专利名称：神经干细胞增殖的调节的制作方法
本申请是1994年11月14日申请的U.S.Ser.No.08/338,730的部分继续申请。
在分裂旺盛的组织，如产生血细胞的骨髓中存在着特化的细胞，即干细胞。干细胞的关键性鉴定特征是其具有自我更新或产生更多自身细胞的能力。一个干细胞的最简单定义为具自我维持能力的一个细胞。一种较为严格的(但仍然是简化的)干细胞的定义是由Potten和Loeffler[“发育”Development)，1101001(1990)]提出的，他们把干细胞定义为“具有下列功能的未分化细胞a)增殖，b)自我维持，c)产生大量分化的具功能的子代，d)受伤后再生组织，和e)灵活运用这些选择。
干细胞分裂产生子代，即前体细胞。前体细胞包含新的干细胞和祖细胞。新的干细胞能够再分裂，产生更多的干细胞，保证其自身维持和产生更多的祖细胞。祖细胞能够进行有限的增殖，其所有子代最终经过非可逆分化成为无丝分裂的功能细胞。
图1示干细胞、祖细胞和分化细胞之间的相互关系。
干细胞的作用是替换那些由于自然的细胞死亡、损伤或疾病而失去的细胞。特殊类型组织中出现的干细胞通常与那些含有高转换率细胞的组织相关。然而这一相关性并非总是如此，因为干细胞被认为出现在一些组织，如肝脏中[Travis，“科学(Science)，2591829(1989)]，而这些组织中细胞并不具高转换率。
最典型的干细胞系统是造血干细胞。有证据表明位于骨髓的一个单一的造血干细胞，能够经过一系列祖细胞形成所有的血细胞谱系。1991年10月29日授权的美国专利5,061,620提供了一种分离、再生和利用造血干细胞的方法。出生前，造血干细胞在许多部位，包括胎儿卵黄囊、骨髓、肝和脾中处于活跃状态；即将出生时，骨髓成为血细胞生长的主要部位，肝脏和脾脏中的造血干细胞处于静止状态，并且只有当骨髓中造血干细胞的活性被抑制或出现大范围血细胞破坏时，肝、脾中造血干细胞才重新开始产生血细胞。
成体哺乳动物CNS的分化细胞很少或不能进入有丝分裂周期和产生新的神经组织—基本上所有的神经发生出现在出生前和出生后不久阶段。虽然人们认为星形细胞的转换有限而且缓慢[Korr等，“比较神经病学杂志”(J.Comp.Neurol.)150169(1971)]，并且出现能导致少突神经胶质细胞的祖细胞[Wolsqijk和Noble，“发育”(Development)，105386-698(1989)]，但并不能正常产生新的神经元。然而，大鼠在有限的成体脑部位，如齿状回和嗅球[Kaplan，“比较神经病学杂志”(J.Comp.Neurol.)，195323(1987)；Bayer，S.A.“纽约科学院”(NY.Acad.Sci.)，457163-172(1985)]中具有产生新的神经元的有限的能力，但这并不出现于所有的哺乳动物中；并且在成体灵长类中也没有新的神经元的产生[Rakic，P.“科学”(Science)，2271054(1985)]。在多数哺乳动物(特别是灵长类)中这种不能产生新的神经元细胞的特性对长期的记忆保留可能是有利的，但是当需要替代由于损伤或疾病而失去的神经细胞时，这成了一种明显的缺陷。
哺乳动物CNS中细胞的低转换，以及成体哺乳动物CNS在受伤或疾病后细胞损失情况下不能相应地产生新细胞的特性，导致人们认为成体哺乳动物CNS不含干细胞。然而最近从CNS中分离到在体外具有干细胞特性的细胞。这种细胞出现在从胚胎[Reynolds等，“神经科学杂志”(J.Neurosci.)124565(1992)]至成体[Reynolds和Weiss，“科学”(Science)，2551707(1992)]，表明了成体CNS虽然相应于损伤或疾病并不产生新细胞，但它能够以类似于造血系统的方式产生新细胞和通过干细胞及其子代的增殖和分化修复自身。最近的体内实验结果提示在成体脑室的室管膜下衬垫质中存在着相对静止的干细胞群(Moreshead等，“神经元”(Neuron)，Vol.13(5)1071-1082(1994))。在神经损伤或疾病状态下，这些干细胞假如经适当刺激，能成为替代细胞的来源。
造血干细胞以及肝、肠和皮肤中的干细胞系统的存活、扩展和增殖，已被证实受许多不同营养因子的控制。例如在造血系统中，红细胞生成素和糖蛋白CSF(集落刺激因子)以及各种白细胞介素已被确定为调节干细胞功能的因子[Metcalf，D.，“生物测定”(Bioassays)，14(12)799-805(1992)]。
通过对营养因子在神经细胞在胚胎发育过程中作用的研究表明在出生前神经系统发育过程中有内源性产生物质，如血小板衍生生长因子(PDGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子α(TGFα)和神经生长因子(NGF)参与作用。例如一种胚胎神经祖细胞，即0-2A细胞能产生少突神经胶质细胞和2型星形细胞。在PDGF存在下，0-2A细胞分裂并经几次分裂分化成少突神经胶质细胞。加入CNTF和底物因子，而不加PDGF，能够促进0-2A祖细胞分化成I型星形细胞[Raff等，“自然”(Nature)(Lond.)，303390-396(1983)]。bFGF使发育成神经元的胚胎祖细胞的增殖增加2倍[(Gensberger等，“欧洲生物化学联合会通讯”(FEB Lett.)，2171-5(1987)]。Cattaneo和Mckay(1990)的结果显示将生长因子一起加入或以先后方式加入时，会诱导产生新的效应，而这种效应在将这些因子单独加入时见不到。他们证明了只有将成神经细胞先用bFGF处理后，NGF才能刺激其增殖而产生神经元[Cattaneo，E.和Mckay，R.“自然”(Nature)，347762-765(1990)]。bFGF也显示出能够影响PDGF受体的表达和在PDGF存在下阻断0-2A祖细胞的分化[Mckinnon等，“神经元”(Neuron)，5603-614(1990)]。EGF或TGFα显示出对生长于培养物中的胚胎视网膜神经上皮细胞具有一定的促细胞分裂作用，结果使在生长因子持续存在下的祖细胞产生神经元，而不产生胶质细胞[Anchan等，“神经元”(Neuron)，6923-936(1991)]。在同一研究中，他们报道了在衍生于出生后大鼠神经上皮的培养物中出现神经元和Muller细胞。
