专利名称：用于增加造血细胞的方法
背景技术：
造血是血细胞由骨髓中的多能干细胞发育和分化的过程。该过程包括通过靶细胞上的膜结合受体发挥作用的多肽生长因子(细胞因子)间的复杂的相互作用。对一特定的通常是系特异性和/或阶段特异性细胞因子的反应，细胞因子的作用导致细胞的增殖和分化。由干细胞向一单一细胞类型如血小板的发育可能需要许多以适宜的顺序发挥作用的细胞因子的协调作用。
多年来推测血小板的产生可能由特定的体液因子调节。早期的实验已经表明血小板减少的动物的血浆和尿液含有一种促进巨核细胞集落形成和增大骨髓巨核细胞的活性。在文献中这种活性被称为血小板生成素(最近由McDonald，《实验血液学》(Exp.Hematol.)16201-205，1988和McDonald，《美国儿科血液学和肿瘤学杂志》(Am.J.Ped.Hematol.Oncol.)148-21，1992综述)。该活性的低浓度以及缺乏适宜的生物检测方法长期妨碍着蛋白质的纯化和鉴定。目前已经利用培养的基因工程细胞制备出血小板生成素。见de Sauvage等，《自然》(Nature)369533-538，1994；Lok等，《自然》369565-568，1994；Kaushansky等，《自然》369568-571，1994；和Bartley等，《细胞》(Cell)771117-1124，1994。
已表明血小板生成素在正常的(Lok等，同上)和血小板减少的(Sprugel等，《血液》(Blood)84(10增刊1)242a，1994)动物体内增加血小板的数量并且刺激红细胞的产生(Kaushansky等，《临床研究杂志》(J.Clin.Invest.)待发表)。在体外TPO促进定向成为巨核细胞的CD34+细胞的存活和增殖(Papayannopoulou等，《血液》84(10增刊1)324a，1994)。
虽然目前TPO的克隆和鉴定允许研究其在刺激血小板生成中的临床应用，但血小板减少和贫血仍是重要的临床问题，如与癌症患者的化疗和放疗相关联。在接受骨髓移植和外周血干细胞移植，包括自体移植的患者中仍特别需要刺激血小板产生的方法。且还需要刺激红细胞产生。本发明提供满足这些需要的治疗方法并提供其它相关的的优点。
发明的总结本发明提供用于在一需要增加造血细胞的受体患者体内增加造血细胞的方法。这些方法包括步骤(a)给予供体一定数量的足以刺激供体体内髓系细胞增殖的血小板生成素(TPO)；(b)从供体收集细胞，其中细胞为骨髓细胞或外周血干细胞；并(c)将骨髓细胞或外周血干细胞输注给受体患者。供体和受体可以是不同个体或同一个体。在本发明的一个实施方案中，受体患者已进行过化疗或放疗处理。在另一实施方案中，给予骨髓细胞或外周血干细胞后或同时，给予受体患者一定量的足以促进血小板恢复或红细胞恢复的TPO。
在另一方面，本发明提供制备用于移植的细胞的方法，包括给予供体一定数量的足以刺激供体体内髓系细胞增殖的TPO，和从供体收集细胞，其中细胞为骨髓细胞或外周血干细胞。
在第三方面，本发明提供一种在一接受化疗或放疗的患者体内刺激血小板恢复或红细胞恢复的方法，包括(a)给予患者一定数量的足以刺激患者体内髓系细胞增殖的TPO；(b)在化疗或放疗前从患者体内收集骨髓细胞或外周血干细胞；并(c)在化疗或放疗后给患者回输所收集的细胞。在一个实施方案中本方法进一步包括在回输所收集的细胞后或同时给予患者一定量的足以促进血小板恢复或红细胞恢复的TPO。
参考下面详细的描述和所附的图，本发明的这些和其它方面将更为明显。
图的简要描述
图1说明移植来自TPO或载体处理的供体小鼠的骨髓细胞对受体动物的血小板记数的效果。在一个实验中，对TPO处理的骨髓的受体也用TPO(20kU/天腹腔注射)处理。数据表示为在两个实验中的10-20只小鼠的均值。*，p＜0.05；**，p＜0.01。
图2说明移植来自TPO或载体处理的供体小鼠的骨髓细胞对受体动物的红细胞记数的效果。数据表示为在两个实验中的20只小鼠的均值。*，p＜0.05；**，p＜0.005。
图3说明在接受来自TPO或载体处理的供体的骨髓移植物的小鼠中经过或不经过移植后TPO处理血小板的恢复。
发明的详细描述术语“干细胞”此中被用于表示多能干细胞和髓样祖细胞。
术语“移植”此中被用于表示从一个供体移走细胞随后将细胞给予一受体的过程。该术语包括同种异基因移植，其中供体和受体是同一物种的不同个体；和自体移植，其中供体和受体为同一个体。
