专利名称：链激酶基因及其分离与表达的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种生物工程药物，特别是链激酶的基因及其分离与表达。
链激酶(Streptokinase，简称SK)是由β-溶血性链球菌产生的一种分泌性蛋白，是体内血纤维蛋白溶酶原最有效的活化剂之一。1992年古巴有人在大肠杆菌中表达了链激酶基因(M.P.Estracla et al.High level expression of streptokinase in Escherichia coli.Bio/Technology vol.10，1992；1138-1142)。其方法是从似马链球菌染色体DNA中钓取分离到SK基因，并将其克隆至分泌性表达载体pEG-3中，诱导培养后，SK以分泌形式表达，重组蛋白约占菌体总蛋白的25％。菌体破碎后重组蛋白先后用亲和层析和阴离子交换层析方法得到SK纯品。此种方法的不足之处主要是表达水平低，给下游的纯化带来不少困难。
1993年国内也有人在大肠杆菌中表达了SK基因，但所用的基因是从国外引进的(丁皓 朱运松等，基因工程链激酶(r-SK)纯化及其单克隆抗体制备和鉴定，生物工程学报10(1)56-60，1994)。
本发明的目的是从中国人群分离的链球菌中钓取SK基因，提高其在大肠杆菌中的表达水平。
本发明的主要内容是1、SK基因的分离从中国人群中分离得到化脓性链球菌，用乙醇沉淀法大量提取其染色体DNA，以所提取的染色体DNA为模板，通过PCR方法(POLYMERASECHAIN REACTION聚合酶链式反应)大量扩增得到目的SK基因。2、SK基因的序列分析把分离到的SK基因插入M13mp19(单链噬菌体)中，根据相应的酶切位点做四个测序亚克隆，然后对全长SK基因序列进行序列分析。3、高效表达载体的构建把获得的SK基因和表达载体pBV220分别用EcoR I和BamH I双酶切消化，再用T4DNA连接酶把酶切回收后的pBV220和SK基因定向连接起来，获得有SK基因定向插入的重组表达载体，并命名为pBV-SK。4、SK基因的表达用热诱导方法诱导SK基因在大肠杆菌中表达。采用SDS-PAGE蛋白电泳法及薄层扫描法测定其表达水平。
本发明从中国人群中分离到的化脓性链球菌中钓取SK基因，SK基因在大肠杆菌中的表达水平占菌体总蛋白的60％以上。序列同源性比较表明其活性部位十分保守，但在非活性部位V1区(第522-732碱基)和V2区(第810-870碱基)有较大变异。重组蛋白的纯化产物具有溶解血块的生物学活性。
实施例1、SK基因的分离用乙醇沉淀法从中国人群中分离的化脓性链菌中大量提取染色体DNA，设计并合成一对特异性引物，引物序列如下上游引物5’-GGAATTCAATGCAAGCTATTGCCGGGACTG-3’下游引物5’-CGGGATCCAGAAGATCGTGGCTATTCATC-3’以所提取的染色体为模板，通过PCR方法大量扩增得到目的SK基因，PCR反应条件如下模板DNA 10μl上游引物1μl下游引物1μldNTP2μl10×Buffer 10μl灭菌水 75.5μl95℃，10分钟后加入0.5μlTag DNA聚合酶，然后循环30次，每个循环包括94℃ 1’→50℃ 30”→72℃ 70”。2、SK全长序列分析把得到的SK基因定向插入M13mp19(单链噬菌体)方法如下双酶消化SK基因M13mp19Ecok1 1μl 1μlBamH1 1μl 1μl10×Buffer 2μl 2μlSK的PCR产物16μl M13mp19 2μl灭菌水14μl20μl 20μl37℃反应2小时，然后用低熔点琼脂糖的方法分别回收酶切片断。再用T4DNA连接酶把回收后的M13mp19和SK基因连接起来，反应如下回收后的SK基因 7μl回收后的M13mp19 1μl10×T4DNA连接酶缓冲液1μlT4DNA连接酶 1μl10μl16℃温浴过夜。把反应完全的连接液转化，用氯化钙制备的新鲜大肠杆菌(JM101)的感受态细胞中，(方法参见J.Sambriik et al，Molecu-lar cloning a laboratory Mannual，2nd Edition 1989，CSH)。
挑取无色噬菌斑，筛选有SK基因插入的重组质粒，用Backman自动测序仪对全长SK基因进行序列分析。
序列分析表明与国外报道的基本一致。但有一小部分碱基发生变异。同源性比较表明，我们所获得的SK基因与古巴研究组获得的SK基因的同源性为87％，差异性主要集中在V1区(第522-732碱基)和V2区(第810-870碱基)。
