专利名称：黑皮素的制作方法
技术领域：
本发明涉及黑皮素(melanocortin)肽领域。
黑皮素(过去也称为促黑激素)是最初来源于命名为阿黑皮原(pro-opiomelanocortin)这样一种较大前体蛋白的肽类。天然黑皮素都具有七肽核心序列Met-Glu-His-Phe-Arg-Trp-Gly。这些黑皮素包括α-MSH(α-促黑激素)，β-MSH，γ-MSH，γ-LPH(γ-促脂解素)和ACTH(促肾上腺皮质激素)。
黑皮素有广泛的生物学活性，很早就知道它们能够刺激色素形成及皮质类固醇的形成，同时也发现它们能够诱导大鼠的过量梳理行为，促进可控的行为规避反应，升高血压及加快心率，加速神经重建和调节免疫反应。就在最近，鉴定和克隆了黑皮素的5种神经肽受体。这些受体在不同的组织类型中具有不同的分布形式(在空间上以及丰度上)。它们属于所谓的G-蛋白偶联受体家族。黑皮素受体1(MCR-1)在黑色素细胞中表达，然而MCR-2是在诸如肾上腺中表达的促肾上腺皮质激素受体。已经发现黑皮素受体3、4和5表达于中枢神经系统。与这些受体相关的配体具有极大的神经药理学作用，例如使唤起、运动、注意力、记忆和学习变得容易。这些配体也与食物激发的行为有关。此外还发现它们与解热活性有关。
已制备了许多不同的(合成的)黑皮素类似物，并建议用于激活或阻抑一种或多种黑皮素受体。已揭示这种激动性或拮抗性作用可用于涉及色素形成、神经重建等方面的应用中。然而，迄今为止研究的黑皮素均缺乏对神经系统所表达受体的专一性(选择性)，和/或缺乏足够的结合亲和性或诱导受体介导之反应或阻碍所述反应的能力。通常期望一种靶向MC-受体的药物能够高度有效、可以口服、能适度抵抗体内的降解(具有足够的半衰期)并能够通过血脑屏障。
本发明提供了符合这些结构要求、基本上可用作MC受体特异性药物的肽或肽样结构。
这样，本发明提供了对黑皮素受体，尤其是对mc3、mc4或mc5受体具有特异性结合亲和力的肽，其包含下列序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)其中，X和Y是氨基酸残基，Z是一个芳香族氨基酸残基。
根据本发明，上述肽是高度有效的MSH活性激动剂。达到这种高效力的原因可归因于第7位(按原始ACTH分子的位置计)，这一位置应是D-2-噻吩基-Ala或3-吡啶基-D-Ala，并且对该位置，只能替换成非常有限和非常相似的残基才不至于影响激动剂效力的提高。MSH激动剂活性的另一重要原因是残基1-3和/或残基11-13的去除。第9位芳香族氨基酸的存在也对活性贡献很大。第4和5位正常情况下不可以去除；这些残基应该存在，尽管在所述位置存在哪种氨基酸残基远不那么关键。已经清楚，在这些位置至少可以允许进行保守的替换，并且不太保守的替换一般也不会导致效力的显著丧失。第6位的组氨酸残基和第8位的精氨酸残基对活性非常重要，如果能够进行替换的话，那也只能进行保守的替换。特别是，在同一分子内，更重要的残基一般不应该全部被替换。第9位的优选残基是Naftyl-alanine，既可以是D构象，也可以是L构象。
这个残基的存在导致效力进一步提高。
第10位氨基酸残基对该分子的活性不是必需的，但它确实有一些影响。如果存在残基的话，那么优选的是甘氨酸或赖氨酸，其中后者有另外的优点，即可以提供反应活性部分，所述部分可以用于将该肽与其它分子偶联或使该肽环化。如果要形成环形肽(这比较优选，因为这种环形肽的半衰期比线性形式有了提高)，那么在另一端也应该提供反应活性部分。环形肽另一个优点是它们倾向于对MC受体有更高的选择性，特别是二硫桥可提高对MC-4受体的选择性。然而，也可以通过在基本核心之外提供可使环闭合的反应活性部分(例如导致形成内酰胺的反应活性部分)而产生环形肽。
