专利名称：：人绒毛膜促性腺激素液体制剂的制作方法
技术领域：
：本发明涉及含促性腺激素的液体药物制剂。更具体地涉及以多元醇或非还原糖稳定的hCG(人绒毛膜促性腺激素)液体制剂。人们知道，高纯度蛋白质容易发生降解，甚至由于接触空气中的物质而引起。这一特性对于用重组DNA技术制备的蛋白质甚至更为明显。这样的蛋白质常以多糖类如乳糖、或以甘露糖醇、或以蛋白质或氨基酸如白蛋白和甘氨酸加以稳定。用通常包括冷冻干燥步骤的方法得到干燥粉末，来获得可注射的稳定化的促性腺激素制剂；经这样的方法制成的稳定化的制剂，即使储存在室温下也可保持较长周期的活性。WO93/11788描述了单独以蔗糖或以蔗糖和其它稳定剂合用进行稳定化的含促性腺激素的冷冻干燥的药物组合物。在所述专利申请中表明，蔗糖给研究中的冷冻干燥组合物提供的稳定性优于乳糖或甘露糖醇所提供的。迄今无人描述促性腺激素的液体稳定化制剂。人们极需得到这种液体制剂，以便使组合物易于注射并避免冷冻粉末的重建，从而简化使用方法。我们令人惊讶地发现，可以得到这样的液体稳定化制剂。本发明的主要目的是提供以多元醇或非还原糖稳定化的含hCG的液体药物组合物。多元醇以甘露糖醇为佳，非还原糖以蔗糖为佳。本发明的液体制剂以甘露糖醇稳定则更佳。溶液以缓冲的水溶液为佳，按本发明的缓冲液选自磷酸盐、乙酸盐或琥珀酸盐组成的一组。较佳的缓冲液为磷酸盐，pH以7.00为佳。hCG以重组体为佳，例如可按欧洲专利160699所描述的技术，在CHO(中国仓鼠卵巢)中表达，用相应的DNA转化，来进行制备。本发明的进一步目的是提供所述液体药物组合物的制备方法，包括用含赋形剂的缓冲液溶液稀释hCG储备液。本发明的另一个目的是提供供应市场形式的所述液体药物组合物，包含在无菌条件下密封于适合使用前储存的容器中的这种制剂。为了使本发明的hCG制剂的稳定性达到最优化，曾以各种pH、过离子强度、介电常数的不同缓冲液和不同浓度的重组hCG进行过一系列预试验。为了评估pH和缓冲液的效应，用注射用水配制0.01M磷酸盐、琥珀酸盐或乙酸盐缓冲液溶液。用1MNaOH将pH调节为6.0、7.0或8.0。将重组hCG的储备液加到缓冲系统中，达到5,000IU/ml的溶液。然后将溶液过滤，倾入3ml玻璃小瓶中。这样制得的制剂的组合物报告于表1。对这些制剂进行了稳定性的加速试验研究，以便通过较高温度数据的外推，可预见制剂室温储存于容器中时的稳定性。在这种情况下，将样品储存于40℃和50℃，按下面的标准条件用HPSEC分析测定其纯度以检查考察重组hCG的稳定性。A相0.1M磷酸盐(pH6.7)+0.1MNa2SO4等效条件(Isocraticcondition)100％A相柱TSKG2000SWXL流速0.5ml/分钟紫外检测器214nm注射体积20μl(10,000IU强度)40μl(5,000IU强度)表3报告了用HPSEC测得的重组hCG单体峰的百分率。结果表明，pH6.0和8.0的溶液比pH7.0的溶液的稳定性较差，而在缓冲液之间未观察到明显的稳定性差异。对重组hCG5,000IU/ml溶液评估了离子强度的效应，该溶液以0.01M磷酸盐和琥珀酸盐缓冲液(pH7.0)配制，以NaCl调节至如下渗透压值150,300和400mOsm。制剂的组合物报告于表2。将样品储存于4℃、25℃、40℃和50℃，用HPSEC测定重组hCG的稳定性。表4所报告的结果表明，离子强度的增加对重组hCG的稳定性有负性效应。对以0.01M磷酸盐和琥珀酸盐(pH7)配制的含5、10和15％丙二醇的5,000IU/ml重组hCG溶液进行了介电常数效应的评估。制剂的组合物报告于表2。将样品储存于4℃、25℃、40℃和50℃，用HPSEC测定重组hCG的稳定性。表4所报告的结果表明，增加丙二醇的百分率对重组hCG的稳定性有负性效应。为了评估重组hCG浓度的效应，用HPSEC对分别含2,500、5,000、7,500和10,000IU/ml重组hCG的磷酸盐缓冲液(0.01M，pH7.0)溶液在50℃的稳定性监测2周。表5所报告的结果表明，较浓的溶液稳定性较高。为了比较各种稳定剂和/或赋形剂对重组hCG稳定性的效应，用0.01M磷酸盐缓冲液(pH7.0)制备含10,000IU/ml重组hCG的六种液体制剂，作为第一步。