术语“增加造血细胞”此中被用于表示在造血细胞被摧毁后，如由于疾病或治疗的干涉导致的摧毁，造血细胞水平的恢复或增进的复原。
术语“血小板生成素”包括以特异性结合同种的MPL受体并在体内刺激血小板产生的能力为特点的蛋白质。在正常的测试动物中，TPO能够在开始每日给药后的10天内将血小板水平提高100％或更高。在序列号1中显示一个代表性的TPO cDNA序列，而在序列号2中显示相应的氨基酸序列。分析和实验证据表明成熟蛋白在残基Ser-22处起始。本领域技术人员将认识到所阐明的序列与人TPO基因的一个单等位基因一致，并且预期等位基因变异存在。等位基因变体包括含有沉默突变的那些和突变导致氨基酸序列改变的那些。显然本领域技术人员能够制备其它变体，如通过利用另一密码子在便于核苷酸序列操作的位点改造，通过密码子的置换在氨基酸序列中产生保守的改变，等。本发明考虑利用等位基因的和改造的变体TPO。另外，已知长度上大约150个氨基酸或更多的氨基端TPO多肽是有活性的(de Sauvage等，ibid；Bartley等，同上；普通转让的美国专利申请号08/346,999)，并且TPO的这种截短形式的利用在本发明的范围之中。在科学文献中已经公布了源自非人物种的血小板生成素(Lok等，同上；de Sauvage等，同上；Bartley等，同上)。
本发明提供用于增加患者，特别是如在癌症的治疗中经过放疗和/或化疗的患者体内造血细胞的方法。这些疗法杀伤骨髓和外周血中正在分裂的祖细胞，这限制治疗且通常需要输血来恢复血小板和其它血细胞的循环水平。尤为重要的是那些在放疗后接受骨髓和/或外周血干细胞移植的和患有先天性代谢缺陷需要骨髓移植的患者。这些适应症是与乳腺癌、白血病、淋巴瘤、多发性骨髓瘤的治疗相关的骨髓移植以及如重症联合免疫缺陷、地中海贫血和镰状细胞贫血的先天性缺陷。在肿瘤细胞存在于外周血中的风险不存在的条件下可以优选外周血干细胞移植。
进行骨髓和外周血干细胞移植的方法在本领域中是已知的。综述见Synder等，“输血医学”(Transfusion Medicine)Benz和McArthur编辑，《血液学》(Hematology)1994，美国血液学会，96-106，1994。按照公认的临床步骤通过白细胞分离收集外周血干细胞。根据细胞表面标志物(例如CD34)筛选造血祖细胞，这容许富集预期的细胞并清除污染的肿瘤细胞。将收集的细胞在一种合适的冷冻保护剂中(例如二甲基亚砜、羟乙基淀粉)冻存直至需要。在麻醉下通过骨穿刺从供体收集骨髓细胞。为了降小体积，通常对收集的骨髓进行处理使血浆和细胞成分分开。在异基因骨髓移植中，移走血浆也可以消除红细胞不相容性。对细胞组分可以利用密度梯度技术或自动化分离方法富集单核细胞并利用各种细胞毒药物清除T细胞。按照已经建立的方法包括控制速率的冷冻和冷冻保存剂的使用来冷冻保存收集的骨髓细胞。在使用前将干细胞立即在一温水浴融化使与融化相关的损失降至最小。在异基因骨髓移植情况下，供体和受体是组织相配的以使移植物抗宿主病的风险降至最低。
造血细胞的增加是干细胞移植入受体患者特别是髓系细胞包括CD34+干细胞和来自CD34+干细胞的细胞所造成的。尤为重要的是巨核细胞系和红系细胞，它们分别可以重建受体的血小板和红细胞群。
在本发明中，供体在捐献骨髓或外周血细胞前用足以刺激髓系细胞增殖的数量的TPO处理供体。这个数量通常是在0.5lg/kg/天到40lg/kg/天范围之间，优选1lg/kg/天到20lg/kg/天。对供体的处理将在骨髓或外周血干细胞收获前的3天到2周内进行一天到几天，优选大约2-5天。优选在细胞收获前5到10天内处理供体。供体体内CD34+干细胞和髓系其它细胞的增加可以通过移植物受体的血小板和/或红细胞水平的加速恢复来证实。
在本发明的一个实施方案中，对受体在移植后用TPO处理以进一步促进血小板的恢复。已经发现用TPO进行移植后处理可提高经致死剂量照射并给予取自TPO处理供体骨髓的测试动物的存活。“一定量的足以促进血小板恢复的血小板生成素”是与未处理患者相比在正常血小板水平恢复的时间上产生统计学上显著的降低或在血小板记数上产生统计学上显著的增加的量。移植后处理中所用的TPO的剂量通常是在0.5lg/kg/天到40lg/kg/天范围之间，给药大约3到20天。大体上，接受骨髓移植的患者比那些接受外周血干细胞移植的患者需要更长时间的移植后处理。
