专利名称：牛乙肝病毒的应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及医学——预防医学——微生物与免疫学领域，尤其涉及一种牛乙肝病毒及其表达产物在制备人乙肝疫苗、乙肝免疫球蛋白及其表达产物与相关产品中的应用。
乙型肝炎病毒(HBV，Hepatitis B virus)感染是人类面临的难题之一，全世界每年用于治疗HBV感染所致疾病的医疗费用高达数十亿美元。
中国是HBV感染的高度流行区域，推广应用乙型肝炎疫苗是全世界及中国的重要卫生措施。
对HBV感染的预防不仅可减少乙型肝炎病人，且可降低肝硬化及原发性肝癌的发病率，因而对每个家庭都具有重要的社会效益和显著的经济效益。
已有技术中，用于预防和控制HBV感染的有效制品是人血源乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白(HBIG，Hepatitis B Immuno-globulin)类产品，都需要从HBV携带者人群中采血，为确保安全性，制备疫苗和HBIG的过程采取了异常严格的技术措施。因而已有技术存在来源困难，设备要求高和成本高等缺陷。
本发明的发明目的，是为上述免疫制剂提供一种新的来源——用牛血源代替人血源，即直接从携带牛乙型肝炎病毒(OHBV，Oxenhepatitis B virus)的牛血清中提取相关的抗乙型肝炎病毒表面抗原抗体(抗-HBs，Anti to hepatitis B surface antigen)或用OHBV及其表达产物，免疫牛或其它动物，以获取、制备用于人的，阻断HBV感染的HB疫苗和HBIG。
使上述免疫制剂的生产，开拓新的广泛来源，安全性高并可大幅度降低成本和设备要求。
本发明的目的是通过如下技术方案实施的设计一种利用感染了OHBV的牛血清中OHBV及其表达产物，包括牛乙型肝炎病毒核心抗原(OHBcAg，Oxen hepatitis B coreantigen)、牛乙型肝炎病毒中间抗原(OHBeAg，Oxen hepatitis B“e”antigen)、牛乙型肝炎病毒表面抗原(OHBsAg，Oxen hepatitisB surfaee anfigen)及其它相关产物和抗原等，其提取、纯化及浓缩可利用沉淀法、离心法、平衡法、层析法、离子交换法和/或其综合法，在制备用于人类的，阻断HBV感染的HB疫苗和HBIG，及其表达产物与其相关产品中的应用，其特征是在制备应用中a、采用完整OHBV及OHBV的各种表达产物如OHBcAg、OHBeAg、OHBsAg及其它相关产物和抗原。
b、从感染了OHBV牛血清中分离OHBV，进一步分析其基因序列及相应表达产物的氨基酸序列，采用OHBV的各个不同核酸序列及相应表达产物，包括OHBcAg、OHBeAg和/或OHBsAg及其它相关产物和抗原等的应用与开发。
上述的应用包括乙肝疫苗及其相关产品如高效价HBIG，也包括制备新的HBV动物模型等。
上述的应用中，所述的在相关产品中的应用是指利用牛血清及含OHBV牛血清用于检测、鉴定及提高质量为目的，与HBV感染标志物相关的各种试剂盒(例如，乙肝酶联试剂盒、放射免疫试剂盒、血凝试剂盒等)中的应用，及用牛血清及含OHBV的牛血清作被检测物等。
上述的应用中，所述的在相关产品中的应用，是指牛血清及含OHBV牛血清在制备除已有技术中的鸭HBV及土拨鼠HBV感染模型外新的OHBV感染动物模型(如羊)中的应用。以用于抗病毒试验、发病机理等方面的研究。
以上技术方案的依据是用只是感染动物的引起动物病变的病原体，用于人类疾病预防的事例已有非常成功的先例——牛天花病毒制备的疫苗去预防人类天花病毒感染，在人类战胜天花的过程中立下了不可磨灭的功勋。
在牛血清中可以检测到HBV感染的相关指标，包括HBsAg及抗乙肝病毒表面抗原抗体(抗-HBs，Anti to Hepatitis B surfaceantigen)，但未检测到HBeAg及抗乙肝病毒核心抗原抗体(抗——HBc，Anti to Hepatitis B core antigen)。提示牛血清中的OHBV与HBV有同源基因，主要在表面抗原抗体(S基因)系统，但不涉及到核心部分，即有相同点，又无传播OHBV给人的危险。
用人血清中HBV的HBsAg可以抑制牛血清中检测到的抗——HBs。
用牛血清中检测到的抗——HBs可抑制人血清中的HBsAg。
用人血清中抗——HBs可以抑制牛血清中的HBsAg。
从牛血清分离OHBV，进一步分析其基因序列及相应表达物的氨基酸序列，同时与HBV及其相应表达产物序列比较，则可以具有下列用途，进一步了解HBsAg的主要功能基因，进而提取该基因去用于制备乙肝疫苗及HBIG。
