专利名称：合成的哺乳动物染色体和其构建方法
技术领域：
本发明涉及基因表达和基因治疗领域，并涉及有关这些用途的新载体。具体地说，本发明涉及开发和利用在基因表达和基因治疗中(尤其是在人类中)作为载体的合成或人工染色体的方法。本发明使得可以从分离的纯化的DNA控制性地构建稳定的合成或人工染色体。就这一DNA而言，功能性染色体在细胞中形成并作为染色体外因子被保持。当治疗DNA包含的染色体中时，所述人工染色体发挥天然存在的染色体的必需染色体功能，以使所述染色体作为基因治疗的有效载体起作用。
背景技术：
为治疗遗传性或者获得性疾病对细胞进行遗传操作称为基因治疗。迄今为止，此领域中的大多数临床研究集中于病毒的基因治疗载体的应用。基于这些研究的结果，能明显看到现行的病毒基因治疗载体有严重临床限制性。这些包括免疫原性，细胞病变，不稳定的基因表达及对治疗基因片段大小的限制。因此，近来人们更注重非病毒基因治疗载体的应用。
尤其是，对活细胞进行多种遗传操作时，合成的哺乳动物染色体将会是有用的载体。其优越性在于高度的有丝分裂稳定性，一致和可调的基因表达，高的克隆容量，及非免疫原性。
1983年，人工染色体首次构建于啤酒糖酵母(Murray等，自然，305189-193(1983)，1989年，构建于S.pombe(Hahnenberger等，美国科学院学报，86577-581(1989)。然而由于很多原因，是否能在哺乳动物细胞中构建相似的载体并不清楚。
第一，十多亿年前，多细胞有机体(即哺乳动物细胞的祖先)从酵母中分化出来。尽管在活的有机体之间存在着相似之处，但总体上，相似性与他们进化上的趋异程度呈反相关。很明显，酵母，一种单细胞有机体，在生物学上与复杂的多细胞脊椎动物有截然的不同。
第二，酵母染色体小于哺乳动物染色体几个级别长度。啤酒糖酵母和S.pombe染色体长度分别是0.2--2Mb及3.5--5.5Mb，而哺乳动物的染色体大约在50Mb--250Mb。由于在长度上的明显区别，能否将类似酵母人工染色体的构建体构建成及转染进哺乳动物仍不清楚。
第三，酵母染色体压缩程度少于哺乳动物的染色体。这意味着，哺乳动物染色体的高级结构依赖于染色质复杂的相互作用。哺乳动物染色体的这种复杂结构(包括DNA结构和高级染色质结构)使人们怀疑人工染色体是否能在哺乳动物细胞中构建。
第四，酵母着丝粒比哺乳动物的着丝粒更简单。例如，啤酒糖酵母的着丝粒由125bp组成。S.pombe的着丝粒包括2到3个拷贝的14kb序列元件及一段反向重复序列，中间为一段7Kb的核心区。相比之下，人类着丝粒由几百个Kb到几个Mb的高度重复的α卫星DNA组成。而且，在哺乳动物的着丝粒中，未证明有象在S.pombe中发现的中央核心区及反转重复序列。这样，不同于酵母着丝粒，哺乳动物的着丝粒非常大且高度重复。
第五，酵母着丝粒比哺乳动物的着丝粒有更少的纺锤体吸附(Bloom，细胞，73621-624(1993))。例如，啤酒糖酵母有一个微管吸附到着丝粒上。S.pombe的每个着丝粒有2--4个微管。在人类中每个染色体的着丝粒的几十个微管吸附(Bloom，细胞，73621-624(1993))。这进一步说明相比于酵母着丝粒，哺乳动物着丝粒的复杂性。
总而言之，这些区别是重要的，因此在酵母中成功的结果并不能合理地预测能转化入哺乳动物。
正常的哺乳动物染色体由连续的线性DNA链组成，长度约在50至250Mb。为使这些遗传单位能忠实复制且在细胞分裂时分开，至少必须包括三种类型的功能元件端粒，复制起点和着丝粒。
哺乳动物中的端粒是由重复序列(TTAGGG)组成，对染色体末端的复制和稳定性来说是必要的。复制的起点在细胞周期的S期对染色体DNA的有效及可控复制是必要的。
虽然哺乳动物的复制起点还没有在序列水平上弄清，但我们相信它们在哺乳动物的DNA上丰富存在。最后，着丝粒在有丝分裂期间对染色单体分开进入子细胞是必要的，这保证了每一个子细胞获得一个单体，且只有一个的所有染色体的拷贝。正如复制起点一样。着丝粒也未能在序列水平上搞清。α卫星DNA可能是一个重要的着丝粒组成成分(Haaf等，细胞，70681-696(1992)；Larin等，Hum.Mol.Genet.3689-695(1994)；Willard，Trends in Genet.6410-415(1990)。但某些有丝分裂稳定的异常染色体衍生物缺乏α卫星DNA(Callen等，Am.J.MedGenet.43709-715(1992)；Crolla等，J.Med.Genet 29699-703(1992)；Voullaire等，J.Hum.Genet.521153-1163(1993)；Blennow等，Am.JHum.Genet.54877-853(1994)；Ohashi等，Am.J.Hum.Genet.551202-1208(1994))。因此，对哺乳动物的着丝粒的组成仍然了解很少。
虽然一些人声称在哺动物的细胞中构建成″人工″染色体，但没有任何人曾经构建成一个仅仅包含外源DNA的人工染色体。在以前的研究中，研究人员要么修饰现有的染色体使其变小(″削短″法)，要么将外源DNA插入到现有的染色体中，这种方法将使染色体断裂形成包含内源序列的片段(″断裂″方法)。在本发明中，外源DNA序列可引入人类细胞，能形成稳定的合成染色体，但并未整合入内源染色体中。
在削短法中，利用了三种特殊的设计(1)通过非法重组，端粒引导截短(Bamett，M.A.等，核酸研究，2127-36(1993)；Farr.C.J.等，ENBOJ.145444-54(1995))，(2)通过同源重组，α卫星DNA引导端粒插入/截短(Brown，K.E.等，Hum Mol.Genet.31227-37(1994))，(3)双着丝粒染色体形成/断裂(Hadlaczky，G.，哺乳动物人工染色体，美国专利5,288,625(1994))。
Barnett等(核酸研究，2127-36(1993))，Farr等。(EMBO J.145444-54(1995))和Brown等(Hum Mol.Genet.31227-37(1994))描述了将内源染色体片断化的方法，即将端粒DNA和一种可选择标记同时转染进哺乳动物细胞。在上述实验中可构建一个小于初始染色体的截短染色体。但形成的截短染色体包含大量内源染色体序列，也包含内源着丝粒。这样，这些截短染色体并不是从头产生。
Hadlaczky(哺乳动物人工染色体，美国专利5,288,625(1994))描述了一种细胞系，这种细胞系由于双着丝粒染色体断裂现象可用于增殖一条染色体。但除了可选择的标记外所有序列来自于初始的全功能双着丝粒染色体。因此，这种所谓的″人工″染色体也不是从头产生的。
在″断裂″方法中，Haaf等(细胞681-696(1992))和Praulovszky等(美国科学院学报，8811042-11046(1 991))报道了通过把转染DNA插入内源染色体产生染色体片段的方法。转染以后，插入的DNA序列开始扩增(拷贝数增加)，在某些克隆中，一部分内源染色体断裂形成游离于染色体之外的片断。上述两个报道中，可在内源染色体及染色体外片段上广泛发现插入的转染DNA。
在Haaf等的实验中(细胞，70681-696(1992))，他们将人类α卫星DNA和新霉素抗性基因共转染进非洲绿色猴子细胞中。每一次转染不包括任何其它外源DNA。在所有的转染克隆中，发现DNA被整合进内源染色体。在一个含有染色体外片段的克隆中，转染的α卫星DNA整合后被广泛地扩增。基于Southern印迹杂交和原位荧光杂交，作者得出结论，非洲绿色猴子序列与转染的α卫星DNA共扩增，且被扩散到转染的α卫星DNA中。在对包含扩增α卫星DNA的染色体的进一步分析中发现，被转染染色体的″数量，大小，转染位置(端粒，间质，或者是着丝粒)在3-31号细胞系之间是不同的。这提示了转染序列的不稳定性。最后，分析包含扩增α卫星DNA的染色体的有丝分裂行为，发现有高频率的后期桥形成，提示染色体具有双着丝粒(或者是多着丝粒)。这样，已发现的高度结构不稳定性及后期桥结构的高频发生与染色体片断形成来自于插入/扩增/断裂的想法是一致的。最后，值得注意的是，在某些包含未扩增的α卫星DNA的克隆中，未发现染色体外片段，进一步说明此方法中扩增对染色体片断化过程是重要的。
Prazovszky等(Pvoc.Narl.Acad.Sci.USA 8811042-11046(1991))通过插入一段非着丝粒区人类DNA到内源染色体上产生染色体片段(后来McGill等和Cooper等在人类染色体9qter图谱上显示(Hum.Mol.Genet.1749-751(1992))(Hum.Mol.Genet.1753-754(1992))。同Haaf实验一样，插入的转染DNA广泛扩增，且散布于小鼠基因组序列中。作者认为转染DNA的插入/扩增导致双着丝粒染色体的形成，然后断裂产生染色体片段。对染色体片段的分析毫无疑问的说明染色体片段来源于含有插入扩增DNA的小鼠染色体。
Haafer等和Praulovszky等所做的实验有许多重要的相似之处。第一，都表明转染DNA可插入内源染色体。第二，插入以后，转染DNA能广泛扩增。第三，通过扩增的DNA序列，内源DNA(受体细胞中未被转染的染色体序列)可散布分布。第四，含有扩增转染序列的内源染色体能被CREST抗血清所着色。第五，含有扩增的转染序列的内源染色体在有丝分裂期间行为相似，即形成双着丝粒染色体。最后，含有扩增的转染序列的内源染色体都表现出结构不稳定。因此，这些大量重要的相似之处，及被Pranovszky等证明的染色体断裂都显示了在两种实验中染色体插入/扩增/断裂机制。
Larin等(Hum.Mol.Genet.3689-95(1994))获得进一步的证据，证明若只有转染和插入α卫星DNA而缺乏扩增则不足以产生染色体外片断。在这些实验中，α卫星DNA与一个可选择的标记连接，并转染进人类细胞。在所有抗药克隆中，α卫星DNA插入内源染色体。当这些插入形成着丝粒样结构时(例如主缢痕，CREST抗血清着色，后期染色体延迟)，没有一个克隆可形成染色体外片段。由于这些实验没能发现一种克隆，其染色体包含α卫星DNA，但无内源着丝粒，因此这并不是一种可靠的方法能证明是否着粒样结构的形成可促进染色体分离。
由于是从已存的染色体构建成“削短″染色体，或插入DNA到已存的染色体形成″断裂″染色体，对从转染的裸露的DNA从头合成染色体，这些文献并未提供任何指导。
而且，由于多种原因，当作为基因治疗载体时，构建的染色体及构建方法有严重的限制性。第一，构建的方法仅能应用于构建培养细胞的染色体。由于病人的细胞断裂现象非常少见，及/或产生的染色体结构不可预测，这些方法不适用于直接应用于病人。另外，断裂方法中扩增序列的不稳定性也不适用于病人，因为有因基因组重排导致细胞转化及癌变的风险。
因此，如果有带有限定结构的一个预先构建的染色体作为载体能被直接引入病人的细胞，将会非常理想。尤其是这种载体可不依赖于插入内源染色体或者是插入后的扩增，而且在细胞中构建体的结构与转染前的结构本质上相同。
第二，削短染色体和染色体片段包含不可限定的内源序列，而且并不能为鉴别功能重要的序列提供指导。
如果可构建由限定序列组成的载体，如果有一种构建限定的人工染色体的方法，通过这种方法能迅速鉴别出功能重要的序列，那将非常理想。
第三，通过现有的方法，不能将削短法或断裂法产生的染色体完全纯化。因此，当将削短染色体导入哺乳动物细胞时，很难不导进其它的哺乳动物染色体。
第四，因为还不能将削短染色体和染色体片段作为裸DNA分离，从而可重新导人细胞中，因此直到现在，一个外源DNA导入细胞后能否从头生成一条功能染色体仍不清楚(首先不插入宿主染色体中)。
因此，通过导入纯化的DNA，能提供从头合成的人工哺乳动物染色体，将非常理想。
最后，在削短染色体和染色体片段上增加新的DNA序列(例如治疗基因)十分困难。
因此，如果能在体外构建载体，载体上插入新的DNA序列的位置是确定而有效的，那将非常理想。
Sun等(自然，遗传学，83341(1994))报道设计了一种以病毒为基础的载体应用于人类细胞中。这种载体叫作″人类合成的游离染色体″。然而，载体依赖于EBNA-1的存在，这是一种有毒和有免疫原性的病毒蛋白质。而且载体依赖于病毒复制起点，而不是天然的哺乳动物染色体的复制起点。同时，这条″染色体″不包含功能着丝粒或者端粒DNA，有丝分裂时不能形成动粒，因此这样的的载体不能以一种可控的方式进行分离。最后，不同于内源染色体，这些载体在细胞中拷贝数增加，每个细胞约50--100个拷贝。基于定义哺乳动物的染色体的标准，这个载体叫做″人类人工染色体″不适当，因为它通过不相关的机制具有不同的性质和功能。
因此仍然需要完全的合成或者人工染色体，他们来自于能在体外操作的DNA，同时，转染进细胞后有功能染色体结构，且以可控方式指导基因表达。
在人类人工微染色体和基因治疗载体的发展构建中，克隆大的，高度重复DNA的能力是一个重要的步骤。此外，微生物中重复DNA的稳定克隆对制作哺乳动物染色体的高分辨率物理图谱非常重要。
有许多克隆系统能促进在微生物中克隆，扩增外源DNA。已成功地应用质粒，噬菌体和酵母人工染色体(YACs)克隆许多哺乳动物的DNA序列。然而，某些类型的重复DNA似乎在这些载体中结构不稳定(Schalkwyk等，Curr.Opin.Biotechnol.6(1)3793(1995)；Brutlag，D.等细胞，10509-519(1977))。这导致基因组物理图谱上的空缺，同时也不能应用这些载体来扩增高度重复的哺乳动物着丝粒DNA。