在本发明中使用的TPO可利用基因工程的培养细胞按照本领域中普遍已知的方法制备。现总结这些方法，将编码TPO的一种DNA分子与提供其维持和在宿主细胞中转录的其它DNA序列相连。将所得的表达载体插入宿主细胞，并将所获得的被“转化”或“转染”的细胞在一合适的营养介质中培养。幼仓鼠肾(BHK)细胞是一种优选的宿主。虽然可以从细胞裂解液中回收TPO并在体外处理来产生活性蛋白，但优选改造细胞以分泌TPO到培养基中。大体上，见de Sauvage等，ibid；Lok等，ibid；Kaushansky等，《自然》369568-571，1994；Wendling等，《自然》369571-574，1997；Bartley等，ibid；和未决的普通转让的美国专利申请号08/366,859和08/347,029，这些以一个整体并入本文作为参考。
可以通过联合应用层析和其它技术包括染料-配体亲和基质上的直接俘获和离子交换层析从细胞条件培养液中纯化TPO。可以通过羟磷灰石吸附除去污染的蛋白质。
为了药物的利用，将TPO按照传统的方法制备以用于非肠道特别是静脉内或皮下给药。静脉内给药可以是通过大丸注射或在一到几个小时这样一个典型的期间输注。大体上，药物的配方可包括一种造血蛋白联合一种药学上可用的载体，如盐水、缓冲盐、5％葡萄糖水溶液或类似的物质。配方还可包括一种或多种赋形剂、防腐剂、增溶剂、缓冲剂(例如磷酸盐缓冲液)、白蛋白或一种防止蛋白质在药瓶表面丢失的非离子去污剂等。另外，TPO可与其它细胞因子、尤其是早期作用细胞因子如干细胞因子、IL-3、IL-6、IL-11或GM-CSF联合。在利用这种联合疗法时，可将细胞因子组合在一个单一配方中或以各自的配方给药。配制的方法在本领域中是众所周知的并被公布在如《Remington药物科学》，Grnnaro编，Mack出版公司，Easton PA，1990中，它被并入本文作为参考。
通过下面的非限定性的实施例对本发明做进一步阐明。
实施例实施例1利用转染的幼仓鼠肾细胞(BHK 570细胞，ATCC CRL 10314)制备小鼠血小板生成素。无血清培养基含有145kU/ml的TPO活性，其中将10个单位定义为在利用转染有编码MPL受体的表达载体(Vigon等《(美国国家科学院学报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)895640-5644，1992)的BaF3细胞进行的细胞分裂(3H-胸苷掺入)测试中产生半量最大刺激的TPO的量。BaF3是一种源于小鼠骨髓的白细胞介素-3依赖前淋巴样细胞系(Palacios和Steinmetz，《细胞》41727-734，1985；Mathey-Prevot等，《(分子细胞生物学》(Mol.Cell.Biol.)64133-4135，1986)。在3H-胸苷存在的情况下将细胞暴露于测试样品。通过与一个人TPO的标准曲线相比较对掺入细胞DNA的3H-胸苷进行定量。在集落形成测试中TPO在大约100-400U/ml的范围内是有效的。小鼠中在20-40kU/天的范围内可以见到体内活性。对于体内实验，在无内毒素的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中TPO稀释至预期的浓度并通过腹膜内或皮下注射给药。
雌性Balb-C小鼠(年龄范围8-12周)是获自Broekman B.V.(Someren，荷兰)，并用商品化的啮齿类食物喂养和随意提供酸化的水。将移植的受体饲养在无病原体环境中并喂以含有浓度为1mg/ml的环丙沙星、70lg/ml的多粘菌素B和2g/100ml的蔗糖的水。
将受体小鼠置于一聚间位乙酸甲酯盒中并利用菲利浦SL75-5/6mV直线加速器(菲利浦医疗系统，Best，荷兰)进行致死量(8.5Gy)照射。以4Gy/min的剂量率在后-前和前-后位置上将辐射分为两部分。用105取自稳定状态的供体小鼠的骨髓细胞移植小鼠。在采集骨髓的4小时内进行移植。在移植后1-5、3-8或3-12天腹膜内给予(i.p.)20kU/天剂量的TPO治疗5只受体小鼠的实验组。以相同数量的骨髓细胞移植对照组动物，并在移植后以相似的时间间隔给予盐水。与盐水处理的对照受体相比，给予TPO不能导致加速的血小板重建。在1-14天皮下(S.C.)给予30kU/天的剂量在加速血小板恢复上也是无效的。在血细胞或红细胞的重建上也未见到效果。
