专利名称：马莱克氏疾病疫苗的制作方法
技术领域：
本发明是关于一种改良的马莱克氏疾病病毒[MDV]疫苗株，以及该病毒的生长方法和包含该病毒的疫苗。
马莱克氏疾病病毒会给家禽工业带来严重的经济损失。大部分严重的经济损失是由血清1型野生型病毒引起的。血清2型和3型也可在该领域中发现。血清1型是一种致癌基因株，血清2型是非致癌基因，血清3型是一种火鸡疱疹病毒(HVT)。不同的类型在它们的抗原特性方面具有高度的相似性，但是临床重要性方面又各不相同。
为了降低由马莱克氏疾病[MD]引起的经济损失，已经研制了疫苗。抗MD的疫苗来自于上述三种血清型。本发明是关于血清1型疫苗病毒。
血清1型MD病毒在体外通常与细胞密切相关。作为这种病毒生长的基质，小鸡胚胎成纤维细胞(CEF)经常被使用。但应用CEF有一些不足之处。CEF是从胚胎化的特异无病原体的鸡蛋中获得。为了获得足够的细胞，需要大量这种昂贵的鸡蛋，而且，收获这些细胞要消耗时间和精力。CEF的质量是变化的，收获的过程要求大量无菌操作，否则很有可能被污染。
在现有技术中，已经描述了几种可以用来生长MDV的细胞型，例如从火鸡、鹅、鸽子野鸡、鹑，以及日本鹌鹑的胚胎中得到的原始成纤维细胞培养物。然而，得到可以产生疫苗病毒的连续细胞系却是非常方便的。
使用连续细胞系获得产品的优点是细胞样品可以很容易地从已经建立并被很好控制的细胞库中获得，细胞库储存在如液氮之中。连续细胞系的质量要比CEF稳定，因为使用连续细胞系费力较少，必须实行的无菌操作较少，被污染的危险也比较低。
令人惊奇的是，现在已经发现MOV血清1型可以在一种连续鸟细胞系中顺利生长。尤其是可以使用鹌鹑细胞系如QT35(日本鹌鹑肿瘤)细胞系。已能适应生长的病毒可以在鸟类细胞系中生长并产生足够高产量的疫苗商品。实验证据表明已适应在例如QT35细胞中繁殖的疫苗病毒还能在小鸡中诱导对抗MD的保护免疫性。这种适应生长的马莱克氏疾病病毒株可源自毒性减弱了的MDV株，例如毒株Rispens，CVI988。
这个发现很令人惊奇，因为从现有技术(cho，1981，Aviandiseases 25839-846)中已经知道可以用一项实验将血清1型病毒与血清3型病毒区分开，实验中QT35细胞系用作病毒基质。接种血清3型病毒会导致明显的细胞病理学效应(c.p.e.)而接种血清1型病毒后没有检测到c.p.e.，表明这些病毒在QT35细胞中生长不充分。
连续或已建立的细胞系培养物的生长不受条件限制并可无限传代。这与只能维持几代的原始细胞培养物形成对照。原始细胞培养物是细胞的体外培养物，它们是直接从如肝、肾、脾、蛋等组织分离出来的。如果这些供给细胞的组织被微生物污染，那么细胞被污染的可能性也就会很高。甚至对于那些供给细胞或卵的动物的各个方面都进行控制并严格要求其居住条件，也不能保证细胞不带有无关因素。
使用已建立细胞系使建立细胞库成为可能。这是一大批充满alicots的细胞，储存在例如液氮之中。这些细胞都被广泛检测以证实不存在无关因素。因而由于使用这个细胞库而成为产品污染源的风险极其小。而且，与原始细胞培养物相比，已建立细胞系的使用明显地降低了终产品受到污染的危险。
与原始细胞培养物相比，来自细胞库的已建立细胞系的另一优点在于其质量稳定可靠。细胞系的每一个alicot具有相同的质量。与此相对比，以前细胞的质量依靠提供组织的动物或蛋的情况而定。
为了制备适应生长的MDV，用毒株CV1988在QT35细胞中传代。发现病毒在传第一代时增殖程度非常低。在滚瓶(roller bottle)中应用传染的高多重性可以得到一些细胞病理学效应(c.p.e.)。还发现在滚瓶中连续传代许多次之后，病毒产量增加了。相反，在固定培养(鲁氏瓶，每瓶75cm2)传代期间，病毒消失了。
图1表示的是MDV的CV1988株以滚瓶或鲁氏瓶两种培养方式在QT35细胞上适应生长的情况，两种瓶中的每一次传代都分别有一个病毒滴度(以每3.107个细胞的10logTCID50表示)与之相对应。在滚瓶中传代足够多次之后，病毒产量非常高，以至于可获得一个有利可图的生产系统。可以看到，在滚瓶中第12次传代之后，病毒滴度增加了。
随后又进行了适应生长实验。在这个实验中，传代期间滴度也增加了。为了阅明适应效应，在第二代中产生每3.107个细胞为106.03的TCID50滴度，从一个滚瓶中收获的病毒能接种5个有QT35细胞的滚瓶。在第19代中，产生每3.107个细胞107.02的滴度，一个滚瓶的产量足够接种50个滚瓶。