在位置X和Y(指在原始ACTH核心中第4和5位)最理想的残基，X位置是Nle，Y位置是甘氨酸或天冬氨酸，其中天冬氨酸的存在还有其它优点，即具有产生内酰胺的反应活性部分。
本发明的肽一般比MSH本身更有效。优选肽的效力比MSH要高达100倍。本发明也包括一些效力较低的肽，因为效力并不是以肽为基础的有效药物必须符合的唯一标准。如上面已经提到，半衰期和选择性也是重要参数。
确定肽效力的试验是常规的体外试验，以及在大鼠中衡量梳理行为的体内实验。梳理实验的结果很好地显示出诸肽能够激活受体，并且由此激活与所述受体偶联的G蛋白级联，因此，这些肽能够用作MC受体的激动剂。本发明提供了对MC受体特别具有选择性的肽，以激动剂的方式靶向MC受体、特别是MC-4受体可以用于治疗中枢神经系统失调，各种神经病，肥胖症，特别是与神经病有关的糖尿病，以及由细胞毒性治疗(化学治疗法等)引起的神经病。
因此，本发明也提供了能够治疗上述病情的药物组合物。用于这种治疗的剂量通常是每日给药一次，用量为每剂量单位约1μg-100mg，优选10μg-10mg，更优选50μg-1mg。该剂量应能使得体内浓度可达0.1nM-1μM，优选1nM-100nM，更优选10-50nM。组合物中可含有用于肽药物或肽衍生药物常规剂型的常规添加剂。这种剂型优选是口服剂型，如片剂、粒剂、粉剂或液体剂型，虽然也可以应用肠内和胃肠外施用方式。特别优选的是这样的组合物，其中本发明的肽与旨在预防或可导致神经病的药物(如胰岛素和细胞毒性剂)一起合并使用。
本发明将在下面的试验部分作详细解释。
实验材料与方法黑皮素配体的受体活性通过磷酸钙沉淀方法，用人MC3(Gantz等，JBC 1993.2688246-8250)、人MC4(Gantz等JBC 1993.26815174015179)或人MC5受体构建体稳定地转染了人胚肾(HEK293)细胞。在每一个实验的开始时，用pCRE-LacZ载体10μg(Chen等，1995，生化分析226349-354)进行转染，充当报告质粒，该载体中LacZ基因的表达由一个cAMP响应性元件驱动。在pCRE-LacZ转化后第二天，将细胞分离到96孔板上。48小时后，用测试培养基(DMEM+0.1mg/ml BSA，0.1mM IBMX)中的不同浓度MC受体配体刺激细胞6小时。在裂解缓冲液中经一轮冻融裂解细胞，加入底物缓冲液(60mM磷酸钠，1mM氯化镁，5mM β-巯基乙醇，200μg/ml ONPG)，然后将细胞在37℃培养1小时。利用如Chen等所述的显色测定法，在小平板读数仪(Biorad Model 3500)中，于405nm检测因受体激活所引起的cAMP信号转导通路激活情况。
动物，插管植入，脑室内注射在深度麻醉状态下，将插管植入体重为120-130g的雄Wistar大鼠的脑室内孔中(Brakkee等，生命科学，第17卷，1979)。使大鼠恢复3天，再用于接下来的10天实验中。如果大鼠被用于多次梳理实验中，那么它们应在连续的实验之间恢复至少三天。用Hamilton注射器，对溶于3μg盐溶液(154mM氯化钠)中的肽(15ng)进行脑室内注射。按照Gispen等(实验动物科学(Lab.Anim.Sci.)，29，1975)的方法进行梳理实验。注射后立即将大鼠置于观察盒内。在注射15分钟后开始观察，并持续50分钟。在50分钟的时间内，每15秒对梳理行为进行评分，这样得到的大鼠梳理行为最高分为200。
