专利名称：：活的减毒的产rtx巴斯德氏菌科细菌的制作方法
技术领域：
：本发明涉及活的减毒的产RTX巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科细菌、产生这种细菌的方法、包含这种细菌的疫苗、产生该疫苗的方法及保护人和动物免受用致病的产RTX巴斯德氏菌科细菌感染的方法。巴斯德氏菌科包括嗜血杆菌属(Haemophilus)、放线杆菌属(Actinobacillus)及巴斯德氏菌属(Pasteurella)。该科细菌也经常称作HAP-类群(HAP-group)细菌。已知这些密切相关属的几个种表达同源钙依赖性的孔道形成细胞毒素，即所谓的RTX毒素。(RTX代表毒素的重复(repeatintoxin))。该科的产RTX-毒素细菌是传染病整个领域的原因所在，影响人和动物。已知其它与HAP-类群无关的属，如埃希氏菌属(Escherichia)和博德特氏菌属(Bordetella)也有RTX-毒素。这些RTX-毒素在某些方面与HAP-类群的RTX-毒素相似。RTX-毒素由Braun等全面综述过(微生物学中的关键性综述18(2)115-158(1991)革兰氏阴性细菌也由Welch，R.A在(分子微生物学5/3521-528(1991))和Welch等在(感染病原体和疾病4254-272(1995))中综述过。正是由于在巴斯德氏菌科细菌产-RTX成员中RTX-毒素的存在才高度促成了这些细菌在人和动物中的病理特征。所有RTX-毒素都显示某种细胞毒或细胞溶解活性。然而靶细胞和宿主特异性依毒素和酰化的不同而不同(Mcwhinney等；细菌杂志(J.Bact.)174291-297(1992)和Hackett等；生物化学杂志(J.Biol.Chem.)27020250-20253(1995))。由于靶细胞的不同，各种RTX-毒素家族的毒素称为如溶血素，细胞溶素或细胞毒素。尽管HAP-类群的许多产RTX成员已经清楚，它们中的有些种类因它们造成的经济损失而臭名昭著。胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)产生对猪、马、牛和人红细胞、兔和猪的嗜中性细胞及猪肺泡的巨噬细胞有细胞毒/细胞溶解活性的RTX-毒素。(Rosendal等；美国兽医研究杂志491053-1058(1988)，MaudsleyJ.R.和KadisS；加拿大微生物学杂志(Can.J.Microbiol.)32801-805(1986)，Frey.J和Nicolet.J；感染与免疫562570-2575(1988)，Bendixon等；感染与免疫33673-676(1981)，Kamp，E.M.和vanLeengoed，L.A.M.G.；临床微生物学杂志(J.Clin.Microbiol.)271187-1191(1989))。放线杆菌在猪中的感染会对养猪业导致严重的经济损失，因为它会导致幼猪严重死亡和较大猪的体重下降。溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)的RTX-毒素活性主要是针对反刍动物的嗜中性白细胞和单核细胞/巨噬细胞(Shewen和Wilie；感染与免疫(Inf.&Immun.)35，91-94(1982)，Baluyut等；美国兽医研究杂志421920-1926(1981)，Himmel等，美国兽医研究杂志43764-767(1982))。巴斯德氏菌属(Pasteurella)感染会导致反刍动物，尤其是牛和羊的严重问题。乳腺炎和肺炎既见于羊又见于牛中，而船热(ShippingFever)会导致牛中的额外问题。由于巴斯德氏菌属感染的经济损失是很大的。已知其它非-HAP类群细胞也产生RTX-毒素。大肠杆菌(E.coli)的溶血素对很多种不同动物的不同细胞是有毒的。它在接触后的几分钟之内裂解许多种动物的红细胞。(Cavalieri，S.J.和Snyder.I.S.；感染与免疫37966-974(1982)，Gadeberg等；感染与免疫41358-364(1983)，Keane等；美国病理学杂志126305-357(1987)，Bhadki等；实验医学杂志169737-754(1989))。百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)溶血素也显示出较宽的宿主细胞范围。(Shattuck，R.L.和Storm，D.R.；生物化学246323-6328(1985)，Hewlett等，《蛋白质细菌毒素》，Rappuoli，R.等(编)，Stuttgart，Fisher-Verlag249-257(1990))。涉及革兰氏-阴性细菌RTX毒素合成、激活和运输的操纵子的遗传结构最近由Coote.J.G.加以综述(FEMS微生物学综述88137-162(1992))。一般地，RTX-操纵子含有4个基因实际的毒素-基因(A)、激活剂-基因(Activator-gene)(C)、和编码参与毒素分泌到周围介质蛋白的两个基因(B和D(以及在百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)中的E))。