专利名称：盐酸青藤碱组合物及其预防治疗视网膜色素膜炎的用途的制作方法
技术领域：
本发明涉及含有青藤碱的药物组合物及其制备方法，也涉及青藤碱预防治疗视网膜色素膜炎的用途，尤其是，本发明涉及含有青藤碱的滴眼剂，并用该滴眼剂来治疗视网膜色素膜炎眼科疾病。如1.免疫性色素膜炎(Immune-Mediated Uveitis Disease)2.边缘性角膜变性(Margimal Degeneration of Cornea)3.蚕蚀性角膜溃疡(Mooren UlCer)4.巩膜炎(Scleratitis)5.单疱病毒性角膜炎(Herpes Simple Keratitis HSK)。
视网膜色素膜炎是眼科常见多发病，也是致盲的主要眼病之一，对视网膜色素膜炎的研究已有近百年的历史，但只是在本世纪七十年代末，视网膜S抗原提纯成功，并用其建立了可靠的动物模型之后，对该病的研究才得以深入展开。色素膜炎的发病机制复杂，病程慢性反复，自身免疫因素与其发病有重要关联，目前治疗色素膜炎的抗炎免疫药物中，尚无毒付作用小的安全有效的治疗药物。也没有理想的治疗方法。
青藤碱(Sinomenine)是中药青风藤(sinomeniun actutum(Thunb)Rend et wile)中含有的生物碱，其分子式为C19H23NO4，分子量为329.38，从化学结构来看，青藤碱有氢化菲核及乙胺桥组成，具有类似吗啡类的化学结构。现有技术表明青藤碱具有镇痛、抗炎等作用，临床上用来治疗风湿及类风湿关节炎。而且现有技术已表明，青藤碱是非常安全的药物，应用百天后，尿、血液生化检查均无异常。
本发明人出人意料地发现，青藤碱具有预防和治疗视网膜色素膜炎(下文称之为EAU)的作用。含有青藤碱的组合物是一种安全有效的EAU治疗剂。
因此，本发明的目的是提供一种具有预防和治疗EAU作用的青藤碱的药物组合物，所述组合物含有青藤碱和现有技术中常用的可药用赋型剂，该组合物可以是现有技术中的各种剂型，如固体片剂、散剂、丸剂，液体制剂如注射剂、滴眼剂、悬浮剂，乳剂，软膏剂如眼用软膏剂等。优选为滴眼剂、眼用软膏、眼用膜剂。所述的赋型剂是指各剂型中常用的载体、稀释剂、溶剂等，如片剂中含有稀释剂如淀粉、粘合剂如淀粉糊、羧甲基淀粉钠等。润滑剂如硬脂酸钙等。注射剂中含有溶剂如注射用水等，及等渗剂如葡萄糖、氯化钠、眼用软膏中含有眼用的软膏基质。如凡士林、液体石蜡、羊毛脂等。
各种组合物中青藤碱的含量不受特别的限制，通常制剂中活性成分为制剂总量的2-5％(重量/重量)，优选为2％(重量/重量)，给药的剂量也不受特别的限制，取决于给药方式、病人的年龄、病情等多种因素，通常每天为50-150mg/kg体重，由于青藤碱非常安全，疗程通常以病情治愈为止。
本发明的另一目的是提供一种制备具有治疗视网膜色素膜炎的药物组合物的方法，该方法是将青藤碱或其可药用的盐和常用的可药用赋形剂进行混合，混合的方法依据所制备的剂型而定，通常按各剂型的常规方法来制备，如制备片剂时，可将活性成分与稀释剂及粘合剂混合制粒，干燥后加入崩解剂及润滑剂，然后压制成片；制备滴眼剂时，可将活性成分与溶剂及等渗物质混合，制备眼用软膏时，可将活性成分与眼用软膏基质混合，当然滴眼剂眼用软膏均须无菌操作。
术语“活性成分”指青藤碱及其可药用的盐，即可药用的酸加成的盐，如盐酸、硫酸等。“稀释剂”指用于增加药物体积和重量的药用试剂，如，淀粉、蔗糖、乳糖等；“粘合剂”指淀粉糊、糖浆，“润滑剂”是指硬脂酸镁，滑石粉，溶剂是指水，“等渗物质”是指氯化钠，葡萄糖等，眼用软膏基质是指凡士林。