CNS疾病包括很多种，如神经变性疾病(象Alzheimer病和帕金森疾病)、急性脑损伤(如中风、头部受伤、大脑性麻痹)和大量与CNS机能障碍有关的疾病(如抑郁、癫病和精神分裂症)。最近几年由于对这些疾病危险性最大的老年人口的增长，神经变性疾病已成为一个重要问题。这些疾病，其中包括Alzheimer疾病、多发性硬化、Huntington舞蹈病、肌萎缩性侧索硬化和帕金森疾病。这些疾病被认为与CNS特定部位的神经细胞的变性有关，它们会导致这些细胞或脑部位不能执行其应当执行的功能。除了神经变性疾病以外，急性脑损伤常常导致神经细胞的损失、受影响脑部位的功能不良以及随之而来的行为异常。CNS机能障碍的最常见类型(按照受影响人数)的特征不是神经细胞的损失，而是现存的神经细胞功能异常。这可能是由于神经元不恰当的激发，或者是由于神经递质的合成、释放和加工的异常。对其中一些机能障碍进行了充分研究，它们是典型的疾病，如抑郁和癫痫，其他的则是研究较少的疾病，如神经官能症和精神病。
到目前为止，治疗CNS疾病主要是通过用药物化合物进行。然而，这种治疗伴随着许多问题，包括转运药物通过血-脑屏障的能力有限和病人长期使用这些药物获得的药物耐受性。例如用左旋多巴使帕金森病人的多巴胺能的活性获得部分恢复，该药物是一种能穿过血-脑屏障的多巴胺前体。但病人会对左旋多巴的作用产生耐受性，因而需要逐渐增加剂量以维持其功效。此外，有许多副作用与左旋多巴相关，如运动的增加和无法控制的运动。
治疗神经疾病的一项新兴技术需要将细胞植入CNS，以替代或补偿宿主神经细胞的损失或功能异常。虽然胚胎CNS细胞在人体试验中获得了最佳结果[Winder等，“新英格兰医学杂志”(New Eng.J.Med.)3271556(1992)]，并且是优选的供体组织，但是伦理上和政治上所需考虑的问题以及大量组织的可获得性限制了这种细胞的应用。人们正在研究用于治疗CNS疾病的其他类型供体组织。其中包括经遗传修饰的神经细胞系[Renfranz等，“细胞”(Cell)，66173(1991)；Synder等，“细胞”(Cell)，681(1992)]、成纤维细胞[Kawaja等，“神经科学杂志”(J.Neurosci.)122849(1992)]、肌肉细胞[Jiao等，“自然”(Nature)，363456(1993)]、胶质祖细胞[Groves等，“自然”(Nature)362453(1993)]和包在荚膜内的细胞[Hoffman等，“实验神经病学”(Exp.Neurol.)，132100(1993)]。
尽管移植法比现有的治疗神经疾病的方法有显著的进步，但这项技术尚未完善。例如，在移植时有些类型细胞不能整合到宿主CNS组织中。特别地，用非神经元原代细胞培养物会限制所移植的材料与宿主组织之间建立联系的能力。从原始神经组织中获得的永生化供体细胞能够形成连接，但是整合入这些转化细胞中的癌基因的表达难以控制，因而会产生肿瘤和其他并发症。供体和宿主会产生对移植入细胞的排斥。也存在着移植的细胞导致肿瘤形成或将传染性物质从供体组织传到宿主的潜在可能。
Gage等在美国专利5,082,670中公开了一种将遗传修饰的神经细胞移植至适当CNS部位，以治疗缺损、疾病或CNS细胞的损害。这一专利中公开的供体细胞取自非神经元的原代培养物，但建议遗传转化的神经细胞可以使用。这些供体细胞有着内在问题。Gage等认识到用于他们技术中供体细胞所带来的局限性，并且承认存在着“…复制非转化细胞培养系统的缺乏…”。他们也承认，“非复制神经元细胞对病毒感染的抗性”。这后一论点概括了与试图应用现有技术方法进行神经细胞遗传修饰相关的困难，这些神经细胞除了取自胚胎组织的以外，在正常情况下不能促细胞分裂。这一技术本质上具有组织排斥的潜在可能。在理想情况下，遗传修饰的移植细胞应该为自体的，因而可防止免疫并发症—即如果病人自身静止的神经干细胞能经遗传修饰和/或刺激，在体外分裂和分化成新的神经细胞，然后被植入以替代失去的或受伤的神经组织，那么这将是有益的。
现在为人所知的在其一生中都存在于哺乳动物脑中的多潜能神经干细胞[Reynolds和Weiss，“科学”(Science)，2551707(1992)]提供了非转化神经细胞的一种来源，这种非转化神经细胞在生长因子，如表皮生长因子的存在下经刺激成为具有丝分裂活性。在培养物中，神经干细胞可被诱导增殖并提供大量未分化的神经细胞。这些未分化的神经细胞能够分化成主要类型的神经细胞，并且能被移植、遗传修饰，然后移植或用于药物筛选或其他目的。
为了能够增加、减少或以其他方式改变神经干细胞和/或其子代有丝分裂活性，能够在体外调节神经干细胞增殖将是一个有利方面。增加静止神经干细胞有丝分裂的活性有一显著的优点，因为可用于移植、遗传修饰、药物筛选等的子代数量将会增加。这也有利于测定体外生长的、在增殖诱导生长因子存在下进行增殖的神经干细胞是如何被调节而使增殖的数量下降。这一资料可用于在体内调节增殖诱导生长因子，如见1993年11月9日申请的U.S.Ser.No.08/149,508中所公开的那些。这不仅有利于调节那些在一种生长因子或几种生长因子结合作用下成为具有丝分裂活性的神经干细胞的数量，而且有利于调节这些干细胞的前体子代的有丝分裂速率。