毒素-基因(A)的初级翻译产物为无毒的蛋白。激活剂-基因(C)的作用是至关重要的因为该基因编码的基因产物通过翻译后的修饰而激活RTX-毒素的毒性。该激活导致毒素的结构改变。如在百日咳博德特氏菌(Bordetellapertussis)中，RTX-毒素的翻译后修饰是由酰胺连接的十六烷酰化(palmitoylation)赖氨酸残基所致(Hackett等；科学266433-435(1994)。大肠杆菌(E.coli)的RTX-毒素可在体外通过从酰基载体蛋白向溶血素原转移一个脂肪酰基基团而被激活(lssartel等；自然351759-761(1991))。已知(参见如Coote，J.G.；FEMS微生物学综述88137-162(1992))，RTX-毒素是巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)细菌中重要的毒性因子。这已由Tascon等(分子微生物学.14207-216(1994))和Jansen等(感染与免疫6327-37(1995))在如胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)中加以证实。已知毒性因子是插入疫苗的主要目标。因此，已进行过几种用RTX-毒素作为亚单位-疫苗的尝试。体内合成的HAP-类群RTX-毒素本质上是在RTX-激活剂蛋白存在下产生的。因此，RTX-毒素总是翻译后修饰成高度有毒的蛋白。如果它们高度有毒，很明显RTX毒素在用作疫苗成份之前必需被解毒。根据体外合成的丧失毒性的胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)RTX-毒素的亚单位疫苗较早已在如欧洲专利EPNo.0.354.628中加以描述，其中公开了根据胸膜肺炎放线杆菌溶血素和细胞毒素的亚单位疫苗，并且在欧洲专利EPNo0.453.024中公开了根据溶血素、细胞毒素和外膜蛋白的胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗。根据溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)RTX毒素的亚单位疫苗也已被公开，如在美国专利No.5,055,400,加拿大专利申请CA2,014,033及加拿大专利申请CA2,081,950中。用作疫苗亚单位的RTX-毒素容易从野生型菌株细菌培养物上清中获得。另一种获得RTX-毒素作为亚单位的方法在加拿大专利申请CA2,045,950中被提出，其中描述了在异源菌株大肠杆菌(E.coli)中异源表达编码胸膜肺炎放线杆菌RTX-蛋白的基因。然而，用这样获得的RTX-毒素的疫苗实验未被说明过。亚单位疫苗产生的类似方法在欧洲专利EP0.500.736中提出。在该专利中，公开了RTX毒素-基因(A)和激活剂-基因(C)的序列。也公开了在激活剂-基因C存在或不存在情况下毒素基因A表达的异源表达系统。然而用毒素亚单位的种痘实验未描述过。然而所有RTX-毒素亚单位疫苗有三大缺陷·为了充分激发免疫系统需要很大量的抗原物质。·通常，仅B-细胞免疫性被激发。·活的病原菌具有许多重要的免疫原性分子，如外膜蛋白和荚膜多糖，所有都具有重要的保护功能。因此，为了产生有效的亚单位疫苗，人们必须额外地包含进尽可能多的其它免疫原性上重要的抗原。紧接着第一点和第二点，尤其是第三点提及的明显问题是难以生产有效的亚单位疫苗。这可通过，如在上面提及的欧洲专利EPNo0.453.024中公开的胸膜肺炎放线杆菌亚单位疫苗加以说明，其中4个不同的亚单位(3个RTX-毒素和1个外膜蛋白)结合于一个疫苗中。很明显，为了克服抗巴斯德氏菌科(Pasteurellaceae)-感染的亚单位疫苗的缺陷，活的减毒的疫苗将是高度必要的。活的减毒的疫苗具有以下优点·它可用低剂量施用(它自我复制)·它密切模仿自然/野生型感染·它在同一时间内提供所有可能的免疫学上重要的抗原。然而，尽管有明显优点，在本发明之前还没有得到根据产生具有较少活性RTX-毒素的HAP-类群细菌的活的疫苗。缺乏活的减毒的疫苗的原因由下面的反论清楚地加以说明·活的减毒的疫苗菌株的第一个特征是它不应该产生活性的RTX毒素，因为如上所述，正是这种RTX-毒素才使HAP-类群菌株如此剧毒。·然而通过丧失表达RTX-毒素的能力而毒性减弱的活的减毒细菌将实质上缺乏最重要的毒性因子，即RTX-毒素，且因而将不会激发对该毒素的免疫反应。因此，如果RTX-基因从HAP-类群菌株删除且这种减毒菌株用作抗由毒性HAP-类群野生型菌株所致疾病疫苗的基础，仅获得部分的保护人们将不会获得抵抗这些野生型菌株最重要的毒性因子，即RTX-毒素的保护免疫性。因此，不能期望基于RTX-毒素缺失细菌的疫苗在野生型菌株感染后提供对RTX-毒素损伤效应的保护。缺乏apxI-操纵子的菌株由Reimer等制备(微生物病理(MicrobialPathog.)18197-209(1995)，它们缺失了所有在胸膜肺炎放线杆菌ApxI毒素合成和运输中起作用的基因。这样的菌株正如预期的一样是无毒的，因为它们不再分泌最重要的毒性因子；因此，RTX-毒素没有抗体，更不用说保护性抗体，将被诱导以抵抗RTX-毒素。