目前，用不同品牌的乙肝试剂盒测牛血清，某种指标例如e抗体结果大部分不同，问题在于试剂盒的生产制备中使用了牛血清或牛血清白蛋白，故一方面要求生产中不得使用牛血清；另一方面应将牛血清(特别是感染了OHBV的牛血清)作为一种鉴定(检定)HBV各类试剂盒的一个标准物，即在加样中应留出牛血清待测孔，而不仅只是目前的人血源阳性或阴性血清。采集感染了OHBV的牛血清，标定剂量或滴度用于检测标准物。在检测试剂盒质量时加入该标准物作为检测指标的一种，结果该标准应阴性，其结果阳性应视为该试剂盒不合格，如此将有效提高目前市售乙肝检测试剂盒的质量。
制备乙肝疫苗时，为获取大量OHBV，可用完整的OHBV去感染牛或其他动物，以得到制备乙肝疫苗的原料。
提取、纯化及浓缩OHBV及其表达产物，(例如，HBIG及OHBsAg等)可采用下列方法，例如密度梯度率离心法(速率区带法、等密度区带法、区带转头技术)、聚乙二醇沉淀法、氯化铯密度梯度离心法及改良法、氯化铯同密度沉降沉淀平衡法、区带离心沉淀法、四步综合法、胃酶消化亲和层析法、单纯亲和层析法、超速离心法、低温超(高)速离心法、各浓度饱和硫酸铵沉淀法、胃蛋白酶消化—DEAE纤维素(Diethylamine ethyl cellulose)离子交换层析——亲和层析——凝胶过滤法、胃蛋自酶消化——DEAE纤维素离子交换层析——区带离心法、硫酸铵提纯——DEAE纤维素层析法、硫酸铵提纯——葡聚糖凝胶G200层析和/或上述方法的综合利用。
用目前已有技术生产人血源乙肝疫苗的方法制备牛血清OHBsAg性质乙肝疫苗。
制备HBIG时，免疫未感染OHBV的牛或其他动物(例如羊)，同时加免疫佐剂，测定牛血中HBIG含量至达有效、有价值浓度后，采血，用前述方法提取、浓缩HBIG。
综上所述，采用本发明用OHBV及其表达产物，在制备人乙肝疫苗HBIG及其表达产物与相关产品中的应用，具有明显的积极效果，例如1、用牛血清制备抗——HBs以替代目前的人血源HBIG，达到安全、经济、高产的效果。
2、用OHBV或其OHBsAg替代目前的人血源乙肝疫苗，不仅安全，且可使产量提高成本大幅度下降。
3、HBIG可以用于HBV暴露高危人群预防，前景广阔。
4、对乙肝疫苗及HBIG的研究与开发提供了新的思路。
以下结合实施例对本发明作进一步阐述实施例材料与方法1、待测牛血清采自当地某处牛群。其中3～10月龄小牛10只，3～12年龄成年牛20只。
2、试剂盒10只小牛曾用上海传医试剂盒检测抗-HBc(目测)。其余各项试剂盒均系上海实业科华生物技术有限公司产品(立可读，EIA-TMB)，其中检测HBsAg(批号951018)；检测抗-HBs(批号951210)；检测HBeAg(批号951226)；检测抗-HBe(批号951215)。
3、实验方法严格按照说明书操作及判读结果。OD450nm测定用南京产DG3022酶联仪。
4、对照及抑制试验用血清均系各试剂盒原配备，混合后重新确认。
结果与分析1、抗-HBc测定检测10份小牛血清，均为阴性(目测法)。
2、HBeAg测定检测30份牛血清，均为阴性(OD450nm范围0.00～0.07。两份阴性对照均为0.00，两份阳性对照分别为1.34和1.55。
3、抗-HBe测定3.1检测结果两份阳性对照OD450nm值均为0.00，两份阴性对照OD450nm值分别为0.58和0.69。按照说明书方法计算COV值并判断结果。
(标本OD值≥COV为阴性，<COV为阳性>
据上标准，有三份标本≥0.3175；15份标本OD值0.11～0.3174；8份标本为0.05～0.10；4份标本≤0.04。即90％的牛血清抗——HBe抗体检测阳性。
3.2抑制试验取OD值最低的3份牛血清用HBeAg阳性对照按1∶1加入，37℃，30min，离心取上清；同时对HBeAg阳性对照也按1∶2稀释。检测结果见表1表13份抗-HBe阳性牛血清用HBeAg抑制试验结果(OD450nm)牛血清 对照人血清血清号 未稀释 1∶2稀释 HBeAg抑制 血清号1∶2稀释110.030.33 0.490.570.63(-)0.780.75150.040.38 0.390.640.61(+)0.040.00200.040.46 0.550.780.68
据表1.结果，可见经1∶2稀释后No.20血清转阴，该份血清经HBeAg抑制后OD值明显高于另两份血清；另两份血清抑制后均转阴。此试验初步证实在牛血清中可检测到抗-HBe抗体。
4、HBsAg测定共检出阳性血清5份，阳性率16.67(5/30)。同前法选出3份血清用抗-HBs阳性血清作抑制试验，抑制率分别为15.38(No.12)，42.86％(No.15)及0.00％(No.18)。