已构建细菌人工染色体(BACs)可在大肠杆菌中克隆大的DNA片段(O Conner等，科学，244(4910)307-12(1989)；Shizuya等，美国科学院学报，89(18)8794-7(1992)；Hosoda等，核酸研究，18(13)3863-9(1990))。虽然这个系统看起来能稳定地扩增至少300kb以上的哺乳动物DNA，几乎没有什么独立的哺乳动物DNA片段曾被分析(Shizuya等，美国科学院学报，89(18)8794-7(1992))。同时在BAC载体中检测的结构稳定的片段，广泛的特征就是与某种类型的序列相关。因此，这些片段是否包含重复DNA元件还不清楚。尤其是，依据限制性位点和Southern分析，这些片段不包含α卫星DNA是明确的。
许多哺乳动物的DNA序列看起来似乎在酵母人工染色体(YAC)载体中结构稳定，然而相似长度的某些重复元件却不稳定(Neil等，核酸研究，18(6)1421-8(1990))。对YAC系统来源的DNA性质的的了解表明大的系列重复单位在遗传上是不稳定的，即使在相似长度的的非重复DNA能稳定的条件下。因此，在BAC载体上，象α卫星DNA中发现的大(＞100bp)系列重复序列的结构稳定性不能用合理的必然性来预测。此外，即使某系列的α卫星族在BAC载体中结构上稳定，但可以推定，那些有足够长度及序列组成以至能促进着丝粒功能的系列能否在这个载体中稳定扩增仍不清楚。
与所引用的方法不同，本发明的几个实施方案描述了有确定结构及组成的预先构建的染色体载体，其可直接导入病人细胞。因为本发明中所描述的载体不依赖于插入内源染色体或者尔后的扩增，因此细胞中构建体的结构与转染前本质上是相同的。
与所引用的方法不同，本发明描述的载体由确定的序列组成。而且，构建这些合成的染色体的方法使得可以迅速鉴别其他功能重要序列。
与所引用的方法不同，本发明是发明人首次证明可通过将纯化DNA导入哺乳动物细胞能重新构建人工哺乳动物染色体。
与所引用的方法不同，因为本发明中所描述的载体在体外合成，插入新的DNA序列是简单而有效的。
发明概要本发明的目的是提供单一和杂交合成族DNA(特别是α卫星DNA)的方法。本发明的另一个目的是提供克隆、繁殖和稳定重组产生重复DNA(特别是天然存在的或合成的α卫星族)的方法。
因此，本发明涉及稳定克隆大重复DNA序列的方法、包含以上族的载体和用这些载体转化的宿主。
本发明发明人已开发了产生大量长度多达736 kb的纯化的完整α卫星族的方法。通过将这些族与端粒DNA和人类基因组DNA序列一同转染进人类细胞，产生了在缺少选择的情况下显示出高度有丝分裂稳定性的若干全合成人类染色体。
与以前试图产生人工哺乳动物染色体的方法不同，这种方法不依赖于现有的内源染色体的修饰。此外，在内源染色体内它不产生多重整合事件。这些染色体在染色体外形成和保持，因此避免了整合到内源染色体。
合成染色体形成相对高的频率和与染色体形成相关联的其它基因组重排的缺乏使得本发明发明人制备的合成染色体可以在异源基因表达和基因治疗中用作有效的载体。
因此，本发明基于发明人发现，借助于单独分离的纯化的DNA，合成或人工染色体在细胞被从头产生(从纯化的DNA)，并作为染色体外因子被保持。这种染色体保持天然哺乳动物染色体的必需功能之处在于，它作为非整合的构建体被稳定地保持在单个的哺乳动物细胞(没有选择性压力)中，就象天然存在的染色体一样被遗传。对于线性的染色体，这表示着丝粒、端粒和复制起点功能。
因此，本发明涉及一种合成或人工哺乳动物染色体。该染色体从分离的纯化的DNA产生。分离的纯化的DNA被转染进哺乳动物细胞。在没有整合进内源染色体的情况下，其形成功能性染色体。这种染色体不是来源于原位内源天然存在的染色体。起始材料是分离的纯化的着丝粒DNA和允许染色体形成而不整合的DNA。对线性染色体，包括端粒DNA。在一个优选的实施方案中，允许染色体形成而不整合的DNA是基因组DNA(来源于有机体天然存在的基因组)。
这样人工哺乳动物线性染色体最好实质上包含着丝粒、端粒和基因组DNA。在一个实施方案中，人工染色体是环形染色体。在这种情况下，不存在端粒DNA，因为对复制染色体末端其不是必需的。
所说的基因组DNA是次基因组DNA片段，其是限制酶消化片段、通过对基因组DNA的机械剪切产生的片段或体外合成的片段。该基因组DNA的起始材料(即转染的)可以是异源片段的混合物(例如限制消化物)，或可以是克隆的片段(同源的)。
着丝粒DNA包括指导或支持动粒形成从而能够使得进行适当的染色体分离的DNA。在活性功能性着丝粒上的着丝粒DNA在有丝分裂期间与CENP-E相关联，如免疫荧光或免疫电子显微镜法所说明的。″相关联″意指着丝粒DNA和CENP-E由荧光原位杂交(FISH)免疫荧光共-定位。
端粒DNA包括提供端粒功能的串联重复的TTAGGG。即线性DNA分子的复制末端。端粒DNA作为一个可有可无的在线性染色体是所需的时所使用的组分被包含。本文通过将″端粒的/″端粒″放入括号中表示。
在转染之前，DNA可以是裸露的、用一种或多种DNA-凝聚剂凝聚的或用一种或多种DNA-结合蛋白包被的。
本发明也涉及一种人工哺乳动物染色体，其是通过向哺乳动物细胞引入以上分离的纯化的DNA片段产生的。在一个优选的实施方案中，所述方法使用实质上包含着丝粒、端粒和基因组DNA的DNA。
各种片段可以单独地转染或者在转染之前连接一种或多种。这样，着丝粒(端粒)和基因组DNA被单独地(unligated)引入，或者一种或多种分离的纯化的DNA相互连接。
本发明也涉及包含人工哺乳动物染色体的哺乳动物细胞和包含人工哺乳动物染色体的组合体。
本发明也涉及以上描述的分离的纯化的DNA，当引入到哺乳动物细胞中时，其形成人工哺乳动物染色体。在优选的实施方案中，分离的纯化的DNA实质上包含着丝粒、端粒和基因组DNA。
本发明也涉及包含纯化的DNA的哺乳动物细胞和包含纯化的DNA的组合体。
本发明也涉及包含纯化的DNA的载体。
本发明也涉及包含所述载体的哺乳动物细胞和包含所述载体的组合体。
本发明也涉及以上描述的分离的纯化的DNA，其是通过组合一种或多种以上所描述的DNA的方法产生的。在优选的实施方案中，所述DNA包括(1)着丝粒DNA，(2)端粒DNA，(3)基因组DNA。DNA可以是未连接的或一种或多种可以是相互连接的。
本发明也涉及通过把以上所述的纯化的DNA引入哺乳动物细胞制造人工哺乳动物染色体的方法。
本发明也涉及使DNA能够形成人工染色体的方法，该方法包括体外组合以上所描述的DNA。
本发明也涉及通过把纯化的DNA引入哺乳动物细胞并使染色体复制，在哺乳动物细胞中繁殖人工染色体的方法。
在一个优选的实施方案中，本发明也涉及通过从人工哺乳动物染色体表达异源基因在哺乳动物细胞中表达所述基因的方法。
这样，本发明也涉及通过在人工染色体上包括进所需基因以表达兴趣基因来提供所需基因产物的方法。在优选的实施方案中，本发明提供了一种基因治疗的方法，其通过在人工哺乳动物染色体上包括进异源治疗性DNA，以便对包含所说染色体的哺乳动物产生治疗效果。
在本发明的一个优选的实施方案中，着丝粒DNA是α-卫星DNA。
在本发明的一个优选的实施方案中，人工哺乳动物染色体完全来源于人类DNA序列，并且在人类细胞中是功能性的。
附图简要描述
图1.本发明的方法的一个示意性图。数字″1-16″代表α卫星DNA(约171 bp)的单体单位的1-16个拷贝，在线性族中串联排列。″X″代表在携带所说族的载体的骨架中在扩展至所需大小期间的所需限制酶位点。
图2.百分重组体(在50代之后)和族大小(kb)的相互关系的图解。
图3.用于产生大的头-对-尾串联的α卫星DNA族的方法。pVJ104-Yα16以BamHI和Sjil线性化，经脉冲电场凝胶电泳(PFGE)纯化。同样地，pBac-Yα16以BamHI和BglII线性化，经PFGE纯化α卫星族。A)在连接酶，BamHI和BglII存在下将纯化的族一起温育。因为BamHI和BglII是互补/非同裂酶突出端，形成BamHI/BglII接合的连接事件(头-对-尾连接正是这种情况)将消除两种位点。这样，头-对-尾接合将阻止被BamHI和BglII切割。相反，头-对-头，或尾-对-尾的连接事件将分别再产生BamHI或BglII位点。因为存在BamHI和BglII，这些连接产物将被切开产生其组成单体(或头-对-尾多聚体)。通过控制连接酶的量，温育时间和DNA的浓度，必要时可以变化头-对-尾产物的长度。B)连接后，由PFGE分析产物。第1道，分子量标准(NEBL Midrange II标记)；第2道，在BamHI和BglII存在4小时下连接的Yα16(BamHI/BglII片段)；第3道，在BamHI/BglII存在下连接12小时的Yα16(BamHI/BglII片段)，第四道，在BamHI和BglII存在下模拟连接的Yα16(BamHI/BglII片段)；第5道，无限制酶连接12小时的VK75(BssHII片段)；第6道，在BssHII存在下连接12小时的VK75(BssHII片段)；第七道，模拟连接的VK75(BssHII片段)。连接产物的分子量显示在左边。注虽然这些样品运行在相同的凝胶上，但在第4和5道之间去除去了若干不相干的道。
图4.用以制造合成染色体的策略。
图5.克隆22-7和22-13的合成染色体的荧光原位杂交(FISH)分析。收获细胞，滴加到载玻片上，如实验方法(参见本文实施例)中所述杂交到Yα卫星DNA上。用得克萨斯红抗生物素蛋白检测生物素化的探针，并用两层生物素化的抗生物素蛋白和得克萨斯红抗生物素蛋白扩增。A)克隆22-7的中期扩散的DAPI图象。B)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与A)同。C)克隆22-13的中期扩散的DAPI图象。D)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与C)同。在每种情况之下，合成染色体用一白箭头表明。
图6.克隆22-6和23-1的合成染色体的FISH分析。收获细胞，滴加到载玻片上，如实验方法(参见本文实施例)中所述杂交到Yα卫星DNA(克隆22-6)或17α卫星DNA(克隆23-1)上。用得克萨斯红抗生物素蛋白检测生物素化的探针，并用两层生物素化的抗生物素蛋白和得克萨斯红抗生物素蛋白扩增。A)克隆22-6的中期扩散的DAPI图象。B)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与A)同。C)克隆23-1的中期扩散的DAPI图象。D)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与C)同。在每种情况之下，合成染色体用一白箭头表明。在D)中，黄箭头表明在整合位点的C组染色体的位置。
图7.克隆22-11和17-15的合成染色体的FISH分析。收获细胞，滴加到载玻片上，如实验方法(参见本文实施例)中所述杂交到Yα卫星DNA(克隆22-11)或17α卫星DNA(克隆17-15)上。用得克萨斯红抗生物素蛋白检测生物素化的探针，并用两层生物素化的抗生物素蛋白和得克萨斯红抗生物素蛋白扩增。A)克隆22-11的中期扩散的DAPI图象。B)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与A)同。C)克隆17-15的中期扩散的DAPI图象。D)除了α卫星探针用三立方滤器可视化外，其它与C)同。在每种情况之下，合成染色体用一白箭头表明。
图8.在包含合成染色体的克隆中存在的转染α卫星DNA的量的测定。A)收获总基因组DNA，消化，如实验方法中的描述电泳。第1道，HT1080；第2道，克隆22-6；第3道，克隆22-7；第4道，克隆22-11；第5道，克隆22-13；第6道，克隆23-1。B)显示了各克隆合成Yα卫星DNA估计的量。注克隆23-1用17α卫星DNA转染，因此不包含合成的Yα卫星DNA。
图9.在有丝分裂期间CENP-E与合成染色体相关联。如实验方法中的描述，在从含有合成染色体的克隆收获的中期染色体上进行免疫荧光分析。A)克隆22-11的DAPI-染色的染色体。B)除了抗CENP-E抗体的位置用三立方滤器可视化外，其它与A)同。C)克隆23-1的DAPI-染色的染色体D)除了抗CENP-E抗体的位置用三立方滤器可视化外，其它与C)同。在每种情况之下，合成染色体用一白箭头表明。
图10.在没有选择生长70天后克隆22-11的X-Gal平板染色。如本文实验方法中的描述收获细胞并染色。A)HT1080；B)克隆22-11。在克隆22-11中存在蓝细胞而在HT1080中不存在表明在这些细胞中仍然表达β-geo。
优选实施方案的详尽描述本发明已发现功能性哺乳动物染色体可以从引入哺乳动物细胞的纯化的DNA构建。对各种用途而言利用这些染色体具有若干优点。
首先，因为它们被形成和自我复制，通过插入到宿主基因组中它们将不引起插入突变。
第二，由于大的转移载体(在兆碱基范围内)，具有容纳包括其所有调节元件的大基因的全部内容的能力。其本身可以包括几兆碱基的DNA。
第三，因为一些遗传疾病是一个以上基因缺陷的结果，由于可以容纳多于一个基因的哺乳动物人工染色体。
第四，染色体是稳定的，这样可以在许多细胞分裂上提供治疗益处。
第五，染色体是-非致免疫的。
因此，本发明提供了一种在微生物中产生结构上完整的高度重复的DNA的方法，其被用于构建人工染色体。限定长度、组成、方向和定相的族是可能的。″适当的定相″指在族中任何高级的重复的精确长度和方向不被族构建改变(从天然存在的序列改变)，在重复单位的接合时也不存在非重复DNA。例如，对于alphoid序列，高级重复单位的长度和方向完全相同于天然存在的高级的重复单位，在高级重复单位的接合时不存在非-alphoid序列，除了产生限制位点的修饰碱基外。
因此，提供了一种用于克隆重复串联族DNA的方法，其中制备第一DNA单位，使得该DNA单位的相对的端包含互补的但非同裂酶的限制位点。将这种DNA连接进载体，该载体在限制位点之一线性化。如步骤a)制备第二DNA单位，然后与第一单位串联连接，以形成定向重复族。将这一族转化进宿主细胞，尤其是细菌宿主细胞，选择包含族的和稳定的克隆。以载体线性化开始，重复这些步骤，直到达到所需的族大小。
