准曲线将凝固时间转化成凝血因子VII活性单位，所述标准曲线用正常收集的人血浆(假定每毫升包含一单位凝血因子VII活性；从健康供体收集的含枸橼酸盐的血清制备)的1∶5到1∶640稀释度制成。利用这种测定法，修饰的凝血因子VII制剂不显示出可检测的凝结剂活性。表2显示了对照(未转染的)BHK细胞条件培养基(+/-维生素K)、野生型凝血因子VII、和两种表达修饰的凝血因子VII的细胞之分离物的凝固时间的测定结果。VII活性因子被视为比对照样品缩短的凝固时间。表2样品稀释度凝固时间(秒)对照+K1∶533.11∶1033.4对照-K1∶534.31∶1033.2野生型凝血因子VII1∶2019.01∶4021.51∶8023.3修饰的凝血因子VII(#6)1∶133.5修饰的凝血因子VII(#10)1∶132.5为了确定修饰的凝血因子VII对血浆因子底物的作用，将修饰的凝血因子VII和重组野生型或者天然凝血因子VII的制剂与凝血因子X或IX一起温育，其激活作用由凝固测定和凝胶电泳监测。实施例III修饰的凝血因子VII结合组织因子的能力修饰的凝血因子VII与野生型凝血因子VII竞争组织因子的能力和抑制其凝固活性的能力在限制量的组织因子(组织促凝血酶原激酶)存在下在一步(one-step)凝固测定中评价。在类似于实施例II中所述的一步测定中测定凝固时间。将有限量的组织因子、恒定量的野生型凝血因子VII、和增加量的变体凝血因子VII用于混合实验中。凝血因子VII/VIIa前凝血质活性的抑制作用被视为在包含增加量的变体凝血因子VII的测定中凝固时间的增加。在试验样品中的凝血因子VII活性的量以标准曲线(在正常收集的血浆中测量的凝血因子VII活性)的百分比计算。凝血因子VII活性的标准曲线由磷酸盐缓冲盐水(PBS)中的范围从1∶5到1∶640的正常收集的血浆的系列稀释度产生。为了这个目的，假定正常血浆包含大约500毫微克/毫升凝血因子VII，这被认为是一个单位活性。100微升凝血因子VII缺失血浆、100微升血浆稀释物、200微升组织促凝血酶原激酶(Dade，Miami，FL.)用来在MLAElectra800自动定时器上测定凝固时间。为了建立标准曲线，结果绘制成活性百分比(1∶5＝100％种活性)对凝固时间(秒)的图。测定需要包含野生型与变体凝血因子VII的培养基由不到百分之一的血清组成。用PBS制成稀释物以使凝固时间落在标准曲线上。最终体积为100微升。在实验中试验指定为克隆“#6”和“#10”的不同的人凝血因子VIISer344→Ala变体。下表的结果说明凝血因子VII的量增加，则凝血因子VIIa的活性降低。表3用Ser344-Ala变体进行的混合测定的结果(在10微升/反应时，B4A1(野生型)培养基用作100％活性)Ser344→Ala变体培养B4A1培养BHK对照*FVIIa活性百分比克隆编号基的量基的量#1010μl10μl070#1020μl10μl051#1030μl10μl043#1040μl10μl034#1050μl10μl028#10(-K)§20μl10μl078#610μl10μl074#620μl10μl056#630μl10μl046#640μl10μl041#650μl10μl032#6(-K)20μl10μl085BHK对照010μl20μl91BHK对照(-K)010μl20μl107*未转染的条件培养基§为了表达凝血因子VII变体，将细胞在维生素K存在下培养，例外的是注有“(-K)”的。这些试验表明具有Ser344-Ala取代的凝血因子VII变体以剂量依赖形式与天然凝血因子VII竞争，并抑制天然凝血因子VII/VIIa的前凝血质活性。因此，可以得出结论Ser344-Ala变体人凝血因子VII与天然人凝血因子VIIa竞争，从而在人血浆中抑制凝血因子X和/或的IX的激活作用。实施例IV凝血因子VII与PPACK的反应在转染幼仓鼠肾细胞中产生重组凝血因子VII。按Thim等(生物化学，277785-7793，1988)，Brinkous等(美国科学院学报，861382-1386，1989)和Bjoern及Thim(Res.Discl.No.269，564，1986)(本文一并参考)等所述纯化所述的蛋白质。回收细胞培养基，过滤并稀释以降低盐浓度。然后经采用包含CaCl2的洗脱缓冲液阴离子交换色谱分级分离稀释的培养基。回收凝血因子VII组分，经使用钙依赖性抗凝血因子VII单克隆抗体的免疫色谱进一步纯化。可以用两个阴离子交换色谱进一步纯化，其中凝血因子VII分别用CaCl2和NaCl洗脱。在最终洗脱液中回收凝血因子VII。在50mMTris-HCl、100mMNaCl、5mMCaCl2、pH7.4中的重组凝血因子VIIa(1μM)与20μMPPack(D-苯基丙氨酰-脯氨酰-精氨酸氯甲基酮；Calbiochem，LaJolla，CA)温育5、20和60分钟。添加包含产色底物S2288(H-D-异亮氨酸-L-脯氨酰-L-精氨酸P-硝基酰基苯胺；KabiVitrumAB，Molndal，瑞典)的缓冲液以获得2.5倍稀释物，最终浓度为0.3mMS2288。测定P-硝基酰基苯胺的产生并与作为对照的采用未处理的凝血因子VIIa的结果比较。结果说明，在这些反应条件下约60分钟后，凝血因子VIIa是完全失活的。实施例VDEGR-凝血因子VIIa的产生如实施例IV制备重组人凝血因子VIIa，将在10mM甘氨酸缓冲液、pH值8.0、10mMCaCl2、50mMNaCl中的重组人凝血因子VIIa稀释到1.5毫克/毫升的浓度。将10倍摩尔过量的已用蒸馏水溶解的丹磺酰-L-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸-氯甲基酮、DEGRck(Calbiochem，LaJolla，CA92037)添加到凝血因子VIIa中。