本发明人通过免疫药理学方法，体外自由基产生系统以及抗脂类过氧化系统进行了观察分析。结果发现，青藤碱对细胞及体液免疫功能均有明显抑制作用。并且发现它在体外可有效地清除超氧阴离子及羟自由基，抑制脂类过氧化，这些作用为研究青藤碱防治EAU提供了一定的实验基础。
本发明人通过S抗原诱发的EAU模型，观察了青藤碱全身给药对大鼠EAU发生的抑制作用。同时利用酶联免疫吸附法(ELISA)及淋巴细胞体外转化实验，观察了EAU大鼠抗S抗原抗体水平及淋巴细胞对S抗原刺激的增殖反应的变化，结果发现，青藤碱可降低EAU的发生率，并减轻病变程度。同时对抗S抗原体及淋巴细胞对S抗原刺激的增殖反应有明显抑制。由此表明青藤碱对EAU具有抑制作用。
青藤碱具有免疫抑制及抗自由基抗氧化作用，因此青藤碱可从这两方面抑制EAU的发生及减轻病理损伤。
以下具体实例是对本发明的进一步说明，不对本发明构成任何限制。
实施例1.滴眼剂的制备①处方盐酸青藤碱 2.0g氯化钠 0.5g抗坏血酸0.5g尼泊金 0.03g蒸馏水加至100ml②制法按量将盐酸青藤碱，氯化钠，抗坏血酸，尼泊金等加入到蒸馏水中，溶解，120℃灭菌1小时，无菌装入滴眼瓶。
实施例2.眼用软膏剂的制备①处方盐酸青藤碱5.0g液状石蜡 适量
①处方盐酸青藤碱5.0g液状石蜡 适量眼膏基质 加至100g②制法取无菌盐酸青藤碱，置灭菌乳钵中研细，加少量灭菌液状石蜡，研成细腻糊状，然后加入少量灭菌眼膏基质研匀，再分次递加剩余的基质，研磨均匀，即得。
实施例3.眼用药膜的制备①处方盐酸青藤碱 0.15g聚乙烯醇(05-88) 28g甘油 2g蒸馏水 30ml②制法称取PVA(聚乙烯醇)及甘油与水混匀，待PVA膨胀后在90℃水浴上加热使溶，趁热经80目筛网过滤，滤液冷后加入盐酸青藤碱，搅拌使溶，在涂膜机上制成宽10mm，厚0.15mm，含主药约5％的药膜带，封闭包装在聚乙烯薄膜中，经含量测定后划痕分格(每格面积约10×5mm2)，最后在紫外灯下灭菌(正反面各15分钟)，即得。
实施例4.眼用注射剂的制备①处方盐酸青藤碱 2g氯化钠 0.8g注射用水100mlpH5.5②制法将盐酸青藤碱、氯化钠溶于注射用水中，用pH计测定其pH值在4.0-5.5，过滤，分装(2ml/支)，灭菌。
实施例5.青藤碱对小鼠免疫功能的影响及抗自由基与抗脂类过氧化作用的研究
(一)试剂与动物刀豆蛋白A(ConA)(Concanavalin A)，细胞脂多糖(LPS)(lipopolysaccharide)，RPMI-1640细胞培养液，黄嘌呤(Xanthine，Xan)，黄嘌呤氧化酶(Xanthine Oxidase)，DMPO(5.5-dimethy1-1-pyrroline-1-oxide)购自美国Sigma公司，金属络合剂DETAPA C(Diethylenetriaminepenta acetic Acid)购自Sigma公司。1，1，3，3，四乙氧基丙烷(1，1，3，3-Tetraethoxy propane TEP)购自Fluda公司。伊文斯兰(Evans Blue C34H24N6O14S4)购自德国Serva公司。印度墨汁(Indian ink)北京西中化工厂。淋巴细胞分离液(Iymphocytes Separation Medium)密度P(g/ml)为1.077±0.002。甲基3H胸腺嘧啶核苷[Methyl-3HI Thymidine]放化纯度＞95％。比度18ci/mmol中国原子能科学研究院。胎牛血清(Fetus Bovine SerumFBS)购自GIBCO公司。其余试剂均为国产分析纯。盐酸青藤碱系北京医科大学药学院提供，为白色结晶，易溶于水。
实验动物系北京医科大学动物部提供的BALB/C纯系小鼠，体重约20g，雄性，健康无病，常规标准饲料喂养。
(二)青藤碱的提纯与鉴定提纯步骤见
图1.