本发明首次提供活的减毒的产RTX-毒素的巴斯德氏菌科(familyPasteurellaceae)细菌，它们的确产生RTX-A毒素，但是是非-活性形式。这些细菌具有异常的特征一方面毒性减弱，而另一方面，它们仍能够产生RTX-毒素。这可通过以这样的方式修饰细菌而完成即，使它们不产生功能性RTX-激活剂蛋白。然而，RTX-A毒素的表达不受影响。根据本发明的活的减毒菌株优于亚单位疫苗及RTX-毒素基因缺失的活菌株的优点在于·它们的确产生RTX-毒素以诱导产生抗该毒素的保护性抗体·不过它们的毒性被减弱因为它们产生非-毒性形式的RTX-毒素·它们额外拥有所有其它抗原，这些抗原与RTX-毒素相邻，对获得有效的免疫反应是必需的。非活性形式的RTX-A毒素被认为是无毒的，即没有与活性毒素相同的毒性效应。如上面提及的，可通过不产生功能性RTX-激活剂蛋白的方式修饰细菌而获得。而RTX-A毒素的表达不受影响。功能性RTX-激活剂蛋白被认为具有在野生型细菌中表达的RTX-激活剂蛋白的所有特征，且以野生型水平表达。因此，非功能性RTX-激活剂蛋白被认为缺乏一些或所有在野生型细菌中表达的RTX-激活剂蛋白的特征，和/或以不足以获得野生型活性RTX-毒素水平的水平表达。这里必须强调以下内容如果非功能性RTX-激活剂蛋白缺乏如在野生型细菌中表达的RTX-激活剂蛋白的所有特征，该细菌将根本不产生活性的RTX-毒素。然而，如果非功能性RTX-激活剂蛋白仅缺乏如在野生型细菌中表达的RTX-激活剂蛋白的部分特征，该细菌可以产生部分活性形式的RTX-毒素和部分非活性形式的RTX-毒素。例如如果是由于突变而表达激活剂蛋白就是这种情况，但激活剂蛋白的激活效率下降。激活速度是激活剂蛋白激活RTX-毒素的速度，即，转换RTX-毒素非活性形式至其活性形式的速度。因此不用说，产生部分非活性形式RTX-毒素和部分活性形式RTX-毒素的细菌也包括在本发明之内。丧失达到野生型活性RTX-毒素水平的能力也许是由于RTX-激活剂蛋白活性降低的结果。这也可能是RTX-激活剂-蛋白表达水平下降的结果，或者两种可能性都有。因此，活性下降和/或表达水平降低的RTX-激活剂-蛋白在本发明的范围之内。另外，修饰RTX-激活剂蛋白的靶位点(即，RTX-毒素的酰化-位点)是可能的。如果该位点被修饰成酰化的程度降低或无酰化的程度，这也导致非-活性形式RTX-毒素的产生。酰化-位点可用重组DNA技术容易地突变。突变也可通过如缺乏包括酰化-位点的限制性片段或通过酰化-位点的定点诱变而获得。具有非功能性RTX-激活剂蛋白的活的减毒细菌可用几种方法获得。一种可能性是在编码RTX-激活剂蛋白的基因中导入突变，优选利用重组DNA技术。突变理解为上面提及区域的遗传信息相对于存在于野生型细菌基因组该区域遗传信息的改变。例如，突变是导致不产生功能性RTX-激活剂-蛋白的核酸取代、缺失、插入或倒位或其几种的组合。当前已知道许多有关HAP-类群产RTX-毒素菌株的RTX-激活剂基因的定位(location)、限制性图谱和常常甚至是核苷酸序列。该信息可在如Coote，J.G的综述(FEMS微生物学综述88137-162(1992))中找到，他给出了不同RTX-毒素间结构和功能关系的整体观点。关于具体RTX-毒素的非常详细的信息可在如涉及溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)RTX-基因的美国专利5,055,400，和Frey等；遗传微生物学杂志1391723-1728(1993)和Frey等；1994爱德伯格(Edinburgh)英国，关于所有在胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)RTX-毒素的合成和运输中起作用基因的HAP-大会会议录中找到。编码RTX-激活剂蛋白基因或涉及该基因转录/翻译序列的突变可用几种方法获得。一种可能性是在载体中克隆RTX-激活剂基因的相关序列，用限制性酶切除部分或全部的RTX-序列并以突变的序列替代野生型RTX-毒素基因。这样的替代如通过众所周知的同源重组技术而完成。另一种可能性是用定点诱变获得所需的突变。这些标准的重组DNA技术由如Sambrook等在《分子克隆实验指南》冷泉港实验室出版社(1989)中描述。因此，在一个优选的实施方案中，细菌在编码RTX-激活剂蛋白的基因中具有突变。该突变根据其大小和特征可导致活性减少或完全丧失活性的RTX-激活剂蛋白。在一个更为优选的形式中，编码RTX-激活剂蛋白的基因的突变是缺失。缺失的大小高度可变它可少到如一个核苷酸，从而导致移码突变。另一方面，编码RTX-激活剂蛋白的整个基因可被缺失。另一种可能性是保持编码RTX-激活剂蛋白的基因完整，但降低RTX-激活剂蛋白的表达水平。由于毒素基因和激活剂-基因从多顺反子信使RNA的同一个启动子转录，故降低转录水平的同时不降低RTX-毒素的表达水平是不可能的。然而，RTX-激活剂蛋白表达水平的改变可通过向编码RTX-激活剂蛋白基因上游的核糖体结合位点导入突变而获得，优选通过用重组DNA技术。因此，在另一优选的实施方案中，细菌在控制RTX-激活剂的mRNA翻译的区域，如核糖体结合位点具有突变。