r-SK编码区核苷酸序列如表1。表1r-SK编码区核苷酸序列***** SequenceSKSP1 *****Sequence length 1245 Residues10 20 30 40 50 60ATTGCTGGGT ATGGGTGGCT ACCAGACCGT CCACCTATCA ATAACAGCCA GTTAGTTGTG70 80 90100110120AGTATGGCAG GTATCGTTGA AGGTACCGAT AAAAAAGTTT TTATAAATTT TTTTGAAATC130140150160 170 180GATCTAACAT CACAACATGC TCACGGAGGA AAGACAGAGC AGGGCTTAAG TCCAAAATCA190200210220 230 240GAACCATTTG CTACAGATAA TGGCGCAATG CCACATAAAC TTGAAAAAGC TGACTTATTA250260270280 290 300ACAGCTATTC AAAAACAGCT GATCGCTAAC GTTCACAGTA ACGACGGCTA CTTTGAGGTC310320330340 350 360ATTGATTTTG CAAGCGATGC AACCATTACT GATCGAAACG GCAAGGTCTA CTTTGCTGAC370380390400 410 420AAAGATGGTT CGGTAACCTT GCCGACCCAA CCTGTCCAAG AATTTTTGCT AAGCGGGCAT430440450460 470 480GTGCGCGTTA GACCATATAA AGAAAAACCA GTACAAAATC AAGCGAAATC TGTTGATGTG490500510520 530 540AAATATACTG TACAGTTTAC TCCTTTAAAC CCTGATGACG ATTTCAGACC AGGTCTCAAA550560570580 590 600GATACTAAGC TATTGAAAAC ACTAGCTATC GGTGACACCA TCACATCTCA AGAATTACTA610620630640 650 660GCTCAAGCAC AAAGCATTTT AAACAAAACC CACCCAGGCT ATACGATTTA TGAACGTGAC670680690700 710 720TCTCATTGGC GGTTGACATT TTTCCCGGAC GATTTTTACC CGAGTGGAAT CCAAGAGTTT730740750760 770 780ACTTTACCGT TTCCAAAGAC CGGGAAACAA GCTTATGGGA TCAATAAAAA ATCTGGTCTG790800810820 830 840AATAAAGAAG GAAACAACAC TGACCTTATC TCTGAGAAAT ATTACATCCT TAAAAAAGGA850860870880 890 900GAGTCTCCGT ATGATCCCTT TGATCGCAGT CACTTGAAAC TGTTCACCAT CAAATACGTT910920930940 950 960GATGTCAACA CCAACGAATT GCTAAAAAGC GAGCAGCTCT TAACAGCTAG CGAACGTAAC970980990 1000 1010 1020TTAGACTTCA GAGATTTATA CGATCCTCGT GATAAGGCTA AACTACTCTA CAACAATCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080GATGCTTTTG ATATCATGGA CTATACCTTA ACTGGAAAAG TAGAGGATAA TCACGATAAG1090 1100 1110 1120 1130 1140AATAATCGTG TCGTCACAGT TTATATGGGT AAGCGCCCTA AAGGGGCAAA GGGTAGCTAT1150 1160 1170 1180 1190 1200CATTTAGCTT ATGATAAAGA TCTCTATACC GAAGAAGAAC GAAAAGCTTA CAGCTACCTG1210 1220 1230 1240 1250 1260CGTTATACAG AGACACCTAT ACCTGATAAC CCTAAAGACA AATAA3、高效表达载体的构建把获得的SK基因和载表达载体pBV220用Ecok1和BamH1双酶切消化。步骤如下外源SK基因 pBV220Ecok1 1μl1μlBamH1 1μl1μl10×Buffer 2μl2μlSKPCR产物 16μl pBV220 2μl灭菌水 14μl20μl 20μl37℃酶切2小时，然后用低熔点琼脂糖的方法回收酶切片段，再用T4连接酶把酶切回收后的pV220和SK基因定向连接起来，连接反应如下回收后的SK基因 7μl回收后的pBV220 1μl10×T4DNAligase buffer 1μlT4DNAligase buffer 1μl20μl
混合液温育过夜。把反应完全的反应物转化用氯化钙制备的新鲜大肠杆菌(DH5α)的感受态细胞中，(方法参见J.Sambriik et al，Molecular cloning a laboratory Mannual，2nd Edition 1989，CSH)。用氨苄青霉素作为筛选标志。尔后提取抗性菌落中的质粒DNA，用Ecok1和BamH1双酶切作进一步的鉴定，获得有SK基因插入的重组质粒，并命名为pBV-SK。4、SK基因的诱导表达包含有重组质粒pBV-SK的重组克隆用LB培养基活化后以1％的比例接种于加有氨苄青霉素的新鲜MacA培养基中，30℃培养至对数中期(其OD值为0.4-0.6)，然后立刻转入42℃水浴中继续培养4-5小时。离心用TE悬浮沉淀，加入等体积的加样缓冲液，SDS-PAGE蛋白电泳。在分子量47KD处出现一特异带，对照菌中此位置无相应带。薄层扫描表明SK基因的表达量大于60％。
权利要求
1.生物工程药物链激酶(r-SK)，其特征为，该药物是从中国人群中分离到的链球菌中钓取的基因表达而得。