本发明的定向克隆方案在图1中说明，其中说明了克隆的α卫星DNA高级的重复。如图所示，本发明的方法利用″建造″方法，其中较短的单位(优选地是高级的重复)加合在引起产生较长的串联族重复单位。所述单位以导致限定的方向的方式相互加合，其由两个不同的限制位点(每个在各重复单位的各端)建立。优选地，基于串联族的重复单位(尤其高级的重复单位)包含互补但非同裂酶的限制位点。这样的末端可以利用聚合酶链式反应之类的方法设计到所说单位中。在本发明的方法中，互补末端旨在包括互补的突出末端和平末端两者。
在一个优选的实施方案中，DNA族是alphoid DNA。如实施例1所示，聚合酶链式反应可以用来扩大一个单一2.7kb DNA alphoid单位(实际长度2.712kb)，以便从人类染色体17在高级的α卫星重复的相对的末端产生互补限制位点(BamHI和BglII)。可以用聚合酶链式反应-介导的定点诱变修饰高级重复的末端，以便在各重复的相对的末端产生互补的限制位点。然后将修饰的高级的重复克隆进小-F克隆载体pBACI08L(Shizuya，H.等，美国科学院学报，898794-8797(1992)，本文一并参考)中。将这些互补限制位点用于连接非互补侧翼限制位点，以直接克隆来源于单一修饰的高级重复的合成族α卫星DNA(图3)。合成的族可以从任何高级的alphoid重复(包括来源于从染色体17、Y染色体或其它染色体的这样的alphoidDNA)产生，此外，可以制备由两种染色体高级重复组成的杂交族。在一个优选的实施方案中，所说DNA是人类DNA。
长达200-215kb的族在本发明的载体与宿主中是稳定的。在一个实施方案中，构建了一个87kb-215kb长的族。在一个优选的实施方案中，构建了一个至少100kb长的族。在一个非常优选的实施方案中，构建了一个至少140kb，尤其是至少174kb长的族；174kb的族超过最小已知的观察到的功能性α卫星族的长度。
在产生这样的位点中有用的互补但非同裂酶限制酶的例子包括SalI和XhoI；MunI和EcoRI；AflIII和NcoI/StyI(同裂酶 两者之一都是either逐-非同裂酶配偶体的配偶体)；NheI和XbaI和StyI/AvrII(同裂酶)和Spel(任何组合)；ClaI和BstBI和AccI(任何组合)；MluI/AflIII(同裂酶)和BssHII和AscI；和NotI和EagI。BclI是BamHI与BglII两者的互补/非同裂酶。
然后，用例如(1)BamHI和SfiI或(2)BglII和SfiI消化扩增的DNA。在用能够分离这样的DNA的物理的方法(例如，凝胶电泳)分离消化的DNA中的带后，切下消化物的DNA带，并与从其它消化物切下的DNA带连接。在上述例子中，因为BglII和BamHI产生相容的突出端，SfiI产生仅能以特定的方向转移的不对称的突出端，所以将侧翼于这些位点的DAN连接到载体DNA上，以产生头到尾方式的串联二聚体。然后这种DNA可以转化进微生物。
在这一策略的第二变体中，平端切割限制酶可以替代BamHI和BglII。例如，SmaI和EcoRV可以分别替代BamHI和BglII。然后如上所述进行消化和片段分离是。对两种平端和互补/非同裂酶变异相同的这一策略的一个重要特征是，如果需要，族的生理学定相可以精确地保持。可以使用的其它平端切割酶的例子包括SspI、StuI、ScaI、PmlI、PvuII、Ec1136II、NaeI、EheI、HincII、HpaI、SnaBI、NruI、FspI、DraI、MscI、Bst1071、AluI、Asp 700/XmnI、AviII、BbrPI、Bst1107、Eco47III、DpnI、HaeIII、HindII、NamI、MluMI、MvnI、RSaI、SwaI、Bsh1236I、Eco72I、PalI和SrfI。
可以采用如实施例2描述的简单的生长和稀释实验测定包含大的微生物中合成α卫星DNA串联族的克隆质粒，例如，可以用传代50代和后续的质粒DNA结构完整性分析测定结构稳定性。可以通过限制分析和琼脂糖凝胶电泳分析质粒结构。这些克隆极少甚至没有观察到重组，表明定向克隆方案可以用于构建并繁殖在小-F克隆载体(如pBAC 108L载体)和合适的大肠杆菌宿主中的合成α卫星族。
本发明的方法可以用于构建任何所需的重复DNA单位。例如，可以克隆来自任何真核染色体的α卫星DNA(尤其是人类DNA)。大串联族高度重复DNA的其它例子包括免疫球蛋白DNA基因座，异源核染质重复区和端粒。
本发明的定向克隆方法不需要存在多形的限制位点(如克隆内源(非修饰的)族时所需的)。甚至当存在时，这些位点不允许控制族的确切大小。此外，通过利用本发明的方法中使用的高级的重复(参见图1)，接着加倍其大小，整个族的确切的序列是已知的，由于原来的高级的重复的序列是已知的。
当克隆内源族(如内源α卫星族)，人们不能确信给定族的精确组成。尤其是，族中非重复DNA的间断可以明显影响在大肠杆菌中的稳定性。此外，对作为基因治疗合适的载体，人们必须知道向这种治疗的接收者所提供的载体的确切的序列。本发明的方法消除了这种疑虑，并且使得技术人员迂回测序天然α卫星族，有利于从已知的重复序列从头构建有用的族。
在结构上有差别的高级的重复相对于更为同源的族而言一般显示出在大肠杆菌中增加的结构稳定性。这样，通过利用按照本发明的方法的同源的合成族，可以获得载体中的重复DNA的最小限度稳定性的精确测定。
任何所需细菌宿主(其中载体稳定地被保持)可以用作宿主。尤其是当利用BAC载体和BAC系统时，大肠杆菌是有用的。
合成的α卫星族可以以下列方式用于合成的人类染色体的构建(1)将合成的α卫星族转染到人类或其它哺乳动物细胞系中；(2)将合成的α卫星族与随机克隆的人类DNA或者特异性DNA片段一起转染到人类或其它哺乳动物细胞系中；(3)将合成的α卫星族与未连接的特异性染色体组分共-转染进人类或其它哺乳动物细胞系中，所说组分如端粒DNA、基质连接区和/或提高包含α卫星的游离基因DNA有丝分裂稳定性的其它染色体座。这些非连接形式的组分的共-转染使得可以转染细胞系，以构建无限量的结构排列，使核分裂最稳定的形式得以保持，而不稳定的形式有时失去。其后可以用标准的方法和过程收获稳定的构造。可以分离在缺少选择压力时显示出有丝分裂稳定性的那些构建体，且其后用于制备基因治疗载体，该载体包含一种或多种治疗有用实体，如基因、核酶或反义转录物。
因此，本发明涉及实质上包含着丝粒、基因组和可有可无的端粒DNA的合成或人工哺乳动物染色体。在一个可替性实施方案中，人工染色体是一种环形染色体。在这种情况下，不存在端粒DNA，由于对复制染色体末端而言它不是必需的。所说染色体至少具有在哺乳动物细胞中提供必需染色体功能的DNA序列。
所说的基因组DNA是次基因组DNA片段，其选自机械剪切片段的限制酶消化片段和体外合成的片段。染色体基因组DNA组分可以来源于次基因组片段的混合物(例如限制酶消化物)，或者来源于克隆的片段。
基因组DNA的功能是双重的。DNA表达基因产物或引起基因产物的表达(例如，通过具有调节功能)，所说DNA使得可以在细胞中从纯化的DNA形成人工染色体，无须在细胞中将纯化的DNA整合进内源染色体，人工染色体也包含着丝粒DNA和可有可无的端粒DNA。基因组DNA可以来源于任何有机体，并且可以是任何大小的。
形成合成的哺乳动物染色体组分的基因组DNA可以来源于哺乳动物源(除染色体在其中复制的细胞所来源的哺乳动物外)。例如，小鼠基因组DNA可以提供给人类细胞，人类基因组DNA可以提供给其它哺乳动物细胞。此外，它可以来源于不同于着丝粒或端粒源的源。
另外，基因组DNA的功能可以用任何有机体(包括原核有机体)的基因组DNA和用体外合成的DNA(相应于天然存在的序列，部分同源于天然存在的序列或者完全是非同源的)有力地进行例证。
着丝粒DNA包括指导或支持动粒形成从而能够使得进行适当的染色体分离的DNA。在活性功能性着丝粒上的着丝粒DNA在有丝分裂期间与CENP-E相关联，如免疫荧光或免疫电子显微镜法所说明的。″相关联″意指着丝粒DNA和CENP-E由荧光原位杂交(FISH)免疫荧光共-定位。
在本发明的一个优选的实施方案中，着丝粒DNA是α卫星DNA。然而，任何功能性着丝粒DNA(尤其是重复DNA)使得可以用本文描述的方法制造人工染色体。
本发明发明人已建立用于产生大的α卫星族的体外方法。以前，没有使大于200kb的在结构上完整的α卫星DNA定量纯化(对于哺乳动物细胞的转染必需的)的可供使用的方法。通过利用这些方法，控制量的α卫星DNA可以体外产生。如本文的描述，必要时，通过经验控制连接酶的量、培养时间和DNA的浓度，可以变化最终产物的长度。
然而，本发明不限于来源于α卫星DNA的着丝粒DNA。由本发明发明人建立的体外方法可以运用于任何如本文所述起作用的着丝粒DNA，尤其是重复DNA的。
此外，对于着丝粒形成，不需要整个α卫星重复。这样，着丝粒DNA也可以包括α卫星衍生物和类似物，例如，α卫星或有关的卫星DNA的子-单体区。
在alphoid单体内代表蛋白质结合位点的亚区可以连接在一起，以产生由小的重复单位组成的功能性着丝粒。这一实施方案的功能由小鼠-人类杂交体的数据显示。
在鼠物种M.musculus中，小的卫星DNA包含CENP-B盒，似乎是α卫星DNA的功能等同物。有趣的是，在M.musculus中，小的卫星重复单位仅仅120bp，与CENP-B盒外的α卫星DNA没有明显的同源性。尽管在重复大小和序列中不同，人类染色体在小鼠/人类杂交体中有效分离。这说明丝粒重复单位大小与序列可以变化，而不消除着丝粒功能。
鼠物种M.caroli明显缺乏小卫星DNA(Kipling等，分子细胞生物学，154009-4020(1995))。在这一物种中，功能性α卫星等价物似乎是79bp卫星序列，包含CENP-B盒(存在60bp序列，其97％同源于79bp序列，但缺乏CENP-B盒)。在M.musculus和M.caroli杂交中，两物种的染色体通常在相同的细胞内分离。这表明小卫星和79bp卫星序列在有丝分裂期间被相同的纺锤体识别。这样，不同的着丝粒重复大小可以是功能性的。
因为α卫星，小卫星和79bp卫星重复是不同大小和功能的，本身绝对重复大小不是着丝粒DNA的功能决定性的。另外，因为在这些着丝粒重复之间仅有有限的序列同源性，所以很可能在代表蛋白质结合位点的重复之内的亚区是重要的功能性组分。
这样，在本发明的一个实施方案中，在α卫星DNA之内的着丝粒DNA含有亚区。在一个优选的实施方案中，着丝粒DNA是由串联连接由序列5aTTCGttggAaaCGGGa 3(SEQ ID NO1)限定的CENP-B盒组成的，在以上序列中由大写/粗体字母表示的碱基对CENP-B结合来说是最重要的，由小写字母表示的碱基可以由其它碱基替代。
在其它实施方案中，其它物种alphoid等同物用于着丝粒DNA。人类和其它哺乳动物的染色体已显示出在其它物种的细胞中有效地分离(如种间肉体细胞杂交体所说明的)。这些杂交体的例子包括小鼠×人类，仓鼠×人类，大鼠×人类，仓鼠×小鼠，大鼠×小鼠和小鸡×人类。人类染色体在小鸡细胞中分离的能力(Dieken，E.，等，Nature Genet.12174-182(1996))表明人类着丝粒DNA在非哺乳动物物种(即禽类)中也是功能性的。
基于从杂交物种杂交体的观察结果，很明显来源于一个物种的染色体在其它物种中是功能性的。因此，合成染色体可以在人类细胞中利用其它哺乳动物(和禽类)的着丝粒替代α卫星DNA或者与α卫星DNA一起产生。相反，α卫星DNA可以在其它哺乳动物(和禽类)物种中用作着丝粒DNA源。
这样，在本发明的另一个实施方案中，将基因组(端粒)DNA与M.musculus小卫星DNA，Mus caroli 79bp卫星DNA或其它哺乳动物的类似的序列一同转染进细胞。在另一个实施方案中，将端粒和基因组DNA与来源于禽类(avian)细胞的着丝粒DNA一同转染进细胞。
实质上，在有丝分裂期间与CENP-E相关联的着丝粒DNA体现了本发明的一个方面，即包括使用异源于宿主细胞的着丝粒序列和其它合成染色体组分的一个方面。只要在染色体中的着丝粒序列在有丝分裂期间与CENP-E相关联，哺乳动物细胞的功能性染色体就预期与基因组序列和端粒序列无关，并且对那一物质，与特异性着丝粒序列无关。
端粒DNA可以来源于保持端粒功能的任何DNA序列(来源于任何所需物种)。在哺乳动物和其它脊椎动物中，在染色体末端最丰富的和保守的序列是TAGGG，这形成长度在2到20千碱基之间的族。人类端粒DNA由约5千碱基的重复TTAGGG组成的，这种序列的小的伸展在向哺乳动物细胞系引入线性分子后足以引起端粒形成(Huxley，C.，基因，17-12(1994))。简单的(TTAGGG)n族足以提供端粒功能所需的人工染色体。因此，端粒DNA包括串联族六聚体TTAGGG。当需要形成线性染色体时，就包括端粒DNA。
在Huxley等，生物技术12586-590(1994)中讨论了端粒、着丝粒和复制起点。
本发明也涉及纯化的DNA分子，其实质上包含本文所描述的着丝粒、基因组和可有可无的端粒DNA。
在一个实施方案中，纯化的DNA是裸露的DNA。
在另一个实施方案中，纯化的裸露的DNA与一种或多种DNA凝聚剂凝聚，为了稳定化它使其抵抗剪切，在转染之前凝聚纯化的DNA可以是有利的。通过在转染前凝聚纯化的着丝粒(端粒)和基因组DNA，其对由转染操作引起的结构损伤具有更强的抵抗力。这样，在本发明的一个实施方案中，纯化的着丝粒(端粒)和基因组DNA在转染之前与一种或多种DNA凝聚剂凝聚。在这一方面，多聚阳离子已显示出物理凝聚高分子量DNA，并且保护它抵抗机械剪切(Kovacic等，核酸研究，233999-4000(1995)；Widom和Baldwin，分子生物学杂志，144431-453(1980)；Widom和Baldwin，生物聚合物，221595-1620(1983))。因此，在另一实施方案中，纯化的DNA以多聚阳离子化合物凝聚。多聚阳离子的例子包括聚-赖氨酸、聚-精氨酸、精脒、精胺和氯化六胺钴。