红外光谱用美国Nicolet公司FTIR-5DX型红外光谱仪，KBr压片。紫外光谱用美国Beckman公司UV-VisDU-7型紫外可见光谱仪。原谱用VGZAB-HS(EI+)质谱仪。
青藤碱白色结晶IRνmaxKBr；cm-13450，2900，2350，2000，1725，1450。
UVλmaxC2H5OH(nm)234.6，258.0。质谱m/z(M+)329。
(三)青藤碱对小鼠免疫功能的影响1.溶血素试验原理经绵羊红细胞免疫过的小鼠，其淋巴细胞可以产生抗绵羊红细胞的抗体-称为溶血素，并释放至外周血中，分离出致敏动物的血清，在体外与绵羊红细胞一起培养，在补体参与下，可以产生溶血现象。血清中溶血素的含量可通过溶血过程中释放的血红蛋白量来测出。
绵羊红细胞悬液的制备在无菌条件下，取健康成年绵羊颈外静脉血，除去纤维蛋白。加入二倍体积的Alsever溶液，摇匀后置4℃保存备用。
Alsever溶液葡萄糖2.05g，柠檬酸钠0.80g及氯化钠0.42g，溶于双蒸水100ml中，用无菌G5漏斗过滤，4℃保存。
豚鼠血清取健康豚鼠血清，与绵羊红细胞预试，不溶血的血清选用在正式试验。血清经绵羊红细胞吸收后，离心取上清液，于-20℃保存备用，试验时用生理盐水1∶10稀释。
都氏试剂(测血红蛋白用)碳酸氢钠1.0g，氰化钾0.05g以及高铁氰化钾2.0g，用双蒸水溶至1000毫升，并蔽光保存。
免疫动物给药取上述保存的绵羊红细胞，用灭菌生理盐水洗三次，离心1000转/分，5分钟，弃上清液，用生理盐水3∶5(V/V)稀释，其中每毫升约含绵羊红细胞20亿个。按0.2毫升/鼠，腹腔注射，免疫5天后，采血进行溶血实验。给药分组见表1。
溶血试验参考徐学瑛改良方法[药学学报，第14卷，第七期，443-445页，1979年]。采小鼠眼眶血0.5至1毫升，放置室温一小时后，离心2000转/分，10分钟，取上层血清，用生理盐水按1∶500稀释。于1毫升稀释血清中加0.5毫升绵羊红细胞，冰浴中加1毫升补体(豚鼠血清)，置37℃水浴中保温10分钟，立即至冰浴中止反应。离心2000转/分，10分钟。取上清液1毫升，加都氏试剂3毫升，摇匀后，放置10分钟，并于540nm比色。生理盐水做空白对照。
绵羊红细胞半数溶血吸收度值测定取实验所用绵羊红细胞0.25毫升，用都氏试剂稀释至4毫升，放置10分钟，于540nm比色，其吸收度值为绵羊红细胞半数溶血吸收度值。
样品半数溶血值HC50的计算溶血素试验以HC50为反映溶血素水平的观察值，其计算方法为
2.体外抗体形成细胞(PFC)的测定原理用绵羊红细胞免疫小鼠，将其脾细胞在体外与一定量的绵羊红细胞孵育，在补体参与下，使抗体形成细胞周围的绵羊红细胞受抗体分子的敏化而溶解。在一定条件下，溶解程度与抗体形成细胞的多寡成正比。
测定方法参考史美浩法[上海免疫学杂志，第一卷，第1期，第1页，1981年]。用绵羊红细胞免疫小鼠的方法同前。给药分组见表2。免疫给药5天后，断颈处死动物，在冰浴下制备脾细胞悬液，用Hank′s液洗涤二次。计数后，用pH7.2的PBS调整至1×107个细胞/毫升，在该细胞悬液1毫升中加入0.2％(V/V)的绵羊红细胞及补体各1毫升，轻摇匀后，置37℃保温一小时，离心2000转/分，10分钟，取上清液于413nm处测OD值，以PBS做空白对照。
3.对氨基二甲苯(DNCB)所致小鼠迟发型皮肤超敏反应的影响原理DNCB是一种半抗原，将其涂抹在皮肤后，与皮肤蛋白结合成完全抗原，激活T淋巴细胞，使其转化增殖为致敏淋巴细胞。致敏10-14天后，再次涂抹DNCB攻击，可致局部迟发型变态反应。
测定方法参考许爱华法[中国药理学通报，第六卷，第四期，第252-255页，1990年]稍加改良。用硫化钡将小鼠颈部脱毛后，用50％的DNCB丙酮溶液2μl局部致敏，10天后在每只鼠已脱毛的腹部皮肤上均匀涂布2.5％DNCB丙酮液20μl进行攻击。24小时后，经尾静脉注射1％伊文思兰溶液，剂量为10ml/kg体重，30分钟后断颈处死动物，取腹部兰染皮肤，直径8毫米，剪碎，浸泡在2ml 1∶1的丙酮生理盐水中；密封24小时后，离心2000转/分，10分钟，取上清液，于610处测OD值；分组给药见表4以正常小鼠皮肤做空白对照。
4.小鼠静脉血碳粒廓清速率的测定原理一些颗粒状异物，如印度墨汁静脉注进血循环后，迅速被单核吞噬细胞所清除。若将颗粒异物量恒定，测定血流中颗粒物质清除的速率，可以反映单核吞噬细胞的吞噬功能。