于37℃温育2小时后，将第二10倍摩尔过量的DEGRck添加到混合物中，于37℃温育另外的2小时。将第三10倍摩尔过量的DEGRck添加到凝血因子VIIa中并在4℃温育约16小时。于4℃将DEGR-凝血因子VIIa样品对三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(0.05MTris-HCl、0、1MNaCl、pH7.5)充分透析，以除去任何游离的DEGRck。在凝血因子Xa产色底物测定中就游离DEGRck的存在试验最终的DEGR-凝血因子VIIa混合物。将DEGR-凝血因子VIIa混合物添加到与产色底物S-2222共存的纯化的人凝血因子Xa中，这一底物能够被凝血因子Xa特异性地裂解，但不被凝血因子VIIa裂解。未标记的DEGRck能够结合到凝血因子Xa上，从而抑制凝血因子Xa的产色活性。掺加游离的DEGR-ck到凝血因子Xa混合物中产生标准曲线以测定溶液中游离DEGRck水平对凝血因子Xa产色活性抑制作用。对DEGR-凝血因子VIIa混合物的分析显示在充分透析后，游离DEGRck∶DEGR-凝血VIIa的比率低于0.5％，从而保证在以下所描述的各测定系统中由DEGR-凝血因子VIIa观察到的抑制作用不是由于DEGRck的存在。实施例VI在大鼠平滑肌细胞上凝血因子Xa的产生采用对凝血因子Xa特异性的产色底物，经测定细胞刺激凝血因子X向凝血因子Xa的转化的能力就细胞-表面组织因子的存在分析脉管平滑肌细胞。将大鼠脉管平滑肌细胞(Clowes等，J.Clin.Invest，93644-651(1994))以生长培养基中每孔8,000个细胞平板接种到96孔培养平皿(AmericanScientificProducts，芝加哥，Il.)中(表4)。表4500mlDulbecco改进的Eagle的培养基(DMEM)(GIBCO-BRL)，Gaithersburg，MD)10％胎牛血清(Hyclone，Logan，UT)1mM丙酮酸钠(IrvineSantaAna，CA.)0.29毫克/毫升L-谷氨酰胺(Hazelton，Lenexa，KS)，1xPSN；(100X是5毫克/毫升青霉素，5毫克/毫升链霉素，10毫克/毫升新霉素)(GIBCO-BRL)，Gaithersburg，MD.)在于37℃培养48小时后，将培养基改变成无血清培养基(表5)。表5250mlDulbecco改进的Eagle培养基(DMEM)250mlHam’sF-12培养基(FredHutchinson癌研究中心，Seattle，WA)1mM丙酮酸钠.29毫克/毫升L-谷氨酰胺20μM转铁蛋白(JRH，Lenexa，KS.)，5μM胰岛素(GIBCO-BRL)16毫微克硒(Aldrich，Milwaukee，WI.)1毫克/毫升牛血清清蛋白(Sigma，St.Louis，MO)于37℃培养细胞72小时。在培养后，将PDGF-BB(10毫微克/毫升)或10％胎牛血清添加到细胞中，以刺激组织因子表达(Taubman等，J.Clin.Invest.91547-552，1993)。平行组细胞既不接受PDGF也不接受血清，以监测未刺激细胞的内在的活性。在6小时培养之后，将重组人凝血因子VIIa以10nM最终浓度添加到细胞中。以一组为添加凝血因子VIIa的细胞作为阴性对照。在37℃培养细胞2小时，用HEPES缓冲液(10mMHEPES、137mMNaCl、4mMKCl、5mMCaCl2、11mM葡萄糖、0.1％BSA)洗涤。洗涤后，用每孔50微升200nM血浆-纯化的人凝血因子X在补充有5mM氯化钙的Tris-缓冲盐水中培养细胞，将25微升0.5M乙二胺四乙酸和25微升800μMS-2222产色底物(KabiPharmacia，Franklin，OH)溶液添加到各孔中。平板在室温下培养40分钟，然后在405毫微米用THERMOMAX微板读数器分析(MolecularDevices，MenloPark，CA)。表6显示与对照(无凝血因子VIIa)孔相比凝血因子VIIa处理过的孔吸收率的增加。吸收率的增加是所产生的凝血因子Xa的水平和其后续产色底物裂解(释放发色团)的直接尺度。这些数据也说明在用PDGF-BB或10％胎牛血清预处理的细胞中产色活性水平高于未处理的细胞。表6试验样品OD405对照.043内在的.247PDGF-BB.36010％FCS.342这些结果清楚地显示在大鼠脉管平滑肌细胞的细胞表面上存在凝血因子X到凝血因子Xa的凝血因子VIIa-依赖性激活作用。实施例VIII细胞表面产色活性被DEGR-凝血因子VIIa的抑制如以上所述，将大鼠脉管平滑肌细胞平板接种到96孔培养皿中，如上所述在无血清培养基中培养细胞72小时，用添加10％胎牛血清6小时处理，以刺激组织因子表达。在刺激之后，将仅有10nM凝血因子VIIa，或10nM凝血因子VIIa+100nMDEGR-凝血因子VIIa的缓冲液添加到各孔中。在37℃培养细胞2小时，然后用HEPES缓冲液洗涤。在洗涤之后，用每孔50微升200nM凝血因子X(在补充有5mM氯化钙的Tris-缓冲盐水中)培养细胞，将25微升0.5M乙二胺四乙酸和25微升800μMS-2222产色底物(KabiPharmacia)溶液添加到各孔中。平板在室温下培养40分钟。如上所述在405nm分析产色活性。表7显示了在仅用凝血因子VIIa处理的孔中产色活性的刺激作用，当DEGR-凝血因子VIIa与凝血因子VIIa共培养时的刺激作用的抑制。这些结果显示DEGR-凝血因子VIIa充当凝血因子VIIa结合的竞争性拮抗剂，从而抑制凝血因子X到凝血因子Xa的激活和后续S-2222的裂解。