肽的合成肽的纯化利用配备了Waters RCM组件的Waters Prep 4000液体层析系统进行制备性HPLC，所述组件带有两个PrepPak柱和quard柱(25×210mm)，内装Delta-Pak C18材料。在制备性小室中利用Waters 486分光光度计在230nm处检测肽。用含0.1％三氟乙酸(TFA)的水和含0.1％TFA的乙腈进行梯度纯化。
α-MSH肽的合成和环化方法复肽的合成我们用Hamilton Microlab 2200同时合成了多达40种肽，合成水平为30μmol。将Hamilton Microlab 2200的程序设置为将洗涤溶剂和反应试剂送递到带有40个独立的具滤膜的4ml柱的架子上，柱中含有Rink(4-(2’，4’-二甲氧基苯基-Fmoc-氨甲基)-苯氧基)树脂用于肽合成。柱子在每一步骤后都自动真空抽干。依据Fmoc/HBTU(2-(1H-苯并三唑-1-基)-1，1，3，3-四甲基脲六氟磷酸)化学[Fields等，肽研究4，95-101]进行偶联循环，双偶联步骤为40分钟。利用1.5ml的三氟乙酸/苯酚/苯硫基甲烷/水/乙二硫醇(10/0.75/0.5/0.5/0.25)混合物，在2小时内使肽去保护并裂解，然后加入己烷/二乙醚1/1沉淀2次。沉淀物干燥，并从水/乙腈中冻干。
肽的环化利用经HPLC纯化的肽或粗提的肽，通过半胱氨酸间的二硫桥或通过天冬氨酸和赖氨酸侧链间的内酰胺桥进行环化A.二硫桥将粗制MBJ06(40mg)溶于40ml的0.5％碳酸氢铵溶液(pH8)中，搅拌过夜。24小时后，用Ellman’s试剂检测不到游离巯基，向其中加入0.5ml乙酸后再冻干产物。将肽溶于3ml的40％乙酸中，再通过30分钟内梯度为14％至20％乙腈水溶液(包含0.1％TFA)的制备性HPLC纯化肽。纯化后的产率为22.8mg。
B.内酰胺桥将20ml DMF(肽级)，26mg苯并三唑-1-基-氧-三吡咯烷鏻六氟磷酸盐(PyBOP，0.05mmol)和0.017mlDIEA(0.1mmol)的混合物加入粗制MBJ07(20mg，0.012mmol)中。环化反应后进行分析HPLC。2小时后，用0.1M HCl将混合物酸化至pH4。产物用30ml水稀释后，通过30分钟内梯度为21％至30％乙腈水溶液(包含0.1％TFA)的制备性HPLC进行纯化。产率为15.4mg。
结果通过PEPSCAN对产生的MSH肽进行的筛选表明有几个氨基酸可以提高MSH效力。MSH肽中第7位的D-2-噻吩基-Ala和3-吡啶基-D-Ala对于提高MSH的效力作用最大。第9位的Naftyl-Ala也提高了MSH效力(
图1b)。第1-3位和第11-13位的删除进一步提高了MSH活性。图1显示了下列肽的剂量-反应曲线MBU 23*2GH6R7G# 线性MBU 24*2GH6R8G# 线性MBU 27*CGH6R8C# 环形二硫桥MBU 28*2DH6R8K# 环形内酰胺MBU 29*2DH6R7K 环形内酰胺*乙酰基 #carboxamid 2＝正亮氨酸 6＝D-噻吩基，7＝2-naftyl-L-丙氨酸，8＝2-naftyl-D-丙氨酸第4和5位可能不太关键(图3和4)。
在第9位高度优选芳香族氨基酸(F，W，Y)(图2)。图3至9分别表示在Nle-MSH第4-10位进行不同氨基酸替换的效果。
图6显示，脑室内注射后，这些肽诱导梳理行为的活性。MSH可以诱导过量梳理行为的最低剂量为1500ng。此处所测试的5种化合物在体内比MSH的效力高100倍。表1在三个不同的细胞系中计算的EC50值hMC3 hMC4 hMC5MBU23 5.510-95.510-9n.d.