测定方法参考金均芳法[中国药理学报，2269，1981年]。给药分组见表6。给药5天后，经小鼠尾静脉注射印度墨汁(原液用灭菌生理盐水稀释5倍)。剂量为10ml/kg体重。注射后1分钟及11分钟，分别于内眦静脉取血20μl，溶于2ml0.1％碳酸钠溶液中，摇匀后，于675nm处测OD值。根据两次OD值，按公式计算廓清指数(K)值，计算公式为K=logOD1-logOD2T2-T1]]>T1和OD1分别为注射后第一次采血的时间及对应OD值，T2和OD2分别为注射后第二次采血时间及对应OD值。
5.对小鼠淋巴细胞体外转化的影响原理T淋巴细胞在刀豆蛋白A(ConA)的刺激，或B淋巴细胞在细菌内毒素(LPS)刺激下转化为淋巴母细胞或浆母细胞；此过程中同时伴有DNA合成明显增加，此时将同位素3H标记的胸腺嘧啶核苷(TdR)加入培养液内，则被淋巴细胞做为DNA合成原料摄入到细胞内；测定细胞内掺入DNA中的3HTdR的放射性相对数量，可表示淋巴细胞转化率的高低。
测定采用常规的3H胸腺嘧啶核苷掺入法。简之为断颈处死动物，无菌条件下取其脾脏，用Hank′s制备脾细胞悬液，将其加至淋巴细胞分离液内，离心1000转/分，5分钟，取出淋巴细胞层，用1640培养液(含5％胎牛血清)洗涤2次，调至2.5×106个细胞/ml浓度，将其加于96孔微量细胞培养板之孔内，每孔0.2ml，每组6孔，其中3孔为实验孔，3孔为对照。实验孔内加不同浓度青藤碱溶液。每孔再加入20μg/ml的ConA0.02ml，使终浓度为2μg/ml或500μg/ml的LPS0.02ml，使终浓度为50μg/ml，微量振荡器混合后，入培养箱，于37℃，5％CO2，培养72小时。培养结束前6小时，每孔加入10μci/ml3H-TdR 20μl(每孔为0.2μci)，继续培养至72小时末。用多头收集器将各孔细胞分别收在49型玻璃纤维滤纸片上，蒸馏水洗涤后，放入37℃烘干，置于含7毫升闪烁液的测量瓶中，用液闪烁计数器测定每分钟脉冲数(Cpm)。计算3H-TdR掺入抑制率(％)。
给药分组见表3及表5。
(四)青藤碱体外抗自由基与抗氧化作用的研究1.青藤碱对羟自由基的影响根据Femton反应原理，将6％过氧化氢15μl、0.4mmol/L硫酸亚铁铵15μl、0.9mol/L DMPO 10μl以及不同浓度的盐酸青藤碱溶液10μl(对照样品用50mmolL/L，pH7.4的磷酸缓冲液代替青藤碱)振荡混匀，吸入内经0.7mm的毛细石英管内，样品高度1.5cm，置于ESR谐振腔内测定。
2.青藤碱对超氧阴离子自由基的影响依据黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应原理，将0.9mol/L DMOP18μl、1.6mol/L DETAPAC 3μl、30mmol/L黄嘌呤10μl、400μl/L黄嘌呤氧化酶10μl以及不同浓度的盐酸青藤碱溶液5μl(对照样品用50mmol/L，pH7.4磷酸缓冲液代替)振荡混匀，将其吸入内径0.7mm毛细石英玻璃管内，样品高度2cm，置于ESE谐振腔内测定。
ESR测定使用西德Bruker，ESP-300型ESR波谱仪。测试条件微波功率2mW。X波段。调制频率100,00KHz调制幅度IG。中心磁场3360G。扫宽100G。扫描时间240秒。扫描次数1。温度21℃。
3.青藤碱对鼠肝匀浆脂类过氧化的影响肝匀浆制备取Wistar大鼠，雄性，体重150g左右，断头处死，迅速取出肝脏，置于冰冷的生理盐水中，经腔静脉灌入冰冷的生理盐水，使肝脏变为土黄色。用50mmol/L，pH7.2磷酸缓冲液制成10％(W/V)肝匀浆，离心10000g 4℃，30分钟，取上清待用。
脂类过氧化测定取上述肝匀浆上清液0.9ml，加入不同浓度的盐酸青藤碱溶液0.1ml(对照样品用50mmol/L，pH7.2磷酸缓冲液代替)，混匀后，置于37℃震荡温育90分钟；之后加入10％三氯醋酸2ml，振荡混匀后，静置10分钟，离心2000转/分，10分钟；取2ml上清液，加入8％的硫代巴比妥酸液1.5ml，混匀后置于沸水浴中加热15分钟，之后冷却，用756分光光度计，在532nm波长处测定OD值。以1μlmol/L四乙氧基丙烷为标准，计算脂类过氧化产物丙二醛的含量。Bradford法测定蛋白质含量。
(五)试验结果我们首先对所提纯的青藤碱进行了紫外光谱、红外光谱及质谱分析。见附图(2)-附图(4)。结果表明，青藤碱纯度＞98％，分子量为329.0。外观呈白色针状结晶，为单体化合物。
1.青藤碱对小鼠体液免疫功能的影响青藤碱对小鼠体液免疫功能的影响，表现在抑制小鼠绵羊红细胞(SRBC)溶血素生成、体外抗体生成反应(PFC)及脂多糖(LPS)诱导的B细胞增殖反应。