表7试验样品OD405对照.035凝血因子VIIa.342凝血因子VIIa+DEGR-凝血因子VIIa.073实施例VIII由DEGR-凝血因子VIIa产生的大鼠平滑肌细胞表面产色活性剂量依赖性抑制在补充有1％胎牛血清的的生长培养基(如表4，没有10％胎牛血清)中以每孔4,000个细胞将大鼠脉管平滑肌细胞平板接种到96孔培养皿上。5天后，除去培养基，将单独的增加浓度的凝血因子VIIa或者与增加浓度的DEGR-凝血因子VIIa一起的10nM凝血因子VIIa添加到细胞中，于37℃用凝血因子VII混合物培养细胞2小时。在培养后，洗涤细胞，并在室温下用50微升在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的200nM凝血因子X培养细胞5分钟。各孔具有25微升0.5M乙二胺四乙酸，将25微升800μMS-2222(KabiPharmacia)添加至其中，在室温下培养平板40分钟。如上所述在微板读数器上于405毫微米分析产色活性。表8说明，随着增加量的凝血因子VIIa添加至孔中，产色活性剂量依赖性增加。但具有100nM凝血因子VIIa的DEGR-凝血因子VIIa混合物添加到细胞(表9)中时，产色活性具有剂量依赖性抑制作用。1∶1摩尔比率的DEGR-凝血因子VIIa∶凝血因子VIIa抑制产色活性的大约95％。这些数据说明，在这实验设计中，DEGR-凝血因子VIIa比天然凝血因子VIIa对在培养物中的平滑肌细胞有明显更高的细胞表面组织因子亲和性。如果DEGR-凝血因子VIIa和凝血因子VIIa具有相等的结合组织因子的亲和性，则在两种分子以等摩尔比率添加到细胞中时，观察到的抑制作用的水平不会这样高。表8凝血因子VIIa浓度(nM)OD.405.10.005.39.0251.56.0586.25.11125.00.154100.00.208表9显示由DEGR-凝血因子VIIa产生的在大鼠平滑肌细胞上的凝血因子Xa产色活性的剂量依赖性抑制作用。增加浓度的DEGR-凝血因子VIIa与100nM凝血因子VIIa的共培养，用色底物S-2222测定凝血因子Xa产色活性。表9DEGR-凝血因子VIIa浓度(nM)OD405.00.208.39.1761.56.1166.25.07325.00.026100.00.014实施例IX在可溶性组织因子测定中由DEGR-凝血因子VIIa产生的凝血因子Xa产生的抑制作用利用产色测定进行采用纯化的的重组可溶性组织因子的凝血因子向凝血因子Xa的转化。从啤酒酵母表达和纯化组织因子(Shigematsu等，生物化学杂志，26721329-21337，1992)，可溶性组织因子由Dr.W.Kisiel(新墨西哥的大学)纯化并确定特征。制备包含65.9微升可溶性组织因子(2.2μM)，29.0微升PCPS(1mM，Sigma，St.Louis.MO)、29.5微升人凝血因子X(4.1μM)、2.77mlHank’s缓冲液(25mMTris，pH值7.4)、150mMNaCl、2.7mMKCl、5mMCaCl2、0.1％BSA的反应混合物。将40微升组织因子/凝血因子X混合物，25微升用TBS稀释的凝血因子VIIa和25微升用TBS稀释的DEGR-凝血因子VIIa添加到96孔微滴板的各孔中。包括仅采用40微升组织因子/凝血因子X混合物，25微升用TBS稀释的凝血因子VIIa和25微升TBS的对照。将S-2222(4mM)产色底物10微升添加到孔中的反应混合物中，在室温下培养。如上所述，用微板读数器在405毫微米分析结果。在不加DEGR-凝血因子VIIa时采用增加浓度的凝血因子X进行凝血因子X的凝血因子VIIa激活的标准曲线的确定。表10中给出的结果显示，随着添加至反应混合物中的凝血因子VIIa的量的增加，产色活性剂量-依赖性地增加。同时添加不同量的DEGR-凝血因子VIIa和100nM凝血因子VIIa导致产色活性的剂量依赖性降低(表11)。这些数据显示DEGR-因子VIIa作为天然因子VIIa结合可溶性组织因子的竞争性拮抗剂起作用，并且进而抑制凝血因子Xa的产生(当经针对产色底物S-2222的产色活性降低测定时)。表10由添加到可溶性组织因子中的增加浓度的凝血因子VIIa产生的凝血因子Xa产色活性的刺激作用。用产色底物S-2222测定光密度的变化。凝血因子VIIa浓度(nM)OD405.78.1681.56.2883.12.4786.25.69412.50.76425.00.79050.00.738100.00.770表11测量在存在天然凝血因子VIIa时将DEGR-凝血因子VIIa添加至可溶性组织因子中产生的凝血因子Xa产色活性的抑制作用，用产色底物S-2222测定光密度的变化。DEGR-凝血因子VIIa浓度(nM)OD4050.81050.750100.609200.296400.167800.0831600.055实施例XDEGR-凝血因子VIIa的血凝固抑制作用监测DEGR-凝血因子VIIa对凝固时间的作用的标准的凝固测定按以下所述进行将100微升正常狒狒血浆(用作为抗凝剂的柠檬酸钠收集)添加到100微升不同浓度的TBS(20mMTrispH值7.4，150mMNaCl)稀释的DEGR-凝血因子VIIa中。将样品混合，并在37℃简短培养。把样品添加到Electra800自动凝结定时器(医学实验室自动化公司，Pleasantville，NY)上。在培养之后，将包含25mMCaCl2的组织因子制剂200微升添加到DEGR-凝血因子VIIa制剂中。组织因子制剂制备成来源于新冷冻脑组织的狒狒脑盐水提取物，并就其在狒狒血浆中开始凝结的能力确定特征。选择给出大约40秒的凝固时间的组织因子浓度。表12中的数据说明，由于添加DEGR-凝血因子VIIa，凝固时间剂量-依赖性增加。