这样的突变影响编码RTX-激活剂蛋白RNA的翻译效率。根据它们的共有特征序列(Consensus-motive)和核糖体结合位点与起始密码子之间相对距离约5-6个核苷酸，核糖体结合位点一般容易检测到。在许多情况下，例如对于几个胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)的RTX-激活剂基因它们已被公开(Frey等，基因14297-102(1994))。在该实施方案的更为优选的形式中，在控制RTX-激活剂mRNA翻译区域的突变为缺失。例如，缺失可以包括缺失核糖体结合位点一个或更多个核苷酸。另外一个获得具有非功能性RTX-激活剂蛋白的活的减毒细菌的可能性是增加编码反义RNA的核酸序列，它可结合到编码激活剂蛋白的信使RNA上。由此，这样序列的表达导致激活剂蛋白水平的下降。反义RNA是具有与信使RNA(mRNA)序列部分或全部互补序列的RNA，相对于mRNA是反义的。在最优选的实施方案中，根据本发明的活的减毒的细菌为胸膜肺炎放线杆菌。本发明也涉及保护动物免受用产RTX-毒素的巴斯德氏菌科细菌感染的疫苗。这样的疫苗基于根据本发明的活的减毒的产RTX-毒素细菌和药物上可接受的载体。这些疫苗包括至少免疫有效量的根据本发明的产RTX-毒素的活的减毒的细菌。免疫有效意指接种施用的活的减毒的产RTX-毒素的细菌量足以诱导宿主对产RTX-毒素细菌的毒性形式的有效免疫反应。所施用的有用剂量将根据年龄、体重和接种的哺乳动物、施用方式及接种所要抵抗的病原体的类型而变化。疫苗可以包括足以引发免疫反应的任何剂量的细菌。例如，在103与1010个细菌范围的剂量是很合适的剂量。除了上述免疫有效量的活的减毒的产RTX-毒素细菌外，根据本发明的疫苗也包含药物上可接受的载体。这样的载体可以为简单的如水，但也可以包括如培养细菌的培养液。另一种合适的载体是例如生理盐浓度的溶液。其它药物上可接受的用于本发明的载体或稀释剂的实例包括稳定剂如SPGA，碳水化合物(如，山梨醇，甘露醇，淀粉，蔗糖，葡萄糖，葡聚糖)，清蛋白或酪蛋白之类的蛋白，牛血清或脱脂乳之类的含蛋白的试剂及缓冲液(例如，磷酸盐缓冲液)。具有辅助活性的一种或更多种化合物可添加进可不添加进疫苗中。佐剂为非特异性的免疫系统刺激剂。它们增强宿主对入侵病原体的免疫反应。本领域已知的佐剂的例子有弗氏完全或不完全佐剂、维生素E，非离子嵌段聚合物，胞壁酰二肽、ISCOMS(免疫刺激复合物，参看如欧洲专利EP109942)，皂角苷，矿物油，植物油及Carbopol(一种均聚物)。尤其适于粘膜使用的佐剂有如大肠杆菌(E.coli)不耐热的毒素(LT)或霍乱毒素(CT)。其它合适的佐剂如氢氧化铝，磷酸盐或氧化物，油性-乳液(如BayolF(R)或Marcol52(R)，皂角苷或维生素E加溶物。因此，在优选的形式中，根据本发明的疫苗包括佐剂。关于施用于动物，根据本发明的疫苗可以鼻内，皮内，皮下，喷剂或肌内方式给药。在更为优选的实施方案中，根据本发明的疫苗额外包括选自其它病原微生物或病毒的一个或更多个抗原。这样的疫苗可通过向活的减毒的根据本发明的产RTX-毒素的细菌和上述药物上可接受的载体中添加选自其它病原菌或病毒的一个或更多个抗原而获得。当然，不仅添加一个或更多个抗原，而且添加一个或更多个失活或活性形式的整个病原体也是可能的。另外，这也可用已知的重组DNA技术，通过向活的减毒的产RTX-毒素细菌中克隆编码选自其它病原微生物或病毒的一个或更多个抗原的遗传信息而获得。根据本发明的细菌很适合作为这样的遗传信息的载体，因为它们具有减毒的特征。根据本发明的额外带有编码选自其它病原微生物或病毒一个或更多个抗原遗传信息细菌的疫苗可同时对两种或更多种疾病产生免疫。无论从医学或身体角度考虑，对于要接种的动物来说要比分别接种每种病原体当然要轻松得多。在一更为优选的实施方案中，根据本发明的疫苗包括胸膜肺炎放线杆菌属活的减毒的产RTX-毒素的细菌。在一尤其更为优选的形式中，这些抗原选自，但不限于由猪生殖呼吸综合症(PRRS)病毒，假狂犬病毒，猪流感病毒，猪细小病毒，可传播胃肠炎病毒，旋转病毒，大肠杆菌，Erysipelothrixrhusiopathiae，多杀巴斯德氏菌，支气管炎博德特氏菌，副猪嗜血菌和猪链球菌组成的组。在另一个更为优选的实施方案中，根据本发明的疫苗包括溶血巴斯德氏菌属活的减毒的产RTX-毒素细菌。在该实施方案更为优选的形式中，选自其它病原微生物或病毒的抗原选自由牛病原体组成的组，所述病原体包括牛旋转病毒、牛病毒性腹泻病毒、副流感3型病毒、牛副粘病毒、口啼疫病毒、多杀巴斯德氏菌、Haemophilussomnus、流产布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、Streptococcusspp.，Mycoplasmaspp.和牛呼吸多核病毒。有好几种贮存活的有机体的方法。例如贮存于冰箱是众所周知的方法。在含有甘油的缓冲液中-70℃保存也是常用的。细菌也可于液氮中保存。冷冻干燥是另一种保存方法。冷冻干燥的细菌可被保存并维持存活数年。冷冻干燥的细菌的贮存温度可大大高于零度而不影响其存活。冷冻-干燥可根据众所周知的标准冷冻-干燥方法完成。