从表1可以看出在治疗剂量为50mg/kg体重时，抗SRBC溶血素生成稍有所下降，与对照组比较，抑制率为10.64％，统计学上无显著差异，P＞0.05。当青藤碱剂量增至100mg/kg及150mg/kg体重时，较明显的抑制了抗SRBC溶血素生成，抑制率分别为26.48及41.97％，与对照组比较，分别有显著及极显著性差异，P＜0.05及＜0.01。而且这种抑制作用呈现明显的剂量依赖关系。
从表2中可以看出，青藤碱对PFC反映的抑制作用，50ml/kg剂量时，抑制率为10.4％，与对照组比较，无显著差异，P＞0.05。100mg/kg剂量时，抑制率为24.69％，统计学上有显著差异P＜0.05。在150mg/kg体重组，对PFC反应抑制率为26.54％，与对照组比较有显著差异，P＜0.05。
实验用大肠杆菌脂多糖(LPS)作为刺激物，主要激活B淋巴细胞在体外增殖，同时观察青藤碱对其的影响。从表3中可以看出，培养物中青藤碱浓度大于80μg/ml，3H-TdR掺入抑制率，呈逐渐增加趋势。尤其当药物浓度增至140及160μg/ml时，抑制率增加更为显著。与对照组比较的结果，120μg/ml、140μg/ml及160μg/ml组，统计学上有显著性差异，P＜0.05。上述结果表明，青藤碱对小鼠的体液免疫功能有明显抑制作用。
2.青藤碱对小鼠细胞免疫功能的影响青藤碱对小鼠细胞免疫功能的影响，表现为抑制DNCB所致的小鼠迟发性皮肤超敏反应及体外抑制刀豆蛋白A(Con A)所诱导的T淋巴细胞增殖反应。
从表4可以看出，青藤碱对DNCB所致小鼠迟发性皮肤超敏反应的抑制作用明显。当注射50mg/kg体重剂量时，抑制率就达43.48％，与对照组比较，统计学上有明显差异，P＜0.05。当剂量增至150mg/kg体重时，抑制率为63.77％，与对照组比较，统计学上有极显著差异，P＜0.01。
青藤碱对Con A诱导的T细胞反应的抑制，如表5所示青藤碱浓度达80μg/ml时，3H-TdR掺入抑制率为33.12％，与对照组比较，统计学上有显著差异，P＜0.05。随青藤碱浓度增高，掺入抑制率也增大，并与对照组比较，均有显著或极显著差异，P＜0.05或P＜0.01。实验结果表明，青藤碱对细胞免疫功能有明显抑制作用。
3.小鼠静脉血碳粒廓清速率的测定小鼠静脉血碳粒廓清速率主要反映体内单核吞噬细胞的吞噬功能，是衡量非特异免疫功能的重要指标。从表6可以看出，青藤碱治疗组中，50mg/kg体重的剂量对廓清速率影响甚小，抑制率只有2.7％。治疗剂量为100mg/kg体重时，抑制率为16.22％，与对照组比较无显著性差异，P＞0.05。治疗剂量为150mg/kg体重时，廓清速率的下降为明显，抑制率为29.73％，与对照组比较有显著差异，P＜0.05。实验结果表明，青藤碱在大剂量时对非特异性免疫功能有一定抑制作用。
4.青藤碱对羟自由基的清除作用实验应用的产生羟自由基的反应是经典的Fenton反应。自旋捕集剂DMPO是环硝酮类化合物，它可以捕获羟自由基，与之形成DMPO与羟自由基的自旋加合物，该加合物比较稳定，半衰期为2.6小时。在ESR中形成特征性波谱，见附图5。用该波谱第二波峰的峰对峰高度(h)(单位mm)表示ESR信号的相对强度(Cell Biophy，14174，1989]从表7可以看出青藤碱在体外对羟自由基有比较明显的清除作用。随反应体系药物浓度的增加，ESR信号强度递减，抑制率渐增。与对照组比较，均有极显著性差异，P＜0.01。
5.青藤碱对超氧阴离子的清除作用黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶反应体系是体外生成超氧阴离子自由基的典型反应体系。体系中的自旋捕集剂DMPO捕获超氧阴离子后，形成自旋加合物DMPO-·OOH，在ESR中可测出特征性波，见附图6，用该波谱第一峰的峰对峰高度h(单位mm)表示ESR信号的相对强度[Cell Biophy，14174，1989]青藤碱对超氧阴离子有明显清除作用。从表8可以看出，实验的各剂量组其ESR信号相对强度均较对照组低，统计学上均呈显著或极显著差异。P＜0.05或P＜0.01。
6.青藤碱对大鼠肝匀浆脂类过氧化的抑制作用从表9可以看出，在体外系统中，青藤碱浓度为5×10-3mol/L以及5×10-4mol/L时，MDA形成量显著减少，抑制率分别达71.08％和63.25％，与对照组比较，统计学上有显著差异，P＜0.05或P＜0.01。在5×10-5mol/L浓度组，虽然MDA形成量下降，但是统计学上还没有达到显著程度，与对照组比较，P＞0.05。上述结果表明，在体外，青藤碱有明显清除超氧阴离子及羟自由基的作用，并明显抑制脂类过氧化产物生成。