DEGR-凝血因子VIIa在血浆中低至1微克/毫升的剂量导致凝固时间明显的缩短。表12由DEGR-凝血因子VIIa引起的凝固时间的缩短。DEGR-凝血因子VIIa凝固时间的缩短(微克/毫升血浆)(秒)040.70.546.21.050.82.564.55.0108.110.0158.4实施例XI血小板积累由DEGR-凝血因子VIIa的抑制在非人灵长类机械性损伤动脉血栓形成位点分析DEGR-因子VIIa抑制血小板积累的能力。基本上按Lumsden等(血液，811762-1770(1993))的描述，将主动脉动脉内膜切除模型用于狒狒。除去1-2厘米长的一段狒狒主动脉，倒转并刮削以除去动脉内膜和大约50％的培养基。将动脉倒转至其正确的方向，在两端上套管并放置到狒狒体外分路(shunt)上，因此经分路使机械性损伤的动脉暴露于狒狒血液。就在打开分路循环血液之前，将111In-标记的自体血小板静脉内注射进动物。损伤动脉位点上血小板积累的水平通过实时(real-time)γ-照相图象测定。采用大药团注射DEGR-凝血因子VIIa和盐水对照并就在打开分路之前给药来完成DEGR-凝血因子VIIa对血小板积累的抑制作用。连续测量损伤动脉60分钟。0.005毫克/千克剂量的DEGR-凝血因子VIIa抑制血小板积累。1.0毫克/千克大药团注射时，用药后1小时血小板积累的大约90％被抑制。这些结果在图2中被显示。这些数据显示以DEGR-凝血因子VIIa与组织因子的抑制作用在急性脉管损伤的非人灵长类模型中能很好地抑制血小板-富集血栓的发展。实施例XII在动脉硬化兔中囊血管成形术后DEGR-FVIIa抑制脉管再狭窄评价在新西兰白(NZW)动脉硬化兔中囊血管成形术后DEGR-FVIIa抑制脉管再狭窄的能力。这一动物模型已被很好地确定特征，并被证明在评价抗血栓形成化合物对脉管损伤发展的作用上时一个好的模型(Gimple等，循环，861536-1546(1992)，和Rogosta等，循环，891262-1271(1994))。基本上如Ragosta(同上)所述用这一动物模型评价DEGR-FVIIa。经给兔肌内注射5毫克/千克赛拉嗪和35毫克/千克氯胺酮进行麻醉。最接近的股动脉由在腹股沟韧带下切下最近的和最远的缚线暴露。分离片断用27根剂量针插管。用针刺穿制出小孔。分离片断用盐水冲洗以便清除剩余血液，经以80毫升/分钟速率通入空气8分钟干燥。空气干燥后，分离片断再一次以盐水冲洗以除去缚线。经非闭合的局部压力保持止血，片断用金属夹子划分界线。用1％Xylocaine局部治疗局部痉挛。外科手术后的第二天，使动物食用1％胆甾醇和6％花生油食料一个月直到囊血管成形。为缓解手术后疼痛口头用药Tylenol10毫克/千克3-5天。在外科手术后的3到5天给予Ambipenlcc。输送给动物的试验药物包括就在囊血管成形术前注射的大药团，接着用渗透泵经由内部颈静脉连续全身输注。药物输注时间是3天。对照动物囊血管成形术前接收肝素，150U/千克IV大药团，接着输注盐水。DEGR-FVIIa处理的动物接收1毫克/千克大药团注射，接着是50微克/千克/小时输注。为了放置渗透泵连续全身输注，按以上所述进行麻醉，在整个过程中，保持附加的氯胺酮和赛拉嗪的IM注射。通过中线颈切开，经麻醉切开和远端连接分离右内部颈静脉。将一硅橡胶管(PE-160)引入右内部颈静脉。制成一皮下通道以通过硅橡胶管。这一管与渗透泵连接。渗透泵在兔的背面皮下输注。经麻醉切开和远端连接分离右普通颈动脉。经由动脉切开术，置于5F插管器推进至主动脉弓形接点。抽取血液用于测定止血剂参数、药物和胆甾醇水平，动脉内注射20毫克xylacain。对照aortoiliofemoral血管造影照片采用3秒内注射3-4毫升肾造影剂经位于主动脉分岔上的5FBerman导管手工完成的。在除去Berman导管后，将0.014英寸导线(guidewire)引入下行的主动脉并置于主动脉分岔处。在荧光透视指导下，将2.0至2.5mm的适当大小的囊血管成形术引入，推进至导线上并位于狭窄处。囊以手工充气器充气60秒。三次充气在60秒充气间隔进行。这一方法在各动物中在两条股动脉上进行。在囊充气后，撤除血管成形术导管，将Berman导管再引入到主动脉分岔之上3厘米处。为了最大限度地减少痉挛，动脉内给予20毫克利多卡因如。如以上所述制作后一方法的血管造影照片。以股动脉水平置于1cm栅板以计算实际直径。然后撤除导管。右颈动脉用3-0丝线连接，经分层堆积缝合伤口。如上所述给予Ambipen和对乙酰氨基酚。就在预注射试验化合物大药团时，大药团注射后1小时和连续输注末的3天测定前凝血酶时间和血液中DEGR-FVIIa浓度。获得1-2毫升含枸橼酸盐的血浆，并测定凝血酶原时间与抗原水平。标准的凝固测定用于按如下所述监测在对照和DEGR-FVIIa-处理过的动物中的凝血酶原时间。用作为抗凝剂的柠檬酸钠收集的25微升兔血浆添加到150微升TBS(20mMTrispH值7.4，150mMNaCl)中。混合样品并添加至Electra800自动凝结定时器(医学实验室自动化公司，Pleasantville，NY)上，在培养之后，将20微升包含25mMCaCl2的组织促凝血酶原激酶制剂(Sigma化学公司)调节至血浆制剂中。选择在对照兔血浆中给出大约20秒的凝固时间的组织促凝血酶原激酶浓度，ELISA测定用来测定对照和DEGR-FVIIa处理过的兔血浆样品中的DEGR-FVIIa的浓度。测定包括首先用0.1M碳酸盐缓冲液(pH值9.6)稀释抗人FVII单克隆抗体(Dr.W.Kisiel，新墨西哥大学)至2.0微克/毫升，并以100微克/孔添加至96孔板上。然后将平板在40℃培养一夜，其后用洗涤缓冲液(PBS，pH7.4，包含0.05％Tween20)洗涤两次。