任选的有用的添加剂，如脱脂乳，海藻糖，明胶或牛血清白蛋白可在冷冻-干燥过程中加入。因此，在优选实施方案中，疫苗是冻干的形式。本发明也涉及用根据本发明的疫苗保护易感动物免受巴斯德氏菌科细菌的感染。在优选实施方案中，根据本发明的疫苗用于保护易感动物免受胸膜肺炎放线杆菌的感染。本发明也涉及制备活的减毒的产RTX-毒素巴斯德氏菌科细菌的方法。所述的方法包括在编码RTX-激活剂蛋白基因中导入突变。在该方法的优选的实施方案中，要导入的突变是RTX-激活剂蛋白基因中的缺失。最后，本发明涉及制备保护动物免受产RTX-毒素巴斯德氏菌科细菌感染的疫苗的方法。一种方法包括将根据本发明的细菌与上述药物上可接受的载体混合。实施例实施例1活的减毒的胸膜肺炎放线杆菌菌株的制备。pApxI-D11的构建根据本发明的活的减毒的细菌的可行性通过胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)△apxIC突变体的构建加以说明。为了获得该突变体，首先制备包括RTX-激活剂基因中缺失的质粒。构建纲要见于图1。胸膜肺炎放线杆菌apxI操纵子序列保藏于GenBank，保藏号为X52899。从pJFF750(Gygi等；感染免疫603059-3064，1992)，apxIC和apxIA基因及启动子区域被切成4481bp的BglII/PstI片段且克隆进入质粒pGEM3Z(PromegaCo.，LeidenNL)，以BamHI和PstI消化。得到的质粒命名为pApxI-D1。用限制性酶XhoI消化切下包括大多数ApxIC编码区的407bp的DNA片段，然后以限制酶Sspl部分消化。突出的粘性末端以S1-核酸酶将其转变为平端且从琼脂糖凝胶中分离出约6800bp的片段且重新连接。得到的质粒命名为pApxI-D2。横跨XhoI/SspI缺失连接的序列通过核苷酸序列分析加以确证。随后，大多数ApxIA的编码区通过AfIII/SmaI消化，用S1-核酸酶补平和重新连接而被缺失。用限制酶PstI和SacI从pApxI-D3中切下1454bp的用于等位替代的交换卡式盒(exchangecassette)并克隆入以相同酶消化的载体pJQ200KS(Quandt等；基因12715-21，1993)中。得到的质粒命名为pApxI-D4。pApxI-D4中sacB基因3’端通过HpaI消化而去除并以从pAP13中切下rpsL基因的540bp的EcoRV片段替代。得到的质粒命名为pApxI-D11。结果得到质粒pApxI-D11的结构通过各种限制酶消化核查。消化图谱表明的确获得所需的质粒。该质粒进一步用于△apxIC突变体的构建。从胸膜肺炎放线杆菌HV211菌株构建△apxIC突变体。质粒pApxI-D11用于等位替代。为了此目的，通过用标准的滤膜配对(filtermating)技术(DeLorenzo和Timmis，酶学方法235386-405，1994)与大肠杆菌(E.coli)接合而将其导入胸膜肺炎放线杆菌。名为MBHPP101的大肠杆菌供体通过以质粒pApxI-D11转化SM10λpir菌株(Miller和Mekalanos，细菌学杂志1702575-25831988)而构建。在链霉素存在下及后来链霉素和萘啶酮酸(菌株R)都存在下培养血清型10区分离物HV211(Serotype10fieldisolateHV211)(由Beck等测试的菌株之一，临床微生物学杂志322749-2754，1994)后分离胸膜肺炎放线杆菌受体菌株MBHPP105。接合以后，经固体培养基筛选，获得对萘啶酮酸和庆大霉毒抗性的胸膜肺炎放线杆菌外接合体(exconjugant)。Southern印迹分析表明，得到的菌株(I)含有既作为环状质粒又整合进ApxI操纵子的pApxI-D11DNA。这可从图2的左边组中看出，其中指示菌株DNA杂交到pApxI-D11的1.478KB的SalI/SacI片段上。在萘啶酮酸存在下进一步培养后，菌株平板接种于含萘啶酮酸的血液琼脂上且鉴定出无溶血带胸膜肺炎放线杆菌菌落。结果通过Southern印迹分析确证得到的命名为MBHPP113的菌株为胸膜肺炎放线杆菌血清型10的ApxIC阴性突变体(见图2)。正如预期，在SspI消化的MBHPP113菌株的染色体DNA中，仅一条带与缺失区域两侧探针杂交(图2，左边组)。带的大小(约4.4KB)相应于亲本菌株染色体DNA两个杂交带的总和，减去407bp的缺失。此外，已表明在MBHPP113中质粒主链已不再存在(图2，中间组)。最为重要的是，已表明包括apxIC基因的SspI/XhoI片段在MBHPP113中不复存在(图2，右边组)。实施例2△apxIC突变体MBHPP113RTX-毒素表达、分泌和溶血活性缺失的测试。胸膜肺炎放线杆菌△apxIC突变体MBHPP113溶血活性的缺失。为了证明MBHPP113中△apxIC的缺失效应，经血液平板培养后比较△apxIC菌株MBHPP113和野生型亲本菌株的溶血活性。属于血清型7(仅产ApxII)的胸膜肺炎放线杆菌参照菌株也被收入作为比较。由于ApxII具有中等的溶血活性，故该菌株显示中度的溶血水平。用无菌牙签将单个菌落转移至含(0.1％NAD和2％羊红血细胞的Columbia琼脂板上。