专利名称：用于下调免疫系统th2活性的母牛分枝杆菌的制作方法
技术领域：
本发明是关于对以免疫系统活性从Th1活性向Th2活性转移为特征的疾病的治疗。在惊人的发现中观察到，母牛分枝杆菌(Mycobacteriumvaccae)制剂能够引起非特异性的全身性Th1偏移，特别是通过下调Th2活性但不伴随上调Th1活性而起作用。可应用本发明治疗的疾病包括慢性疲劳综合征，海湾战争综合征和总体过敏反应综合征(TotalAllergy Syndrome)。
慢性疲劳综合征(CFS)(Turnberg et al)病人可能具有较高的变态反应性征侯发病率，二倍数量的皮肤过敏性反应，以及NK细胞活性降低，IFNγ和IL-2减少(Streus，1996)。某些病人具有对EB病毒的高抗体水平，这也是Th1活性降低的病人的特征。他们还具有情绪改变和抑郁症。这些特征都与细胞因子分布状态中Th1向Th2的转换相一致。这种偏移可能是由于现代生活方式的结果，这种生活方式使人们不能暴露于足够的Th1-诱导性刺激，而倾向于较多地暴露于Th2诱导性免疫接种和过敏原。
本发明者相信，海湾战争综合征代表一种特殊情况下的CFS，其中可发现Th2-诱导性刺激，因为海湾战争人员都接受了多种Th2-诱导性疫苗接种。疫苗接种或感染可发挥全身性作用，非特异性地增强或减弱对其它无关抗原反应的Th1/Th2细胞因子平衡(Shaheen et al.，1996，Shirakawa et al.，1996)，并可影响(积极地或消极地)不相关疾病的存活率(Aaby，1996，Aaby et al.，1995)。根据这种免疫接种方案的如下四个特点，可证实本发明者关于用于海湾的这些免疫接种诱导了全身性Th2转换的观点(i)对在海湾的英国军队使用了百日咳杆菌(Pertussis)作佐剂，它的佐剂性具有很强的Th2作用(Mu & Sewell，1993，Ramiya et al.，1996，Smit et al.，1996)。
(ii)对海湾战争军队给予了抗鼠疫、炭疽、伤寒、破伤风和霍乱的Th2-诱导性免疫原。而且，这样大量的抗原负荷有可能诱发对Th2的反应(Aaby，1995，Bretscher et al.，1992，Hernandez-Pando & Rook，1994)。
(iii)是在军队在海湾地区部署之后，或者刚刚被运输到这里之前给予这些疫苗接种，这时人体应激水平已经提高了。在有高水平糖皮质激素(即皮质醇)存在下的免疫接种，可诱发对Th2的反应(Bernton et al.，1995，Brinkmann & Kristofic，1995，Ramirez et al.，1996)。
(iv)军队还曾暴露于氨基甲酸酯和有机磷杀虫剂的环境中，这些杀虫剂可抑制对于正常Th1功能所必需的IL-2诱导的征侯(Casale etal.，1993)。对于这种因素的重要性尚不确切。但是已有传闻，这些杀虫剂常常是从海湾当地的来源获得的，因此对其纯度不了解，甚至有可能存在较毒性的污染物。
因此，在这种环境下给予的多种疫苗接种，可能已经引起了全身性长时间持续的细胞因子不平衡。由于疫苗接种或其它Th2-诱发性环境刺激和感染，在一般人群中也偶尔发生相同的作用，这可以解释慢性疲劳综合征广泛发病的原因。
下面将对这些观点作更详细的说明。
本发明者已作出了惊人的发现(被杀死的)母牛分枝杆菌制剂能够以非特异性方式，强有力地纠正全身性Th1＞Th2偏移。这种作用是以某种方式使免疫系统活性偏移远离Th2，这种方式包括对在所注射的母牛分枝杆菌制剂中不存在的抗原的免疫反应。
已通过动物模型和人体实验证明了这点。代表性实验将在下面的详述中描述。特别是它们惊奇地显示出Th2活性的下调，而且可以不伴随Th1活性的上调。
简单地说，对于实验动物给予母牛分枝杆菌时，可观察到远离Th2活性的全身性非特异偏移，表现为在预先免疫以便建立Th2反应的小鼠对卵清蛋白(一种与母牛分枝杆菌本身无关的过敏原)的IL-4(Th2)依赖性抗体应答的滴度下降。单次注射母牛分枝杆菌就能引起这种作用，进一步注射可使之加强。此作用是非特异性的，因为不需要在所注射的制剂中存在任何卵清蛋白成分。
对于人(癌症病人)，通过如下方式证明了这种作用以佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯和钙离子载体刺激后，在外周血中出现能自动分泌IL-2(一种特征性Th1细胞因子)的淋巴细胞，以及分泌IL-4(一种特征性Th2细胞因子)的T细胞减少了。在每次连续注射母牛分枝杆菌之后，显示这种激活Th1表型的淋巴细胞百分数逐渐增加，在许多病人3-5次注射109个细菌后(0天，15天，30天，然后每月一次)达到高峰值。
此外，下面还有报告表明，对患有慢性疲劳综合征的病人给予母牛分枝杆菌制剂，获得了有益的效果。
本发明者以前曾公开过将母牛分枝杆菌用于治疗结核病(GB-A-2156673)，癌症(ZA 95/2644)，HIV感染(WO 94/06466)，以及慢性炎症(GB-B-2252044)。WO 92/08488(也是出自本发明者)公开了它作为佐剂用于同所需抗原一起给药的用途，显示出对此抗原反应的T-细胞成分从Th2型式转变成Th1型式。在WO 92/08488中并未提示母牛分枝杆菌可引起免疫系统活性的非特异性Th2/Th1转移，这是一种不同于，在针对母牛分枝杆菌所给予的抗原的特异性反应中的转移。而且在WO 92/08488中和在别处，都没有提示它能下调Th2活性，而不伴随上调Th1活性。
关于母牛分枝杆菌作为Th1佐剂的综述包括Abou-Zeid et al(1997)，Skinner et al(1997a)，和Skinner et al(1997b)。也可参阅Mosmann and Sad(1996)，此文述评了Th1细胞因子的下调对Th2细胞增殖有抑制作用。