在第二个系列的实验中，用TPO以每只小鼠20kU/天i.p.的剂量连续5天处理供体小鼠。在第5天处死小鼠并收获血液、骨髓和脾。在一个Sysmex800计数仪(TOA Medical Electronics Company，Kobe，日本)上对白细胞、红细胞和血小板计数。TPO处理诱导血小板数量增加2.5倍，但对白细胞或红细胞的数量却无影响。
对TPO处理的供体小鼠也测定了祖细胞的水平。在无菌条件下通过用含有500lg/ml青霉素、250lg/ml链霉素和2％胎牛血清(FBS)(GIBCO BRL，Gaithersburg，MD)的RPMI 1640冲洗股骨收获细胞。通过研磨器官和用含有2％FBS的RPMI 1640冲洗一次来制备脾的单细胞悬液。为了计数集落形成单位，按照发表的步骤(Fibbe等，《免疫学杂志》(J.Immunol.)148417，1992)培养CFU-GM。简言之，在小鼠GM-CSF(1.25ng/ml)存在的条件下，将骨髓细胞培养于含有104细胞/孔的微量滴定板中的半固体培养基中。将外周血单核细胞和脾细胞分别培养于含有5×105细胞/ml和106细胞/ml的3.5cm平板中。在37℃含有5％CO2的充分湿化的环境中培养细胞。培养6天后，利用倒置显微镜对集落(定义为＞20个细胞的集团)计数。在1.25ng/ml重组小鼠GM-CSF、2U/ml重组人EPO、25ng/ml重组IL-3、5％转铁蛋白、5％牛血清白蛋白、5％10-3β巯基乙醇和7.5％Iscove改良的Dulbecco培养基(IMDM)联合存在的条件下以相同的方式在3.5cm平板中进行CFU-mix检测。在充分湿化含有5％CO2的环境中于37℃培养6到7天后，利用一倒置显微镜对集落形成细胞计数。与盐水处理的对照相比，TPO处理导致骨髓或脾中集落形成单位(CFU)和BFU-E数量的增加(表)。
表供体处理股骨TPO 盐水有核细胞(×106) 18.4±4.719.9±4.3CFU(×103)55.3±12.5*38.6±5.2BFU-E(×103) 24.0±4.916.4±2.3脾有核细胞(×106) 71.8±35.0 78.4±42.5CFU(×103)27.3±16.9 16.3±11.4BFU-E(×103) 10.2±2.31.9±0.7结果以每个器官(股骨或脾)的绝对细胞数(均值±S.D.，n＝7)表达。
CFU代表在CFU-mix测试中培养的集落总数。*p＜0.05。
用取自以20kU/天i.p.的剂量连续处理5天的供体或盐水处理对照供体的105骨髓细胞移植致死性照射的受体动物。移植后每3天通过尾静脉放血从每个受体取血样。在TPO处理或未处理的骨髓细胞的受体之间于可见的出血倾向上未观察到差别。
利用学生T检验分析细胞计数。在MANOVA分析中，考虑它们的时间过程对组进行比较。在数据的log值上进行分析。将＜0.05的值认为统计学上显著。利用MANOVA检验对曲线进行比较。结果表明与用取自盐水处理对照供体的同等数量骨髓细胞移植的对照动物相比，在TPO处理骨髓的受体中血小板的重建被显著地改变(图1)。另外，在接受TPO处理骨髓的动物中，血小板最低点高于接受对照骨髓的动物(在移植后12天88×109对30×109，20个小鼠的均值)。如在图1中所示，用20kU/天TPC(腹内注射)在1-5天进行移植后处理在接受取自TPO处理供体骨髓的小鼠中未导致血小板重建的进一步加速。
除加速的血小板重建外，TPO处理骨髓细胞的受体也表现出加速的红细胞重建(图2)。在这些动物中红细胞计数的最低点也比在移植有相等数量未处理骨髓细胞的对照中高。进行实验来进一步证实这种效应是由于TPO对红系造血的直接活性而与血小板计数和出血倾向的差别无关。这个实验中受体动物直到移植后12天未发生出血，此时处死受体小鼠并评价骨髓和血液来源的祖细胞的数量。虽然这些差别没有统计学的显著性，TPO处理骨髓细胞的受体比移植有相等数量未处理骨髓细胞的对照具有更高的BFU-E集落数/股骨(770±386对422±320，均值±SD，n＝5)。用TPO以所测试的剂量进行移植后处理未导致红细胞重建的进一步加速。实施例2进行第二个实验用来在经致死性照射并接受取自TPO处理的或未处理的供体骨髓的小鼠中比较血小板计数，并确定对受体动物进行移植后TPO处理的效果。
B6D2 F1小鼠获自Taconic(Germantown，NY)并在无特定病原体的条件下喂养。将小鼠每笼养5只并随意喂以酸化的水和食物。40只雌性小鼠用作受体，5只雄性小鼠用作供体。