表1.青藤碱对用绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠产生溶血素的影响组别 剂量动物数半数溶血值 IR(mg/kg.d，ipxd) (X±SD) (％)对照 - 6 187.98±11.66 -SIN150×5 6 167.98±31.4310.64SIN2100×5 6 138.20±15.86* 26.48SIN3150×5 6 109.08±28.77* 41.97ip腹腔注射IR抑制率SRBC绵羊红细胞*对照组与治疗组相比较P＜0.05**对照组与治疗组相比较P＜0.01.表2.青藤碱对用绵羊红细胞(SRBC)免疫的小鼠抗体形成(PFC)的影响组别 剂量动物数光密度 IR(mg/kg.d，ipxd) (X±SD)(％)对照 - 6 0.162±0.019-SIN150×56 0.145±0.01410.49SIN2100×5 6 0.122±0.01724.69SIN3150×5 6 0.119±0.01526.54*对照与治疗组相比较P＜0.05表3.青藤碱对由脂多糖诱导的B细胞增殖反应的抑制作用(LPS50μg/ml)组别n剂量每分钟脉冲数IR(μg/ml) (X±SD) (％)对照3- 10429±3275-1 320 10174±47302.442 340 10201±42382.193 360 9502±3124 8.894 380 8089±2198 22.435 3100 8780±2176 15.826 3120 7675±2054*26.417 3140 5529±2788*46.988 3160 732±422* 92.98IR抑制率表4.青藤碱对由DNCB小鼠迟发性皮肤超敏反应的作用组别剂量 动物数光密度 IR(mg/kg.d，ipxd)(X±SD) (％)对照 - 11 0.138±0.028 -SIN150×5 8 0.078±0.013*43.48SIN2100×5 8 0.075±0.012*45.65SIN3150×5 8 0.050±0.012** 63.77*对照与治疗组相比较P＜0.05**对照与治疗组相比较P＜0.01表5.青藤碱对ConA诱导的T细胞反应的抑制作用(ConA2.0μg/ml)组别n剂量每分钟脉冲数IR(μg/ml)(X±SD) (％)对照3-26617±5224 -1 320 25345±3736 4.782 340 23978±1684 9.883 360 22202±5002 16.594 380 17800±1142*33.125 3100 13841±3378*48.006 3120 4673±3910**82.447 3140 1648±760** 93.818 3160 236.3±80.0*99.11表6.青藤碱对小鼠静脉血碳粒廓清速率的影响组别 剂量动物数 光密度 K(mg/kg.d，ipxd) (X±SD) (％)对照 - 10 0.037±0.007-SIN150×5 80.036±0.0062.70SIN2100×5 80.031±0.00516.22SIN3150×5 80.026±0.006* 29.73K廓清速率*对照与治疗组相比较P＜0.05表7.青藤碱对自由基的清除作用(Fenton反应系统)组别n剂量每分钟脉冲数 IR(mol/l)(X±SD)(％)对照3- 77.50±7.97 -1 320 22.67±2.31**70.752 340 30.17±5.51**60.433 360 37.17±5.51**52.044 380 40.67±5.97**47.525 3100 53.00±3.28**31.61IR抑制率*对照组与治疗组相比较P＜0.05**对照组与治疗组相比较P＜0.01表8.青藤碱对超阴离子自由基的清除作用(黄嘌呤/黄嘌呤氧化酶的系统)组别n 剂量 信号强度 IR(mol/l) (X±SD)(mm) (％)对照3 - 56.67±2.76 -1 3 2×10-228.83±8.31**49.132 3 2×10-335.67±4.29**37.063 3 2×10-436.27±7.88**36.004 3 2×10-542.53±3.91* 24.955 3 2×10-640.13±4.26* 29.19IR抑制率*对照组与治疗组相比较P＜0.05**对照组与治疗组相比较P＜0.01表9.青藤碱鼠肝浆脂类过氧化物丙二醛生成的影响组别 n剂量每分钟脉冲数 IR(mol/l) (X±SD)(mm) (％)对照 4- 1.66±0.38 -1 45×10-30.48±0.06**71.082 44×10-40.61±0.08**63.253 45×10-51.02±0.64**38.55IR抑制率*对照组与治疗组相比较P＜0.05**对照组与治疗组相比较P＜0.01