在一个可替实施方案中，本发明包括用蛋白质预包被的DNA。用DNA-结合蛋白(如组蛋白，非组蛋白染色体蛋白质，端粒结合蛋白和/或着丝粒结合蛋白)包被DNA也可以是有利的。这一预包被预期有若干理想的结果。首先，它导致DNA的凝聚，保护高分子量DNA使之免受剪切。第二，它通过阻断核酶结合到DNA上抑制转染DNA的核酶降解。第三，由于以上列出的各蛋白质包含核定位信号，转染后预包被的DNA可以更有效地进入核。通过在转染之前用DNA结合蛋白顶包被着丝粒(端粒)和基因组DNA，我们预期会增加转染和合成染色体形成的效率。
这样，在另一个本发明的实施方案中，纯化的着丝粒(端粒)和基因组DNA在转染之前用DNA结合蛋白包被。DNA-结合蛋白的例子包括组蛋白，非组蛋白染色体蛋白质，转录因子，端粒结合蛋白和/或着丝粒结合蛋白。
DNA-结合蛋白也可以经它们对DNA的亲和性鉴别和纯化。例如，可以在滤膜杂交实验中揭示DNA结合，在所说实验中，使蛋白质(通常是标记的以利于检测)结合到固定化在滤膜上的DNA结合或者反之，其中DNA结合位点(通常是标记的)结合到蛋白质已固定化在其上的滤膜上。这样结合的序列特异性和亲和性用DNA保护测定和凝胶阻滞测定揭示。这样的蛋白质的纯化可以用序列-特异性DNA亲和色谱进行，例如采用结合上域的DNA衍生化的树脂的柱色谱，DNA结合蛋白的蛋白酶促降解可以用于揭示保持结合能力的DNA。
这样，本发明涉及一种人工哺乳动物染色体，其是通过用本文描述的纯化的DNA转染哺乳动物细胞，使细胞体外完全重构DNA产生的。
这样，本发明涉及一种人工哺乳动物染色体，其是通过用纯化的裸DNA转染哺乳动物细胞产生的，该DNA实质上包含着丝粒DNA(端粒DNA)和基因组DNA，如本文所描述的。
这样，本发明也涉及一种人工哺乳动物染色体，其是通过用纯化的凝聚DNA转染哺乳动物细胞产生的，该DNA实质上包含着丝粒DNA(端粒DNA)和基因组DNA，如本文所描述的。
本发明也涉及一种人工哺乳动物染色体，其是通过将纯化的包被DNA引入哺乳动物细胞产生的，该DNA实质上包含着丝粒DNA(端粒DNA)和基因组DNA，如本文所描述的。
本发明也涉及由体外组合本文所描述的分离的纯化的和基因组DNA(端粒DNA)的方法产生的纯化的DNA。
本发明也涉及由体外组合本文所描述的分离的纯化的着丝粒DNA(端粒DNA)和基因组DNA的方法产生的纯化的凝聚DNA。另外，单独的DNA组分可以预凝聚然后组合。
本发明也涉及由体外组合本文所描述的分离的纯化的着丝粒DNA(端粒DNA)和基因组DNA并添加DNA-结合蛋白的方法产生的纯化的包被DNA。另外，单独的DNA组分可以预包被然后组合。
以上所述的纯化的DNA可以包括未连接的着丝粒(端粒)和基因组DNA。另外，以上所述的纯化的DNA也可以包括着丝粒(端粒)和基因组DNA，其中这些DNA中一种或多种是相互连接的。
本发明也涉及包含以上所述的纯化的DNA的组合体。该组合体可以包含有利于DNA进入细胞的组分。对人工染色体的形成，组合体可以有利于DNA摄取进哺乳动物细胞。另外，组合体可以包括有利于DNA摄取进细胞的组分，所说的细胞用于繁殖包含所说DNA的载体。
本发明也涉及包含以上所描述的DNA的载体。该载体可以用于繁殖DNA，即，在将它们引入到哺乳动物细胞之前扩增以上所述的序列，并形成人工染色体。
因此，本发明也涉及包含以上所描述的DNA的载体的组合体。
本发明也涉及包含以上所描述的载体的细胞。
本发明也涉及包含所说的人工染色体的哺乳动物细胞。
本发明也涉及包含以上所述的纯化的DNA的哺乳动物细胞。
虽然本发明包括任何哺乳动物细胞，但在本发明的优选的实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。
在本发明的优选的实施方案中，着丝粒DNA是人类α卫星DNA。然而，应当理解，α卫星DNA可以来自任何灵长类。本发明还包括来源于非灵长类哺乳动物的着丝粒DNA，其中所说的着丝粒DNA在有丝分裂期间与与CENP-E相关联。任何在有丝分裂期间与CENP-E相关联的着丝粒DNA，尤其是重复DNA(其来源的无关的有机体的)预期向按照本发明的人工哺乳动物染色体提供功能性的着丝粒序列。这样，人工哺乳动物染色体在人类细胞中起作用，例如，可以包含不是来源于人类而是来源于非人类哺乳动物和甚至来源于非哺乳动物物种(如禽类)的着丝粒序列。与CENP-E相关联的任何重复DNA是潜在的有用的。因此，在本文的教导下，任何着丝粒序列都可以试验作为哺乳动物人工染色体组分的功能。
在具体公开的本发明的实施方案中，着丝粒DNA包括大的伸展的α卫星族，由重复的端粒序列(TTAGGG)n和由用限制酶NotI消化产生的随机基因组片段组成的一个区段。在优选的实施方案中，限制酶将DNA消化成片段，其在由NotI消化人类基因组DNA所产生的片段的范围内，优选地在10kb到3bm的范围内。所说的限制酶包括但不限于BamHI、Bgll、SalI、Xhol、SfiI、NotI、SrfI、PmoI和AscI。
当纯化的DNA引入哺乳动物细胞时，这种DNA形成一个功能性的合成或人工染色体。这种染色体具有天然存在的哺乳动物染色体的特征。染色体以低的拷贝数存在于细胞中，通常每个细胞一个。染色体是线性的，并包含端粒序列。在有丝分裂期间CENP-E与人工染色体相关联，表明功能性动粒的形成。在缺少选择的情况下，染色体是有丝分裂上稳定的。染色体以一种不可检测的整合频率随时间的变化在结构上是稳定的。染色体包含一个或多个转录活性基因。这样，这些染色体不是来源于天然存在的染色体，而是从分离的纯化的DNA序列开始体外构建的。
因此，本发明也涉及用于制造人工哺乳动物染色体的方法，该方法包括把以上所述的纯化的DNA引入哺乳动物细胞。
可以用大量本领域技术人员已知的方法将DNA引入到哺乳动物细胞。这些方法包括但是不限于电穿孔；磷酸钙沉淀法；脂转染；DEAE葡聚糖、脂质体、受体-介导的胞吞和颗粒运送。染色体或DNA也可以用来微注射蛋，胚胎或来自体内的或在体外的细胞。可以用本领域已知的引入技术(例如脂质体)用本文描述的染色体或DNA转染细胞。在本发明的一个优选的实施方案中，借助于脂转染将纯化的DNA引入哺乳动物细胞。
这样，纯化的DNA对转染哺乳动物细胞来说是有用的，所说的转染导致在细胞中从转染的DNA形成人工染色体。
DNA可以在非哺乳动物细胞中单独地繁殖，或者一种或多种组分连接在一起繁殖。这样，本发明也涉及连接到用于繁殖的载体上的纯化的DNA。这样的载体在本领域中是众所周知的，包括但不限于pBac108L，p1，pACYC184，pUC19，pBR322，YACs和粘粒。
本发明也涉及包含人工或合成染色体的哺乳动物细胞。本发明涉及任何哺乳动物染色体或哺乳动物细胞。虽然包括所有的哺乳动物，但优选的具体例是人类。因此，本发明的一个优选的实施方案包括包含合成的人类染色体的人类细胞。
所说的DNA与染色体已特别地开发来作为基因治疗和其它目的的表达载体。因此，在本发明的优选的实施方案中，纯化的DNA实质上也是由对于表达所需的基因产物(例如治疗剂)有用的一个或多个DNA序列组成。这样，本发明涉及用于通过把可表达的DNA包括在人工染色体中将这种DNA引入细胞的方法。DNA可以是可调节的，有结构的，作为基因产物表达的等。在一个优选的实施方案中，DNA提供基因产物。当转染进哺乳动物细胞时，在转染后形成的人工染色体具有和表达这些DNA序列。
过去20年，重组DNA技术已越来越多地用于产生所需的生物材料。编码各种药学上重要的人类基因产物的DNA序列已被克隆。这些包括胰岛素，纤溶酶原激活剂，α1抗胰蛋白酶和凝结因子。然而，本发明包括表达任何和所有所需的药学上和/或生物学上有关的基因产物。
一旦在细胞中，异源基因产物就在所选择的组织中以产生功能性的基因产物的水平表达。总的共同之处是大多数转染基因的正确的组织-特异性表达可以完成。对于正确的组织特异性，可能重要的是在引入进细胞和形成人工染色体之前除去所有用于克隆兴趣DNA序列的载体序列。这样，兴趣异源基因可以以可控制的方式掺入到人工染色体中，以便天然存在的序列以其天然存在的构型存在，并保证组织特异性。
合成染色体可以引入到人类茎干细胞或骨精髓细胞。其它应用对本领域技术人员是显而易见的。
已开发了将载体引入培养的细胞中和引入动物或人类患者组织中的各种方法。用于把载体引入哺乳动物和其它动物细胞的方法包括磷酸钙转染、DEAE-葡聚糖技术、微注射，脂质体介导支术、基于阳离子脂质的技术、转染、原生质体融合技术、电穿孔等。这些技术对本领域技术人员是公知的，在许多容易得到的出版物中有描述，并有许多综述。一些技术在以下文献中有描述转录和翻译，实际的方法，Hames，B.D.& Higgins，S.J.，编者，IRL出版社，牛津大学(1984)(其相关技术本文一并参考)和分子克隆，第二版，Maniatis等，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)(其相关技术本文一并参考)。
在说明书中，参考了各种分子生物学领域技术人员已知的方法。所参考的提出这些已知方法的出版物和其它材料就其相关技术本文一并参考。
提出重组DNA技术的一般的原则的一份标准的参考文献是分子克隆，第二版，Maniatis等，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989)。
定义所有有关重组体DNA技术的术语以专业通用的方式使用，对本领域技术人员是清楚的。
术语″Yα卫星″和″Ya可以替换使用，指来源于人类Y染色体的α卫星DNA。
术语″17α卫星″和“17α”可以替换使用，指来源于人类染色体17的α卫星DNA；α卫星DNA是存在于人类着丝粒上的串联重复DNA序列，并包含大约170bp的碱基单体重复。这种小的重复被组织成显示出对一个或一小组人类染色体特异性的高级的单位。
术语″着丝粒的″指被束紧并且是纺锤体的连接位点的染色体区。它在减数分裂和有丝分裂期间对染色体的适当分离来说是必要的，因此是人工染色体的必需组分。着丝粒DNA包括指导或支持动粒形成从而能够使得进行适当的染色体分离的DNA。在活性功能性着丝粒上的着丝粒DNA在有丝分裂期间与CENP-E相关联，如免疫荧光或免疫电子显微镜法所说明的。″相关联″意指着丝粒DNA和CENP-E由FISH免疫荧光共-定位。
必需染色体功能在以上的描述和背景中讨论过。这些包括有丝分裂稳定(没有实验选择压力)、实质上1∶1分离、自我复制的，即，着丝粒、端粒、复制作用的起点。
术语″功能性等同″指起因于不同的DNA或者蛋白质序列，但其提供相同的生物功能的遗传功能。
术语″基因产物″指DNA、RNA、蛋白质或肽。
术语″基因组DNA″包括一种或多种克隆片段，其来源于限制酶消化物或者其它序列和大小的混合物，例如机械剪切DNA或体外合成DNA。所述DNA可以来源于相同的染色体(例如，使用克隆片段时或者当消化纯化的染色体的DNA时)或来源于不同的染色体(例如，当基因组限制消化物用于转染时)。
术语″基因组的″指在有机体中天然被发现的基因组DNA。然而，发明人也认为这种基因组DNA的功能可以由其它来源的DNA(例如在自然界中没有发现的合成DNA)来完成。这样，如本文所使用的，″基因组″一般也用来指与本文描述的着丝粒(端粒)DNA一同引入细胞的DNA。该DNA表达基因产物或引起基因产物表达，使得可以在细胞中从纯化的DNA形成人工染色体，而无须在细胞中将纯化的DNA整合进内源染色体。这样这种DNA可以是合成的或来源于任何有机体的，并且可以是任何大小的，只要它含有必需的可表达序列和以上讨论的功能。
因此，除着丝粒DNA之外，在本发明中所包括的人工染色体实质上包含这样的DNA序列，其表达基因产物或引起基因产物表达，使得可以在细胞中从纯化的DNA形成人工染色体，而无须在细胞中将纯化的DNA整合进内源染色体。用来提供染色体功能的序列(例如非整合的)和表达序列可以是相同的序列。这样，在发明人考虑的范围内的是可表达的序列也提供了其它功能。另外，提供了染色体功能和表达功能的序列可以是不同的序列和来自不同的来源。
在特别公开实施方案中，基因组DNA来源于NotI限制性消化物。因此，在一个优选的实施方案中，允许在细胞中从纯化的DNA形成人工染色体而无须在细胞中将纯化的DNA整合进内源染色体的DNA来源于限制性片段，该限制性片段是由用具有NotI识别位点(8个核苷酸)的限制酶消化总基因组DNA产生的。然而，完全在发明人所考虑的范围内的是利用天然存在的基因组DNA的限制片段和其它片段，其比由NotI和可比较的酶产生的那些要小一些。例如，发明人考虑降低DNA的大小但保持以上的功能。因此，在一个非常优选的实施方案中，DNA被剥离得仅包含对表达一种或多种兴趣基因并且提供使得可以从纯化的DNA形成人工染色体而无须将纯化的DNA事先整合进内源染色体的功能所必需的DNA。
这些DNA的来源不必相同。这样，表达序列可以来自一种有机体，提供了染色体功能的序列可以来自另一种有机体。此外，一种或两种序列可以是体外合成的，并且不必符合天然存在的序列。在这一方面，序列不必严格地是″基因组″的。对序列的唯一的限制是它们提供以上指出的功能。
术语″异源的″指在天然存在的基因组中尚未发现的DNA序列，在其细胞中引入了人工哺乳动物染色体。另外，如果所述的序列被发现，附加的拷贝被认为是″异源″的，因为它们不能以这种形式在天然存在的基因组中发现。如以上所讨论的，异源DNA可以同时是所需的表达序列和″基因组DNA″。″可表达的DNA本身不能表达，但使得和引起另一个异源或内源DNA序列的表达。例如，在DNA是调节的时就是这种情况。