非特异性结合位点的阻断以37℃温育2小时的200微升/孔缓冲液(PBS，pH值7.4，包含0.05％Tween20和1％BSA)阻断，然后将平板在37℃培养1小时，用洗涤缓冲液洗涤。阻断之后，添加范围在20-0.027毫微克/毫升的DEGR-FVIIa的标准稀释系列，以及以100微升/孔的量使用的试验兔血浆的稀释系列(1∶100到1∶4000，在阻断缓冲液中)。未免疫的兔血浆用作为负对照。将平板在37℃培养1小时，用洗涤缓冲液洗涤。通过添加在阻断缓冲液中的1∶1,000稀释度的兔抗人FVII多克隆抗体(Dr.Kisiel.新墨西哥大学)检测DEGR-FVIIa。将平板在37℃培养1小时，接着用洗涤缓冲液洗涤5次。采用100微克/孔量的1∶2,000稀释度的山羊抗兔IgG抗体过氧物酶缀合物(Tago公司)检测特异性抗体结合。将平板在37℃培养1小时，用洗涤缓冲液洗涤6次。最后添加100微升底物溶液(0.42毫克/毫升在0.2M柠檬酸盐缓冲液(pH5.0)中的邻苯二胺二盐酸盐[OPD]，包含0.3％H2O2)。在室温下1-3分钟后通过添加100微升/孔1NH2SO4停止显色反应。在微板分光光度计上于490nm测定平板。通过比较的样品与DEGR-FVIIa标准曲线的A490值测定DEGR-FVIIa在血浆样品中的浓度。血浆样品分析凝血酶原时间和DEGR-FVIIa抗原水平的分析结果分别显示在表13和表14中。数据以每个个体动物给出。表15总结了平均凝固时间。总的来说，在注射大药团1小时后的时间点，DEGR-FVIIa处理过的动物具有提高的凝血酶原时间，在3天时间点其回复到接近预处理水平。对DEGR-FVIIa抗原水平的分析也显示，在1小时时间点，血浆中的DEGR-FVIIa具有高的水平，在血浆中在2-6微克/毫升之间变化，在3天时间点上具有较低的循环水平。当经体外掺加具有DEGR-FVIIa的正常的兔血浆测定时和在标准稀释的组织促凝血酶原激酶测定中测定凝血酶原时。在1小时时间段测得的DEGR-FVIIa水平符合凝血酶原时间预料的增加。N/A＝没有获得数据</tables>N/A＝没有获得数据表15.血浆凝固时间的统计学总结不成对t-试验XPRR-BLEEDDF不成对t值Prob.(2-tail)12-1.12.2852组计数平均值标准偏差标准误差对照824.51.64.58IDEGR-VIIa623.21.48.6不成对t-试验X血管形成术后1小时DF不成对t值Prob.(2-tail)10-5.44.0003组计数平均值标准偏差标准误差对照624.53.351.37IDEGR-VIIa640.86.352.67不成对t-试验X血管成形术后3天DFProb.(2-tail)13.0622不成对t值-2.04组计数平均值标准偏差标准误差对照819.541.53.54DEGR-VIIa721.061.33.5血管成形术后3周按以上所述在宰杀前经左颈动脉重复制得血管造影照片。通过垂直较低的腹部切开，分离了远侧主动脉，邻近束缚，将输注导管插入上面的主动脉分岔处，远侧主动脉用50毫升盐水冲洗，接着用在120mmHg输注15分钟的500毫升Histochoice(AMRESCO，Solon，OH)溶液固定。一旦灌注开始，就用超剂量的戊巴比妥(3ml戊巴比妥钠IV，65毫克/毫升)毒杀动物。两侧切下5cm股动脉片断。将该组织保存在Histochoice溶液中供光学显微镜分析。为了测定在囊血管成形术位内膜损伤的发展，将切下的股动脉切成系列3毫米片段，嵌入石蜡中，从各动脉的多个区切下片段。将片段固定到载玻片上，玻片以苏木精和曙红和VanGiemson染料染色。用Bioquant程序进行形态测定分析，以获得内腔的、内膜和血管中层的区域测量，进行来源于损伤的动脉的组织切片的形态测定分析，测定总腔区。通过测定内部的弹性薄片之内的区并减去各组织切片相应的腔区来测定内膜区。通过测定在外部弹性薄片之类的区，并减去在内部弹性薄片之内的区来测定血管中层区。在对照和DEGR-FVIIa处理的动物的股动脉中的内膜损伤测量显示在DEGR-FVIIa处理的动物中内膜的大小上有明显的减小(表16)。相反，血管中层区的测量显示两组之间没有明显的区别。<tablesid="table3"num="003"><tablewidth="745">表16在囊血管形成术治疗的兔中的内膜和血管中层测定结果组N内膜(mm2)标准偏差Prob.(2-tail)对照130.8190.4140.0138DEGR-FVIIa100.4380.192组N血管中层标准偏差Prob.(2-tail)对照130.3890.0980.172DEGR-FVIIa100.3290.105</table></tables>血管造影照片测量数据在表17中给出，其中对对照和DEGR-FVXIa处理过的动物以平均腔直径(MLD)+/-标准偏差给出所有3个时间点的结果就在预血管成形术时，就在血管成形术后和血管成形术后21天。在对照和DEGR-FVIIa处理的动物之间在预血管成形术时和在血管成形术后测定时MLD没有明显的区别。然而在血管成形术后21天测量时在DEGR-FVIIa处理的动物中观察到MLD明显增加。<tablesid="table4"num="004"><tablewidth="840">表17.最小腔直径(MLD)测定结果PTCA前MLD测定组N平均MLD标准偏差Prob.(2-tail)对照131.2020.240.3883DEGR-FVIIa101.2830.19PTCA后MLD测定组N平均MLD标准偏差Prob.(2-tail)对照131.4920.5510.5326DEGR-FVIIa101.3230.72521天MLD测定组N平均MLD标准偏差Prob.