结果如从图3中可以看出，经37℃培养8小时后。HV211(野生型)，MBHPP105(R，即抗性菌株)和质粒的整合突变体(I)如预期被溶血带所包围。血清型7(仅产ApxII)的胸膜肺炎放线杆菌参照菌株显示出中度的溶血水平。也如预期的，△apxIC菌株MBHPP113(图3中记作△)周围未能检测到溶血带。该实验清晰显示，△apxIC菌株MBHPP113的确不产生活性的Apx-毒素。△aPxIC菌株MBHPP113对apxIA的表达和分泌。根据本发明的△apxIC菌株预想是表达和分泌RTX-毒素，但是以非溶血的形式。表达和分泌在该实验中得到测试。通过来自各种胸膜肺炎放线杆菌菌株的浓缩培养上清液与所述的单特异性抗-ApxlA(Beck等，临床微生物学杂志，32；2749-2754，1994)之间的反应研究ApxIA蛋白的分泌。抗-ApxIIA血清和其它血清型的野生型菌株主要用作比较。从巧克力琼脂平板接种胸膜肺炎放线杆菌至5ml含0.1％NAD的ColumbiaBroth培养基，且在37℃培养6小时，同时以200rpm震摇。以10,000×g离心30分钟后收集无细胞培养上清液。ApxIA蛋白根据制造商的操作指南用Centricon-100(MilliporeCo.，Etten-Leur，NL)浓缩滤膜浓缩20倍。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白与单特异性抗-ApxIA血清和抗-ApxIIA血清杂交和反应。巧克力琼脂板含KH2PO4(1g)，K2HPO4(4g)，NaCl(5g)，ProteosepeptoneNo3(15g)，淀粉(1g)，Bacto琼脂(15g)，无菌水(至1000ml总体积)，羊血(100ml)，马血清(100ml)及Isovitalex溶液(12ml)。结果浓缩的培养上清液在平行的聚丙烯酰胺凝胶上电泳并电印迹至Immobilon-P上，如图4所示。得到的印迹在A组与单特异性抗-ApxIA血清反应，且在B组与单特异性抗-ApxIIA血清反应。测试的菌株为HV211(野生型)，MBHPP105(R，即抗性菌株)，质粒整合突变体(I)，MBHPP113(△)(见从胸膜肺炎放线杆菌菌株HV211△ApxIC突变体的构建)和血清型6，5a和5b的野生型参照菌株。血清型6的野生型参照菌株产ApxIIA，但无ApxIA。从图4A中WT，R，I和△道的105KD-带，很明显，WT菌株以及R-菌株，I-菌株和MBHPP113菌株产生和向外输出ApxlA蛋白。实施例2中的实验结果证明，胸膜肺炎放线杆菌MBHPP113菌株的确能够表达和向外输出非活性形式的RTX-毒素。实施例3从胸膜肺炎放线杆菌菌株4074构建△apxIC△apxIIC突变体菌株4074中的△apxIC突变的构建按实施例1中所述完成。在链霉素存在下及随后在链霉素和萘啶酮酸都存在下培养血清型1参照菌株(Frey和Nicolet，临床微生物学杂志28232-236，1990)后分离胸膜肺炎放线杆菌受体菌株MBHPP104。MBHPP104与MBHP101(实施例1中所述)接合以后，获得对萘啶酮酸和庆大霉素抗性的胸膜肺炎放线杆菌。将该菌株平板接种于含2％羊红细胞，0.1％NAD和萘啶酮酸的CBM平板以后，鉴定出几个具有较小溶血带的菌落。通过Southern印迹分析，证明这其中的一个命名为MBHPP111的菌落为胸膜肺炎放线杆菌(A.pleuropneumoniae)菌株4074的apxIC阴性突变体。用接合供体菌株MBHPP142中的pApxII-D2构建体(代替pApxI-D11)，以与apxIC缺失类似的方式将apxIIC缺失导入MBHPP111菌株。pApxII-D2的构建示于图5。简言之，质粒pJFFapxIICU15通过插入载体λZAPExpress(Stratagene公司)中含apxIIC和apxIIA基因(通过部分Sau3AI消化菌株4074染色体DNA获得)的4.3kb的片段和用辅助噬菌体切成载体pBK-CMV(StratageneCo.)构建。apxIIC编码区的框内缺失用pJFFapxIICU15为模板以寡APXIIC-OL(5’-CAATACCTTAAGATCATTTTTTAGCATCATCCC)和APXIIC-OR(5’-ACATTTCTTAAGTATGAGCAAGAGTTAATAACAGC)的PCR扩增而完成。得到的8.5Kb的PCR片段以AflII消化并被重新连接。得到的质粒命名为pApxII-D1且横跨缺失位点的序列通过序列分析确证。pApxII-D1插入子切成SpeI/BglII片段且连接到以XbaI和BamHI消化的pAppEX-KG1中。得到的质粒命名为pApxII-D2且转入大肠杆菌(E.coli)S17-1λpir(Simon等，生物技术1；784-791，1983)。该接合供体菌株命名为MBHPP142。MBHPP111与MBHP142接合以后，获得萘啶酮酸和庆大霉素抗性的胸膜肺炎放线杆菌外接合体(exconjugant)，平板接种于含0.1％NAD，2％羊红细胞及20μg/ml萘啶酮酸的CBM琼脂平板上。可鉴定出非溶血的胸膜肺炎放线杆菌菌落。