″高级的重复″指自身由较小的(单体)重复单位组成的重复单位。α卫星族的基本的组成单位是大约171bp alphoid单体。单体被组织成染色体-特异性高级的重复单位，其也是串联重复的。在给定的高级的重复中的组分单体的数量在小至2个(例如人类染色体1)到大于30个(人类Y染色体)之间变化。组成型单体相互显示出不同的同源性，从大约60％到实质上序列等同。然而，在整个大多数给定的alphoid族中，高级的重复保持高的同源性。
术语″哺乳动物染色体″指DNA分子或遗传单位，其在哺乳动物细胞中起染色体的作用。
术语″裸露的DNA″指与任何生物组分(染色体或细胞)组分不相关联的DNA，其提出以所说的组分与天然存在的染色体相关联，所说的组分例如组蛋白、非组蛋白染色体蛋白质、RNA、转录因子、拓扑异构酶、支架蛋白、着丝粒-结合蛋白和端粒-结合蛋白。这样的DNA可以从细胞分离和从非DNA染色体组分纯化。另外，这种DNA可以是体外合成的。
天然存在的″指出现在自然界中和不是由实验诱导的。
复制起点指DNA合成的开始位点。
术语″分离的″指已从细胞移去的DNA。术语″纯化的″指实质上完全与细胞的非DNA组分分开的分离的DNA，或者指已体外合成并且实质上完全与可能干涉从DNA构建染色体的用于合成的材料分开的DNA。纯化的DNA也可以是DNA序列从用以与天然发生联系的DNA序列分离的DNA序列。
复制子是基因组的片断，在其中DNA被复制，并且按定义包含复制起点。
词组保持所有天然哺乳动物染色体的功能″指染色体作为非整合的构建没有实验选择压力时稳定地保持在分开的哺乳动物细胞中，至少表明着丝粒，端粒(线性染色体)，复制起点功能和基因表达。
有丝分裂上稳定的指合成或人工染色体在没有实验选择压力(如药物选择等)下10代后保持至少50％存在于细胞中，最优选地是在30代后至少10％存在于细胞中。优选地，合成染色体在大于99％的时间显示出1∶1分离。
稳定地转化″指包含重复单位的克隆DNA族能够在微生物宿主细胞中繁殖至少50代，所说的微生物以低于0.6％的重组频率(174kb族)和低于0.2％的重组频率(130kb族)生长。当用本发明的方法克隆时，小于130kb的族显示出极少甚至没有重组，术语合成的″或″人工的″可以替换使用，″合成″的或″人工染色体″是具有必需染色体功能但不是天然存在的构建体。其已通过把纯化的DNA引入细胞产生。因为染色体完全由转染DNA组成，所以称它为合成的或人工的。人工或合成染色体以分天然存在的构型存在。
术语″转染″指将核酸引入到细胞中。所引入的核酸在引入的序列、物理构型或拷贝数上在细胞中不是天然的。
端粒指包含经称为端粒酶的核糖核蛋白酶合成的简单的重复DNA的染色体末端。所述功能使得线性DNA分子的末端可以复制。
如果核酸分子包含编码多肽的序列和表达控制序列，并且如果所说的表达控制序列可操作地连接到编码多肽的核苷酸序列上，则核酸分子(如DNA或基因)表达多肽或基因产物，所说的表达控制序列在适当的宿主环境中提供转录、加工和翻译包含在蛋白质产物的DNA中的遗传信息。然而，如本文所讨论的，基因产物不限于多肽基因产物而是可以包括RNA。此外，可以由用作表达载体的人工染色体纠正的遗传缺陷可以是顺式作用影响进一步的基因表达的缺陷。
可操作连接是这样一种连接，其中调节DNA序列和所要表达的DNA序列以允许基因表达的方式连接。基因表达所需的调节区的精确性质可以随不同的生物体变化，但一般包括启动子区、涉及转录和翻译起始的5非编码序列如TATA盒，CAP序列，CAAT序列等。如果需要，可以通过以上所述的方法获得编码蛋白质的基因序列3的非编码区。这个区可以由其转录终止调节序列(如终止和聚腺苷酸化序列)保持。这样，通过保持天然邻接编码蛋白质DNA序列的3区，可以提供转录终止信号。在表达宿主细胞中转录终止信号功能上不令人满意时，在宿主细胞中的3功能的可以被替代。
下列实施例不是将本发明限制在所描述的特定的实施方案中，而是用来具体描述实施本发明的某些方式。
实施例实施例117号染色体α卫星载体的构建为了利用BAC载体在大肠杆菌中克隆扩增α卫星DNA，构建了一系列大小不同的串联α卫星族。
以前曾经报道过人类17号染色体的高级α卫星重复序列的结构(Waye和Willard，分子细胞生物学，6(9)3156-3 165(1986))。人类17号染色体主要的高级重复序列长度为2.7kb，紧靠EcoRI酶切位点，由16个alphoid单体组成。用限制性内切酶EcoRI消化人的基因组DNA，把来源于人17号染色体或Y染色体的高级重复序列，即α卫星DNA分散的结构单位克隆到质粒克隆载体pACYC184(New England Biolabs)上。用DNA序列分析技术证实了克隆的高级重复序列的核苷酸序列。
用聚合酶链反应(PCR)可扩增长度为2.7Kb的一个高级重复序列单体，这样在高级重复序列两端可构建互补的限制性酶切位点(BamHI和BglII)。同时要维持高度重复序列的精确长度。扩增此片段的一对引物是VB100-5…gggcgggagatctcagaaaattctttgggatgattgagttg(SEQ ID NO2)和VBIOI-5..gggcgggatcccttctgtcttctttttataggaagttattt(SEQ ID NO3)用BamHI消化扩增的片断，用凝胶进行纯化，再连接到用BamHI和HpaI消化，用凝胶纯化的载体DNA上，也就是把修饰的高级重复序列克隆进BAC载体pBAC108L(Bruce Birren赠与，加利福尼亚理工学院，Pasadena，CA)上。将构建的质粒命名为pBAC-17α1。
为了构建合成的α卫星DNA双体，用两种不同的酶组合分别将pBAC-17α等份消化(1)BamHI+SfiI，或者是(2)BglII+Sfil。BglII+SfiI消化后，通过凝胶电泳切下2.7Kb的α卫星DNA片断，再连接到用BamHI+SfiI消化后切下的pBAC17α1ded片段上。因为BgIII和BamHI产生相容的突出端，而SfiI产生不对称的突出端，仅能以特殊的方向连接，这样2.7Kb的片断连接到载体上能构建成头尾相连的串联双体形式。通过电穿孔转入DH108细菌菌株。用限制性分析法分析这些克隆，并且将包含有17号染色体的修饰后串联双体排列形式的α卫星DNA的克隆命名为pBAC-17β(图1)。重复这种技术路线能构建扩展的α卫星族，可含有4，8，16，32，48或64个α卫星高级重复序列。利用一种相似的技术路线可构建来自于人类其他染色体，如Y染色体的合成族高级重复序列。
构建成的BAC载体(包含有长度为174Kb的α卫星DNA)代表了最大量的目前在大肠杆菌中克隆并扩增的此类DNA。以前实验曾利用粘粒成功地在大肠杆菌中克隆了大约40kb(Willard等，Prog.Clin.Biol.res.3189-18(1989))。其它曾利用中等拷贝数量的质粒克隆一系列长度在171bp alphoid单体至40kb范围内的族(Waye和Willard，核酸研究，15(18)7549-69(1987))。在本领域的研究中，发现在大肠杆菌中扩增有最大alphoid系列的质粒有高频的重组率。相比之下，在pBAC-17α64扩增过程中，用标准的质粒纯化方法检测未发现重组产物，因为对克隆载体的研究已显示出α卫星DNA在微生物中的结构不稳定性，pBAC-17α64的制备中利用凝胶电泳分析有明显重组序列的存在。通过这种方法未发现显著水平的重组质粒。
实施例2大肠杆菌中稳定克隆的重复DNA的方法尽管实施例1中，在大肠杆菌中扩增后，人工α卫星族未出现高水平的重组或缺失。但很可能因发生的重组频率相当高，大量的缺失产物使得任何一种产物都不能被检测出来。因此，这些构建体的重组率应用高度敏感的方法来测定。除此之外，因为较长系列的稳定性不如较短系列的，检测了几种不同长度的构建体，他们的稳定性如下。
用曾经克隆进pBAC 108L的三种不同大小的α卫星族进行稳定性实验。将这些构建体pBAC-17α32，pBAC-17α48和pBAC-17α64含有α卫星DNA大小分别为87kb，130kb，174kb，转化进(电穿孔)大肠杆菌株DH10B(GIBCO BRL)，挑出单一克隆分析。因为可能是转化方法本身可导致DNA重排，只有那些经限制性酶消化和电泳后，主要包含全长序列的克隆才能在甘油储存液中保存。
稳定性实验之初，从每个构建体的甘油保存液中取出大肠杆菌，在含有12.5μg/毫升氯霉素的LB平板上化线。挑出八个生成的克隆分别培养至饱和，培基是5ml包含12.5μg/毫升氯霉素的LB(大约20代)。从每个克隆里提取质粒DNA并纯化的，然后用BamHI消化，由脉冲电场凝胶电泳分离。包含任何全长质粒DNA的克隆可以说在单细胞期有全长质粒。对没有包含任何可检测的到全长质粒的克隆，推测是新化线前重组的结果(如在甘油储存期间发生)，这些克隆将被排除。从包含一些全长质粒的克隆中随即选出10个培养物，稀释一百万倍加入包含12.5μg/ml氯霉素的新鲜LB中，生长至饱和(大约30代)。从单细胞培养至饱和大约需生长50代。
为了确定50代生长中重组质粒的发生频率，将每个饱和培养物划线在LB板上，LB含有12.5μg/毫升氯霉素。单个的菌落在包含12.5μg/毫升氯霉素的1.5ml LB中生长至饱和。饱和后纯化DNA，并且经限制性酶消化(BamHI)和PFGE分析。任何包含可检测到的全长质粒的菌落记数为50代实验未重组。相反地，没有包含任何可检测的全长质粒的菌落记数为50代实验期间实验重组发生。为了计算每种构建体每一代重组发生的频率，要算出50代后重组菌落所占的比率。1减去这个值等于非重组菌落所占的比率(在50代之后)。每代重组菌落发生的比率为1减去未重组菌落比率的50次方根。总结为下列方程式X＝1-(1-Y)1/150在这里″X是每代产生的重组菌落比率，Y是50代生长后重组菌落所占的比率。
利用这种方法，计算出含有三种α卫星构建体的的重组频率。在50代生长之后，0％(N＝9)的pBAC-17α32菌落重组形成截断式，pBAC-17α48与pBAC-17α64各有8.5％(N＝59)，25％(N＝84)。每一代重组频率分别为0.18％，0.57％，与以前报道的包含较小alphoid DNA(如40kb)的克隆载体和传代较少(如30代)的克隆比较，它们的重组频率非常低。
结果表明，利用发明的方法和BAC载体，大到至少174kb长度的α卫星族在大肠杆菌中可稳定扩增。每一代，174kb和130kb系列的重组率分别是0.18％和0.57％。这样，以pBAC-17α64为例，从单细胞生长50代后，单细胞来的饱和细菌培养物效价约为1,000，平均至少75％的细胞包含全长pBAC-17α64。这对用于基因治疗的含有α卫星的人工染色体来说，大量增殖重组率降至此范围是预期的可接受的。
除测定在pBAC 108L中α卫星DNA的重组频率，也明确了高度重复α卫星族的大小与载体中稳定性的相互关系。基于所测的重组频率，BAC载体中(假定50代后的有50％的全长菌落)同源α卫星DNA的最小上限保守估计为200到215kb(见图2)。这是利用计算机程序Cricket Graph通过推断算出的。这是alphoid容量的最小估计，因为发现其他系符合数据而预测值比上述的要大。从这种相互关系中，可估计，当利用200-215kb系列在菌株DB108中扩增时，50代之后50％以上的质粒会是全长的。利用BAC载体及特殊的抗重组菌株，很可能上限值还要变大。而且，这种估计是基于最大的同源系列。异化序列的稳定性，包括天然α卫星族，应大于这种估计。
在这里所述的实验表明第一次能在大肠杆菌中稳定克隆，扩增大于50kb的α卫星族。以前，曾用粘粒在大肠杆菌中克隆α卫星DNA(Haaf等，细胞，70(4)68 196(1992)。除了相对较小的系列(等于或小于40kb)，其他系列未被分析其完整性和稳定性。也有人用YACs克隆α卫星DNA(Neil等，核酸研究18(6)1421-8(1990))。在这些研究中，α卫星族的不稳定受到注意，需要附加的操作，如琼脂糖凝胶纯化，才能获得包含主要的全长系列。此外，利用YACs扩增α卫星DNA有一定的缺点。或许最重要的与YACs的拓扑结构有关。总的来说，YACs是线性的DNA分子，因此，不能用简单的碱性裂解法纯化α卫星构建体，使其没有酵母的染色体污染。代替它的是必须采用脉冲场凝胶电泳，这种分离方法经不起放大实验的检验。最后YACs的线性拓扑结构使他们在纯化时易被剪切。这里，已证明了含有α卫星的BACs可被富集并纯化去除大肠杆菌的染色体DNA，同时无实质上的剪切。
以前的研究表明α卫星DNA是功能性人的着丝粒的重要组分。天然存在的α卫星族长度从230kb至几兆碱基不等(Oakey和Tyler，Genomics7(3)325-30(1990))；(Wevrick和Willard，美国科学院学报，86(23)9394-8(1989))。然而，最近的研究证明140kb小的α卫星DNA在人类细胞中足以提供着丝粒功能(Brownl.等，人类分子遗传学，3(8)1227-1237(1994))。这里所述α卫星的系列是首次能大规模的，稳定产生的α卫星族，这样的α卫星族大得足以满足功能性人类着丝粒的需要。这些构建体可作为合成的人类染色体的骨架。
实施例3Y染色体α卫星载体的构建除了所用的DNA来自人类男性Y染色体细胞株GM07033外，构建法与实施例1相同，来自任何正常的人类男性细胞株的DNA均可。在人类Y染色体上主要的高级alphoid重复序列长度为5.7kb，可由旁边的EcoRI酶切位定界。将从Y染色体alphold系列中来的5.7kb高级重复序列克隆进标准的大肠杆菌克隆载体pACYC184(New England Biolabs)中。用PCR修饰高度重复序列的末端，两端分别加上BamHI酶切位点及BglII酶切位点，代替现有的EcoRI酶切位点。如前所述，将修饰后的高级重复序列克隆入pBAC108L克隆载体。