(2-tail)对照130.8890.2280.0001DEGR-FVIIa101.3930.242</table></tables>实施例XIII细胞表面DEGR-FVIIa在狒狒SMCs上的产生由凝血因子Xa的抑制为了测量DEGR-FVIIa在狒狒平滑肌细胞(SMCs)的单分子层上阻断FVIIa结合到组织因子上并尔后凝血因子X转化成凝血因子Xa的效能，基本上按照以上实施例VIII的方式进行细胞表面产色测定。这一方法是由Sakai等，生物化学杂志，2649980-9988(1989)和Wildgoose等，美国科学院学报，877290-7294(1990)描述的那些方法的修饰的方法。狒狒SMCs从华盛顿大学，Seattle，WA获得，是由主动脉移植物的培养而来。将狒狒SMCs以8,000个细胞/孔的浓度(在200微升补充有10％胎牛血清的DMEM培养基中)平板接种到96-孔培养皿上，在37℃下5％CO2中保持该浓度4天。测定时，除去110微升培养基，将增加浓度的FVIIa或FVIIa与DEGR-FVIIa两者添加到孔中。产生FVIIa浓度的标准曲线，范围从5nM到0.04nM。为了测量DEGR-FVIIa对FVIIa活性的抑制活性，在恒定量(5nM)的FVIIa存在下将增加浓度的DEGR-FVIIa添加到试验孔中。FVIIa和DEGR-FVIIa两者都用HEPES缓冲液(10mMHEPES，137mMNaCl、4mMKCl、5mMCaCl2、11mM葡萄糖、0.1％BSA)稀释，将10微升10x储备溶液添加到细胞中。将细胞在37℃与试验化合物一起培养2小时，然后用HEPES缓冲液洗涤3次。向各孔中添加50微升在三羟甲基氨基甲烷缓冲液(25mMTrispH值7.4，150mMNaCl、2.7mMKCl、5mMCaCl2、0.1％BSA)。在室温下4分钟后，添加25微升0.5M乙二胺四乙酸停止凝血因子X向凝血因子Xa的转化。添加在三羟甲基氨基甲烷缓冲液中的25微升/孔0.8mMS-2222(一种凝血因子Xa-特异性产色底物)，60分钟后在Thermomax微板读数器(MolecularDevices公司，MenloPark，CA)中与405毫微米测定吸收率。示于图3中的结果说明FVIIa处理的孔的酰胺分解活性呈剂量依赖性增加(空心方框)。吸收率的增加是孔中所产生的凝血因子Xa的水平和其后续产色底物裂解的直接尺度。添加具有恒定量的FVIIa(5nM)的增加浓度的FVIIa显示出酰胺分解活性随增加的DEGR-FVIIa水平剂量依赖性增加(实心方框)。等摩尔比率的DEGR-凝血因子VIIa凝血因子VIIa能够抑制产色活性的90％以上。即使是10倍低水平的DEGR-FVIIa，也有产生凝血因子Xa产色活性的40％的抑制作用。这些结果支持这样一个结论，即DEGR-FVIIa是在SMCs完整细胞单层表面上由FVlla产生的凝血因子X到Xa的激活作用的极端有力的拮抗剂。实施例XIVDEGR-凝血因子VIIa对狒狒中脉管血栓形成和脉管损伤形成的作用试验人DEGR-凝血因子VIIa在非人灵长类中抑制组织因子(TF)和激活的凝血因子VII(FVIIa)介导脉管损伤形成(VLF)(由机械性脉管损伤诱导)的能力。就在进行狒狒机械性损伤开始之前，静脉内输注DEGR-凝血因子VIIa7天(5只动物)或30天(1只动物)。在第30天完成脉管损伤形成的测量。将5只处理的动物的结果与5只平行的载体缓冲液输注的对照的结果比较。在研究动物上采用基线测量a)血小板计数，中性白细胞计数，单核细胞计数和红的细胞计数；b)血浆纤维蛋白原水平；c)血浆凝结因素VII、VIIa、X和V活性水平，以及FVII抗原水平；和d)抗凝血因子VIIa抗体水平的基线血浆样品。在三氟溴氯乙烷麻醉和无菌操作条件下，用自体111In-血小板标记的动物接受静脉内输注DEGR-FVIIa，采用系链(tether)系统以连续静脉内给药(开始是1毫克/千克的药团注射，接着是50微克/千克/小时的持续静脉内输注)。动物接受外科颈动脉动脉内膜切除术，双臂动脉或双边股动脉Fogarty囊导管血管成形术。采用系链系统经静脉导管连续输注给药DEGR-FVIIa7或30天。在外科手术30天后，用三氟溴氯乙烷麻醉动物，并用包含0.1％glutaraldeyde的4％多聚甲醛原位进行压力灌注固定30分钟此时，用Harker等，循环，8341-44(1991)和Hanson等，高血压，18I170-I176(1991)描述的方法收获脉管片断(包含以前被损伤的位点)。体外后固定(包含0.1％glutaraldehyde的4％多聚甲醛)样品，低温保存并加工供损伤程度分析。研究11只正常的成熟狒狒(Paioanubis)，6只动物接收DEGR-FVIIa输注(50微克/千克/小时)，剩下的5只时不接收DEGR-FVIIa的对照动物。在使用前3个月，给动物除蠕虫，并观察不出有疾病。所有方法都经公共团体动物饲养和使用委员会同意，并遵照实验室动物饲养和使用NIH指南给出的方法，以及动物保护法和有关的制度政策。在氯胺酮(10毫克/千克肌内)和地西泮(0.5毫克/千克静脉内)诱导后，在三氟溴氯乙烷麻醉下实施侵入性过程。在手术后完成实验过程中的后续短期固定，使用氯胺酮盐酸硫胺素(5-20毫克/千克肌内)。采用Hanson等，高血压，18I170-I-176(1991)和Krupski等，循环，841749-1757(1991)(本文一并参考)的技术通过中线颈切开完成颈动脉的动脉内膜切除术。动脉内膜切除用于脉管损伤模型，是因为它与临床有关，和因为由正常动脉的动脉内膜切除术的诱导的VLF显示出再生性。简言之，切除普通的颈动脉从锁骨近接处到颈动脉分岔远侧处的周围组织。