实施例6青藤碱对实验性自身免疫性视网膜色素膜炎防治作用的观察(一)试剂与动物完全福氏佐剂(Complete Freund′s Adjuvant)购于GIBCO公司，百日咳杆菌疫苗(pertussis)90亿个/ml购自北京生物制品研究所，胎牛血清(Fetus Bovin Serum)购于GIBCO公司，RPMI-1640细胞培养基购自Sigma公司，其它试剂为国产分析纯试剂。盐酸青藤碱为北京医科大学天然与仿生药物国家重点实验室提供。实验动物系北京医科大学实验动物部提供的Wistar大鼠，雄性，体重约150g，健康无眼病。
(二)实验性自身免疫性视网膜色素膜炎大鼠模型的诱发兔视网膜S抗原100μg(1mg/ml)，与等体积完全福氏佐剂混合乳化，动物双后足庶底皮下注射，同时尾静脉注射百日咳杆菌疫苗0.21ml。
(三)动物模型的分组与治疗经S抗原免疫的动物模型，随机分为三组，分别用50mg/kg，100mg/kg及150mg/kg的盐酸青藤碱腹腔注射治疗(盐酸青藤碱溶液用0.9％灭菌氯化钠溶液新鲜配制，φ0.25μ微孔滤膜除菌，即刻应用)。对照组用0.9％灭菌氯化钠腹腔注射。正常对照组不做任何治疗，饲养条件与模型动物一致。治疗自抗原免疫后第二天开始，每天注射一次，至第二十一天末。
S抗原免疫后的动物每日用裂隙灯观察。临床分度参考WackerWB等的标准[Experimental allergic uveitis II Manifestationsproduced in the guinea pig by immunization with homologousretina Invest ophthalmology，8，381，1969]进行了修改。
0度(一)正常I度(+)角膜缘血管明显的充血，虹膜明显充血，瞳孔缩小，光反应迟缓，瞳孔区晶体前囊膜表面有细小点状渗出物。
II度(++)前房或玻璃体内有明显渗出。
III度(+++)前房积脓或浆液性视网膜脱离出现。
(四)酶免疫吸附法(ELISA)测定抗体的水平在S抗原免疫后第十四天及二十一天分别经尾静脉采血，分离血清测定S抗原抗体水平。方法采用酶联免疫吸附法(ELISA)，简之为将2μg/ml的S抗原溶液300μl加入96孔平底培养板内，4℃过夜。将抗原液吸出后，用0.02Mol/L，pH7.4磷酸缓冲液为上述缓冲液(含0.5％Tween-20)冲洗三次。每孔加入稀释血清样品300μl(稀释液为上述缓冲液内含0.5％牛血清蛋白)。37℃保温1小时后吸出样品，用磷酸缓冲液冲洗三次。加入300μl(HRP-IgG)辣根过氧化物酶IgG(200倍稀释)，于37℃保温1小时。吸出样品，用磷酸缓冲液冲洗三次。
加入0.04％邻苯二胺(OPD)溶液0.3ml，室温30分钟，8M硫酸0.05ml终止反应，495nm测定OD值。正常Wistar大鼠作为正常对照。
(五)淋巴细胞体外转化测定于S抗原免疫后第14天及21天，取大鼠眼眶血，分离淋巴细胞体外培养，用S抗原作为刺激物，培养及测定方法同前。观察指标为刺激指数(SI)。计算方法
(六)实验结果1.青藤碱对S抗原所诱发的EAU的防治作用三种剂量的青藤碱均不同程度地降低了实验性自身免疫性视网膜色素膜炎(EAU)的发生比率。从表10及附图7可以看出，用青藤碱50mg/kg体重治疗后，EAU的发生比率由对照组的90.9％下降至80.56％，下降了10.35％，其中三度病变者下降了约4.3％，二度病变下降了约4.1％，一度病变下降了约1.9％。但统计学上，对照组与治疗组比较，差异尚无显著意义。当青藤碱治疗剂量增加至100mg/kg体重时，EAU的发生比率明显下降，结果见表11及图8。治疗后EAU的发生比率由对照组的93.48％下降至68.18％。其中三度病变由对照组的47.8％下降至20.5％，二度病变由对照组的21.7％下降至9.1％。对照组与治疗组比较，统计学上有显著差异，P＜0.05。从表12及图9可以看出当青藤碱的治疗剂量增至150mg/kg体重时，EAU的发生比率同样明显下降。对照组的发生率是90.48％，治疗组为63.64％，减少了26.84％。其中三度病变由对照组的19.0％下降至治疗组的15.9％，二度病变由对照组的42.9％下降至治疗组的4.5％。对照组与治疗组比较，统计学上有显著差异，P＜0.05。实验结果表明青藤治疗可以明显降低S抗原诱发的EAU发生比率。