效应于脑或脊髓组织的损伤会发生神经胶质增生。这一过程所产生的胶质瘢痕被认为可能会阻止神经元轴突重新建立穿过受伤部位的连接，因而阻碍了功能的恢复。在伤口部位和最接近伤口的一定距离处都能进行增殖的星形细胞是胶质瘢痕的主要细胞组成部分(Reier，P.J.“星形细胞”(Astrocytes)Vol.3263-323(1986))。效应于损伤的神经干细胞和其子代的增殖可能是神经胶质增生产生的一个因素。如果在损伤部位神经胶质增生的程度能够减轻，那么神经修复会得到增强。
能够通过阻止或减低有丝分裂活性以减少神经胶质增生将是有利的，这将导致在伤口附近星形细胞数目的增加。减弱神经干细胞和/或其子代效应于伤口诱导信号的增殖能力，可能成为限制胶质瘢痕形成的一种方法。被分离的轴突穿过受伤部位重新建立连接的增加将会提高神经修复过程的质量和恢复功能。
鉴于前面提到的伴随着用于移植或其他用途的CNS细胞来源的缺陷，很明显在本技术领域存在着一种对可靠方法的需求，使这些方法能够培养大量的从人和非人来源的胚胎和成体神经细胞，而这些细胞未经插入癌基因有意识地使其永生化以诱导其无限增殖，因而这消除了对细胞正常的功能遗传改变影响的任何问题。在某些情况下，也需要能够调节细胞在体外和体内的增殖。
因而本发明的一个目的是提供了一种方法，它通过加入特定的生物因子，如生长因子或这些因子的组合，以改变干细胞生长的培养基从而在体外调节CNS干细胞的增殖。
本发明的另一个目的是为体内调节CNS干细胞的增殖提供了一种方法和治疗组合物。这一组合物包括特定的生物因子，如生长因子或这些因子的组合，将它们注入CNS的室系统以调节干细胞增殖。
对于本技术领域熟练人员来说，根据以下详细描述和附加的权利要求，本发明这些目的连同其他的目的以及其特征是显而易见的。
所有参考文献不能被认为是所要求保护的本发明的公开内容，它应被认为是现有技术。提供的参考文献用作背景材料。
本发明描述了一种调节体外增殖多潜能神经干细胞和/或增殖所述神经干细胞子代的方法。该方法包括以下步骤解离含有至少一个多潜能神经干细胞的哺乳动物神经组织，这一多潜能神经干细胞能够产生出具分化成神元、星形细胞和少突神经胶质细胞能力的子代；并且在含有至少一种增殖因子和一种调节因子的培养基中增殖多潜能神经干细胞，其中的增殖因子能够诱导干细胞增殖，而调节因子可以调节多潜能神经干细胞的增殖和/或这种多潜能神经干细胞子代的增殖。
此外，本发明还描述了调节体内增殖多潜能神经干细胞和/或增殖所述神经干细胞子代的一种方法和组合物。这一方法包括将一种治疗组合物输送到室的部位，该组合物至少含有一种能对多潜能神经干细胞的增殖和/或对多潜能神经干细胞的子代增殖有调节作用的因子。
在本发明的一个实施例中，增殖因子是bFGF，调节因子是EGF或硫酸乙酰肝素，它们能增加干细胞子代增殖率。
在本发明的另一个实施例中，含有抑制神经干细胞增殖的一种因子或几种因子结合的治疗组合物是通过体内应用以减少细胞的增殖。
图1说明多潜能神经干细胞增殖的示意图。(A)在增殖因子存在下，干细胞分裂并且产生由更多干细胞和祖细胞组成的未分化细胞球。(B)当来源于无性繁殖的未分化的细胞球被解离并且以单个细胞进行植板时，在非粘附性基质上并且有增殖因子存在时，每个干细胞会产生一个新的球体。(C)如果将球体培养在可以进行分化的条件下，祖细胞会分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。
图2(A)培养在20ng/mgl EGF中10天的神经球照片(放大100倍)。(B)培养在20ng/ml FGF中10天的神经球照片(放大100倍)。(C)培养在20ng/mlEGF+20ng/ml FGF中10天的神经球照片(放大100倍)。
图3在20ng/ml EGF+20ng/ml FGF或20ng/ml FGF+2μg/ml硫酸乙酰肝素存下，来源于成体小鼠脊髓的颈、胸和腰区的初级细胞所产生的神经球数目图。
本发明是基于调节和控制多潜能神经干细胞增殖的方法和组合物的研制，并且目的在于调节体外或体内生长的多潜能干细胞所衍生的子代数目。在此所用的“神经干细胞”或“中枢神经系统(CNS)干细胞”是指来自神经组织的相对静止的未分化干细胞，它能增殖而产生更多的神经干细胞(因而保证其身维持)和祖细胞。“多潜能”是指能够产生子代的神经干细胞，该子代细胞能够产生各类主要的分化神经细胞，即神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。与之相比较，能产生两种分化细胞的未分化细胞，如能产生少突神经胶质细胞和星形细胞的0-2A细胞被称为“双潜能”，而只产生一种分化细胞的未分化细胞称为“单潜能”。
“祖细胞”也指衍生于神经干细胞的一个未分化细胞，但它与干细胞的区别在于它具有有限的增殖能力而不能维持自身。每个神经祖细胞的子代在适当条件下将分化成神经元、星形细胞(I型或II型)或少突神经胶质细胞。少突神经胶质细胞是分化的胶质细胞，它们在中枢神经系统(CNS)中形成包围轴突的髓鞘质。少突神经胶质细胞的表型为半乳糖脑苷脂(+)、髓鞘质碱性蛋白(+)和胶质原纤维酸性蛋白(-)[GalC(+)，MBP(+)，GFAP(-)]。神经元指分化的神经元细胞，其表型为神经元特异性烯醇化酶(+)、神经丝(+)、微管相关蛋白(+)或Tau-1(+)[NSE(+)，NF(+)，MAP-2(+)或Tau-1(+)]。星形细胞是表型为GFAP(+)、GalC(-)和MBP(-)的分化的胶质细胞。