概括地说，本发明是关于对病人下调免疫系统Th2活性，而不上调Th1活性，特别是在治疗以免疫系统活性从Th1向Th2转移为特征的疾病中，在此下调Th2活性而不伴随上调Th1活性，对治疗特别有益。
本发明的一个方面是提供了一种治疗病人的方法，此方法包括对病人给予母牛分枝杆菌的抗原物质和/或免疫调节物质。
本发明进一步提供了将母牛分枝杆菌的抗原物质和/或免疫调节物质，用于制备对病人治疗的药物中的用途。
本发明的另一方面提供了一种用于治疗病人的物质或组合物，此物质或组合物包括母牛分枝杆菌的抗原物质和/或免疫调节物质。
优选的是，所提供的母牛分枝杆菌制剂不含有任何额外的(“外来的”)抗原，免疫原，或过敏原。
可被治疗疾病的特征是，病人免疫系统存在从Th1活性向Th2活性的总体非特异性偏移。可根据病人IL-2生成减少或者TL-4或IL-5生成增加，或者通过检测作为Th2代表性细胞因子的IL-13，和作为Th1代表性细胞因子的γ-干扰素(IFNγ)，对此疾病进行评价或诊断。还可以考虑其它Th1/Th2细胞因子。认为免疫系统从Th1活性向Th2活性的非特异性转移，可能不是由于或者起因于病人暴露于特殊的抗原，或被特殊病原体感染。被治疗的病人可能不患有结核病或其它分枝杆菌感染。可按照本发明治疗的特殊疾病包括慢性疲劳综合征，海湾战争综合征和总体性过敏综合征(Straus，1996)。可按照本发明治疗的其它疾病是下调Th2活性而不上调Th1活性对其治疗有益的疾病。
对慢性疲劳综合征的可操作性定义，可采用例如所谓的1994 CDC标准(Fukuda et al.)，或者所谓的牛津标准(Sharpe et al.)。关于慢性疲劳综合征的现有知识在Turnberg et al的论文中(1996年10月发表)有综述和讨论。
母牛分枝杆菌物质可以是，或者包含母牛分枝杆菌的死细胞。这种细胞可以用辐射法，化学法或其它任何方法杀死，例如用钴60以2.5兆拉德的剂量照射，但优选的方法是高压灭菌，例如在69kPa压力，115℃-125℃下处理10分钟。高压灭菌可产生比辐射法更有效的制剂。
在杀死母牛分枝杆菌细胞之前，可在适当的固体培养基上对其细胞进行培养。优选的可以是改良的Sauton′s液体培养基(Boyden et al.)，以最好是1.3％的琼脂固化。一般在32℃好氧培养10天之后收获此微生物，然后称重，在稀释剂中作成悬液，准备用于给药。如果需要，使用前可贮存于4℃。
稀释剂可以是无热原的未缓冲生理盐水。优选的稀释剂是硼酸缓冲的，并最好含有表面活性剂如Tween 80。适合的硼酸缓冲液是Na2B4O7·10H2O-3.63g，H3BO3-5.25g，NaCl-6.19g，Tween800.0005％，用蒸馏水稀释至1升。这种稀释剂是可药用的。
通过给予母牛分枝杆菌的GMP制剂SRL 172，获得了上述对人的治疗结果，此制剂经过食品药品管理局(FDA)IND的和英国药品管理署(Medicines Control Agency)CTX的几次审查，获准可对人使用。由Huntingdon Research完成了GLP急性毒理学试验。已在美国获得第一期和第二期安全评价资料，并已提交给FDA。在第三期试验中SRL 172是用于结核病免疫治疗。SRL 172被优选地用于本发明。
SRL 172是从称为R877R的菌株得到的母牛分枝杆菌制剂，根据布达佩斯条约，此菌株于1984年2月13日保藏于联合王国ColmdaleAvenue，London NW 9 5HT的公共卫生中心实验室，国立典型培养物保藏中心(NCTC)，保藏号为NCTC 11659。R877R最初是从乌干达中部Lango区的泥土样品中被分离出(Stanford and Paul)。
可使用其它的母牛分枝杆菌菌株代替SRL 172。借助于生物化学和抗原的判断标准，可鉴别属于母牛分枝杆菌的微生物(Bonicke et al.)。
对于本发明优选的是，用于给药的母牛分枝杆菌物质不含有，或者基本不含有非母牛分枝杆菌抗原物质或免疫调节物质。换句话说，用于给药的这种药剂或组合物包含，或者基本上由母牛分枝杆菌抗原物质和/或免疫调节物质组成，例如死亡的细胞，其提取物或衍生物，以及可药用的稀释剂。
优选地是以“治疗有效剂量”给药，这是足以对病人显出疗效的剂量。这种疗效是至少使其中一种症状有改善。实际给药剂量，给药的频率和时间进程将取次于被治疗疾病的特点和严重程度。治疗的处方，如确定剂量等等，应该是一般专业人员和其它医生的责任。
单一剂量给药(给予死细胞)通常含有107-1010个杀死的母牛分枝杆菌菌体。可以对病人一次给予108-109个杀死的母牛分枝杆菌，虽然需要时可重复给药，例如间隔2周至6个月。
此组合物可以单独给药，或者同其它治疗剂联合给药，同时给予或顺序给予，取决于所治疗的状况。
本发明的药物组合物，为了用于本发明，除了活性成分之外，还可能包括本领域技术人员熟知的可药用的赋形剂，载体，缓冲剂，稳定剂或其它物质。这些物质应该是没有毒性的，并应该不会干扰活性成分的效果。载体或其它物质的确切性质将取决于给药的途径，优选地是通过注射途径，如皮肤、皮下或皮内注射。
用于注射，可使活性成分形成注射给药可接受的水溶液形式，不含热原物质；并且有适当的pH，等渗性和稳定性。对于可药用的优选的适当稀释剂，上面已有论述。
也可采用口服给药，这种情况下，该药物组合物可以是片剂，胶囊剂，粉末剂或液体剂形式。片剂可包含固体载体如明胶，或一种佐剂。液体药物组合物一般包含液体载体如水，石油，动物油或植物油，矿物油或者合成油。还可能含有生理盐水液，葡萄糖或其它糖类溶液，或者二元醇溶液如乙二醇，丙二醇或聚乙二醇。