通过Soutnern印迹分析确证其中一个命名为MBHPP147的菌落为胸膜肺炎放线杆菌菌株4074的apxICapxIIC缺失突变体。结果构建步骤导致在apxIC和apxIIC基因中均具缺失的菌株MBHPP147。胸膜肺炎放线杆菌血清型1△apxC突变体的溶血活性培养于血液平板(如实施例2中所述)后比较△apxIC菌株MBHPP111，△apxIC△apxIIC双缺失突变体MBHPP147和野生型亲本菌株MBHPP104的溶血活性。单个菌落用无菌牙签转移至含0.1％NAD和2％羊红血细胞的CBM平板上。经37℃8小时培养后野生型菌株MBHPP104被2mm的β-溶血带所包围。仍产活性ApxIIA的MBHPP111菌株产生约1mm的更为扩散的溶血带(相当于包围已知仅产生ApxII的胸膜肺炎放线杆菌参照菌株血清型7和12的溶血带)。MBHPP147双缺失突变体为非溶血性的。结果apxIC缺失导致强溶血活性(ApxI溶血素典型特征)的丧失。随后的apxIIC缺失导致溶血活性的完全丧失。结果总结于表1。表1菌株血液琼脂上的溶血带(mm)Western印迹反应抗-ApxIA抗体抗-ApxIIA抗体MBHPP1042++MBHPP1111(d)++MBHPP1470++血清型102+-血清型121(d)-+</table></tables>表1溶血和Western印迹结果小结。溶血带以mm表示且“(d)”表示扩散性溶血。A“+”表示抗体与约105KDa的抗原在Western印迹中的反应。A“-”表明缺乏这样的反应。从血清型1菌株4074获得的△apxC菌株对ApxIA和ApxIIA的表达和分泌。通过各种胸膜肺炎放线杆菌菌株浓缩的培养上清液与单特异性抗-ApxIA和抗-ApxIIA血清在所述的Western印迹方法(Beck等，临床微生物学杂志，32；2749-2754，1994和实施例2)中的反应研究ApxIA蛋白的分泌。结果所有血清型1菌株(MBHPP104，MBHPP111和MBHPP147)显示出仍然表达和分泌ApxIA及ApxIIA。作为对照，收入了血清型10菌株(仅表达ApxI)和血清型12菌株(仅表达ApxII)的浓缩上清液。结果总结于表1。实施例4在小鼠中△apxC突变对胸膜肺炎放线杆菌毒性的影响为了测定apxIC和/或apxIIC缺失对胸膜肺炎放线杆菌毒性的影响，7只小鼠(6-7周龄)为一组通过腹膜内注射三种不同剂量的5种不同菌株感染(见表2)。菌株在含0.1％NAD的CBM培养基中新鲜培养且以0.9％(W/V)的NaCl溶液洗一次且重悬于相同的缓冲液至0.8OD600(相当于约3.109cfu/ml)。然后用相同的缓冲液作10和100倍稀释。每组小鼠腹膜内注射0.5ml的其中一种菌株的一种稀释液。剩余的感染培养物的系列稀释液铺板于含0.1％NAD的CMB平板上且计算感染培养物的真正cfu含量。结果从数据可断定菌株HV211的LD50通过apxIC缺失至少增加20倍。对于菌株4074，单个△apxIC缺失导致10多倍LD50的增加。额外的△apxIIC突变又导致另外9倍的增加，加起来毒性总共至少90倍的降低。结果给于表2中。表2</tables>表2通过apxC基因缺失所致的胸膜肺炎放线杆菌的毒性减弱。菌株MBHPP105为萘啶酮酸和链霉素抗性的血清型10区分离物HV211(serotype10fieldisolateHV211)的衍生物；MBHPP113为源自MBHPP105的apxIC缺失突变体；MBHPP104为萘啶酮酸和链霉素抗性的血清型1参照菌株4074的衍生物；MBHPP111为源自MBHPP104的apxIC缺失突变体；MBHPP147为源自MBHPP111的apxICapxIIC双缺失突变体。用活的MBHPP147作为疫苗保护小鼠免受胸膜肺炎放线杆菌感染用10只小鼠为1组共4组(见表3)。两个组在7周龄时腹膜内注射含1.5108细胞的MBHPP147菌株而被接种。4周后这些小鼠再用类似的注射强化。强化后2周，以腹膜内注射108cfuMBHPP104菌株(毒性的血清型1菌株，MBHPP147衍生于此)感染一个接种过的组和一个未接种过的组。其它两个组以106cfuMBHPP105菌株(一种毒性的血清型10菌株)感染。结果在对照组中所有小鼠死亡而10个接种小鼠中的9个抵御以血清型1菌株MBHPP104(p＝0.0001Fisherexacttest)的同源感染(homologouschallenge)，且10个接种小鼠中的4个被保护免受血清型10菌株MBHP105(p＝0.0433Fisherexacttest)的异源感染(heterolagouschallenge)。菌株MBHPP147可用作提供显著同源和异源保护的活疫苗。结果显示于表3。表3表3以MBHPP147接种后保护小鼠免受毒性血清型1(MBHPP104)和血清型10菌株(MBHPP105)的感染。附图描述图1pApxI-D11的构建(见文中解释)。标出了所用质粒的主要遗传特征及所用的所有限制性位点。以前加入的XhoI和SspI限制位点处标为“X/S”，由Frey等，基因142；97-102(1994)测定的ApxI操纵子的转录起始点标为“tsp”。