在适应试验中，做了一些尝试以提高病毒滴度。在一些情况下，收荻的病毒不接种在QT35单细胞层上，而是与新鲜制备的QT35细胞悬液混合，然后种在滚瓶中。在另一些情况下，收获得的病毒不与新鲜细胞混合，而是将收获得物简单地传代培养于空的滚瓶中。这样操作也可以使收荻得的病毒有足够高的滴度继续传代。对于在QT35细胞上的繁殖，传染的高多重性是关键。直到最后，高病毒滴度也是需要的。收荻之后，病毒通常是直接传代，不需要冷冻。为了检查收荻的病毒悬液中病毒的含量进行了免疫荧光测定。
QT35细胞系的发展，已经由Moscovici等人表述了(1977cell 1195-103)。QT35细胞系是由日本鹌鹑甲胆蒽诱导的纤维肉瘤建立起来的。这个细胞系的样品保存在ATCC(Rockville，MD，USA)中，储存号第CRL 10967。
QT35细胞可以用适合于锚基(anchorage)依赖性细胞的多种培养方法来生长。例如，细胞可以生长在滚瓶，立方细胞器(cellcube)中和微量载体上，这些器皿由明胶，塑料或玻璃构成或者包含有这些物质。
细胞也可以用各种细胞培养基或复合细胞培养基来生长。这样的培养基如下1.Ham′s F10，补充有2％的2.8％碳酸氢钠溶液，100个国际单位(IU)青霉素，10％磷酸盐肉汤，8％胎牛血清及2％鸡血清。(Moscovici et.al.，cell 11，page 95-103，05-1977)。2.含有Hanks盐的培养基199，补充有0.3％的磷酸胰化蛋白胨肉汤，0.477％HEPES以及10％胎牛血清。(Fiorentine et.al.，Develop.biol.standard 60，page 421-430，1985)。3.Eagle′s MEM 含有10％的成年牛血清以及抗生素(青霉素100iu/ml，新霉素100μg/ml和100μg/ml)(Reddy et al.IdianVet.J.68，page 907-910，1991)。4.44％的营养混合物F-10和56％的培养基199，补充有5％磷酸胰化蛋白胨肉汤，10％胎牛血清，10μg/ml庆大霉素，10mM HEPES及0.015％碳酸氢钠。(Schnitzlein et al.，Virus Research 10，page 65-76，1988)5.ham′s F12培养基。
这些细胞培养基或复合细胞培养基可以也可不补充现成可获得的能量源(尤其是糖，如葡萄糖、果糖和/或核糖)和/或补充氨基酸源如蛋白质(如牛乳蛋白和/或血清蛋白)。
对于QT-35细胞的传代培养，可以使用蛋白水解酶如胰蛋白酶和胶原酶。
在冻结保护剂如二甲基亚砜(DMSO)或甘油存在下可将细胞冷冻。细胞以及带有病毒的细胞的冷冻方法，是将温度逐渐降低，例如每分钟降低1℃，直到所需的贮藏温度，贮藏优选液氮的温度。
疫苗的稀释剂可以是任何生理学溶液，但优选磷酸盐缓冲的含有NZ-胺的蔗糖溶液。
实施例1疫苗产品产品生产的最初原料是已经在QT35细胞上传代16次的毒株CV1988。这个传代16次后的病毒原料样品于1995年6月7日以储存号第1-1585存放在巴斯德学院(法国，巴黎)的CollectionNational de Microorganismes(CNCM)。
在产品生产中，细胞和病毒通常都在39℃下生长。为得到疫苗产品，将QT35细胞以8.8×104个细胞/cm2的浓度种在滚瓶中，然后孵育。孵育三天后，滚瓶与传染多重性(m.o.f.)为0.01的第16代病毒共同孵育。4天后，以胰蛋白酶作为收荻传染培养物，得每个滚瓶43.1×107个细胞(8.8×105/cm2)。
一份样品被滴定而用另一份样品接种(接种率1∶20)带有QT35单细胞层的滚瓶。这些细胞在3天前以8.8×104个细胞/cm2的浓度种好。接种3天后，用胰蛋白酶作用收获传染的单细胞层。每个滚瓶收获得58.8×107个细胞(12.0×105个细胞/cm2)。离心浓缩细胞悬液并在凝固培基中稀释至浓度为3×107个细胞/ml。此细胞悬液装入1ml小瓶中于液氮中冻存。这些安瓿被称为MasterSeedVirus(MSV)。总共24个安瓿冻存于液氮中。两个安瓿被滴定，滴度显现106.20TCID50/ml。