还可以通过气雾剂将母牛分枝杆菌对呼吸道给药，采用适当的剂型，例如包括其大小能通过呼吸道适当部分的颗粒剂。这种剂型可能是干粉末而不是水悬液。
可使用来自母牛分枝杆菌的物质代替杀死的细胞，特别是具有必要活性的提取物或合成分子。
如前面已简单地论述过的，对于海湾战争退伍军人，多种疫苗接种，应激状态和其它一些因素，可能已经引起了长时间持续的全身性细胞因子不平衡。由于疫苗接种或其它Th2诱导性环境刺激，以及感染，同样的作用可能散在地发生在一般群体中，这可以解释慢性疲劳综合征广泛发病率的原因。
强有力的免疫原对无关抗原免疫反应的性质，可以具有全身性长时间持续的非特异性作用。例如麻疹感染可减少特异反应性发病率和对室内粉尘螨过敏性反应的发病率(Shaheen et al，1996)。类似的情况是，结核菌素皮肤试验阳性的日本儿童与结核菌素阴性的儿童相比较，前者很可能较少具有特异反应性，并且他们的循环Th1/Th2细胞因子比率也较高。而且，重复注射BCG之后，对于出现结核菌素转变的儿童，他们的特异反应性症状消失的机率增加了(Shirakawa et al，1996)。
麻疹疫苗接种是另一个例子。这种疫苗当以标准剂量使用时，与未接种疫苗的人群相比较，相当多地降低了死亡率，可用麻疹的发病率下降来解释。白喉，破伤风和百日咳疫苗(Th2-诱导性的)不表现出这种非特异性保护作用(Aaby et al，1995)。但是，当使用高滴度麻疹疫苗时，死亡率增加了，虽然对麻疹本身的保护作用仍然存在(Aaby，1995，Aaby et al，1995)。有证据表明，这种死亡率增加伴有向Th2的转换，并且对于其它几种免疫原已明确地证实，具有剂量相关的增加对Th2成分的诱导作用(Bretscher et al，1992，Hernander-Pando& Rook，1994)。用于海湾的疫苗是Th2-诱导性的(鼠疫，炭疽，伤寒，破伤风，霍乱)，并累积性地构成了一个大的抗原负荷，又进一步促进了Th2。而且，通过使用百日咳疫苗作佐剂，这种趋势将会增加，因为它是一种强有力的Th2诱导剂(Mu & Swell，1993，Ramiye etal，1996，Smit et al，1996)。百日咳疫苗的这种特性，目前已导致人们探讨如下的可能性它对儿童的使用可能会促进同时增加特异性反应性的发生(Nilsson et al，1996，Odent et al，1994)。
通过对应激状态继发性的内分泌因素，这些疫苗驱动全身性Th2反应的内在趋势将会大大增强，海湾战争的人员在疫苗接种时就暴露于这种应激状态。
几种类固醇激素能调节T细胞的反应。脱氢表雄甾酮(DHEA)或者其未知的代谢产物，倾向于促进Th1模式。这种DHEA能恢复年老小鼠的免疫功能，并且在年老动物观察到，它能纠正调节异常的细胞因子释放(Daynes et al，1993，Garg & Bondade，1993)。对老年人也检测到类似的特点(Moreles et al，1994)。它能促进产生Th1细胞因子如IL-2和IFNγ(Daynes & Araneo，1989，Daynes et al.，1990，Daynes et al.，1995，Daynes et al.，1991)。DHEA还能促进人外周血T细胞分泌IL-2(Suzuki et al，1991)。
DHEA的这些作用与糖皮质激素如皮质醇的作用相反，皮质醇提高Th2活性，并与Th2细胞因子有协同作用(Fischer & Konig，1991，Guida et al，1994，Padgett et al.，1995，Wu et al.，1991)。如果存在非特异性刺激时(Brinkmann & Kristofic，1995)“幼稚”T淋巴细胞的增殖被驱动，或者被抗原驱动(如疫苗接种法)那么将形成具有Th2细胞因子模式的T淋巴细胞。已用来自“清洁的”实验室啮齿动物的脾细胞相当清楚地显示了这点，这种动物在正常环境下几乎没有记忆细胞(Ramirez et al.，1996)。
总的“深层线索”(“bottom line”)是，皮质醇有助于从幼稚的细胞发展Th2细胞因子模式(Brinkmann & Kristofic，1995)。这点必须与如下事实区分开已确立的Th2细胞分泌细胞因子的活性易受皮质醇抑制。因此，以皮质醇类似物用于常规治疗Th2-介导的疾病如湿疹，哮喘和枯草热，可能是通过抗炎症作用，并且通过减少Th2细胞产生细胞因子而发挥功能(Corrigan et al，1995)，可是，当使用皮质醇时，通过驱动新补充的T细胞向Th2偏移，又将促使根本问题依然存在。
心理的和物理的应激状态可激活下丘脑-垂体-肾上腺轴，因而导致包括增加皮质醇分泌在内的多种改变。过度的运动和缺乏饮食和睡眠导致降低了DHEA对皮质醇的比率(DHEA/皮质醇之比)。这与迟发型过敏反应性降低(一种Th1的标志)直接相关，并且同时出现血清IgE水平升高。IgE完全依赖于Th2细胞因子的产生(Bernton et al，1995)。根据上面简述的DHEA和皮质醇的已知作用可预料到这点。
应激状态对Th1-＞Th2转换作用的另一个例子是，以应激方式对考试显示反应的学生，对EB病毒的抗体增加了。这种病毒通常是由Th1反应和胞毒T细胞控制，失去控制将导致病毒复制和抗体增加(Zwilling，1992)。类似的情况是，考试期间的医学院学生，外周血白细胞显示出较低的IFNγ，一种Th1细胞因子的mRNA水平(Glaseret al，1993)。
