专利名称：含蝶呤衍生物的活性氧消除剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及含蝶呤衍生物的活性氧消除剂。此外，本发明还涉及含上述蝶呤衍生物的药物组合物或化妆品组合物。
背景技术：
很久以来，人们就知道许多可认为是与活性氧有关的疾病。作为这些疾病的例子，有缺血损伤(例如缺血性心脏病后遗症、脑梗塞后遗症、或应激性溃疡)、再灌注损伤、炎症性疾病(例如慢性风湿、肾炎、或哮喘)、癌症、糖尿病、白内障、动脉硬化、药物中毒、农药中毒、过量给药引起的肝损伤、农药过量摄取的肝损伤、早产儿网膜症、光过敏症、或放射线损伤等。
对于这种疾病的治疗，给与具有活性氧消除作用的酶，如超氧化物岐化酶(以下称为SOD)有效。但是，SOD的生物半衰期极短，必需大量给药。此外，由于酶为蛋白质，具有抗原性，必需长期给药时必须考虑因抗原抗体反应引起的过敏性休克等副作用。还有口服给药无效等种种问题。
作为对活性氧有消除作用的非蛋白质化合物，已知有蝶呤衍生物。例如，在特开平6-56669号公报中，记载了蝶呤衍生物或新蝶呤衍生物具有活性氧消除作用。此外，特开平7-188232号公报中记载了与上述相同的蝶呤衍生物或新蝶呤衍生物对自由基引起的细胞损伤有效。
作为上述蝶呤衍生物或新蝶呤衍生物的代表化合物的新蝶呤〔即2-氨基-4-氧-6-(D-赤-1′，2′，3′-三羟丙基)-蝶啶；简称NP〕为巨噬细胞产生的物质，目前还不完全了解其生理意义，但已知其对于活性氧有抗氧化作用〔例如S.Kojima等，FEBS，304，2，3，163-166，1992；S.Kojima等，FEBS，329，1，2，125-128，1993〕。
此外，相当于还原型新蝶呤的5，6，7，8-四氢新蝶呤〔简称NPH4〕已知具有强大的抗氧化作用，有报道其对各种疾病有效〔例如S.Kojima等，FEBS，304，2，3，163-166，1992；Icho等，Biochimical Pharmacology，45，10，1953-1958，1993；Arai等，Neuroscience Letters，173(1994)107-110〕。
然而，上述的5，6，7，8-四氢新喋呤〔NPH4〕具有致畸性，因此要寻找其它具有活性氧消除作用的非蛋白质化合物。
本发明人对具有活性氧消除作用的非蛋白质化合物进行了深入研究，发现完全未知具有活性氧消除作用的蝶呤衍生物显示出活性氧消除作用。本发明正是基于这种认识。
发明的公开根据本发明，上述目的可以通过采用以含有式(I)所示的蝶呤衍生物、其环状物或盐作为有效成分为特征的活性氧消除剂而达到
式(1)中R1和R2分别独立地表示氢原子、碳数1～4的烷基，或式R3-CO-所示的酰基，R3为碳数1～4的烷基；X为甲酰基或羟甲基；A为式(Ia)
所示的基团，n为0或1以上的整数；X为羟甲基时n为0；n为1以上整数时R1和R2分别为氢原子，X为甲酰基。
此外，本发明也涉及药物组合物，其特征在于含有上述式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状物或药剂学允许的盐作为有效成分。
更进一步，本发明也涉及化妆品组合物，其特征在于含有上述式(I)所示的蝶呤衍生物、其环状物或盐作为有效成分。
附图的简单说明
图1为PMN-PMA系统中以活性氧累积发光量表示6-甲酰蝶呤消除活性氧活性的图。
图2为表示往DMSO中的超氧化钾溶液加入6-甲酰蝶呤时的低温电子自旋共振法测定结果的图。
图3为不进行血流阻断、完全正常的砂鼠脑海马组织切片的显微照片。
图4为砂鼠-过性脑缺血模型的对照组的脑海马组织切片的显微照片。
图5为砂鼠-过性脑缺血模型的6-甲酰蝶呤给药组的脑海马组织切片的显微照片。
实施发明的最佳形式以下对本发明进行详细说明。
本发明的活性氧消除剂含有上述式(I)表示的蝶呤衍生物作为有效成分。
R1、R2和R3表示的碳数1～4的烷基为直链或支链的碳数1～4的烷基，例如为甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基，优选甲基或乙基。上述式(I)所示的化合物中，R1和R2可以分别独立地表示相同或不同的氢原子，上述碳数1～4的烷基，或式R3-CO-(R3为上述碳数1～4的烷基)表示的酰基。上述式(I)中，n为0或1以上的整数，优选0或1～100的整数，更优选0或1～10的整数。
作为上述式(I)所示的蝶呤衍生物，优选R1和R2分别独立地表示氢原子、碳数1～4的烷基、或式R3-CO-表示的基团，R3为碳数1～4的烷基，A为式(Ia)表示的基团，n为0或1以上的整数，X为甲酰基的6-甲酰蝶呤衍生物。