实施例4构建杂交α卫星载体除所用的alphoid DNA来自两条人类染色体(17号染色体和人类Y染色体)外，构建法如实施例1。构建了两个类型的系列。一种类型是简单的交替重复，即来自17号染色体alphoid DNA的一个高度重复系列单位与来自Y染色体alphoid DNA的一个高度重复系列单位相互交替。构建的第二种类型是17号染色体alphoid DNA的高级重复序列双体与Y染色体alphoid DNA的高级重复序列单体相互交替。同前面的例子一样，在每一种类型中，来自每条染色体的高级重复序列的适当位相都保持在合成杂交连接中。
实施例5构建人工哺乳动物的染色体实验步骤DNA构建体概况此处所提的构建质粒的方法均为标准的分子生物学技术(Sambrook，J.等编，″分子克隆″，冷泉港实验室出版社(1989))。从第17号和Y染色体中克隆α卫星高级重复序列如前所述(Wolfe，J.等，分子生物学杂志，182477485(1985)；Van Bokkelen，G.B等，″稳定克隆DNA大重复单位的方法，美国专利申请(1995))；Waye &Willard，分子细胞生物学，63156-65(1986))。通过加上合适的酶切位点可定向克隆，成功的在质粒pBAC108L中构建了较长的α卫星族。Van Bokkelen G.B.等，″稳定克隆DNA大重复单位的方法，美国专利申请08/487,989(1995)，1995年7月7日申请)，这里一并参考指导克隆长的串联重复序列的文献。
用于实验的质粒前面已经讲到pBAC 108L(Shizuya，H.等，美国科学院学报，898794-7(1992))。pVJ10S是pBAC108L修饰形式，它在多接头中附加有限制性酶切位点，有一个β-geo的表达单位，此表达单位包含CMV早期直接基因启动子与猿猴病毒SV40多聚腺苷酸化信号(Seed，B.自然，320；840-2(1987)；Seed & Aruffo，美国科学院学报，843365-9(1987))，还包括β-geo开放式读码框架(MacGregor G.R.等，发展，1211487-96(1995))及UMS转录终止序列(Heard J.M.等，分子细胞生物学72425-34(1987)；McGeady，M.L.等，DNA 5289-98(1986)；Salier&Kurachi，生物技术，730-1(1989))。pBACYα16(92 kb长的Y染色体α卫星)是由16个相同的克隆得到的高级重复序列首尾相接导入pBAC108L形成的。pBAC17α32(87kb长的17号染色体α卫星)是由32个相同的克隆得到的高级重复序列首尾相接导入pBAC108L形成的。pVJ105-Yα16是从pBAC108L克隆出α卫星族再导入pVJ105形成的。用BamHI和SfiI线性化后，从pBAC17α32克隆出α卫星族导入pVJ105形成pVJ105-17α32，同上的线性化后，β-geo的表达方向是朝着α卫星族。所有的质粒采用碱性裂解(Sambrook，J.等编分子克隆″，冷泉港实验室出版社(1989))纯化，其后为琼脂糖凝胶纯化。
多聚化构建α卫星族＞100kb
用BamHI和SfiI消化pVJI05Yα16后再经脉冲电场凝胶电泳(PFGE)凝胶纯化得到Y染色体α卫星族。其余的α卫星DNA来自于用BamHI和BglII消化pBACYα16和同上的PFGE凝胶纯化后所得的92kb片断。分出条带后，将凝胶带在10mM Tris pH7.5，100mM NaCl，10mM MgCl2中平衡，再在65度中熔化5分钟。两个片段以克分子比率5∶1结合(pBACYα16α卫星片断pVJI05-Yα16片段)。加入ATP(终浓度1mM)，T4连接酶(5个单位)，同时加BamHI(40个单位)和Bgl II(40个单位)，37℃温育4小时。加入β琼脂糖酶(3个单位)37℃温育1小时。转染入HT1080细胞株前放置在冰上1小时。构建17号α卫星DNA的扩展α卫星族，步骤同上，只是用pVJ105-17α32与pBAC17α32分别取代pVJ105-Yα16与pBAC17α32。
高分子量人类基因组DNA的准备HT1080细胞在四个150mM的平皿长至铺满，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化后从平皿中取出，用100ml PBS洗涤。高分子量的DNA在低凝胶温度的琼脂糖活塞中富集收获(Sambrook，J.等编，″分子克隆″，冷泉港实验室出版社(1989))。大约用NotI消化1μg人基因组DNA。消化后，70℃加热5分钟，NotI被灭活。转染前，琼脂糖块用3个单位的β琼脂糖酶消化。端粒DNA的准备通过PCR来产生人类端粒DNA，利用的引物是42a(5 GGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGGTTAGGG3；SEQ ID NO4)和42b(5 CCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCCTAACCC3；SEQ ID NO5)(Ijdo，J.W.等，核酸研究194780(1991))。每个PCR反应都是在1X的PCR缓冲液中进行的，所述缓冲液添加了250ng的42a和42b，5个单位Taq聚合酶，250μM dNTPs，3.3μM MgCl2(Gibco BRL)。PCR反应在Perkin Elmer 9600型热循环器中运行35个循环，温度变化方式如下95℃20秒，40℃ 20秒，72℃ 2分钟。PCR后，每个反应物都进行琼脂糖凝胶电泳以纯化端粒DNA，片断长度＞1kb。将DNA从凝胶上切下，根据制造商的说明利用Magic Prep柱纯化DNA，去除琼脂糖(promega，WI)。转染人类细胞转染以前，用BamHI和SfiI消化pVJ105 Yα16和pVJ10517α32；用BamHI和BglII消化pBac Yα16和pBac Yα32。用PFGE纯化DNA，在10mM Tris pH7.5，100mM NaCl中平衡后再与端粒DNA和/或NotI消化的人类基因组DNA结合，在某些情况下，用图3描述的定向连接方法扩展α卫星族。
将每次转染的DNA组分合并并轻轻混合。转染物包括pVJ105Yα16(0.5-1μg)，pVJ105 17α32(0.5-1μg)，或者是pVJ105 VK75(0.5-1μg)。在注明之处，转染物还包括纯化的Yα16系列(0.5-1μg)，17α32系列(0.5-1μg)，端粒DNA(75-250ng)，人类基因组DNA(1-3μg)和/或VK75片段(0.5-2μg)。添加1ml无血清α-MEM培养基(MediaTech)。再加入7.5μl脂转染试剂，溶液在室温下温育5分钟。依制造商(Gibco BRL)的说明，将DNA与脂转染试剂混合物加到2×106个HT1080细胞中。37℃培养16小时，去除DNA脂转染物，加入完全培养液。转染后36小时，用胰蛋白酶乙二胺四乙酸消化取出细胞，转移到100mm的平皿中，平皿中为完全培养液加300μg/m1G418。选择作用后七天，更换新鲜培养基，其为含有G418 300/ml的完全培养液。选择后12天，用无菌克隆环分离单个菌落放到24孔板中。每次转染的单个菌落在选择作用下扩增到100mm的平皿中。将每种培养物冻存一部分以用作将来的分析，收集大部分培养物用FISH技术进行分析。细胞培养HT1080细胞在α-MEM培养基中生长(Gibco BRL，Bethesda，MD)，此培基又加入了15％的胎牛血清(Hyclone)，青霉素/链霉素和谷氨酰胺。实验中所用的HT1080细胞的亚克隆为四倍体。平板染色含有合成染色体的细胞平板接种在6孔板中，细胞有10％汇合。未转染的细胞同样平板接种在板中作为阴性对照。当细胞长到70％汇合时，去掉培养基，用2ml PBS洗涤细胞。去掉PBS之后，每孔加1ml固定液(2％甲醛和0.2％戊二醛，用PBS稀释)，室温温育4分钟。移走固定液，立刻用2ml PBS清洗细胞。最后，弃去PBS洗液，每孔加入1ml染色液(5mM氰化铁钾，5mM钾亚铁氰化物，5mMMgCI2，1μg/mlX-半乳糖，用PBS稀释)，平板在37℃温育12小时，用PBS洗细胞，利用光学显微镜和相关的成象硬件将细胞成象(Oncor，Gaithersburg，MD)。
荧光原位杂交HT1080细胞在100mm的组织培养平板生长，FISH检测时将其收获，根据已确定的方法，将细胞转移到载玻片上(Verma，R.& Babu，A.，人类染色体，原理和技术，第二版，McGraw-Hill，Inc.(1995))。根据制造商(Oncor，Gaithersburg，MD)的说明，使用染色体特异α卫星探针检测在内源染色体和合成染色体的上的α的卫星序列。
从包含合成染色体的克隆中测定Y染色体的α卫星DNA的状况根据确立的方法，从HT1080细胞及其克隆22-6，22-7，22-11，22-13和23-1收获基因组DNA(Sambrook，J等编，分子克隆，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY(1989))。每个克隆大约能回收10μg DNA，用EcoRI(50单位)和Pst I(50单位)消化过夜。在0.8％的琼脂糖胶上样进行电泳，再转膜到Nytran膜上，与1kbY染色体的α卫星探针65℃杂交过夜，杂交液为25％甲酰胺/10％葡聚糖/0.5％SDS/0.5M NaCl/200μg/毫升鲑精DNA。EcoRI和PstI都在内源Y染色体α卫星高度重复序列中剪切一次，形成4kb和1.7kb的条带。然而，因为使用的构建Y染色体α卫星族的方法，使得EooRI不能切割合成的高度重复系列。因此，EcoRI和PstI剪切合成的高度重复序列得到5.7kb一条带。因为我们知道内源Y染色体α卫星族为1mb长，通过测定5.7kb带(合成系列)与4.0kb带(内源系列)的比率，就可计算出含有合成染色体的细胞中合成α卫星DNA的数量。不必考虑1.7kb带，因为在这种杂交条件下它不与探针杂交。然而，重要的一点是考虑到多数克隆包含2个Y染色体(因为它们是四倍体)而仅仅一条合成染色体。一种例外情况是22-13克隆，它包含单一Y染色体，看来是二倍体。因此，对于22-6，22-7，22-11克隆，每个细胞的合成的α卫星DNA的量由下列方程式估计
对于22-13克隆，利用下列方程式
免疫荧光根据确定的程序，进行抗-CENP免疫荧光染色(Sullivan & Schwartz，Hum.Mol.Genet.42189-2197(1995))。主要步骤如下HT1080细胞在组织培养平板中生长至大约80％汇合。添加乙酰甲基秋水仙碱至终浓度40ng/毫升，37℃温育75分钟。将培养基细心地除去，同时用胰蛋白酶乙二胺四乙酸温育3至5分钟将细胞从平板解离。为了中和胰蛋白酶的作用，加入完全培基，制成的细胞悬液用血细胞计数器记数，Jouan CT422离心机中1000转每分钟离心，弃上清，缓慢加入低渗溶液(25mMKCl；0.27％柠檬酸钠)，重悬细胞，调浓度为0.6×105细胞/毫升。细胞在室温于低渗溶液中温育12分钟。取出500μl细胞放人细胞漏斗中，用Shandon Cytospin 3离心机以1900转/分钟离心10分钟。接着将载玻片温育在10mMTrispH7.7，120mMKCl，20mMNaCl，0.1％曲通100中，温育30分钟。每个载玻片加上稀释抗体(50μl，稀释1000倍，稀释液为1mM三乙醇胺，25mMNaCl，0.2mM乙二胺四乙酸，0.5％曲通100，0.1％BSA)，将盖玻片盖在细胞面上，37℃温育30分钟，去掉盖玻片，在有KB(10mMTris pH7.7，150mMNaCl，0.1％BSA)的Coplin罐子中洗涤载玻片，3×2分钟。加上FITC标记的抗兔疫球蛋白(50ul，用KB1比100稀释)抗体，细胞面盖上玻璃盖玻片，37℃温育30分钟，在有KB的Coplin罐子中洗涤载玻片，3×2分钟。看之前，将载玻片用10μl DAPI(2μg/ml，溶于抗衰减液中)复染。利用荧光显微镜和成象系统(Oncor，Gaithersburg，MD)收集图像。
有丝分裂稳定性时程克隆化以后，在100mm的平皿中扩增细胞，培基中有300μg/ml的G418存在。当细胞长至80％汇合时，每个克隆收集一个平皿的细胞做FISH分析，方法如前所述。这些细胞做为时程的时间零点。另一块平皿的细胞分成16份在100mm的平皿中生长至汇合，培基为无G418的完全培基一旦细胞长至汇合，再分成16份在无G418的完全培基中生长。这个过程反复重复，时间流程如表2所示。在不同的时间点，取出部分培养物做FISH，分析转染的α卫星的存在(17(或Yα)。对于每个完整的染色体扩展，测定Y染色体α卫星(或17号染色体α卫星)信号及它们在染色体上的位置。结果哺乳动物的着丝粒是一个复杂的染色体元件，通常认为它由叫做α卫星的大块DNA组成。阻碍人们阐明着丝粒结构和合成人类染色体发展的一个主要障碍是不能克隆到这群DNA的大片断上。最近，已建立了一种能克隆并大规模生产α卫星DNA的方法，所述DNA的长度约至175kb(VanBokkelen，G.B.等，授权″稳定克隆大的DNA重复单位的方法″，美国专利申请08/487,989,1995年六月六日归档)。同等重要的成就是利用定向克隆技术可构建已知组成和结构的α卫星族。