MBU24 3.010-91.310-84.810-8MBU27 1.310-76.010-92.510-6MBU28 6.310-71.710-84.510-8MBU29 1.410-91.510-82.310-8α-MSH1.410-82.610-83.010-8图注图1.不同的MSH肽在稳定表达人MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞中的剂量响应曲线。MBU27显示对MC4受体具有特异性。MBU23是所有三种受体的有效配体。
图1b.第7和9位的不同氨基酸以及MBU23和MBU24的影响。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。各值表示相比于100nM NDP-MSH最大活性的活性百分比。
图2.在NDP-MSH第9位氨基酸进行单个氨基酸替代的效果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Trp)的各个氨基酸。各值表示相比于10nMα-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在10nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。在NDP-MSH背景下，此位置高度优选芳族氨基酸。
图3.在Nle-MSH第4位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Met)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图4.在Nle-MSH第5位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Glu)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图5.在Nle-MSH第6位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(His)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图6.在Nle-MSH第7位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Phe)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图7.在Nle-MSH第8位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Arg)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。只检测了5种氨基酸替换。
图8.在Nle-MSH第9位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Trp)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图9.在Nle-MSH第10位氨基酸进行的单个氨基酸替代的结果。X轴上绘出的是取代内源氨基酸(Gly)的各个氨基酸。各值表示相比于100nM α-MSH最大活性的百分比活性。所有肽都是在100nM的浓度下对稳定表达三种不同MC受体MC3、MC4和MC5受体的HEK293细胞进行检测。
图10.
肽诱导的梳理行为将3μl盐溶液，或者3μl盐溶液与15ng MBU肽或150ng α-MSH或1500ng α-MSH一起脑室内注射到大鼠中，并且对梳理行为进行评分(平均值±s.d.)。
权利要求
1.一种对黑皮素受体、优选MC3或MC4或MC5受体具有特异结合亲和性的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)其中X和Y是氨基酸残基，且Z是一个芳族氨基酸残基。
2.根据权利要求1的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(2-naftyl-Ala)或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(2-naftyl-Ala)其中X和Y如权利要求1中的定义。
3.根据权利要求1或2的肽，其包括序列X-Y-His-(D-2-噻吩基-Ala)-Arg-(Z)-Z2或X-Y-His-(3-吡啶基-D-Ala)-Arg-(Z)-Z2其中X、Y和Z如权利要求1或2中的定义，Z2是一个氨基酸残基。
4.根据权利要求3的肽，其中Z2是甘氨酸或赖氨酸。
5.根据上述任何一项权利要求的肽，其中Y是甘氨酸或天冬氨酸。
6.根据上述任何一项权利要求的肽，其中X是Nle。
7.根据上述任何一项权利要求的肽，其是环形的。
8.根据权利要求7的肽，其中环形肽是通过形成二硫桥产生的。
9.根据权利要求7的肽，其中环形肽是通过形成内酰胺产生的。
10.含有上述任何一项权利要求的肽的药物组合物。
11.根据权利要求10的组合物，其进一步包含胰岛素或其功能等同物。
12.根据权利要求10的组合物，其进一步包含细胞毒性剂。
全文摘要
本发明提供了衍生自包括ACTH在内的一组激素中的一些新型肽。这些命名为黑皮素的肽可以靶向在数种组织中分布常各异的不同受体。本发明的肽可用于以激动剂方式靶向神经系统中的受体。也公开了一些药物组合物以及它们的用途。
文档编号A61P5/38GK1246868SQ97181332
公开日2000年3月8日 申请日期1997年12月17日 优先权日1996年12月17日
发明者R·A·H·阿丹, J·P·H·布巴奇, W·H·吉斯佩 申请人:扇形支撑剑桥有限公司