对CNS干细胞已有报道，其用途已有描述[Reynolds和Weiss，“科学”(Science)，2551707(1992)；Reynolds等，“神经科学杂志”(J.Neurosci.)，124565(1992)；Reynolds和Weiss，“恢复神经学和神经科学”(RestorativeNeurology and Neuroscience)，4208(1992)；Reynolds和Weiss，“神经细胞的死亡和修复”(Neuronal Cell Death and Repair)，Cuello，A.C.编，ElsevierScience，pp.247-255(1993)]。此外，这些细胞的应用描述于公开的PCT申请WO 93/01275，WO 94/16718，WO 94/10292和WO 94/09119中。如同存在于其他哺乳动物组织中的干细胞一样，CNS干细胞也能自我维持并产生大量的子代，包括新的干细胞和能够分化成神经元，星形细胞和少突神经胶质细胞的祖细胞。
CNS干细胞可以根据Reynolds和Weiss[“科学”(Science)，2551707(1992)]的方法、上述作为参考的公开的PCT申请和以下实施例1所述的方法从任何出生前或出生后哺乳动物CNS组织中分离和培养。多潜能CNS干细胞出现在各CNS区中，包括脊髓圆锥、脊髓的颈、胸和腰区、脑干、纹状体和下丘脑。这些神经干细胞能从上述各区的组织中获得，并能在体外经诱导而分裂，它们能自我维持并产生大量的子代，包括神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞。
简而言之，多潜能神经干细胞取自神经组织并生长在一种培养基上，这种培养基优选为无血清培养基，它可以是含有已知的能维持细胞存活的物质的任意结合。一种合适的无血清培养基，以下称为“完全培养基”，包括Dulbecco氏改进的Eagle培养基(DMEM)和F-12营养混合液(Gibco)(1∶1)，葡萄糖(0.6％)，谷氨酰胺(2mM)，碳酸氢钠(2mM)，HEPES(4-[2-羟乙基]-1-哌嗪乙磺酸)缓冲液(5mM)以及一种确定的激素混合液和盐混合物(10％；可从Sigma获得)。用该激素混合液和盐混合物代替血清，其中含有胰岛素(25μg/ml)、运铁蛋白(100μg/ml)、孕酮(20μM)、腐胺(60μM)和氯化硒(30nM)。向完全培养基中至少加入一种诱导多潜能干细胞增殖的生物因子。
这里所用的“生物因子”指对CNS细胞有作用的生物活性物质，如一种蛋白质、肽、核酸、生长因子、类固醇或其他分子，可以是天然的或人造的，它对干细胞或干细胞子代有生长、增殖、分化、营养或调节作用(可以是单一作用或与其他生物因子联合作用)。生物因子的例子包括生长因子，如酸性和碱性成纤维细胞生长因子(aFGF、bFGF)、表皮生长因子(EGF)和类EGF的配位体、转化生长因子α(TGFα)、类胰岛素生长因子1(IGF-1)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)和转化生长因子β(TGFβ)；营养因子有脑衍生神经营养因子(BDNF)、纤毛神经营养因子(CNTF)和胶质衍生神经营养因子(GDNF)；与生长因子活性有关的胞内途径调节物有佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯、星形孢菌素、CGP-41251、酪氨酸磷酸化抑制剂等等；激素有活化素和促甲状腺素释放激素(TRH)；各种不同的蛋白质和多肽例如有白介素、Bcl-2基因产物、成骨蛋白(BMP-2)和巨噬细胞发炎蛋白(MIP-1α、MIP-1β和MIP-2)；寡核苷酸例如有针对EGF受体、FGF受体等转录的反义链；类似肝素的分子例如有硫酸乙酰肝素；对神经干细胞或干细胞子代有作用的各种其他分子，包括双调蛋白、视黄酸和肿瘤坏死因子α(TNFα)。
生物因子如EGF和bFGF，它们单独对多潜能神经干细胞能产生增殖作用，在此称为“增殖因子”。通常增殖因子结合到一个细胞表面受体，而产生对增殖的诱导。优选的增殖因子包括EGF、双调蛋白、aFGF、bFGF、TGFα和将这些因子与其他生物因子，如硫酸乙酰肝素相结合。诱导神经干细胞增殖的特别优选的结合是EGF和bFGF的结合。通过将增殖因子以约10pg/ml至500ng/ml浓度加入培养基中，优选的浓度为约1ng/ml至100ng/ml。对EGF、aFGF和bFGF的最优选浓度是每一增殖因子约20ng/ml。
干细胞可培养在任何培养容器中，例如96孔板或培养瓶。在增殖诱导生长因子或几种因子相结合作用下，多潜能神经干细胞进行分裂。在3-4天内形成未分化的干细胞子代。这种干细胞子代，在此称为“前体细胞”，包括新产生的多潜能干细胞和祖细胞。在体外，单个干细胞的子代典型地形成一个前体细胞簇，称之为“神经球”；但是，可以改变培养条件(如通过提供一种处理过的底物，其上附着增殖细胞)以使增殖细胞不形成典型的神经球。前体细胞对任何神经元的或胶质细胞的标记不具免疫反应性，但对nestin有免疫反应性，nestin是一种存在于未分化CNS细胞中的中间体丝状蛋白[Lehndahl等，“细胞”(Cell)，60585-595(1990)]。
在增殖诱导生长因子的继续存在下，神经球内的前体细胞继续分裂而使神经球增大，这是由于未分化细胞[nestin(+)，NF(-)，NSE(-)，GFAP(-)，MBP(-)]的数目增大。有可能在相同的或不同的生长因子存在下对前体细胞进行传代，这些因子可使细胞进一步增殖而不促进其分化。采用增殖培养方法细胞能传代30次或更多次，使前体细胞数量呈指数增加。