用HRP-HBe及HRP-抗HFRS抗体分别替代HRP-抗HBs，结果发现HRP-抗HFRS组均阴性，但HRP-抗HBe组则有1份血清出现阳性，1份处于临界值，另1份则为阴性。这一结果提示了两个可能存在的问题，即①牛血清中的牛乙型肝炎病毒的核酸序列(氨基酸序列)可能与人乙型肝炎病毒有重叠，但也有差异；②试剂盒的特异性问题——是否是封闭液中采用了牛血清而非牛血清白蛋白？！5、抗-HBs检测5.1.抗-HBs抗体检出率13.33％(4/30)5.2.抑制试验如同前法，用HBsAg与HBeAg双阳性血清及基因重组HBcAg作抑制试验，结果见表2。
表2.4份抗-HBs阳性牛血清用HBsAg+HBeAg及HBcAg抑制试验结果(OD450m)血清号 未稀释 1∶2稀释 HBeAg+HBsAg抑制 抑制率(％) HBcAg抑制抑制率(％)7 0.230.13 0.10 0.04 0.03-69.570.16 0.20 +56.52121.410.75 0.79 0.74 0.61-12.341.64 1.56 +107.79210.200.07 0.04 0.00 0.00-100.00 0.16 0.21 +236.36300.420.21 0.18 0.00 0.01-97.440.52 0.45 +148.72注阳性对照1.85，1.79；阴性对照0.02，0.01；空白对照0.00。
表2、结果提示，用HBsAg和HBeAg双阳性血清可以抑制牛血清中抗-HBs抗体(抑制率12.34～100.00％)，抑制率与牛血清中抗-HBs抗体OD值成反比关系；但基因重组HBcAg不仅不能抑制，反而却增强了原反应，对此问题值得进一步探讨。
5.3.替代试验用HRP-抗HBe及HRP-抗HFRS分别替代HRP-HBsAg，结果均阴性(未用HRP-抗HBs替代)。
5.4.用牛抗-HBs阳性血清抑制人血清HBsAg试验血清处理方法同前，采用检测HBsAg的方法。结果见表3。
表3、4份抗-HBs阳性牛血清抑制人血清HBsAg试验结果(OD450nm)血清号 上清液 抑制率(％)沉淀抑制率(％) 牛血清抗-HBsOD值7 0.82 0.86 39.350.90 0.7938.99 0.2312 0.85 0.78 41.160.58 0.6854.51 1.4121 1.07 1.28 15.161.37 1.313.25 0.2030 0.89 0.99 32.130.81 0.9038.27 0.42注人血清HBsAg未稀释前OD值为1.43.1.51；1∶2稀释后为1.39.1.38，平均1.385。
表3、结果进一步提示了在牛血清中可以检测到抗-HBs抗体；抗-HBs抗体阳性牛血清抑制人血清HBsAg的能力与其OD值基本呈正相关。
*HRP辣根过氧化物酶。
抗HFRS抗流行性出血热病毒抗体。
权利要求
1.一种牛血清中牛乙型肝炎病毒及其表达产物，其提取、纯化及浓缩可利用沉淀法、离心法、平衡法、层析法、离子交换法和/或其综合法，在制备用于人类的，阻断乙型肝炎病毒感染的牛血源性和/或基因工程性人乙型肝炎疫苗和乙型肝炎免疫球蛋白及其表达产物与相关产品中的应用，其特征在于制备应用中a、采用完整的牛乙肝病毒及其各种表达产物，b、采用牛乙肝病毒的各个不同核酸序列及其表达产物。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的牛乙肝病毒的各种表达产物包括牛乙肝病毒核心抗原、牛乙肝病毒中间抗原和/或牛乙肝病毒表面抗原及其它相关产物和抗原。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的牛乙肝病毒的各个不同核酸序列的各种表达产物，包括牛乙肝病毒核心抗原、牛乙肝病毒中间抗原和/或牛乙肝病毒表面抗原及其它相关产物和抗原。
4.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的在相关产品中的应用，是指牛血清及含牛乙肝病毒牛血清在制备与人乙肝病毒感染标志物相关的各种试剂盒中的应用。
5.根据权利要求1所述的应用，其特征是所述的在相关产品中的应用，是指牛血清及含牛乙肝病毒牛血清在制备牛乙肝病毒感染动物模型中的应用。
全文摘要
一种牛血清中OHBV及其表达产物在制备用于人类的，阻断HBV感染的牛血源性和/或基因工程性人HB疫苗、HBIG及其表达产物与相关产品中的应用。在制备应用中采用完整的OHBV或OHBV的各个不同核酸序列或它们的各种表达产物如OHBcAg、OHBeAg、OHBsAg及其它相关产物和抗原等。亦可应用于与HBV感染标志物相关的各种试剂盒与动物模型。用牛血清制备抗-HBs替代人血源HBIG和OHBV或OHBsAg替代人血源性HB疫苗，安全、经济、高产、低成本。
文档编号A61K39/29GK1164423SQ9611580
公开日1997年11月12日 申请日期1996年5月8日 优先权日1996年5月8日
发明者张东海 申请人:张东海