为了促进从裸转染α卫星DNA形成功能性着丝粒，发明人假定，转染长度大于175kb的α卫星DNA比较有利。在此之前，转染进哺乳动物细胞中的最大的毗连α卫星族长度为120kb(Larin，Z.等，Hum.Mol.Genet.3689-95(1994))。为了构建长度大于175kbα卫星DNA，使用图3A所示的定向连接技术。这种体外技术能构建出长度达736kb的相邻的，不间断的Y染色体α卫星族(图3B，2-4道)。在有或无BssHII的情况下，连接VK75作为对照(图3B，5-7道)。因为连接时BssHII末端又再生了一个BssHII酶切位点，当在连接反应中有BssHII酶时，多体的阶梯被消化为组分单体。在用BamHI片段或BglII片段实验中可得到相似的结果(资料未显示)。这证明再剪切的反应是有效的，2，3道的序列梯是头尾连接的结果。最后，为了证实不同α卫星DNA家族的生物学区别，也构建了17号染色体α卫星DNA的扩展系列(未显示数据)。
利用图4与实验手册列出的技术，发明人已用长的纯化的卫星族构建成合成染色体。将每个这样的染色体组分共转染，发明人推论细胞将会连接这些组分形成一个功能性染色体。因此，用各种组合的α卫星DNA，端粒DNA，基因组DNA转染进HT1080细胞。转染之后，培养物在G418的选择下培养10-14天。分出单个的菌落，选择的作用下扩增，再收集细胞做FISH分析。
稳定转染子的鉴定如表1所示，大多数转染的克隆其α卫星DNA已经插入到内源染色体中。在许多包括端粒DNA的转染中，α卫星插入现象的高发与观察到的染色体切断相关。以前曾观察到插入后，用端粒DNA能有效地切断染色体(Barnett，M.A.等，核酸研究，2127-36(1993)；Brown，K.E.等，Hum.Mol.Genet.31227-37(1994)；Farr，C.J.等，EMBO J.145444-54(1995))。这里，很明显端粒DNA与α卫星DNA一同插入内源染色体，并且引起截短现象。
然而，转染后的细胞亚群中，也观察到含有转染α卫星DNA的合成染色体(见表2，转染22，23及图5-7)。这些阳性转染在两方面与其它转染不同第一，转染之前，用BamHI和BglII在体外预连接α卫星DNA(见图3A和3B)。这就形成了长的，定向的α卫星族，长度为100kb至736kb。第二，转染中包括NotI消化的人类基因组DNA。包括这两种组分，就提供了形成合成染色体的必需的DNA序列。
转染22，23克隆的FISH分析显示约50％的G418抗性克隆包含合成的染色体(见表1)。两次转染后4/5的合成染色体包含克隆的α卫星DNA只能在合成染色体中检测到(见图4-6)。也就是说，转染Y染色体α卫星DNA后，用FISH检测，只能在Y染色体和合成染色体上有可检测的信号。同样地，转染17号染色体α的卫星DNA后，用FISH检测，只能在17号染色体和合成染色体上有可检测的信号。应注意的是，转染22，23都有合成的染色体形成。这证明Y染色体和17号染色体的α卫星都能促进合成染色体的形成。当进一步证明α卫星DNA是合成染色体的一个重要的组分时，则α卫星FISH信号包括大多数或所有的合成染色体。
包含合成染色体的细胞中仅有两种例外情况时，α卫星DNA(与转染用的α卫星DNA来自相同的染色体)既不在Y染色体上也不在合成染色体上(或者若转染17号染色体的α卫星，则为17号染色体)。第一，在克隆17-15中，在17号染色体，合成染色体，C组染色体的末端检测到17α卫星DNA(见图7A，7B)。引人注意的是，这次转染包括未连接α卫星和端粒DNA，但没有人基因组DNA。一个可能性就是转染DNA插入到内源染色体，扩增，再从内源染色体上断裂下来。重要的是注意到如果非alphoid，非端粒人类序列对染色体功能是必须的，那么转染时无人类基因组DNA提供其他DNA对合成染色体的形成是必须的。在一种情况下，缺乏共转染的人类基因组DNA合成染色体也可形成时，发现α卫星插入到内源染色体中。这表明基因组DNA对合成染色体形成或维持的某些方面是必要的。第二，在22-11克隆，发现一条合成染色体和一条Y与14号染色体的易位体(见图7C，7D)。通过脉冲场凝胶电泳，发明人已证明，Y14易位染色体包括内源Yα卫星DNA和非合成的Yα卫星DNA。因此，α卫星DNA仅能在微型染色体上检测出，在任何内源染色体上检测不出。
合成染色体大小估计包含合成染色体的细胞中α卫星DNA的大小约350kb-2mb(见图8)。这是通过利用合成与内源α卫星族的限制位点的多形性测得的。在Southern印迹中，比较合成的α卫星带的强度与内源α卫星带的强度，测得合成α卫星DNA与内源α卫星DNA的比值。由于内源α卫星族长度为1mb(Larin等，HumMol.Genet.3689-95(1994))，而Y染色体的拷贝数(克隆22-6，22-7，22-11是2条；克隆22-13是1条)，与合成染色体的拷贝数量已知(见表2)，就能估算出合成的α卫星DNA的大小(见图7B)，以kb为单位。
尽管很难估算出合成染色体的全长，但在某些情况下，用放大1000倍的荧光显微镜几乎看不到合成染色体。
合成染色体的结构和拷贝数量初始的分析是，包含合成染色体的每个克隆几乎没有合成的染色体，大多数情况下，每个细胞仅有一条。这表明合成染色体拷贝数量的调控类似与内源染色体。
除拷贝数量之外，合成染色体与内源染色体还有两个共性。第一，它们包含端粒序列(数据未显示)。这说明这些合成染色体是线性的。第二，在中期染色体中，可清晰看到合成染色体的单体(见图6，7)。这说明合成染色体的整体结构类似于内源染色体的。而且，因为通常情况下染色单体紧连于着丝粒，这个结果也说明了合成染色体能执行至少一种着丝粒的功能，吸附姊妹染色单体。
中期CENP-E与合成染色体相联系合成染色体出现在子细胞中(大多数情况下，为单拷贝)说明产生了功能着丝粒。为了进一步研究，检测了几个合成染色体，测定在中期着丝粒上是否有CENP-E。以前曾证明功能性和非功能性着丝粒都有CENP-B(Eamshaw，W.C等，染色体，981-12(1989))，因此，它不能为作为着丝粒活性的标记。由于此原因，通常强烈识别CENP-B的CREST抗血清并不是评估着丝粒功能的一种好试剂(曾用于以前的实验，Haaf等，Larin等和Pranovsky等(以上引用的))。另一方面，已证明CENP-E仅在功能着丝粒才有(Sullivan & Schwartz，Hum.Mol.Genet.42189-2197(1995))，因此，可用此蛋白质的单特异性抗体来评估着丝粒活性。
与功能着丝粒一致存在的CENP-E在克隆22-11和23-1中出现，这是目前唯一检测的克隆(见图9)。进而，合成染色体着丝粒上的CENP-E的量与每一个内源染色体的着丝粒上的相似。有趣的是，因为并不认为CENP-E可直接与着丝粒DNA结合，因此，它的水平不取决于α卫星的量。而是仅仅取决于是否形成一个功能着丝粒。这样，CENP-E在中期的存在主要说明合成染色体包含有可指导形成着丝粒/动粒复合物的功能着丝粒。
无选择作用合成染色体表现为有丝分裂稳定性为了确认合成染色体包含一个功能着丝粒，同时能够正确分隔在子细胞中，含有合成染色体细胞在无选择作用下生长一段时期。用FISH技术分析细胞，测定含有合成染色体的细胞所占的百分比。无选择作用生长46天之后(大约60代)，大多数细胞仍然有合成的染色体(见表2)。在几个克隆中，仍然是100％的细胞有合成染色体。这表明合成染色体有丝分裂性是稳定的，因此，证实了这些载体能在体内应用于转染子细胞更正遗传缺陷的想法。
除了测定每一个各合成染色体的分离效率，这个实验也使我们能评估合成染色体随时间的结构稳定性。每个克隆扫描50个铺展染色体，没有发现合成染色体插入到内源染色体中。而且，也没有发现其它显著的有关合成染色体的重排。这个结果，结合高度有丝分裂稳定性，证明这些合成染色体是作为一个遗传单位，有许多与内源人类染色体相同的特征。
合成染色体的基因表达这里描述的合成染色体为细胞基因治疗提供了一种预备的载体。因此，重要的是确定异源基因是否能有效地在染色体载体上表达出来。
依所述的实验步骤，通过共转染将pVJ104-Yα16或pVJ104-17α32，端粒DNA和人类基因组DNA引入HT1080细胞中。每一次转染，将β-geo表达单位与长度至少100kb的α卫星DNA相连。转染之后，细胞中α卫星的位置与β-geo基因的位置相同。因此，含有合成染色体的克隆中，除17-15克隆外，β-geo基因都仅位于合成的染色体上。
为了测定每个包含合成染色体克隆的β-geo表达的水平，也就是合成染色体的基因表达程度，按实验步骤所述的方法用X-gal平板染色法检测细胞。尽管这种技术比较不敏感(如β-geo高水平表达才能检测)，但它可提供大致的表达水平，及能表达标记基因的细胞百分率。无G418选择培养70天之后(大约80次细胞分裂)，克隆22-6至少50％的细胞用此法可检测到β-geo的表达(见图10)。克隆22-6无选择作用培养70天后，大约25％的细胞有可检测到的β-geo的活性(未显示数据)。因为此法的不敏感性及细胞中β-geo的低表达，不能评估其他克隆。讨论结果显示裸DNA能转染进哺乳动物细胞，不插入内源染色体，就可形式一个功能性合成染色体。这些合成染色体有许多正常哺乳动物染色体的特性。第一，它们在细胞中以低拷贝数存在，通常每个细胞一条。第二，合成染色体看来似乎是线性的，包含端粒序列。第三，在有丝分裂期间，CENP-E可结合到合成染色体上表示功能着丝粒的形成。第四，无选择作用时，合成染色体表现为有丝分裂稳定。第五，合成染色体能够装载有转录活性的基因。最后，合成染色体随时间结构稳定，具有不可觉察的插入频率。区别于正常的人类染色体，合成染色体较小，易修饰，允许在多种的染色体环境中表达不同基因。
结果显示用体外构建α卫星族的方法可达736kb长。除了向此处描述的合成染色体提供必要的组分外，这些结果也证明了构建的α卫星的数量具有临床使用性。以前，没有方法构建长度＞200kb，纯化后有足够的量用于转染哺乳动物细胞，结构完整的α卫星DNA。
作为对照，发明人重做了Haaf等以前失败的实验。构建一条染色体，同时伴随有α卫星DNA插入内源染色体。发生这种情况的转染缺乏附加的基因组DNA序列。若没有基因组序列，这条染色体很可能是由含有α卫星DNA的内源染色体断裂形成的。除了低效偶而的情况外，对于基因治疗过程来说，这个方法没有用，因为由断裂机制造成的结果使宿主细胞有基因组重排和恶性转化的风险。
总之，发明人证明了通过转染大的α卫星族，端粒DNA和基因组DNA到人类细胞中，能构建有丝分裂稳定性的合成染色体。尽管每个组分看来对形成有效的合成染色体是必要的，很有可能在缺乏基因组(非α卫星，非端粒)序列时插入α卫星DNA后的基因组重排可导致染色体的形成。另一方面，构建这些合成染色体时，α卫星DNA看来似乎绝对需要。这里，通过利用来自Y染色体和17号染色体的α卫星构建合成染色体，发明人证明了α卫星DNA的来源并不重要。换句话说，来自任何染色体的α卫星DNA都能用于构建合成染色体。进而，假如人类染色体在各种杂合体中是稳定的，包括小鼠，仓鼠，灵长类，则这些物种的α卫星样序列也能用于构建如上所述的合成染色体。表1
表1转染不同组合的α卫星DNA，端粒DNA和人类基因组DNA进入人类细胞的结果。Yα和17α分别是Y染色体和17号染色体α卫星的缩写。hg是经NotI消化后的人类基因组DNA的缩写。Tel是端粒DNA的缩写。VK75是来自X染色体的一个75kb片段缩写。X代表转染中包括此序列。XX代表如实验步骤所述，转染中包括附加纯化的α卫星DNA。(XX)代表如实验步骤所述，转染前，附加的α卫星DNA要预连接在β-geo/α卫星构建体上。表2
稳定性每个克隆按指定的天数无选择作用下生长，一定的培养时间后，收集细胞进行FISH分析并与实验流程所述的适当α的卫星探针杂交。图中已指出每一个时间点检测的细胞数，Y染色体数(或23-1及17-15克隆的7号染色体数)，合成染色体数。每一个实验点含有合成染色体的细胞百分数用黑体显示，时间点0，10，20天分别对应0，12，24次细胞分裂。
尽管以上提到的是非常理想的方案，应理解为本发明不受其限制。它会使本领域普通技术人员想到可对这个开放的方案进行多种修改，同时这样的修改在本发明的范围之内。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)VAN BOKKELEN，Gil B.
(B)HARRINGTON，John J.
(C)WILLARD，Huntington F.(ii)发明名称合成的哺乳动物染色体和其构建方法(iii)序列数5(iv)通讯地址(A)收信人STERNE，KESSLER，GOLDSTEIN & FOX P.L.L.C(B)街道1100纽约路；N.W.，SUITE 600(C)城市华盛顿(D)州D.C.
(E)国家美国(F)ZIP20005-3934(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC兼容机(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件Patentln Release#1.0，版本#1.30(EPO)(vi)当前申请的数据(A)申请号(待定)(B)申请日1996年6月7日(vii)在先申请的数据(A)申请号美国08/487,989和美国08/643,554(B)申请日1995年6月7日和1996年5月6日(viii)律师/代理人信息(A)姓名MICHELE.CIMBALA(B)登记号33,851