以对动物更多控制的方式可证明类似的观点。由于拥挤或限制活动而引起的应激反应可促进小鼠结核性结节中分枝杆菌的生长(Brown etal，1993，Tobach & Bloch，1956)。这是一种对甚至存在少量Th2成分都极度灵敏的动物模型(Rook & Hernandez-Pando，1996)。还论述了其它一些例子(Moynihan，1994)。
有相当多的证据表明，抑郁症与脑中过度的皮质醇介导性作用有关(在Raven et al.，1996中有述评)，应激状态可导致抑郁症。因此，抑郁症(如在CFS和GWS病人所见到的)倾向于与Th2介导的疾病如哮喘，湿疹同时存在，并且某些内分泌改变是Th2病症和抑郁症共有的(Holsboer et al.，1984，Rupprecht et al.，1995)。
在结核病病人，存在全身性Th2偏移(Rook & Hernandez-Pando，1996)，并有异常形式的肾上腺类固醇代谢产物排泄于尿中(Rook et al.，1996)。因此相对于可的松的代谢产物，皮质醇的代谢产物增加了。对疾病的治疗可恢复Th1的优势，并可纠正类固醇代谢产物的类型，使相对于皮质醇的代谢产物，可的松的代谢产物增加了(Rook et al，1996)。用药物美替拉酮治疗抑郁症，对类固醇的代谢产物引起了同样的改变(例如相对于皮质醇的代谢产物，17-羟-11脱氢皮质甾酮的代谢产物增加了)(Raven et al，1995)。母牛分枝杆菌制剂SRL 172对结核病的免疫治疗是有效的。
如前面所述，疫苗接种可诱导全身Th1/Th2平衡的非特异性改变，以及通常所寻求的抗原特异性免疫作用。为了恢复正常健康个体特征性的Th1高于Th2的优势，对CFS的治疗可能需要诱导全身非特异性Th1偏移。这同海湾人员所接受的疫苗接种可能已诱导的偏移正好相反。
现在在此提供的实验证据惊人地表明，母牛分枝杆菌制剂可以使这种可能见于海湾战争退伍军人的有害的Th1向Th2偏移减弱。
现在将非限制性地根据实验实施例和如下附图对本发明进行说明
图1显示小鼠首次以卵清蛋白免疫接种后，在不同天血清总IgE(ng/ml±SD)的改变，被计算成相对于第46天的值。小园圈代表接受母牛分枝杆菌的小鼠，小方块代表盐水对照动物。为方便起见，标明了以卵清蛋白免疫接种和给予母牛分枝杆菌或生理盐水的时间(天)。
图2显示对IL-5(pg/ml±SD)的测定结果，此IL-5是从取自卵清蛋白刺激小鼠的脾细胞在体外释放的。所采用测定方法的最小检测浓度为15.6pg/ml。
图3显示预先用OVA(卵清蛋白)免疫的BALB/c小鼠，以皮下注射生理盐水(●)治疗同注射107母牛分枝杆菌制剂(○)治疗相比较，对血清总IgE(ng/ml)的影响。(图3A)107未修饰的母牛分枝杆菌(Mv)，(图3B)OVA偶联的母牛分枝杆菌(Mv-OVA)，或(图3C)NaCl洗和过碘酸处理的对照母牛分枝杆菌(NaCl-Mv)。数据表示为相对于第46天取样所得到读数的改变值±SD。图上标明了免疫接种和治疗的程序。(OVA以在IFA中的50mg OVA免疫接种)。
图4显示预先用OVA免疫的BALB/c小鼠，以皮下注射生理盐水(●)治疗同注射107个母牛分枝杆菌制剂(○)治疗相比较，对OVA-特异性IgE的影响。(图4A)未修饰的母牛分枝杆菌(Mv)(O.D.405nm)，(图4B)OVA结合的母牛分枝杆菌(Mv-OVA)(O.D.405nm)，或(图4C)NaCl洗和过碘酸处理的对照母牛分枝杆菌(NaCl-Mv)(ng/ml)。数据表示为相对于第46天取样所得到读数的改变值±SD。图上标明了免疫接种和治疗的程序。
图5显示与OVA共同培养的脾细胞IL-2的产生。脾是从经如下处理的小鼠在第109天获得在0天和24天用OVA先免疫小鼠，在53天和81天以生理盐水，107未修饰的母牛分枝杆菌(Mv)，OVA偶联的母牛分枝杆菌(Mv-OVA)，或者相应的对照，NaCl洗和过碘酸处理的对照母牛分枝杆菌(NaCl-Mv)治疗小鼠。培养24小时之后，收集培养上清液测定IL-2。数据表示为此细胞因子的平均水平±SD(pg/ml)。
图6显示与OVA共同培养的脾细胞IL-5的产生。脾是从经如下处理的小鼠在109天获得在0天和24天先用OVA免疫小鼠，在53天和81天以生理盐水，107未修饰的母牛分枝杆菌(Mv)，OVA偶联的母牛分枝杆菌(Mv-OVA)，或者相应的对照NaCl洗和过碘酸处理的母牛分枝杆菌(NaCl-Mv)治疗小鼠。培养48小时之后收集培养上清液测定IL-5。数据表示为IL-5的平均水平±SD(pg/ml)。
图7显示预先用OVA免疫的BALB/c小鼠，以皮下单次注射不同剂量母牛分枝杆菌治疗同注射生理盐水相比较，对血清IgE水平的影响。血清IgE表示为相对于在32天，以母牛分枝杆菌或生理盐水治疗之前取样所得到读数的改变值(平均值±SE)。在第52天和70天采集治疗后的血清样品(即在第42天以生理盐水或母牛分枝杆菌治疗后10天和28天)。在实验方法中标明了免疫接种和治疗的程序。通过Mann-WhitneyU-检验进行不同组间的统计学比较。
图8显示与OVA共同培养的脾细胞IL-2(图8A)和IL-4(图8B)的产生。先对BALB/c小鼠给予二次OVA，然后给予不同剂量的母牛分枝杆菌107，108，或109(pg/ml)。在第82天获得脾细胞并与OVA共同培养。实验方法中标明了免疫接种和治疗的程序。培养48小时后收集培养上清液测定IL-4，培养24小时后收集上清液测定IL-2。数据表示为细胞因子的平均水平±SD。通过Student′s t检验进行不同组间的统计学比较。(生理盐水组在用生理盐水治疗之前，用OVA免疫接种2次，10^7Mv组在用107母牛分枝杆菌治疗之前，用OVA免疫接种2次)。