用蔗糖、甘氨酸、葡萄糖、甘露糖醇、乳糖和NaCl作为稳定剂/赋形剂。制剂的组合物报告于表6。通过将样品储存于4℃、25℃、40℃和50℃将这些制剂进行稳定性试验，并用生物鉴定和HPSEC进行试验。接着，在所述第一步结果的基础上，用蔗糖和甘露糖醇作为稳定剂，制备两种所选择的制剂各4批。表7报告了这些制剂的组合物。按照欧洲药典专著进行生物测定。表8报告了HPSEC稳定性数据，表9报告了生物活性值。结果显示如下1.一周储存后，含葡萄糖和乳糖的制剂的生物活性于50℃时明显地降低。单体峰也低于其它制剂所测得的。2.在甘氨酸和NaCl存在下，与含蔗糖和甘露糖醇的制剂相比，测得的生物活性和纯度明显降低。在这种情况下，重组hCG单体峰百分率的降低不是由于凝聚状态的形成，而是由于游离亚单位的增加。表10和表11分别报告了用HPSEC测得的5,000和10,000IU强度的纯度。数据表明，甚至在50℃储存3周后，含甘露糖醇的制剂纯度高于含蔗糖的制剂。表12和13报告了在50℃储存1周后蔗糖和甘露糖醇制剂用反相HPLC测得的α亚单位的纯度。资料证实含甘露糖醇的制剂比含蔗糖的制剂稳定性好。反相HPLC采用如下标准条件进行A相在1升重蒸馏水中加TFA1mlB相在1升乙腈中加TFA0.79ml梯度条件时间A％B％0851520′604021′208022′8515柱AquaporeRP30025cm柱温40℃流速1ml/分钟紫外检测器214nm注射体积10μl表14和15中报告了生物活性测定的结果。甘露糖醇制剂在4℃和25℃放置24小时后未观察到可察觉的生物活性降低。按照本发明，液体药物组合物包含hCG1,000-40,000IU/ml，以10,000IU/ml为佳，包含在0.01M缓冲液中的甘露糖醇10-180mg/l，以54.6mg/ml为佳。药物制备实施例材料磷酸85％RPEACD(CarloErba)；甘露糖醇DAB，PhEurBP，FU，USP，FCC，E421(Merck)，NaOH1M(Merck)，注射用水。用作制剂小瓶的基本容器包括3ml玻璃小瓶(DIN2R)(I型硼硅玻璃)，橡皮塞(PharmagummiW1816V50)，铝环和翻转帽(flipoffcap)(PharmaMetalGmbH)。含甘露糖醇的重组hCG溶液的制备将磷酸(0.98g)加到注射用水(600ml)中。如果需要，用1MNaOH将pH调节至7.0。将甘露糖醇(54.6g)加到磷酸溶液中，再校正pH，如果需要，用1MNaOH或1∶5稀释的磷酸调节至7.00±0.2。然后将重组hCG储备液(10MIU或20MIU，如果所需的最终强度分别为5,000或10,000IU)加到赋形剂溶液中，再校正pH，如果需要，用1MNaOH或1∶5稀释的磷酸调节至7.00±0.2。用注射用水使溶液成为1升。然后在层流下在不大于1.5大气压的压力下使此溶液经0.22μm的Millipak20滤器过滤，将溶液收集到烧瓶中，缓和地搅拌约1分钟。然后用0.5ml重组hCG溶液充填小瓶。表1r-hCG溶液组合物</tables>表2r-hCG溶液组合物离子强度/介电常数</tables>充填体积1mlFOS＝磷酸盐缓冲液SUC＝琥珀酸盐缓冲液7.0＝pH7.0PG5＝丙二醇5％PG10＝丙二醇10％PG15＝丙二醇15％150，300，400克分子渗透压浓度表3r-hCG纯度(％)HPSEC数据pH/缓冲效应</tables>W＝周ACE＝乙酸盐缓冲液SUC＝琥珀酸盐缓冲液FOS＝磷酸协缓缓冲液6/7/8＝pH6.0，7.0，8.0表4r-hCG纯度(％)HPSEC数据离子强度/介电常数</tables>-＝未测试FOS＝磷酸盐缓冲液SUC＝琥珀酸盐缓冲液7.0＝pH7.0PG5＝丙二醇5％PG10＝丙二醇10％PG15＝丙二醇15％W＝周150，300，400＝克分子渗透压浓度表5r-hCG纯度(％)HPSEC数据浓度效应</tables>Fos/25002,500IU/mlr-hCGFos/50005,000IU/mlr-hCGFos/75007,500IU/mlr-hCGFos/100001,0000IU/mlr-hCG表6液体制剂小瓶组合物</tables>缓冲液H3PO40.01M，pH7.0充填体积0.5ml表7液体制剂小瓶组合物</tables></tables>充填体积0.5ml表8与不同赋形剂的兼容性HPSEC稳定性数据纯度(％)</tables>W＝周充填体积＝0.5mlFOS＝磷酸盐缓冲液SAC＝蔗糖，GLY＝甘氨酸，GLU＝葡萄糖，MAN＝甘露糖醇，LAT＝乳溏N.T.