在肝素硫酸盐大药团(100U/千克，静脉内；Elkins-Simm公司，CherryHill，NJ)注射3分钟后，用atraumatic脉管夹交叉夹紧普通的颈动脉，分出与远侧交叉夹子邻近的1厘米。邻近的动脉片断在弯曲的钳状体上反卷。获得最大限度的外翻，将一对聚丙烯固定缝线(7-0)放置在邻近的链侧，第二对置于腔暴露片段的远侧。从反卷脉管片段分出端1厘米处和连续的1厘米测定距离开始进行动脉内膜切除，这一方法包括采用钳状体和外科显微镜(32X放大)机械切除正常的内膜，和部分厚的血管中层。动脉内膜切除术后，将脉管返回到其正常形态，并且用7-0聚丙烯缝线和在2.5倍放大下的连续的技术使末端对末端吻合，并封闭层上的伤口。为了用形态测定法分析VLF，嵌入石蜡中和用苏木精-曙红染色结缔组织组分的片段用连接有图象分析系统的ZeissPhotoscope(Thomas光学测量方法系统，哥伦布，GA)估价，所述仪包括高分辨率(580线)CCD显微镜照相机(其连接有高分辨率(700线)监测器)，IBM386芯片，具有供图象获得和存储的高分辨率图表digitablet的80MB计算机。用形态测定软件驱动器(Optimsas，Bioscan公司，Edmonds，WA)完成定量的图象分析。就新生内膜(neointimal)增生的损伤的总区和动脉血管中层的相应的区分析动脉交叉片段。为了统计学分析，用学生t试验(2tailed)在两个组之间进行比较。结果表明，与对照动物比较，在用DEGR-凝血因子VIIa处理7天并在30天研究的动物中内膜区明显较少，对照动物经历相同的脉管损伤，但不接受任何DEGR-凝血因子VIIa(图4)。类似的结果在用DEGR-因子VIIa处理30天并在30天测定的动物中得到。囊血管造影照片的臂动脉的初步研究模式表明DEGR-因子VIIa疗法没有可测量益处。然而，在狒狒中，这种模型没有显示为prothrombotic模型，其中组织因子起着关键的作用。与对照比较，在狒狒中用股动脉囊伤害进行的研究确实显示出统计学上DEGR-凝血因子VIIa的明显益处，如图5所示。实施例XIVDEGR-凝血因子VIIa对tPA-诱导的血栓溶解的作用急性心肌梗塞期间的进行性冠状血栓形成主要由在与凝血因子VIIa的复合物中的组织因子(TF)通过外凝结途径介导。测定外途径中不同点的附属血凝固级联抑制作用对组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(TPA)血栓溶解效率的作用。具有电诱导的冠状血栓36只狗以tPA(20分钟内1毫克/千克)进行血栓溶解，4分之1进行附加治疗9只以30微克/千克/分钟(90分钟)接收蜱(tick)抗凝剂肽(TAP)，一种选择性的凝血因子Xa抑制剂。在9只狗中TF-凝血因子VIIa复合物被重组组织因子途径抑制剂(TFPT)(100-150微克/千克/分钟，90分钟)抑制，在9只狗中被作为激活的凝血因子VIIa的竞争性拮抗剂的DEGRVIIa(1-2毫克/千克大药团)抑制。9只狗接收盐水对照。狗在血栓溶解之后观察120分钟，以使重新闭合。这些药剂对血栓溶解的作用在以下表18(数据为平均值+SD)中示出。表18盐水DEGRVIIaTFPTTAP再流动时间(min)32±1320±7*21±6*18±10*流动期限(min)62±4570±4891±35*120循环流动变化70％89％56％0％再闭合70％78％67％0％*在0.05显著性α水平上与盐水对照不同的值。这些数据表明凝血因子Xa或TF-凝血因子VIIa的外途径抑制作用被DEGFVIIa或TFPI阻断，加速tPA-诱导的血栓溶解，在成功的再充满后，凝血因子Xa的选择性抑制作用更有效地保持动脉开放。实施例XV修饰的凝血因子VIIa抑制血管内血栓形成而不影响身体组织的血凝结为了确定凝血因子VII结合TF的抑制作用是否导致抗血栓形成的作用，通过在内皮损伤兔颈动脉(Fotts模型)置于外缩窄器开始循环流动变化(CFVs)(由于再发的血栓形成产生的)。通过置于缩窄器邻近处的Doppler血流探子连续测量颈动脉血流。在缩窄器置于动脉周围后，CFVs在6分之6的兔中以11+2循环/小时的平均频率发生，而在CFVs最低点nadir时，颈动脉血流速度平均为5+2％基线值。在观察CFVs30分钟后，动物接受人重组活性位点阻断性(苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮)凝血因子VIIa(FVIIai)输注(0.1毫克/千克，10分钟)。在6分之6的动物中，凝血因子VIIai完全废除CFVs(CFV频率＝0循环/小时；P＜0.05；颈动脉血流速度＝基线值的106.9％；P＝NSvs基线)。在CFVs抑制三十分钟后，人重组FVIIa以0.1毫克/千克/分钟的剂量输注10分钟。凝血因子VIIa的输注在所有动物中恢复CFVs，这表明凝血因子VIIa结合TF是竞争性的。与基线值比较，FVIIai输注之后，凝血酶原时间、激活的部分组织促凝血酶原激酶时间和响应腺苷二磷酸和凝血酶的体外血小板聚合没有不同。这样，FVII-VIIa在体内开始血栓形成中起着重要的作用，在这个模型中，凝血因子VIIai的给药发挥了有力的抗血栓形成作用，而不影响身体组织的血凝结。从以上所述可以明显看出，本发明提供了具有修饰的催化位点的凝血因子VII或VIIa的组合物，其可以结合组织因子，但实质上不能结合凝血因子X和IX。因为修饰的凝血因子VII或VIIa特异性地干扰凝固级联，而不降解或消耗凝固因子，所以，与当前的疗法相比，给药修饰的凝血因子VII制剂几乎没有不期望的副作用。而且，本文所描述的修饰的凝血因子VII可以容易地由重组方法产生。这样，本发明的组合物具有较低剂量的高效性、方便性和经济性，低的给药剂量及频率和相对的无毒性。