图9显示以皮下注射2次(第53天和81天)107母牛分枝杆菌(○)治疗同注射生理盐水(●)相比较，对血清总IgE(图9A)和OVA-特异性IgE(图9B)的影响。图上标明了免疫接种和治疗的程序。血清IgE表示为相对于第46天取样所得到读数的改变值±SD(ng/ml)。通过Mann-Whitney U-检验进行不同组间的统计学比较。(OVA卵清蛋白免疫接种，Mv母牛分枝杆菌免疫接种)。
图10显示与OVA共同培养的脾细胞IL-5(图10A)，IL-2(图10B)和IFN-γ(图10C)的产生(pg/ml)。在第109天获得脾细胞，并与OVA共同培养。免疫接种和治疗的程序标明在图9上。培养48小时后收集培养上清液测定IL-5，培养24小时后收集上清液测定IFN-γ和IL-2。数据表示为细胞因子的平均水平±SD。通过Student′s t-检验进行不同组间的统计学比较。(生理盐水先以OVA免疫接种2次，然后生理盐水治疗2次；107Mv先以OVA免疫接种2次，然后107母牛分枝杆菌治疗2次)。
在此所提到的所有文献均被引入作为参考。实施例1对实验动物给予母牛分枝杆菌，引起免疫系统Th2活性非特异性降低的证据在0天和第24天以在油中(不完全弗氏佐剂，IFA)乳化的卵清蛋白50μg，免疫6-8周龄的Balb/c小鼠。已知这样可引发很强的Th2模式反应，伴随IgE的产生，并触发二个Th2细胞因子IL-4和IL-5的释放。
然后在第53天和81天给予动物生理盐水或高压灭菌的107母牛分枝杆菌(皮下注射)。
先在第46天(即以生理盐水或母牛分枝杆菌治疗之前)，然后在67天，91天和109天采集血清样品。
然后收集脾细胞，用于在体外培养系统中以卵清蛋白刺激。48小时之后收集培养上清液，借助于ELISA测定细胞因子。
以从Pharmingen获得的抗体对，采用捕获测定法进行检测。
IL-5#18051D捕获抗体#18062D(生物素化的)检测抗体。检测抗体的结合以链霉亲和素-辣根过氧化物酶偶联物(DakoP0397)显示，生色原是ABTS(Sigma A-1888)。
IgE#02111D捕获抗体；#02122D(生物素化的)检测抗体。以亲和素-碱性磷酸酶偶联物(Sigma E-2636)显示检测抗体的结合，生色原是pNPP(Sigma N-2770)。
以同第46天的血清浓度(处理前的最后值)相比较的改变值ng/ml表示IgE水平的结果。因此，从以后每个血样的数值中扣除了第46天的数值。结果注射母牛分枝杆菌降低了以卵清蛋白免疫接种引起的IgE水平上升。以母牛分枝杆菌治疗引起的降低，在所有被测定的时间点都是显著的。结果显示在图1中。
类似的情况是，如果供体动物已用母牛分枝杆菌治疗过，来自这种免疫动物的脾细胞在体外对卵清蛋白的反应中不能释放IL-5，而来自以生理盐水治疗的免疫动物的脾细胞，在对卵清蛋白反应中释放了大量的IL-5。此结果显示在图2中。在未加卵清蛋白培养的对照孔中未检测出IL-5(数据未显示)。结论即使在如下情况下给予母牛分枝杆菌，都将降低反应的Th2模式(i)在以强有力的过敏原(在此情况下是卵清蛋白)免疫接种之后，以及(ii)没有Th2-诱导性分子的抗原表位。
因此，存在不依赖于佐剂对过敏原本身直接作用的Th2反应模式的全身非特异性下调作用。实施例2不同的母牛分枝杆菌制剂对血清IgE的作用在另一个为了确定偶联的母牛分枝杆菌-OVA对血清IgE滴度影响的实验中，用在IFA中的OVA免疫BALB/c小鼠二次，以便诱发IgE反应，然后以如下制剂治疗2次生理盐水，未修饰的母牛分枝杆菌，偶联的母牛分枝杆菌-OVA，或相应的不含OVA，NaCl-洗，过碘酸处理的假偶联母牛分枝杆菌制剂(NaCl-Mv)。第46天OVA免疫的小鼠具有IgE 112.9±10(S.E)ng/ml，相比之下未免疫的动物为55.4±1.7(S.E)ng/ml(p＜0.01)。对于每只小鼠，都用第46天的数值使数据标准化成起始(即第46天)值0，将它从以后的每个数值中扣除。因此，作图的数值是相对于第46天的改变值ng/ml。
在实验期间对照小鼠(以生理盐水治疗的)血清总IgE稳步增加(图3A-C)。在以未修饰的母牛分枝杆菌治疗的小鼠血清总IgE受到抑制(图3A)。相反，NaCl洗，过碘酸处理的制剂对IgE-抑制没有效果，无论是偶联于OVA(图3B)或者是未偶联的(图3C)都没有效果，虽然有一次对照NaCl-Mv给药显示出对血清总IgE的短暂抑制作用(图3C)。这些结果表明，通过NaCl洗，或者通过偶联处理过程，下调IgE的能力被消除了。
相反，不论是未修饰的母牛分枝杆菌或者是对照的NaCl-Mv，都不能下调OVA特异性IgE(图4A和4C)。并且，通过以偶联的Mv-OVA治疗，OVA特异性IgE反应实际上是增强了(图4B)。实施例3不同的母牛分枝杆菌制剂对脾细胞产生IL-2的影响在第109天从以OVA免疫的小鼠获得脾细胞，在体外与OVA共同培养。来自OVA致敏的，接受生理盐水治疗的小鼠脾细胞，在体外对OVA的反应中不能产生IL-2。来自以不含OVA成分的母牛分枝杆菌制剂治疗的免疫小鼠脾细胞，在对OVA的反应中产生了可检测水平的IL-2，但是增加没有显著性。相比之下，来自以偶联的含OVA的母牛分枝杆菌制剂治疗的小鼠脾细胞，在对OVA的反应中释放了高水平的IL-2(与接受生理盐水的小鼠相比较p＜0.05)(图5)。这些结果表明，将OVA偶联于母牛分枝杆菌，使细胞在对OVA的反应中IL-2的产生增加了。