上述体外增殖CNS干细胞的培养技术可通过采用其他的生物因子或将几种因子结合使用的方法进行改进，这些因子或因子的结合以某种其他方式增加、减少或改变了前体细胞的数目和特性，这些前体细胞获自效应于EGF或其他增殖因子的干细胞。增殖的变化是通过观察形成的神经球数目的增加或减少，和/或神经球大小的增加或减小(它是增殖速率的反映—取决于每一种神经球中前体细胞的数目)。因而这里所用的“调节因子”指对干细胞和/或前体细胞的增殖有调节作用的生物因子。例如，当一种生物因子能够增加或减少干细胞数目，而这种干细胞能够效应于一种增殖诱导生长因子(如EGF)在体外增殖，那么这种生物因子即可被认为是一种“调节因子”。或者，效应于增殖诱导因子的干细胞数目可能维持相同，但加入调节因子影响到干细胞和干细胞子代增殖的速率。当一种增殖因子与另一种增殖因子相结合使用时，它也可以作为一种调节因子。例如，在bFGF和EGF相结合作用下形成的神经球显著大于bFGF单独作用下形成的神经球，这表明干细胞和干细胞子代的增殖速率较高。
其他的调节因子例如包括硫酸乙酰肝素、转化生长因子β(TGFβ)、活化素、成骨蛋白(BMP-2)、纤毛神经营养因子(CNTF)、视黄酸、肿瘤坏死因子α(TNFα)、巨噬细胞发炎蛋白(MIP-1α，MIP-1β和MIP-2)、神经生长因子(NGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、白介素和Bcl-2基因产物。结合到增殖因子转录物和其受体转录物的反义分子也能调节干细胞的增殖。其他的对干细胞增殖有调节作用的因子包括那些干扰c-fos途径(一个立即早期基因，已知被EGF所激活)激活的因子，包括对c-fos途径起正调节作用的佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA；Sigma)、星形孢菌素(Research Biochemical International)、负调节c-fos表达的CGP-41251(Ciba-Geigy)以及其他因子，如酪氨酸磷酸化抑制剂[Fallon，D.等，“分子细胞生物学”(Mol.Cell Biol.)11(5)2697-2703(1991)]等等，它们能通过将EGF与其受体结合诱导酪氨酸激酶活化的阻遇。
优选的用于增加效应于FGF的神经干细胞子代增殖速率的调节因子为硫酸乙酰肝素和EGF。优选的减少效应于增殖因子的干细胞数目的调节因子为TGFβ族的成员、白介素、MIPs、PDGF、BMP-2、TNFα、视黄酸(10-6M)和CNTF。减小由增殖因子产生神经球的体积的优选因子为TGFβ族的成员、视黄酸(10-6M)和CNTF。
将调节因子以约10pg/ml至500ng/ml的浓度范围加入培养基中，优选浓度为约1ng/ml至100ng/ml。调节因子最优选的浓度约10ng/ml。调节因子视黄酸从1mM母液进行制备，使用的最终浓度在0.01μM至100μM之间，优选为0.05-5μM。为降低EGF或bFGF对神经球增殖作用优选采用浓度约为1μM的视黄酸。反义链可以1-25μM的浓度使用。优选的范围是约2-7μM。用于增加增殖的PMA和相关的分子，可以采用约1μg/ml-500μg/ml的浓度，优选的浓度约为10μg/ml-200μg/ml。糖胺聚糖-硫酸乙酰肝素是哺乳动物细胞表面普遍存在的一种组分，已知它能影响各种细胞过程，并且结合生长因子分子，如FGF和双调蛋白，以此促进这些分子与细胞表面的这些分子的受体相结合。可以将它以约1ng/ml-1mg/ml浓度加入培养基中，与其他生物因子相结合；更优选的浓度为0.2μg/ml-20μg/ml，最优选的浓度约为2μg/ml。
前体细胞可用于移植以治疗各种神经疾病，见PCT申请WO 93/01275，WO 94/16718，WO 94/10292和WO 94/09119所公开的内容。用于移植的细胞可从采用本领域所知的任何方法从培养基收获，并移植至任何异常神经症状或神经变性症状的动物中，这种动物可以来自任何方式，包括来自因化学、电、机械或其他损伤，因实验抽取神经部位或者因疾病或老化的动物。
在用生物因子体内调节患者正常静止干细胞增殖之前，也可以用本文所公开的方法试验生物因子对多潜能哺乳动物神经干细胞体外增殖或调节作用。神经干细胞可以取自神经疾病患者，以测定生物因子对机能障碍、患病或受伤组织的增殖或调节作用。含有调节因子的治疗组合物可以随后制成以用于治疗各种神经障碍、疾病或损伤。组合物以生理学上可接受的制剂形式含有上述浓度的一种或多种调节因子。
治疗组合物可以在体内应用，以调节神经干细胞的增殖。正常静止的神经干细胞遍布于靠近室区的CNS中。位于前脑内的是侧(第一和第二)室。第三室是前脑较低部分的一个腔，它连接位于菱脑的第四室。与前面提到的室结构相连续的中央管是脊髓的室成份。
CNS干细胞位于组织衬垫的室中，它为这些细胞进行体内修饰和控制，以及最终治疗影响CNS不同区域的各种神经疾病、障碍和损伤提供了几方面有利条件。因此可以设计对这些疾病的治疗法，使得按此文所述方法在体内控制或缓解受影响区域附近的干细胞包围的室。这种室系统存在于几乎所有脑部位，因而可以较容易接近受影响部位。如果想通过用含有一种生长因子或病毒载体的组合物作用干细胞以修饰干细胞，那么移植能使组合物作用于室中的一个装置相对较容易。例如，连接上一个渗透泵的套管可用于释放组合物。或者，可将组合物直接注射入室中，这可以使CNS干细胞子代进入由于受伤或疾病而损伤的部位。而且，室与许多脑部位之间的近距离使得由干细胞或其子代分泌的神经剂能够扩散。