2.根据权利要求1所述的链激酶，其核苷酸编码序列如下***** SequenceSKSP1 *****Sequence length 1245 Residues10 20 30 40 50 60ATTGCTGGGT ATGGGTGGCT ACCAGACCGT CCACCTATCA ATAACAGCCA GTTAGTTGTG70 80 90100110120AGTATGGCAG GTATCGTTGA AGGTACCGAT AAAAAAGTTT TTATAAATTT TTTTGAAATC130140150160170180GATCTAACAT CACAACATGC TCACGGAGGA AAGACAGAGC AGGGCTTAAG TCCAAAATCA190200210220230240GAACCATTTG CTACAGATAA TGGCGCAATG CCACATAAAC TTGAAAAAGC TGACTTATTA250260270280290300ACAGCTATTC AAAAACAGCT GATCGCTAAC GTTCACAGTA ACGACGGCTA CTTTGAGGTC310320330340350360ATTGATTTTG CAAGCGATGC AACCATTACT GATCGAAACG GCAAGGTCTA CTTTGCTGAC370380390400410420AAAGATGGTT CGGTAACCTT GCCGACCCAA CCTGTCCAAG AATTTTTGCT AAGCGGGCAT430440450460470480GTGCGCGTTA GACCATATAA AGAAAAACCA GTACAAAATC AAGCGAAATC TGTTGATGTG490500510520530540AAATATACTG TACAGTTTAC TCCTTTAAAC CCTGATGACG ATTTCAGACC AGGTCTCAAA550560570580590600GATACTAAGC TATTGAAAAC ACTAGCTATC GGTGACACCA TCACATCTCA AGAATTACTA610620630640650660GCTCAAGCAC AAAGCATTTT AAACAAAACC CACCCAGGCT ATACGATTTA TGAACGTGAC670680690700710720TCTCATTGGC GGTTGACATT TTTCCCGGAC GATTTTTACC CGAGTGGAAT CCAAGAGTTT730740750760770780ACTTTACCGT TTCCAAAGAC CGGGAAACAA GCTTATGGGA TCAATAAAAA ATCTGGTCTG790800810820830840AATAAAGAAG GAAACAACAC TGACCTTATC TCTGAGAAAT ATTACATCCT TAAAAAAGGA850860870880890900GAGTCTCCGT ATGATCCCTT TGATCGCAGT CACTTGAAAC TGTTCACCAT CAAATACGTT910920930940950960GATGTCAACA CCAACGAATT GCTAAAAAGC GAGCAGCTCT TAACAGCTAG CGAACGTAAC970980990 1000 1010 1020TTAGACTTCA GAGATTTATA CGATCCTCGT GATAAGGCTA AACTACTCTA CAACAATCTT1030 1040 1050 1060 1070 1080GATGCTTTTG ATATCATGGA CTATACCTTA ACTGGAAAAG TAGAGGATAA TCACGATAAG1090 1100 11101120 11301140AATAATCGTG TCGTCACAGT TTATATGGGT AAGCGCCCTA AAGGGGCAAA GGGTAGCTAT1150 1160 11701180 11901200CATTTAGCTT ATGATAAAGA TCTCTATACC GAAGAAGAAC GAAAAGCTTA CAGCTACCTG1210 1220 12301240 12501260CGTTATACAG AGACACCTAT ACCTGATAAC CCTAAAGACA AATAA
3.根据权利要求1所述的链激酶基因的分离，其特征为所用特异性引物序列如下上游引物5’-GGAATTCAATGCAAGCTATTGCCGGGACTG-3’下游引物5’-CGGGATCCAGAAGATCGTGGCTATTCATC-3’
全文摘要
本发明涉及生物工程链激酶基因及其分离与表达。本发明从中国人群中分离得到的化脓性链球菌中提取其染色体DNA，通过聚合酶链式反应(POLYMERASECHAINREACTION)大量扩增得到目的SK基因。SK基因在大肠杆菌中的表达水平占菌体总蛋白的60％以上，序列同源性比较表明其活性部位十分保守，但在非活性部位V1区(第522-732碱基)和V2区(第810-870碱基)有较大变异。
文档编号A61K38/43GK1161376SQ9610336
公开日1997年10月8日 申请日期1996年4月4日 优先权日1996年4月4日
发明者周俐梅, 王嘉玺, 邹民吉 申请人:北京埃尔法生物医学技术有限公司, 北京四环医学技术贸易公司