利用转染的BHK 570细胞制备重组TPO。主要的分子样品是一条70kD的带。制备物具有5641 U/lg的特异性活性。在pH6.0含有0.05％多乙氧基醚80和0.13M NaCl的29mM磷酸钾缓冲液中配制该蛋白，并以每份20kU冻存。在使用前将TPO和载体溶液直接融化，并每日一次皮下注射给小鼠。
对两只供体小鼠均用每天20kU TPO处理4天，然后在第5天通过颈椎脱臼处死。无菌取出股骨，并用含有2％胎牛血清的Ham’s F12(FredHutchinson肿瘤研究中心，西雅图，WA)通过插入一个连至注射器的25g针头冲洗出骨髓。将细胞悬液通过一个18g针头、一个20g针头和一个22g针头冲洗两次制备单细胞悬液。在血细胞计数仪上对有核细胞计数。
在第2天，将受体小鼠暴露于发自137Cs源(Gammacell 40 Irradiator，Automic Energy of Canada Radiochemical Company，Kanata，加拿大)的1200 cGy全身照射。照射后2到4小时进行骨髓移植。20只小鼠接受取自TPO处理的供体的骨髓(1×105细胞)和20只小鼠接受取载体处理的供体的1×105细胞。在第1天(移植后2天)开始用TPO(20kU/天)处理受体并持续14天。
将小鼠在乙醚麻醉下由眶后窦放血。将50ll血样收集于肝素化的微量移液管(VWR Scientific，西雅图，WA)中，滴入带有EDTA(BectonDickson，San Jose，CA)的微量试管中。也将血滴在玻璃片上，并制备涂片。在一个Cell Dyn3500血液分析仪(Abbott，Santa Clara，CA)上分析血液。确定血细胞比容、RBC计数、WBC计数和血小板计数。
在接受取自对照供体骨髓的小鼠中，血小板计数在第8天降至低水平(低至正常的6％)并在TPO处理的和对照的动物中于12天开始恢复(图3)。在血小板恢复上两组间无差别。然而，在载体处理的对照中，10只动物只有3只存活，而在TPO处理的组中，9只动物有7只存活。死亡与出血有关。在TPO处理组中，因为一些血小板计数很低的动物能够存活故标准差较大。
接受TPO处理供体骨髓的小鼠在第8天具有低于正常的6％的血小板数。大体上用TPO处理14天的动物在血小板计数上恢复更快。9只TPO处理动物中存活了8只，而9只载体处理小鼠中只有4只存活。与对照相比，RBC在接受TPO预处理的骨髓并用TPO处理的小鼠中恢复更快。TPO处理在白细胞恢复中没有影响。
由前所述，虽然此中为了说明已经描述了本发明的特定实施方案，但应认识到仍可进行各种不偏离本发明的精神和范围的修改。相应地，除了如由所附的权利要求限定的外，本发明是没有限定的。
序列表(1)一般信息(i)申请人ZymoGenetics，Inc.
1201 Eastlake Avenue EastSeattleWAUSA98102(ii)发明题目用于增加造血细胞的方法(iii)序列数2(iv)联系地址(A)收信人ZymoGenetics，Inc.
(B)街1201 Eastlake Avenue East(C)城市西雅图(D)州WA(E)国家美国(F)邮政编码98102(V)计算机可读形式(A)媒体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIn Release#1.0，版本#1.25(vi)本申请资料
(A)申请号(B)申请日期(C)分类(viii)律师/代理人信息(A)姓名Parker，Gary E(B)注册号31-648(C)参考/案卷号95-10(ix)通讯信息(A)电话206-442-6600分机6673(B)传真206-442-6678(2)序列号1的资料(i)序列特征(A)长度1062个碱基对(B)类型核酸(C)线型双链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型cDNA(ix)特点(A)名称/关键CDS(B)位置1..1059(xi)序列描述序列号1ATG GAG CTG ACT GAA TTG CTC CTC GTG GTC ATG CTT CTC CTA ACTGCA48Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu ThrAla1 5 10 15AGG