导致形成神经胶质瘢痕组织的神经胶质增生，是由于对CNS组织的损伤造成的。这种瘢痕组织被认为对轴突的长出和切断成分的重新连接有主要的抑制作用，因而阻止了脑或脊髓受伤后的功能恢复。尽管星形细胞不是CNS瘢痕组织的唯一组分，但它是有关的主要成分之一。(Reier，P.J.“星形细胞”(Astrocytes)，Vol.3263-323(1986))。神经胶质增生可能是由于，至少部分是由于以前的静止干细胞的增殖。在CNS受伤之后，对室系统采用已知能抑制神经干细胞增殖的一种因子将是有利的，它通过减少能产生星形细胞的干细胞子代的增殖而使在受伤部位的瘢痕组织的形成减少，并且使轴突成分重新连接的状况得到改善，优选的抑制因子为BMP-2。
实施例1衍生于胚胎脑组织的多潜能CNS干细胞的体外增殖-效应于EGF的神经球增殖通过无菌操作将胚胎期第14天(E14)的CD1白化病小鼠(Charles River)断头并取脑和纹状体。将组织用火焰加工光滑的巴斯德吸管机械解离到完全培养基中。细胞在800r.p.m.下离心5分钟，吸取上清液，将细胞重新悬浮于完全培养基中以便计数。
将细胞的25,000细胞/ml的密度悬浮于含有20ng/ml EGF的完全培养基中。用Eppendorf重复移液器连同一个5ml吸头，向经过不含底物预处理的96孔板的每一孔中加入200μl的细胞悬浮液，并且温育在37℃、湿度100％和95％空气/5％CO2中。
当细胞增殖时，在最初48小时和体外3-4天(DIV)内，它们形成小簇，即神经球，神经球在4-6DIV之间升离基质。对每孔生成的神经球数目进行计数，结果列于表中，并且将该数目与经过传代的效应于EGF所生成的神经球数目(见实施例2)和效应于其他生物因子单独作用或与EGF相结合的作用所生成的神经球数(见实施例3)进行比例。
实施例2增殖的神经球的传代示例1按实施例1所述制备细胞和培养基。细胞以0.2×106细胞/ml浓度植板于经过不含底物预处理的75cm2组织培养瓶中(Corning)，并按实施例1所述温育。
经7DIV之后，取神经球在400r.p.m下离心2-5分钟，将沉淀用火焰加工光滑的玻璃巴斯德吸管在2ml完全培养基中机械解离成单个细胞。
将1×106细胞重新植板于75cm2的装有20ml的含EGF的完全培养基的组织培养瓶中。干细胞重新开始增殖和形成新的神经球。这一过程可以每隔6-8天重复。
示例2按照实施例1和实施例2示例1的方法，只是在完全培养基中加入20ng/ml FGF以替代EGF。
示例3按照实施例1和实施例2示例1的方法，只是除了在完全培养基中加有20ng/ml EGF外，还加入20ng/ml FGF。
经过传代所得的神经球，可以按实施例1所述将其机械解离并将细胞植板于96孔板中。可以测定特定的生物因子或生物因子组合对衍生于经传代神经球的细胞所形成的神经球的增殖的作用，并将这一作用与来自衍生于原初组织的细胞的结果相比较。
实施例3测定纹状体衍生的神经球效应于增殖因子和调节因子各种组合的增殖作用示例1将按实施例1所制备的原始纹状体细胞悬浮于不含生长因子的完全培养基中，并按实施例1所述植板于96孔板(Nunclon)并温育。经过一小时温育，向板的每孔中加入含有一种特定的增殖因子或几种增殖因子的组合的完全培养基，增殖因子或其组合包括EGF，或bFGF(重组人bFGFR &D系统)，或EGF和bFGF的组合，或EGF+FGF+硫酸乙酰肝素(Sigma)，或bFGF+硫酸乙酰肝素。每种生长因子的浓度用20ng/ml，硫酸乙酰肝素的浓度用2μg/ml。
分别在含有完全培养基的培养瓶中配制浓度为0.2μg/ml的活化素、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2(都来自Chiron Corp.)、TNFα、NGF(Sigma)、PDGF(R & DSystems)、EGF和CNTF(R.Dunn和P.Richardson，McGill University)。视黄酸(Sigma)以10-6M浓度加入。向96孔板的每一个含有增殖因子的孔中加入10μl含有上述调节因子的其中一种溶液。同时设置只含有增殖因子的对照孔。
在另一组实验中，通过在含有调节因子而无增殖因子的完全培养基上培养细胞，以测定各调节因子诱导神经球的特性。当在不含增殖诱导因子，如EGF或FGF时，这些调节因子(除EGF外)对神经干细胞增殖都不起作用。
每隔一天重复加入活化素、BMP-2、TGF-β、IL-2、IL-6、IL-8、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2、TNFα和EGF，CNTF则每天加入，而视黄酸、NGF和PDGF只在实验开始时加入一次。细胞温育10-12天，对每孔中神经球进行计数并将所得值列表于Cricket图表III。同时记录与球体大小和形状有关的其他有关信息。
一般来说，bFGF比EGF对每孔生成的神经球数目有较强的增殖作用。在20ng/ml EGF存在下，每孔约生成29个神经球，而在bFGF作用下，则约生成70个神经球。但是在bFGF单独作用下(图1B)，神经球的大小只占在EGF作用下(图1A)生成的神经球的20％。EGF和bFGF结合作用(图1C)比EGF单独作用明显产生更多的神经球，但少于只用bFGF时的神经球数。神经球大小要超过单用bFGF的大小，大致与用EGF时相近。对于用bFGF所生成的球体，加入硫酸乙酰肝素可使球体大小增至效应于EGF所产生神经球的70％。这些数据表明EGF和FGF对于干细胞分裂的诱导有不同的作用。