＝未测试表9与不同赋形剂的兼容性生物测定数据(IU/ml)</tables>W＝周充填体积＝0.5ml*＝一次有效测试n.v.＝无有效测试-＝未测试FOS＝磷酸盐缓冲液SAC＝蔗糖，GLY＝甘氨酸，GLU＝葡萄糖，MAN＝甘露糖醇，LAT＝乳溏N.T.＝未测试表10液体制剂浓度5,000IU/小瓶HPSEC稳定性数据纯度(％)制剂开发</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表11液体制剂浓度10,000IU/小瓶HPSEC稳定性数据纯度(％)制剂开发</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表12液体制剂用RP-HPLC测得α亚单位纯度</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表13液体制剂用RP-HPLC测得α亚单位纯度</tables>W＝周S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇表14液体制剂生物测定数据(IU/ml)</tables></tables>W＝周NV＝无有效测试S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效测试表14(续)</tables></tables>W＝周NV＝无有效测试S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效测试表15液体制剂10,000IU小瓶生物测定数据(IU/ml)</tables></tables>W＝周NV＝无有效测试S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效测试表15(续)</tables></tables>W＝周NV＝无有效测试S01＝蔗糖M01＝甘露糖醇*一次有效测试权利要求1.液体药物组合物，包含人绒毛膜促性腺激素和稳定剂量的多元醇或非还原糖。2.如权利要求1所述的液体药物组合物，其中多元醇为甘露糖醇。3.如权利要求1所述的液体药物组合物，其中非还原糖为蔗糖。4.如权利要求1所述的液体药物组合物，其中人绒毛膜促性腺激素是重组体。5.如权利要求1-4之一所述的液体药物组合物，其中溶液是缓冲的水溶液。6.如权利要求5所述的液体药物组合物，其中缓冲溶液选自乙酸盐、琥珀酸盐和磷酸盐组成的一组。7.如权利要求6所述的液体药物组合物，其中缓冲液为磷酸盐缓冲液。8.如权利要求5-7之一所述的液体药物组合物，其中缓冲溶液为pH7.00。9.如权利要求5-8之一所述的液体药物组合物，其中缓冲溶液为0.01M。10.如权利要求1所述的液体药物组合物，包含1,000-40,000IU/mlhCG和在pH为7.00的0.01M磷酸盐缓冲液中的甘露糖醇10-180mg/l。11.制备权利要求1所述液体药物组合物的方法，其特征在于用含赋形剂的缓冲液稀释hCG储备液。12.权利要求1所述液体药物组合物的供应市场形式，其特征在于在无菌条件下密封于适合使用前储存的容器中。全文摘要本发明涉及包含以多元醇或非还原糖稳定的hCG的液体药物组合物。该组合物以甘露糖醇稳定为佳。在最佳实施例中,这些组合物是在pH7的磷酸盐缓冲液中的水溶液。这些组合物易于注射,因此避免了冷冻干燥粉末的重建,简化了使用方法。文档编号A61K31/047GK1179724SQ95197791公开日1998年4月22日申请日期1995年3月21日优先权日1995年3月21日发明者F·萨马利塔尼,P·纳塔尔申请人:应用研究系统Ars股份公司