CTA ACG CTG TCC AGC CCG GCT CCT CCT GCT TGT GAC CTC CGAGTC96Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu ArgVal20 25 30CTC AGT AAA CTG CTT CGT GAC TCC CAT GTC CTT CAC AGC AGA CTGAGC 144Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg LeuSer35 40 45CAG TGC CCA GAG GTT CAC CCT TTG CCT ACA CCT GTC CTG CTG CCTGCT 192Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu ProAla50 55 60GTG GAC TTT AGC TTG GGA GAA TGG AAA ACC CAG ATG GAG GAG ACCAAG 240Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu ThrLys65 70 7580GCA CAG GAC ATT CTG GGA GCA GTG ACC CTT CTG CTG GAG GGA GTGATG 288Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly ValMet85 90 95GCA GCA CGG GGA CAA CTG GGA CCC ACT TGC CTC TCA TCC CTC CTGGGG 336Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu LeuGly100 105 110CAG CTT TCT GGA CAG GTC CGT CTC CTC CTT GGG GCC CTG CAG AGCCTC 384Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln SerLeu115 120 125CTT GGA ACC CAG CTT CCT CCA CAG GGC AGG ACC ACA GCT CAC AAGGAT 432Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His LysAsp130 135 140CCC AAT GCC ATC TTC CTG AGC TTC CAA CAC CTG CTC CGA GGA AAGGTG 480Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly LysVal145 150 155160CGT TTC CTG ATG CTT GTA GGA GGG TCC ACC CTC TGC GTC AGG CGGGCC 528Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg ArgAla165 170 175CCA CCC ACC ACA GCT GTC CCC AGC AGA ACC TCT CTA GTC CTC ACACTG 576Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu ThrLeu180 185 190AAC GAG CTC CCA AAC AGG ACT TCT GGA TTG TTG GAG ACA AAC TTCACT 624Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn PheThr195 200 205GCC TCA GCC AGA ACT ACT GGC TCT GGG CTT CTG AAG TGG CAG CAGGGA 672Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln GlnGly210 215 220TTC AGA GCC AAG ATT CCT GGT CTG CTG AAC CAA ACC TCC AGG TCCCTG 720Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg SerLeu225 230 235240GAC CAA ATC CCC GGA TAC CTG AAC AGG ATA CAC GAA CTC TTG AATGGA 768Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu AsnGly245 250 255ACT CGT GGA CTC TTT CCT GGA CCC TCA CGC AGG ACC CTA GGA GCCCCG 816Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly AlaPro260 265 270GAC ATT TCC TCA GGA ACA TCA GAC ACA GGC TCC CTG CCA CCC AACCTC 864Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro AsnLeu275 280 285CAG CCT GGA TAT TCT CCT TCC CCA ACC CAT CCT CCT ACT GGA CAGTAT 912Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly GlnTyr290 295 300ACG CTC TTC CCT CTT CCA CCC ACC TTG CCC ACC CCT GTG GTC CAGCTC 960Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val GlnLeu305 310 315320CAC CCC CTG CTT CCT GAC CCT TCT GCT CCA ACG CCC ACC CCT ACCAGC 1008His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro ThrSer325 330 335CCT CTT CTA AAC ACA TCC TAC ACC CAC TCC CAG AAT CTG TCT CAGGAA 1056Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GlnGlu340 345 350GGG TAA1062Gly(2)序列号2的资料(i)序列特征(A)长度353个氨基酸(B)类型氨基酸(D)拓扑结构线性(ii)分子类型蛋白质(xi)序列描述序列号2Met Glu Leu Thr Glu Leu Leu Leu Val Val Met Leu Leu Leu ThrAla1 5 10 15Arg Leu Thr Leu Ser Ser Pro Ala Pro Pro Ala Cys Asp Leu ArgVal20 25 30Leu Ser Lys Leu Leu Arg Asp Ser His Val Leu His Ser Arg LeuSer35 40 45Gln Cys Pro Glu Val His Pro Leu Pro Thr Pro Val Leu Leu ProAla50 55 60Val Asp Phe Ser Leu Gly Glu Trp Lys Thr Gln Met Glu Glu ThrLys65 70 7580Ala Gln Asp Ile Leu Gly Ala Val Thr Leu Leu Leu Glu Gly ValMet85 90 95Ala Ala Arg Gly Gln Leu Gly Pro Thr Cys Leu Ser Ser Leu LeuGly100 105 110Gln Leu Ser Gly Gln Val Arg Leu Leu Leu Gly Ala Leu Gln SerLeu115 120 125Leu Gly Thr Gln Leu Pro Pro Gln Gly Arg Thr Thr Ala His LysAsp130 135 140Pro Asn Ala Ile Phe Leu Ser Phe Gln His Leu Leu Arg Gly LysVal145 150 155160Arg Phe Leu Met Leu Val Gly Gly Ser Thr Leu