因此，除非使卵清蛋白包含(偶联于)在母牛分枝杆菌中，否则对卵清蛋白的Th1反应没有显著的增加。而且如所显示的，当含有卵清蛋白时，虽然Th1反应变成高度显著性，但是对Th2的抑制作用没有改善，并且可能降低(见在此后其它实验)。实施例4不同的母牛分枝杆菌制剂对脾细胞产生IL-5的影响来自OVA致敏小鼠的脾细胞在对OVA的反应中产生了高水平的IL-5(图6)。但是，来自已用母牛分枝杆菌制剂治疗的OVA免疫小鼠的脾细胞，在对OVA反应中都释放显著较少的IL-5，不论所用的母牛分枝杆菌制剂是未修饰的，NaCl洗过的对照，或者OVA-偶联的都是如此。因此，与测定IgE时所看到的结果大不相同，偶联处理过程本身，或者存在OVA对母牛分枝杆菌的偶联，对IL-5释放的下调都没有任何影响。只不过是通过将此过敏原偶联于母牛分枝杆菌，降低了关闭IL-5的能力，因为对Mv-OVA的相关对照是NaCl-Mv(假偶联的)。实施例5不同剂量母牛分枝杆菌对动物中血清IgE的影响为了测定不同剂量母牛分枝杆菌对血清总IgE的影响，用在IFA中的OVA免疫BALB/c小鼠2次(0天和第21天)，以便诱导IgE反应。在第32天对小鼠采血，然后在第42天用生理盐水或者107，108，或109母牛分枝杆菌治疗。
在第32天，OVA免疫的小鼠具有117.09±35.81(S.D)ng/ml的IgE，相比之下未免疫的小鼠为69.27±6.09(S.D)ng/ml(p＜0.001)。对于每只小鼠，都用第32天的数值使数据标准化成起始(即第32天)值0，将它从以后的每个数值中扣除。因此，作图的数值是相对于第32天的改变值ng/ml。
当在第52天和70天进一步采样时(即在第42天治疗后的10天和28天)，对照小鼠(用生理盐水治疗的)的IgE反应已进一步增加了(图7)。相比之下，在用107，108和109母牛分枝杆菌治疗的小鼠，IgE水平的增加受到了抑制(图7)。以生理盐水治疗的小鼠和以不同剂量母牛分枝杆菌治疗的小鼠之间，相比较的p值都小于0.01。实施例6母牛分枝杆菌处理对脾细胞产生细胞因子的影响以用于实施例5的同样实验方案处理BALB/c小鼠。然后在第82天收集它们的脾细胞，在体外与OVA，母牛分枝杆菌和ConA共同培养。来自生理盐水治疗组小鼠的脾细胞，在对OVA的反应中产生了IL-4，但不产生IL-2(图8A/B)。来自已用107经高压灭菌的母牛分枝杆菌治疗的OVA免疫小鼠的脾细胞，在对OVA的反应中显示出IL-2合成和减少产生IL-4。用来自以108或109母牛分枝杆菌治疗的小鼠脾细胞，也观察到在对OVA反应中的IL-2合成。
注意，对于母牛分枝杆菌治疗小鼠的脾细胞，IL-2产量增加没有显著性(SD大于反应量)，仅涉及该组中的某些小鼠。绝大多数被治疗的小鼠不产生IL-2。实施例7二次给予母牛分枝杆菌对血清IgE的影响因为前面已经显示107母牛分枝杆菌是引发对其本身抗原Th1反应的最佳剂量，并且是中试中最有效的剂量(图7)，所以选择此剂量作进一步研究。在0天和第24天用OVA免疫BALB/c小鼠2次，以便诱导IgE反应，并在第46天采血样，然后在第53天和81天用生理盐水或者用107母牛分枝杆菌治疗小鼠2次。在第46天，OVA免疫的小鼠具有112.9±10(S.E)ng/ml的IgE，相比之下，未免疫的小鼠是55.4±1.7(S.E)ng/ml(p＜0.01)。对于每只小鼠，都用第46天的数值使数据标准化成起始(即第46天)值0，将它从以后的每个数值中扣除。因此，作图的数值是相对于第46天的改变值ng/ml。
在实验期间，对照小鼠(以生理盐水治疗的)血清总IgE稳步增加。相反，对于用107经高压灭菌的母牛分枝杆菌治疗的小鼠，IgE的增加被抑制了(图9A)。同时，在此测定中，通过母牛分枝杆菌处理对抗-OVA IgE的抑制作用不显著(图9B)。但是，进一步实验表明，接受母牛分枝杆菌4次的OVA致敏BALB/c小鼠，具有显著较低的OVA特异性IgE滴度。
对OVA的IgG 1和IgG 2抗体未受母牛分枝杆菌治疗的影响。实施例8母牛分枝杆菌处理对脾细胞产生IFN-γ，IL-2和IL-5的影响以用于实施例7的同样实验方案处理BALB/c小鼠。然后在第109天收集它们的脾细胞，在体外与OVA共同培养。来自生理盐水治疗组小鼠的脾细胞，在对OVA的反应中产生了高水平的IL-5，但是不产生IL-2。然而，来自已用107经高压灭菌的母牛分枝杆菌治疗2次的OVA免疫小鼠的脾细胞，在对OVA的反应中不能释放IL-5(图10A)。来自已接受2次107母牛分枝杆菌的小鼠的脾细胞，在对OVA反应中IL-4的产生似乎减少了，但是这种细胞因子的含量水平太接近于本免疫测定法的检测极限而不可靠。如前面所显示(图8A)，在某些用母牛分枝杆菌治疗的小鼠的脾细胞上清液中，同样可检测出OVA诱导产生的IL-2(图10B)，虽然统计学没有显著性。在没有显示IL-2增加的动物中，观察到Th2降低。来自不同组动物的脾细胞，在OVA诱导的IFN-γ合成中没有差异(图10C)。讨论用在IFA中的OVA给予2次免疫接种的BALB/c小鼠发展了典型的Th2型反应。出现了血清IgE水平升高，来自这些小鼠的脾细胞在体外对OVA的反应中释放IL-5，但不释放IL-2。最引人注目的是，通过用低剂量杀死的母牛分枝杆菌治疗，可下调这种正在BALB/c小鼠中进行的过敏原特异性反应，而不需要在母牛分枝杆菌制剂中有任何OVA或OVA抗原表位。
类似的情况是，我们的实验已揭示，通过应用广泛剂量范围的母牛分枝杆菌，可抑制由OVA诱导的高水平血清IgE。这点是未预料到的，因为以前对小鼠的剂量-反应研究，把107作为诱导对包含在母牛分枝杆菌内的分枝杆菌抗原的Th1反应的最佳剂量，没有可检测的Th2反应成分，而109激发混合的Th1+Th2反应。根据所有的这些理由可认为，在这种模型中母牛分枝杆菌很可能不是通过对Th1细胞因子的抑制剂性作用而发挥其功能。对IgE水平的更进一步调节可归于对IgE结合因子的诱导。