尽管为了清楚说明的目的，已通过说明和举例的方式描述了本发明，但很明显，在所附权利要求的范围内可以进行某些变化和修改。权利要求1.一种在病人中抑制组织因子活性的方法，该方法包含用治疗有效量的包含凝血因子VII的组合物对病人给药，所说的凝血因子VII在其催化中心具有至少一种修饰，这一修饰实质上抑制修饰的凝血因子VII激活血浆凝血因子X或IX的能力。2.按照权利要求1的方法，其中所说的修饰包括凝血因子VII与丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应。3.按照权利要求2的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂是有机磷化合物、磺酰氟化物、肽卤甲基酮、或氮杂肽。4.按照权利要求3的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂选自以下肽卤甲基酮丹磺酰-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮和苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮。5.一种在病人中抑制血小板沉淀的方法，该方法包含用治疗有效量的包含凝血因子VII的组合物对病人给药，所说的凝血因子VII在其催化中心具有至少一种修饰，这一修饰实质上抑制修饰的凝血因子VII激活血浆凝血因子X或IX的能力。6.按照权利要求5的方法，其中所说的修饰包括凝血因子VII与丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应。7.按照权利要求5的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂是有机磷化合物、磺酰氟化物、肽卤甲基酮、或氮杂肽。8.按照权利要求7的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂选自以下肽卤甲基酮丹磺酰-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮和苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮。9.按照权利要求5的方法，其中所说的凝血因子VII的修饰包括在丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸催化三联体中的至少一个氨基酸取代、插入或缺失。10.一种在个体中抑制脉管再狭窄的方法，该方法包含用治疗有效量的包含药理学上可接受的凝血因子VII的组合物对病人给药，所说的凝血因子VII在其催化中心具有至少一种修饰，这一修饰实质上抑制修饰的凝血因子VII激活血浆凝血因子X或IX的能力。11.按照权利要求10的方法，其中所说的凝血因子VII的修饰是由凝血因子VII与丝氨酸蛋白酶抑制剂的反应产生的。12.按照权利要求11的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂是有机磷化合物、磺酰氟化物、肽卤甲基酮、或氮杂肽。13.按照权利要求12的方法，其中所说的蛋白酶抑制剂选自以下肽卤甲基酮丹磺酰-苯丙氨酸-脯氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-谷氨酸-甘氨酸-精氨酸氯甲基酮，丹磺酰-苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮和苯丙氨酸-苯丙氨酸-精氨酸氯甲基酮。14.按照权利要求10的方法，其中所说的凝血因子VII的修饰包括在丝氨酸、天冬氨酸和组氨酸催化三联体中的至少一个氨基酸取代、插入或缺失。15.按照权利要求10的方法，其中所说的再狭窄继发于动脉机械性损伤。16.按照权利要求15的方法，其中所说的机械性损伤是由囊血管成形术、动脉内膜切除术、减少的atherectomy、移植片固定模置入、激光治疗或rotablation引起的。17.权利要求15的方法，其中在所说动脉机械性损伤之前24小时内用所说的组合物对个体给药。18.权利要求15的方法，其中在所说动脉机械性损伤之后用所说的组合物进一步对个体给药。19.权利要求10的方法，其中所说的再狭窄出现在脉管移植物、移植片固定模、分流术移植物或者器官移植物中。20.权利要求19的方法，其中在所说脉管移植物、移植片固定模、分流术移植物或者器官移植物置入之前24小时内用所说的组合物对个体给药。21.权利要求19的方法，其中进一步在所说脉管移植物、移植片固定模、分流术移植物或者器官移植物置入之后用所说的组合物对个体给药。22.权利要求10的方法，该方法包括还用组织血纤维蛋白溶酶原激活物或链激酶对个体给药。23.一种治疗个体中冠状动脉急性闭合的方法，该方法包含用包含药理学上可接受的凝血因子VII以及组织血纤维蛋白溶酶原激活物或者链激酶的组合物对个体给药，所说的凝血因子VII在其催化中心具有至少一种修饰，这一修饰实质上抑制修饰的凝血因子VII激活血浆凝血因子X或IX的能力。全文摘要修饰凝血因子VII的催化活性位点以产生有效阻断血凝固级联的化合物。这一修饰使得凝血因子VIIa实质上不能激活血浆凝血因子X或IX。修饰的凝血因子VII的药物组合物用于治疗多种与血凝固有关的疾病。文档编号A61K38/46GK1162977SQ95195849公开日1997年10月22日申请日期1995年10月24日优先权日1994年10月24日发明者凯思琳·L·伯克纳,拉尔斯·克里斯蒂安·彼得森,查尔斯·E·哈特,乌拉·赫德内尔,克劳斯·布雷恩戈德申请人:酶遗传公司,新诺迪斯克公司