加入到含有增殖因子的孔中的调节因子的作用概述于表1。总的来说，TGFβ族、白介素、巨噬细胞抑制蛋白、PDGF、TNFα、视黄酸(10-6M)和CNTF能显著减少生成于所有增殖因子或所试的增殖因子相结合的神经球数目。BMP-2(在10ng/ml剂量下)完全消除效应于EGF的神经球增殖作用。EGF和硫酸乙酰肝素两者都大大增加(约400％)效应于bFGF而形成的神经球的大小。
表1<
>◆ 除BMP-2外(即TGFα和活化素)生成的神经球数目(#)以百分比形式给出，它反映了每孔中神经球数目的减少(-)或增加(+)。神经球数目效应于调节因子存在下的增殖因子，并且是与无调节因子存在下增殖的神经球数目相比较所得的结果。
在增殖因子和调节因子存在下，生成的神经球大小与增殖因子单独存在下生成的神经球相比较，表示如下++大很多+较大＝大小约相同～ 大小不定-较小 --小很多示例2反义/有义实验如实施例1所述获取胚胎组织，并植板于含完全培养基的96孔板中。用下列寡脱氧核苷酸(所有序列为从5′→3′)进行反义和有义实验EGF受体 有义链GAGATGCGACCCTCAGGGAC反义链GTCCCTGAGGGTCGCATCTCEGF 有义链TAAATAAAAGATGCCCTGG反义链CCAGGGCATCTTTTATTTA取各寡脱氧核苷酸在双蒸水中稀释，并保持在-20℃。向96孔板的每孔中加10μl的寡脱氧核苷酸，以使终浓度为1、2、3、4、5、10或25μm。每24小时加入寡脱氧核苷酸。在生长于bFGF(20ng/ml)的培养物中加入EGF受体(EGFr)和EGF寡脱氧核苷酸；生长于EGF(20ng/ml)的培养物中加入EGFr寡脱氧核苷酸。将细胞培养于37℃、5％ CO2、湿度100％的培养箱中。经10-12天，对每孔神经球进行记录并列表。浓度为3μm的反义寡脱氧核苷酸使每孔生成的神经球数减少50％，而有义寡脱氧核苷酸对效应于EGF和FGF产生的神经球数目没有影响。当应用10μM或更高浓度时，有义和反义寡脱氧核苷酸都对细胞有毒性。
采用下列寡脱氧核苷酸可进行相似的实验FGF受体有义链GAACTGGGATGTGGGGCTGG反义链CCAGCCCCACATCCCAGTTCFGF有义链GCCAGCGGCATCACCTCG反义链CGAGGTGATGCCGCTGGC将FGF受体(FGFr)和FGF寡脱氧核苷酸加入生长于EGF的培养物中，而FGFr寡脱氧核苷酸加入生长于bFGF的培养物。
示例3如实施例1所示制备胚胎组合，并植板于96孔板中。将含有20ng/ml EGF或bFGF的完全培养基加入每个孔中。在实验开始时，用Eppendorf重复移液器和一个500μl的吸头向96孔板的每个孔中加入10μl稀释的佛波醇12-豆蔻酸13-乙酸酯(PMA)，使终浓度为10、20、40、100或200μg/ml。细胞培养于37℃，5％ CO2、100％湿度的培养箱中。经10-12天，对每个孔中神经球计数并列入表中。
示例4如实施例1所述制备胚胎组织并植板于96孔板中。用Eppendorf重复移液器和一个500μl吸头向96孔板的每个孔中加入10μl稀释的星形孢菌素，使终浓度为10、1、0.1或0.001μM。细胞培养于37℃、5％ CO2和湿度100％的培养箱中。经10-12天对每孔神经球进行计数并列入表中。
实施例4成体脊髓干细胞增殖—对特定的生物因子或几种因子组合的体外效应脊髓组织取自6周至6个月的小鼠，方法如下颈组织取自第一肋骨嘴侧的脊柱区；胸柱组织取自第一肋骨的尾区和约离最后一根肋骨嘴侧5mm部位；腰骶骨组织构成了脊髓的其余部分。解剖的组织用常规的人工脑脊髓液(aCSF)清洗，再切成小块，然后置于装有经充氧的aCSF的旋转瓶中，其中的aCSF含有高浓度Mg2+、低浓度Ca2+以及胰蛋白酶/透明质酸酶和犬尿喹啉酸酶的混合液，以利于组织的解离。对组织进行充氧、搅拌并在30℃下加热1.5小时，然后转入一个小瓶，在培养液(DMEM/12/激素混合液)中用胰蛋白酶抑制剂处理。组织用一个火焰光滑的吸管捣25-50次。解离的细胞在400r.p.m下离心5分钟，然后重新悬浮于新鲜培养液中。将细胞植板于35mm培养皿(Costar)中并使之沉淀。吸去多数的培养液并加入新鲜的培养液。在一些培养皿中单独加EGF或加入EGF和bFGF，使每种因子浓度为20ng/ml，剩下的培养皿中加入bFGF(20ng/ml)和2μg/ml的硫酸乙酰肝素。细胞培养在5％ CO2、湿度100％和37℃下10-14天。对每孔生成的神经球计数，并将结果列入表格。单独用EGF时任何脊髓部位都不生成神经球。而在EGF+bFGF存在下，所有脊髓部位都生成神经球，尤以腰骶骨部位为最。EGF+FGF和FGF+硫酸乙酰肝素相结合能在颈区产生相似数目的球体，而bFGF+硫酸乙酰肝素结合在胸区和腰区产生较少的神经球(见图3)。
实施例5效应于增殖因子的灵长类组织神经球的体外生成第一次传代的神经球取自成人组织。在一次常规活组织检查中，从一名65岁老年女性患者中取正常组织。活检部位位于右前叶，离侧室前角尖端6mm处。组织用aCSF采用大致与实施例4相同的方法制备。干细胞培养在T25瓶(Nunclon)中，用含有20ng/ml EGF、20ng/ml bFGF或EGF+bFGF各20ng/ml的完全培养基。每隔2-3天检查培养瓶以观察神经球的形成。EGF+FGF相结合作用比单用EGF或FGF生成更多的神经球。
实施例6受伤CNS中干细胞和干细胞子代增殖的抑制