除非使卵清蛋白包含在(偶联于)母牛分枝杆菌中，否则对卵清蛋白的Th1反应不会有显著增加，并且当含有卵清蛋白时，虽然Th1反应变成高度显著性，但对Th2的抑制作用没有改善，并可能降低。实施例9对Th2和Th1细胞因子模式的测定已有一些关于CFS和海湾战争综合征细胞因子模式的资料，但是它们显得不一致，并且采用的方法也不可靠，虽然总体临床表现暗示存在如上面所述的Th2/Th1比率增加(Strans，1996)。
为了证明这点，最优选的技术是，用流式细胞仪精确地计数外周血液中T细胞的数目和百分数，这种T细胞能自发地分泌IL-2(Th1细胞因子)或者IL-4或IL-5(二种Th2细胞因子)，或者在体外用钙离子载体和佛波醇肉豆蔻酸乙酸酯(PMA)刺激之后，能够诱导这种T细胞分泌这些细胞因子。(实际上用一种抑制剂(莫能菌素)可阻断分泌，可使细胞因子累积在细胞内，在此可用适当的荧光染料标记的单克隆抗体对它进行检测(对细胞固定和渗透之后))。
应用这种技术可见，正常人外周血中Th2细胞极端稀少，但是，慢性感染或癌症病人循环血中可常见这种细胞(未公布的观察)。
第二种技术是直接测定血浆或血清中细胞因子的水平。白介素13(IL-13)可作为代表性Th2细胞因子检测，γ-干扰素(IFNγ)可作为代表性Th1细胞因子检测。
应用其中一种技术对海湾战争退伍军人的细胞因子模式进行了检测。确定Th1-＞Th2偏移是指示出母牛分枝杆菌给药对改善症状的适应性。实施例10制备用于给药的母牛分枝杆菌将母牛分枝杆菌培养在包含改良的Sauton′s培养基(Boyden etal)，并用1.3％琼脂固化的固体培养基上。以这种细菌接种培养基，并在好氧条件下32℃培养10天，使细菌生长繁殖。然后收获此细菌，并称重和悬浮于稀释剂中，形成100mg细菌/ml稀释剂。然后用缓冲生理盐水将此悬液进一步稀释，形成含有细菌净重10mg(约1010个细胞)/ml稀释剂的悬液，并分装于5ml的多剂给药的小瓶内。然后将装有活细菌的小瓶在69kPa下高压灭菌(115℃-125℃)10分钟，以便杀死此细菌。将这样制备的治疗剂存放在4℃备用。实施例11应用母牛分枝杆菌治疗以Th1/Th2细胞固子偏移为特征的疾病取实施例3中制备的悬液0.1ml，其中含有母牛分枝杆菌净重1mg(约109个细胞)，剧烈振摇后立即在左侧三角肌上通过皮内注射给药。
可定期地测定病人的Th1和Th2细胞因子水平，以便证实从Th2向Th1的偏移，特别是Th2活性的下调，同时观察病人症状的改善。实施例12应用母牛分枝杆菌治疗患有慢性疲劳综合征的病人(1)对一名70岁的病人用SRL-172治疗鳞状上皮细胞肺癌，同时诊断患有慢性疲劳综合征，注射2次SRL-172之后，病人兴奋地报告它后一种疾病的症状消失了。她自我感觉非常好，感觉她的“痛苦都消失了”。作为一名教师，她已接收了额外的几名学生-表明她症状的改善。这名病人已用SRL 172治疗了一年多，情况仍然良好。
(2)一名病人有7-8年CFS病史，症状包括全身性疲劳，周期性偏头痛，押郁，食物过敏反应和淋巴结病。注射SRL 172 2次之，她报告了病情改善。她的咽喉痛和腺体肿胀，以及食物过敏反应改善更明显，她只需要较小剂量的甲状腺素了。她说话的神志更加明快了，说她较少感到抑郁了。
(3)一个病人的症状主要是头痛，抑郁，和多种食物过敏反应。在用SRL 172治疗之前，已试验了其它很多治疗方式都无效。为了控制症状，她按规定服用了大量Nalcron(每天饭前和饭后服用100mgNalcron胶囊80粒)。自从她每隔2个月接受1次SRL 172以来，她的CFS症状以及食物过敏反应都有相当明显的改善，她相信自己只要坚持按规定注射，将会更好。
参考文献Aaby，P.(1995)医学科学协会。41673-86。
Aaby et al.，(1995)英国医学杂志。311481-5。
Abou-Zeic et al.，(1997)感染与免疫。651856-1862。
Bernton et al.，(1995)纽约科学院年报。774217-231。
Bonicke et al.，(1964)Zentr albl.细菌、寄生虫、感染Skr.Hyg.Abt.1 Orig.192133。
Boyden et al.，(1955)免疫学杂志。7515。
Bretscher et al.，(1992)科学。257539-542。
Brinkmann et al.，(1995)免疫学杂志。1553322-8。
Brown et al.，(1993)感染与免疫。614793-4800。
Casale et al.，(1993)免疫药理学与免疫毒理学。15199-215。
Corrigan et al.，(1995)美国呼吸细胞分子生物学杂志。12567-78。
Daynes et al.，(1989)欧洲免疫学杂志。192319-2325。
Daynes et al.，(1990)实验医学杂志。171979-996。
Daynes et al.，(1993)免疫学杂志。1505219-5230。
Daynes et al.，(1995)皮肤病学研究杂志。10514S-19S。
Daynes et al.，(1991)免疫学研究。14240-45。
Fischer et al.，(1991)免疫学。74228-233。
Fukuda et al.，(1994)国际医学年报。121953-9。
Garg et al.，(1993)感染与免疫。612238-2241。
Glaser et al.，(1993)行为与神经科学。107525-9。
Guida et al.，(1994)血液842733-40。
Hernandez-Pando et al.，(1994)免疫学82591-595。