2.青藤碱治疗对EAU大鼠抗原之水平的影响用酶联免疫吸附法，对EAU大鼠抗S抗原之抗体水平进行测定的结果见表13。S抗原免疫后，抗S抗原体水平升高，在第14天时，OD值由正常对照的0.246增加至0.385，升高了约56.5％，到免疫后第21天时OD值增加至0.758，升高了大约3倍与正常对照组比较，统计学上均有显著性差异，P＜0.05和P＜0.01。经青藤碱治疗后，EAU大鼠抗S抗原之抗体水平虽然仍高于正常对照组，但比未治疗组有不同程度地下降。其中第14天时OD值由对照组的0.385降至治疗组0.291，两者比较的结果，统计学上无显著性差异，P＞0.05，第21天时，由对照的0.785降至治疗组0.641，两者比较的结果，统计学上有显著性差异，P＜0.05。以上结果表明，青藤碱治疗第三周后对抗S抗原之抗体的产生有明显的抑制作用。
3.青藤碱对EAU大鼠淋巴细胞体外转化的影响青藤碱对EAU大鼠淋巴细胞体外转化的影响见表14。在抗原免疫后第14天，对照组的刺激指数为3.94，治疗组刺激指数为2.29，下降约41.9％。第21天时，对照组及治疗组的刺激指数分别为4.69和3.21。治疗组刺激指数下降了约31.6％。两者比较的结果，统计学上均有显著差异，P＜0.05。以上结果表明青藤碱治疗两周后，EAU大鼠淋巴细胞体外对S抗原刺激所发生的增殖反应有明显抑制作用。
表10.青藤碱对Wistar鼠EAU的治疗作用(50mg/kgfor 21天)动物数 百分数(％)组别 总数p n p n对照 303 33 90.91 9.09治疗 297 36 80.56 19.44总数 5910 69 85.51 14.49p阳性(包括+～+++)n阴性(-)表11.青藤碱对Wistar大鼠EAU的防治作用(100mg/kg for21天)动物数 百分数(％)组别 总数p n p n对照 43 3 4693.48 6.52治疗 30 14 4468.18 31.82总数 73 17 9081.11 18.88p阳性(包括+～+++)n阴性(-)表12.青藤碱对治疗对EAU大鼠的防治作用(150mg/kg for21天)动物数百分数(％)组别总数p n p n对照38 4 4290.48 9.52治疗28 164463.64 36.36总数66 208676.74 23.26p阳性(包括+～+++)n阴性(-)表13.青藤碱治疗对EAU大鼠抗原之抗体的影响(100mg/kg)光密度492nm (X±SD)组别14天 (n) 21天 (n)对照0.385±0.017 (4) 0.758±0.013 (4)治疗0.291±0.010 (4) 0.614±0.056 (4)正常 0.246±0.027 (4)*对照与治疗组相比较P＜0.05表14.青藤碱治疗对S抗原刺激的EAU大鼠淋巴细胞转化的影响(100mg/kg)S-抗原(20μg/ml)14天 21天组别每分钟脉冲数SI每分钟脉冲数SI(X±SD) (X±SD) (X±SD) (X±SD)对照17232±3310 3.94±1.37 19339±4121 4.69±1.93治疗11817±3767 2.29±1.10 11936±3673 3.21±1.21SI刺激指数各组样品数为4*对照与治疗组相比较P＜0.0权利要求
1.一种预防和治疗视网膜色素膜炎的药物组合物，它含有青藤碱或其可药用盐和可药用的赋型剂。
2.权利要求1的组合物，该组合物为注射液、滴眼剂、眼用软膏或眼用膜剂。
3.权利要求2的组合物，所述组合物为滴眼剂或眼用软膏。
4.权利要求1的组合物，青藤碱或其可药用盐在组合物中的含量为2-5％。
5.一种预防和治疗视网膜色素膜炎的药物组合物的制备方法，该方法包括将有效量的青藤碱或其可药用盐与药用赋型剂相混合。
6.权利要求5或6的方法，所述药物组合物为注射液、滴眼剂、眼用软膏或眼用膜剂。
7.权利要求5或6的方法，青藤碱或其可药用盐在组合物中的含量为2-5％。
8.将青藤碱或其可药用盐用于制备预防和治疗视网膜色素膜炎的药物组合物的用途。
9.权利要求8的用途，其中药物组合物为注射液、滴眼剂、眼用软膏或眼用膜剂。
全文摘要
本发明公开了一种预防和治疗视网膜色素膜炎的组合物及其制备方法，以及将青藤碱用于制备预防和治疗视网膜色素膜炎的药用组合物的新用途。
文档编号A61K31/485GK1154843SQ9610031
公开日1997年7月23日 申请日期1996年1月18日 优先权日1996年1月18日
发明者陈雅研, 孙旭光 申请人:北京医科大学药学院