A脊髓受伤用戊巴比妥钠(80mg/kg，腹膜内注射)麻醉成体雄性CD1小鼠(CharlesRiver，St.Constant，Quebec)。在颈、胸或腰的高度进行椎板切除术，并用微型外科剪刀切除后索。在损伤形成的同一天，用接有30号套管的100μl容量的渗透微型泵(ALZA；传送速率0.5μl/h/7天；型号1007D)将含有抑制干细胞增殖的调节因子的一种组合物注入第四室。套管采用定向技术移植到前囟后部AP-6.0mm处的第四室，它位于硬脑膜以下L-0.3mm和DV-4.3m处，并在λ和前胸之间有一平的颅骨位置。套管用牙科的丙烯酸粘固剂固定。含有能抑制干细胞效应于受伤刺激的增殖作用的调节因子的组合物以0.5μl/小时的流速灌注1-28天。该组合物含有0.9％盐水、1mg/ml小鼠血清白蛋白(Sigma)和10ng/ml的BMP-2。可以应用的其他的调节因子包括那些对神经干细胞体外增殖有抑制效果的调节因子，如CNTF、视黄酸、TGF-β和MIP族的成员和抗EGF受体和FGF受体的反义寡脱氧核苷酸。细胞在受伤部位的反应按实施例7所述方法测定。
B.脑受伤用戊巴比妥钠(80mg/kg，腹膜内注射)麻醉成体雄性CD1小鼠(CharlesRiver，St.Constant，Quebec)。切去颅骨的一小块，使大脑皮层暴露。按Cavanagh，J.B.的方法(“解剖学杂志”(J.Anatomy)106471-487(1970))在皮层中制造一个切伤。在损伤形成的同一天，用接有30号套管的100μl容量的渗透微型泵(ALZA；传送速率0.5μl/h/7天；型号1007D)将抑制干细胞增殖的因子注入同侧室中。用定向技术植入套管，用牙科的丙烯酸粘固剂固定。能抑制干细胞效应于受伤刺激而产生增殖作用的因子以0.5μl/小时流速灌注1-28天。载体溶液为0.9％盐水，其中含有1mg/ml小鼠血清白蛋白(Sigma)。抑制因子包括那些对神经干细胞体外增殖有抑制作用的因子，如BMP-2、CNTF、视黄酸、TGF-β和MIP族的成员和抗EGF和FGF受体的反义寡脱氧核苷酸。在受伤部位细胞的反应按实施例7所述进行测定。
实施例7检测在CNS受伤部位进行增殖的细胞在实施例6中灌注期结束之后，给小鼠注射溴脱氧尿苷(BrdU；Sigma，120mg/kg，腹膜内注射)，每2小时一次共注射5次，以标记在受伤部位进行增殖的细胞。动物在最后一次注射之后30分钟、2天、4天、1星期、6星期或6个月用过量麻醉剂处死并用4％多聚甲醛穿心灌注。取受伤部位附近(包括受伤部位)以及靠近受伤部位的室部位，并在灌注液中4℃下后固定过夜，然后冷冻保护。切下30μm的弧矢状冷冻切片并直接置于凝胶处理的载玻片上。进行BrdU检测的组织先用1M HCl在65℃下处理切片30分钟，以使细胞的DNA变性，组织然后进行免疫细胞化学处理。采用大鼠抗-BrdU(Seralab)和驴抗-大鼠-FITC进行免疫细胞化学测定。用GFAP的抗血清(由星形细胞表达)，随后用驴抗-小鼠-FITC以显现GFAP的表达和胶质细胞瘢痕的产生。用nestin的抗血清标记切片，随后进行驴抗-小鼠-FITC和对靠近室区和损伤部位的nestin免疫反应性细胞进行计数来定量这一处理对nestin表达的作用。以初级抗体的缺乏证实免疫染色的特异性。将经过处理的动物与只接受用载体室内处理的对照进行比较。
所有引用文献引入此文作为参考。
权利要求
1.一种调节多潜能神经干细胞/或所述的神经干细胞子代体外增殖的方法，包括以下步骤(a)解离含有至少一个多潜能神经干细胞的哺乳动物神经组织，它能产生能分化成神经元、星形细胞和少突神经胶质细胞的子代，并且(b)在一种含有至少一种增殖因子和一种调节因子的培养基中增殖所述的多潜能神经干细胞，其中的增殖因子能诱导干细胞的增殖而调节因子能调节所述的多潜能神经干细胞和/或所述的多潜能神经干细胞子代的增殖。
2.权利要求1的方法，其中所述的增殖因子选自由EGF、双调蛋白、aFGF、bFGF和TGFα组成的一组因子。
3.权利要求1的方法，其中所述的增殖因子为bFGF。
4.权利要求1的方法，其中所述的调节因子选自由硫酸乙酰肝素、CNTF、视黄酸、活化素、白介素和EGF所组成的一组因子。
5.权利要求3的方法，其中所述的调节因子为硫酸乙酰肝素。
6.权利要求3的方法，其中所述的调节因子为EGF。
7.权利要求1的方法，其中所述的多潜能神经干细胞来源于哺乳动物。
8.权利要求1的方法，其中所述的多潜能神经干细胞来源于成年供体。
9.权利要求1的方法，其中所述的干细胞来源于人。
10.权利要求8的方法，其中所述的干细胞来源于患神经疾病的人。
11.一种用于调节病人CNS中神经干细胞增殖的治疗组合物，所述的组合物含有治疗上有效量的神经干细胞调节因子。
12.权利要求11的组合物，其中所述的调节因子抑制神经干细胞增殖。
13.权利要求12的组合物，其中所述的调节因子选自由BMP-2、CNTF、视黄酸、TGF-β族和MIP族的成员以及抗EGF和FGF受体的反义寡脱氧核苷酸所组成的一组因子。
14.权利要求13的组合物，其中所述的调节因子为BMP-2。
15.权利要求12-14任意一项中的组合物，以防止脑或脊髓损伤病人瘢痕组织的形成。
全文摘要
本发明旨在用含有各种生物因子的组合物调节多潜能神经干细胞在体外和体内的增殖。特别地,本发明涉及用于调节前体细胞数目的一种方法和治疗组合物,它是通过干细胞在特定生物因子或这些因子的组合作用下而进行的,其中的前体细胞是由进行分裂的神经干细胞产生。
文档编号A61K38/44GK1170435SQ95196842
公开日1998年1月14日 申请日期1995年11月14日 优先权日1994年11月14日
发明者塞缪尔·韦斯, 布伦特·A·雷诺兹 申请人:纽罗斯菲里斯控股有限公司