为得到工作种子病毒(WSV)产品，在滚瓶中种好细胞，浓度为8.7×104个细胞/cm2，然后孵育。滚瓶用moi为0.01的MSV接种。孵育4天后，用胰蛋白酶收获感染培养物，得每瓶55.4×107个细胞(11.3×105个细胞/cm2)。
一份样品被滴定而用另一份样品接种(比率1∶20)QT35单细胞层。这些单细胞层在3天前以8.7×104个细胞/cm2的浓度种好。病毒生长3天后，用胰蛋白酶收获感染的单细胞层。每个滚瓶收获细胞32.6×107(6.65×105个细胞/cm2)。离心浓缩此细胞悬液，并在凝固培基中稀释至浓度为3×107个细胞/cm2。将此细胞悬液装入1ml安瓿中，在液氮中冷冻。一份样品被滴定，滴度显现106.20TCID50/ml。这些安瓿被称为＂工作种子病毒＂。
为得到疫苗产品，将QT35细胞以8.7×105个细胞/cm2的浓度种于滚瓶中。播种三天后，用moi为0.01的工作播种病毒接种滚瓶。孵育4天后，用胰蛋白酶作用收获传染培养物。每瓶收获得细胞59.6×107个(12.2×105个细胞/cm2)。
一份样品被滴定，而用另一份样品接种(比率为1∶20)QT35单细胞层。这些单细胞层在3天前以8.7×105个细胞/cm2的浓度种好。4天后，用胰蛋白酶作用收获传染培养物。
一份样品被滴定，而用另一份样品接种(比率1∶30)QT35单细胞层。这些单细胞层在3天前，以8.7×105个细胞/cm2的浓度种好。三天后，以胰蛋白酶作用收获得传染的单细胞层。
离心浓缩细胞悬液，并在凝固培基中稀释至浓度为3×107个细胞1ml。将此细胞悬液装入1ml小瓶中，并冻存于液氮中。一份样品被滴定，滴度显现为106.72TCID50/ml。这些安瓿被称为一批第23代疫苗生产日期1995年3月13日。
用于接种的是第23代。也就是从MSV起5代。由1小瓶MSV可以生产±1200安瓿工作种子病毒。用1安瓿工作种子病毒我们可以生产±37500安瓿疫苗，接种37,500,000只鸡。
实施例2由QT35细胞上适应生长的毒株Rispens产生的疫苗的功效疫苗功效的检测使用在欧洲药典对马莱克氏疾病疫苗的专著589(1994)中所描述的方法，只是鸡是在接种5天后被激发免疫，而不是专著处方规定9天的间期。是5天后而不是9天后再激发，这样使检测更灵敏。为了在QT35细胞上传代，Poulvac Marek CVI369批被用作最初原料。检测按实验例1在QT35细胞上传代21次的疫苗病毒。
一天龄SPF小鸡以常规疫苗量的剂量(103.0TCID50或更高)接种一次。接种5天后，将这些鸡用致病性马莱克氏疾病病毒株激发。激发后，常规性检查这些鸡有无马莱克氏疾病症状。激发70天后，将所有的鸡杀掉，调查马莱克氏疾病的宏观损伤。
研究的结果总结于表1
这个结果表明，在未接种组，有86％的鸡染上马莱克氏疾病(符合欧洲药典)。因此，产生于QT35细胞的疫苗符合欧洲药典规定的保护指数应至少是80％的指标。
结论上述实验表明，产生于QT35细胞的马莱克氏疾病疫苗是有效的。
权利要求
1.适于生长在一种鸟类连续细胞系上的马莱克氏疾病毒[MDV血清1型]。
2.权利要求1中的病毒，其特征为该鸟类细胞系是一种鹌鹑细胞系。
3.权利要求2中的病毒，其特征为该鹌鹑细胞系是一种QT-35细胞系。
4.存放在巴斯德学院(法国巴黎)的CNCM处的毒株1-1585MDV。
5.一种保护家禽抵抗马莱克氏疾病的疫苗，其特征为包含一种适于在一种鸟类连续细胞系上生长的MDV病毒材料。
6.权利要求5的疫苗，其特征为该鸟类细胞系是一种鹌鹑细胞系。
7.权利要求6的疫苗，其特征为该鹌鹑细胞系是一种QT-35细胞系。
8.一种保护家禽抵抗马莱克氏疾病的疫苗，其特征为它包含来自毒株1-1585的MDV的病毒材料，该毒株存放在巴斯德学院(法国，巴黎)的CNCM处。
9.生长MDV的方法，其特征为将权利要求1-5的病毒生长在一种它所适应的合适的连续细胞系中。
全文摘要
本发明涉及适应生长于一种鸟类连续细胞系尤其是鹌鹑细胞系QT-35的马莱克氏疾病病毒，也涉及该适应生长病毒在鸟类连续细胞培养物上的生长方法以及包含此病毒的疫苗。
文档编号A61P31/12GK1147015SQ9611101
公开日1997年4月9日 申请日期1996年6月10日 优先权日1995年6月12日
发明者H·E·M·施皮克斯, J·J·卢韦伦斯 申请人:杜法尔国际研究公司