Cys Val Arg ArgAla165 170 175Pro Pro Thr Thr Ala Val Pro Ser Arg Thr Ser Leu Val Leu ThrLeu180 185 190Asn Glu Leu Pro Asn Arg Thr Ser Gly Leu Leu Glu Thr Asn PheThr195 200 205Ala Ser Ala Arg Thr Thr Gly Ser Gly Leu Leu Lys Trp Gln GlnGly210 215 220Phe Arg Ala Lys Ile Pro Gly Leu Leu Asn Gln Thr Ser Arg SerLeu225 230 235240Asp Gln Ile Pro Gly Tyr Leu Asn Arg Ile His Glu Leu Leu AsnGly245 250 255Thr Arg Gly Leu Phe Pro Gly Pro Ser Arg Arg Thr Leu Gly AlaPro260 265 270Asp Ile Ser Ser Gly Thr Ser Asp Thr Gly Ser Leu Pro Pro AsnLeu275 280 285Gln Pro Gly Tyr Ser Pro Ser Pro Thr His Pro Pro Thr Gly GlnTyr290 295 300Thr Leu Phe Pro Leu Pro Pro Thr Leu Pro Thr Pro Val Val GlnLeu305 310 315320His Pro Leu Leu Pro Asp Pro Ser Ala Pro Thr Pro Thr Pro ThrSer325 330 335Pro Leu Leu Asn Thr Ser Tyr Thr His Ser Gln Asn Leu Ser GlnGlu340 345 350Gly
权利要求
1.一种用于在一需要增加造血细胞的受体患者中增加造血细胞的方法，包括给予供体一定数量的足以刺激供体体内髓系细胞增殖的血小板生成素(TPO)；从供体收集细胞，其中细胞为骨髓细胞或外周血干细胞；将骨髓细胞或外周血干细胞给予受体患者。
2.根据权利要求1的方法，其中受体患者已受过化疗或放疗处理。
3.根据权利要求1的方法，其中供体和受体患者是同一个体。
4.根据权利要求3的方法，其中在收集和第二次输注步骤之间用化疗或放疗处理受体患者。
5.根据权利要求1的方法，其中细胞是骨髓细胞。
6.根据权利要求1的方法，其中细胞是外周血干细胞。
7.根据权利要求1的方法，进一步包括在输注骨髓细胞或外周血干细胞后或同时，给予受体患者一定数量的足以促进血小板恢复或红细胞恢复的血小板生成素。
8.根据权利要求1的方法，其中TPO是人TPO。
9.一种制备用于移植的细胞的方法，包括给予供体一定数量的足以刺激供体体内髓系细胞增殖的血小板生成素(TPO)；从供体收集细胞，其中细胞为骨髓细胞或外周血干细胞。
10.根据权利要求9的方法，其中TPO是人TPO。
11.根据权利要求9的方法，其中细胞是骨髓细胞。
12.根据权利要求9的方法，其中细胞是外周血干细胞。
13.一种在接受化疗或放疗的患者中刺激血小板或红细胞恢复的方法，包括给予患者一定数量的足以刺激患者体内髓系细胞增殖的TPO；在化疗或放疗前从患者收集骨髓细胞或外周血干细胞；并在化疗或放疗后给患者回输所收集的细胞。
14.根据权利要求13的方法，进一步包括在回输所收集的细胞后或同时给予患者一定数量的足以促进血小板恢复或红细胞恢复的血小板生成素。
15.根据权利要求13的方法，其中TPO是人TPO。
16.根据权利要求13的方法，其中细胞是骨髓细胞。
17.根据权利要求13的方法，其中细胞是外周血干细胞。
全文摘要
本发明公布用于在接受骨髓或外周血干细胞移植的患者中增加造血细胞包括血小板和红细胞的方法。本方法包括给予供者一定数量的足以刺激髓系细胞增殖的血小板生成素,从供者收集细胞并将收集的细胞给予一受体患者,可以用额外的血小板生成素处理受体患者。本方法在异基因和自体移植过程中是有用的。
文档编号A61K38/00GK1190348SQ96194536
公开日1998年8月12日 申请日期1996年5月29日 优先权日1995年6月7日
发明者W·E·菲比, A·格罗斯曼 申请人:津莫吉尼蒂克斯公司