Holsboer et al.，(1984)新英格兰医学杂志。3111127-。
Morales et al.，(1994)临床内分泌代谢杂志。781360-1367。
Moynihan，J.(1994)身心健康进展1023-28。
Mu et al.，(1993)感染与免疫。612834-2840。
Nilsson et al.，(1996)JAMA 275760。
Odent et al.，(1994)JAMA 272592-593。
Padgett et al.，纽约科学院年报。774323-325。
Ramirez et al.，(1996)免疫学杂志。1562406-2412。
Ramiya et al.，(1996)自身免疫杂志。9349-356。
Raven et al.，(1995)临床内分泌学。43637-644。
Raven et al.，(1996)心理神经内分泌学21277-286。
Rook et al.，(1996)微生物学年评。50259-284。
Rook et al.，(1996)医学季刊。89333-341。
Rupprecht et al.，(1995)心理神经内分泌学20543-551。
Shaheen et al.，(1996)柳叶刀3471792-6。
Skinner et al.，(1997a)跨越2000的疫苗，7月6-9日，澳大利亚昆士兰，摘要。
Skinner et al.，(1997b)感染与免疫。654525-4530。
Stanford and Paul，(1973)Belge热带医学协会年报。53141-389。
Sharp et al.，(1991)皇家医学协会杂志。84118-21。
Shirakawa et al.，(1996)科学，待发表。
Smit et al.，(1996)移植学会会刊。28665-666。
Straus，S(1996)NIH公报号 90-30591-5。
Suzuki et al.，(1991)临床免疫学及免疫病理学。61202-211。
Tobach et al.，(1956)美国生理学杂志。187399-402。
Turnberg et al.，(1996)皇家医师、精神病医生和普通开业医生协会联合工作组报告，伦敦皇家医师协会，58vol.1)。
Wu et al.，(1991)临床研究杂志。87870-877。
Zwilling，B.S.(1992)ASM新闻5823-25。
权利要求
1.从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质，在制备一种药物中的用途，此药物可用于下调病人免疫系统的Th2活性，而不上调病人免疫系统的Th1活性。
2.权利要求1的用途，其中的病人患有慢性疲劳综合征。
3.权利要求1的用途，其中的病人患有海湾战争综合征。
4.权利要求1的用途，其中的病人串有总体过敏反应综合征。
5.权利要求1-4中任何之一的用途，其中从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质包括母牛分枝杆菌的死亡细胞。
6.权利要求5的用途，其中的细胞已用高压灭菌法杀死。
7.权利要求权利要求1-6中任何之一的用途，其中的药物不包含任何非母牛分枝杆菌抗原，免疫原或过敏原。
8.一种包含从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质的组合物，可用于下调病人免疫系统的Th2活性，而不上调病人免疫系统的Th1活性。
9.权利要求8的组合物，其中的病人患有慢性疲劳综合征。
10.权利要求8的组合物，其中的病人患有海湾战争综合征。
11.权利要求8的组合物，其中的病人患有总体过敏反应综合征。
12.权利要求8-11中任何之一的组合物，其中从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质包括母牛分枝杆菌的死亡细胞。
13.权利要求12的组合物，其中的细胞已用高压灭菌法杀死。
14.权利要求8-13中任何之一的组合物，其中的药物不包含任何非母牛分枝杆菌抗原，免疫原或过敏原。
15.一种下调病人免疫系统Th2活性而不上调病人免疫系统Th1活性的方法，此方法包括对病人给予从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质。
16.权利要求15的方法，其中的病人患有慢性疲劳综合征。
17.权利要求15的方法，其中的病人患有海湾战争综合征。
18.权利要求15的方法，其中的病人患有总体过敏反应综合征。
19.权利要求15-18中任何之一的方法，其中从母牛分枝杆菌获得的抗原物质和/或免疫调节物质包括母牛分枝杆菌的死亡细胞。
20.权利要求19的方法，其中的细胞已用高压灭菌法杀死。
21.权利要求15-20中任何之一的方法，其中的药物不包含任何非母牛分枝杆菌抗原，免疫原或过敏原。
全文摘要
用从母牛分枝杆菌(Mycobacterium vaccae)获得的抗原物质和/或致免疫物质下调免疫系统的Th2活性,而不上调Th1活性。可治疗如慢性疲劳综合征,海湾战争综合征和总体过敏反应综合征等疾病。这种物质优选地包括在一个组合物中的母牛分枝杆菌的死亡细胞,此组合物不含有非母牛分枝杆菌抗原,免疫原或过敏原。
文档编号A61P37/00GK1246056SQ9718176
公开日2000年3月1日 申请日期1997年12月17日 优先权日1996年12月18日
发明者G·A·W·罗克, J·L·斯坦福特, A·I·朱姆拉 申请人:斯坦福鲁克有限公司