图2HV211野生型菌株(Wt)，衍生的链霉素和萘啶酮酸抗性菌株MBHPP105(R)，中度整合(I)和最终缺失构建体MBHPP113(D)SspI消化的染色体DNA的Southern印迹分析。为了比较也收入了pApxI-D1(D1)和pApxI-D11(D11)质粒。在左边组，印迹与来自pApxI-D11的1.487KBSalI/SacI片段(含缺失两侧区域)杂交。在中间组，印迹与pApxI-D11载体骨架(分离为5004bp的SalI/SacI片段)杂交。在右边组，印迹与位于apxIC缺失区内的369bp片段(用PCR扩增产生)杂交。图3溶血平板分析。各种菌株用无菌牙签挑到含0.1％NAD和2％羊红血细胞的Columbia琼脂平板上。平板然后于37℃培养8小时。从左至右，为接种的野生型HV211菌株(Wt)，萘啶酮酸及链霉素抗性菌株MBHPP105(R)，插入突变体(I)，缺失突变体MBHPP113(D)、及胸膜肺炎放线杆菌血清型7参照菌株。图4ApxIA和ApxIIA的表达。浓缩的培养物上清液于平行聚丙烯酰胺凝胶上电泳且电印迹至Immobilon-P。得到的印迹在A组中与单-特异性的抗-ApxIA血清反应，且在B组中与单-特异性的抗-ApxIIA血清反应。测试的菌株为HV211(WT)，MBHPP105(R)，质粒整合突变体(I)，MBHPP113(D)和血清型6，5a和5b野生型参照菌株。血清型6野生型参照菌株产生ApxIIA，但不产生ApxIA。图5pApxII-D2的构建。标出所用质粒的主要遗传特征以及所用的所有限制位点。权利要求1)活的减毒的产RTX-毒素的巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科细菌，其特征在于所述的细菌产生非活性形式的RTX-毒素。2)根据权利要求1的活的减毒的产RTX-毒素的细菌，其特征在于其在编码RTX-激活剂蛋白的基因中具有突变。3)根据权利要求1或2的活的减毒的产RTX-毒素的细菌，其特征在于其在控制RTX-激活剂mRNA翻译的区域具有突变。4)根据权利要求1-3的活的减毒的产RTX-毒素的细菌，其特征在于所述的突变为缺失。5)根据权利要求1-4的活的减毒的产RTX-毒素的细菌，其特征在于所述的细菌为胸膜肺炎放线杆菌(Actinobacilluspleuropneumoniae)。6)根据权利要求1-4的活的减毒的产RTX-毒素的细菌，其特征在于所述的细菌为溶血巴斯德氏菌(Pasteurellahaemolytica)。7)保护动物免受产RTX-毒素巴斯德氏菌(Pasteurellaceae)科细菌感染的疫苗，其特征在于所述的疫苗包含根据权利要求1-4的活的减毒的产RTX-毒素的细菌和药物上可接受的载体。8)根据权利要求7的疫苗，其特征在于其包含佐剂。9)根据权利要求7或8的疫苗，其特征在于所述疫苗为冻干形式。10)根据权利要求7-9的疫苗，其特征在于所述的活的减毒的产RTX-毒素的细菌属于胸膜肺炎放线杆菌属(genusActinobacilluspleuropneumoniae)11)根据权利要求10的疫苗，其特征在于其额外包含选自由猪生殖呼吸综合症(PRRS)病毒，假狂犬病毒，猪流感病毒，猪细小病毒，可传播的胃肠炎病毒，旋转病毒，大肠杆菌，Erysipelothrixrhusiopathiae，多杀巴斯德氏菌，支气管炎博德特氏菌，副猪嗜血菌和猪链球菌组成的组的一个或更多个抗原。12)根据权利要求7-9的疫苗，其特征在于所述的活的减毒的产RTX-毒素的细菌属于溶血巴斯德氏菌属(genusPasteurellahaemolytica)。13)根据权利要求12的疫苗，其特征在于其额外包含选自由牛病原体组成的组的一种或多种抗原，所述病原体包括牛旋转病毒、牛病毒性腹泻病毒、副流感3型病毒、牛副粘病毒、口蹄疫病毒、多杀巴斯德氏菌、Haemophilussomus、流产布鲁氏菌、金黄色葡萄球菌、Streptococcusspp.，Mycoplasmaspp.，和牛呼吸多核病毒。14)保护易感动物免受胸膜肺炎放线杆菌感染的方法，所述的方法包括施用根据权利要求10或11的疫苗。15)保护易感动物免受溶血巴斯德氏菌感染的方法，所述的方法包括施用根据权利要求12或13的疫苗。16)产生非活性形式RTX毒素的巴斯德氏菌科活的减毒的产RTX-毒素的细菌的制备方法，其特征在于所述的方法包括在编码RTX-激活剂蛋白的基因中导入突变。17)根据权利要求16的方法，其特征在于所述的突变通过导入缺失而获得。18)保护动物免受巴斯德氏菌科产RTX-毒素的细菌感染之疫苗的制备方法，所述方法包括将根据权利要求1-6的细菌与药学上可接受的载体混合。全文摘要本发明涉及活的减毒的巴斯德氏菌科产RTX－毒素的细菌,其中所说的减毒是由于它们产生非活性形式的RTX毒素。本发明也涉及保护哺乳动物使其免受巴斯德氏菌科产RTX－毒素之细菌感染的疫苗,以及所述活的减毒的细菌及疫苗的制备方法。文档编号A61K39/39GK1173540SQ9711499公开日1998年2月18日申请日期1997年5月30日优先权日1996年5月31日发明者R·P·A·M·塞格斯,J·F·博希·宛·登,J·弗雷申请人:阿克佐诺贝尔公司