(c)证书号1522.0001PC02(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征(A)长度17个碱基对(B)类型核酸(C)链型(D)拓扑结构(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO1ATTCGTTGGA AACGGGA17(2)SEQ ID NO2的信息(I)序列特征(A)长度41个碱甚对(B)类型核酸(C)链型(D)拓扑结构(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEO ID NO2GGGCGGGAGA TCTCAGAAAA TTCTTTGGGA TGATTGAGTT G 41(2)SEQ ID NO3的信息(I)序列特征(A)长度41个碱基对(B)类型核酸(C)链型(D)拓扑结构(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO3GGGCGGGATC CCTTCTGTCT TCTTTTTATA GGAAGTTATTT 41(2)SEQ ID NO4的信息(I)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型(D)拓扑结构(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO4GGGTTAGGGT TAGGGTTAGG GTTAGGGTTA GGGTTAGGG39(2)SEQ ID NO5的信息(I)序列特征(A)长度39个碱基对(B)类型核酸(C)链型(D)拓扑结构(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID NO5CCCTAACCCT AACCCTAACC CTAACCCTAA CCCTAACCC39
权利要求
1.一种人工哺乳动物染色体，该染色体实质上包含着丝粒、端粒和基因组DNA。
2.一种人工哺乳动物染色体，该染色体实质上包含着丝粒DNA、端粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
3.一种人工哺乳动物染色体，该染色体实质上包含着丝粒DNA、端粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
4.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
5.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
6.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的裸DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
7.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的裸DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
8.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的凝聚DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
9.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过用纯化的凝聚DNA转染哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
10.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过将纯化的包被DNA转染进哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
11.一种人工哺乳动物染色体，该染色体是通过将纯化的包被DNA转染进哺乳动物细胞的方法产生的，所说DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
12.权利要求4-11之任一的人工哺乳动物染色体，其中所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA不是相互连接的。
13.权利要求4-11之任一的人工哺乳动物染色体，其中一种或多种所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA不是相互连接的。
14.一种包含权利要求1-11之任一的人工哺乳动物染色体的组合体。
15.权利要求1-11之任一的人工哺乳动物染色体，其中所说的着丝粒DNA包括α-卫星DNA。
16.一种包含权利要求1-11之任一的人工哺乳动物染色体的哺乳动物细胞。
17.权利要求1-11之任一的人工哺乳动物染色体，其中所说的染色体还包含异源DNA，当所说的染色体引入到哺乳动物细胞中时，该异源DNA从所说的染色体表达，或者引起基因产物的表达。
18.纯化的DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
19.纯化的DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
20.纯化的裸DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
21.纯化的裸DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
22.纯化的凝聚DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
23.纯化的凝聚DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
24.纯化的包被DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
25.纯化的包被DNA，该DNA实质上包含端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
26.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
27.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
28.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的裸DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
29.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的裸DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
30.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的凝聚DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
31.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的凝聚DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
32.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的包被DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
33.由体外组合端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA制备的纯化的包被DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
34.包含权利要求18-33之任一的DNA的组合体。
35.包含权利要求18-33之任一的纯化的DNA的哺乳动物细胞。
36.权利要求18-33之任一的纯化的DNA，其中所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA不是相互连接的。
37.权利要求18-33之任一的纯化的DNA，其中一种或多种所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA是相互连接的。
38.权利要求18-33之任一的纯化的DNA，其中所说的着丝粒DNA包括α-卫星DNA。
39.权利要求18-33之任一的纯化的DNA，其中所说的DNA还包含异源DNA，当所说的DNA引入到哺乳动物细胞中时，该异源DNA从所说的染色体表达，或者引起基因产物的表达。
40.包含权利要求18-33之任一的DNA的载体。
41.包含权利要求40的载体的细胞。
42.包含权利要求40的载体的组合体。
43.一种克隆重复串联族DNA的方法，该方法包括(a)制备第一DNA单位，以使所说DNA单位的相反的末端包含互补的但非同裂酶的限制位点；(b)将所说的DNA单位连接进载体；(c)在所说的限制位点之一使所说的载体线性化；(d)连接如步骤(a)制备的第二DNA单位，使其与所说的第一单位串联，以形成定向的重复族；(e)将所说的族转化进细菌宿主细胞；(f)选择包含所说的族的稳定的克隆；和(g)重复步骤(c)-(f)，直到达到所需的族的大小。
44.权利要求43的方法，其中所说的DNA是α卫星DNA。
45.权利要求44的方法，其中所说的α卫星DNA长度大于100kb。
46.权利要求45的方法，其中所说的α卫星DNA长度大于140kb。
47.权利要求44的方法，其中所说的α卫星DNA是人类α卫星DNA。
48.一种包含由定向的重复的DNA族组成的序列的载体，所说的族包含重复DNA单位，其中每个DNA单位的相反的末端包含互补的但非同裂酶的限制位点。
49.权利要求48的载体，其中所说的DNA是α卫星DNA。
50.权利要求49的载体，其中所说的α卫星DNA的所说的族长度大于100kb。
51.权利要求50的载体，其中所说的α卫星DNA的所说的族长度大于140kb。
52.权利要求47的载体，其中所说的α卫星DNA是人类α卫星DNA。
53.一种用权利要求47-52之任一的载体稳定转化的宿主细胞。
54.权利要求53的宿主细胞，其中所说的宿主细胞是原核细胞。
55.权利要求54的宿主细胞，其中所说的原核细胞是大肠杆菌。
56.一种制造人工哺乳动物染色体的方法，该方法包括把权利要求18-33之任一的纯化的DNA引入到哺乳动物细胞中。
57.一种制造人工哺乳动物染色体的方法，该方法包括将权利要求34的组合体引入到哺乳动物细胞中。
58.一种制备纯化的DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
59.一种制备纯化的DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
60.一种制备纯化的裸DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
61.一种制备纯化的裸DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
62.一种制备纯化的凝聚DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
63.一种制备纯化的凝聚DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
64.一种制备纯化的包被DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段。
65.一种制备纯化的包被DNA组合体的方法，该方法包括体外组合纯化的端粒DNA、着丝粒DNA和基因组DNA，其中所说的基因组DNA是选自由限制酶消化片段和机械剪切片段组成的组的次基因组DNA片段，所说的着丝粒DNA包含在有丝分裂期间与CENP-E相关联的DNA序列，并且所说的端粒DNA包含串联重复的序列TTAGGG。
66.权利要求56-65之任一的方法，其中所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA不是相互连接的。
67.权利要求56-65之任一的方法，其中所说的一种或多种所说的着丝粒DNA、所说的端粒DNA和所说的基因组DNA是相互连接的。
68.一种在哺乳动物细胞中表达基因的方法，该方法包括培养包含权利要求1-11之任一的人工染色体的哺乳动物细胞，其中所说的染色体含有所说的基因或者含有使得所说的基因可以表达的DNA序列。
69.一种在哺乳动物细胞中表达异源基因的方法，该方法包括培养包含权利要求18-33之任一的DNA的哺乳动物细胞，其中所说的DNA含有所说的基因或者含有使得所说的基因可以表达的DNA序列。
70.权利要求68的方法，其中所说的基因表达对包含所说细胞的哺乳动物提供治疗作用。
71.权利要求69的方法，其中所说的基因表达对包含所说细胞的哺乳动物提供治疗作用。
全文摘要
本发明涉及基因治疗、基因表达和这些用途的载体领域。具体地说,本发明涉及用于产生DNA的结构完整的大重复单元(尤其是对α卫星DNA的稳定克隆有用的大重复单位)的方法,以及开发和利用在哺乳动物(尤其是人类)中进行基因表达和基因治疗的合成或人工染色体的方法。本发明使得可以控制性地构建由纯化的DNA的分离的区段构成的稳定的合成或人工染色体。功能性最小区段优选地包括着丝粒DNA、端粒DNA和基因组DNA。所述人工染色体发挥天然存在的染色体的必需染色体功能,以使所述染色体作为基因治疗的有效载体起作用。
文档编号A61K48/00GK1191574SQ96195654
公开日1998年8月26日 申请日期1996年6月7日 优先权日1995年6月7日
发明者G·B·冯伯克里恩, J·J·哈里格顿, H·F·威拉德 申请人:凯斯韦斯顿瑞瑟弗大学