更进一步，作为上述式(I)所示的蝶呤衍生物，更优选R1和R2为氢原子，且n为0的上述式(I)所示的化合物，即式(II)
表示的6-甲酰蝶呤。
6-甲酰蝶呤由于具有氨基和甲酰基，在水溶液中多个分子间会自然形成席夫碱，从而变成6-甲酰蝶呤的低聚物或多聚物。在这些低聚物或多聚物中，不仅有直链状的低聚物或多聚物，还含有环状的低聚物或多聚物。从单体到低聚物或多聚物的反应是可逆反应，在碱性条件下，6-甲酰蝶呤低聚物或多聚物容易分解成6-甲酰蝶呤单体。因此，可以认为在机体内和皮肤上也可以进行同样的可逆反应。上述6-甲酰蝶呤低聚物或多聚物是R1和R2同时为氢原子，且n为1以上(优选1～100)的整数的上述式(I)所示化合物，可以作为本发明的活性氧消除剂中的有效成分而使用。
在机体内容易转变为上述式(I)所示蝶呤衍生物的衍生物，即前药，也可以作为本发明的有效成分而使用。适当前药的选择和制备的一般方法，例如在Design of Prodrugs，ed.H.Bundgaard，Elsevier，1985上有记述。
6-甲酰蝶呤可以以游离化合物的形式作为有效成分使用，也可以以其盐，特别是药剂学允许的盐，例如无机酸盐(例如盐酸盐或硫酸盐)或有机酸盐(例如樟脑磺酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、或草酸盐等)的形式使用。此外，也可以以上述6-甲酰蝶呤低聚物或多聚物的形式使用。6-甲酰蝶呤低聚物或多聚物为已知的化合物，根据其自身的已知的方法，可以从游离化合物转变成盐，也可以从盐转变成游离化合物或别的盐。
上述式(I)所示的蝶呤衍生物也可以以游离化合物的形式作为有效成分使用，也可以以其盐、特别是药剂学允许的盐，例如无机酸盐(例如盐酸盐或硫酸盐)或有机酸盐(例如樟脑磺酸盐、酒石酸盐、苹果酸盐、或草酸盐等)的形式使用。上述式(I)所示的蝶呤衍生物为已知化合物，可以以其自身已知的方法进行制备。此外，根据其自身已知的方法，可以从游离化合物转变成盐，也可以从盐转变成游离化合物。
上述式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状物或药剂学允许的盐，由于具有活性氧消除作用或能够转变为具有活性氧消除作用的化合物，因此可以用作为本发明的药物组合物的有效成分。
即上述式(I)所示的蝶呤衍生物之中，n为0，且R1或R2的任一个都不是氢原子的式(I)表示的蝶呤衍生物或6-甲酰蝶呤〔即n为0，且R1和R2同时为氢原子，X为甲酰基的式(I)所示的化合物〕，由于其自身具有活性氧消除作用，无论活性氧生成体系的种类，都对种种原因产生的活性氧有广泛的效用。
此外，上述式(I)所示的蝶呤衍生物中，n为1以上的整数、特别是n为1～100的整数的式(I)所示的蝶呤衍生物，由于给药后在动物的体内或体表缓慢分解，释放出6-甲酰蝶呤，无论活性氧生成体系的种类，都对种种原因产生的活性氧有广泛的效用。
所以，本发明的药物组合物可以对活性氧和自由基有关的种种疾病，例如缺血性损伤(例如缺血性心脏病后遗症、脑梗塞后遗症、或应激性溃疡)、再灌注损伤、炎症性疾病(例如慢性风湿、肾炎、或哮喘)、癌症、糖尿病、白内障、动脉硬化、药物中毒、农药中毒、药物过量给与引起的肝损伤、农药过量摄取引起的肝损伤、早产儿网膜症、光过敏症、或放射线损伤等进行有效的治疗或预防。
根据本发明的药物组合物，蝶呤衍生物或其药剂学允许的盐，可以单独或优选和药剂学或兽医学允许的一般载体共同给与动物，优选哺乳动物(特别是人)。
作为给药剂型，没有特别的限制，例如有散剂、细粒剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、洗剂、糖浆剂、浸膏剂、或丸剂等口服制剂，或注射剂、外用液剂、软膏剂、栓剂、局部给与的乳膏、胶冻剂、凝胶剂、糊剂或点眼剂等非口服制剂。
这些口服制剂例如可以用明胶、褐藻酸钠、淀粉、玉米淀粉、白糖、乳糖、葡萄糖、甘露糖醇、羧甲基纤维素、糊精、聚乙烯吡咯烷酮、结晶纤维素，大豆卵磷脂、蔗糖、脂肪酸酯、滑石、硬脂酸镁、聚乙二醇、硅酸镁、无水硅酸、或合成硅酸铝等的赋形剂、结合剂、崩解剂、表面活性剂、润滑剂、流动性促进剂、稀释剂、保存剂、着色剂、香料、矫味剂、稳定化剂、保湿剂、防腐剂或抗氧化剂等，依照常法进行制造。例如6-甲酰蝶呤和乳糖混合充填的胶囊剂等。
作为非口服给药方法，例如有以乳膏或软膏等的局部给药、注射(皮下，静脉内等)、或直肠给药等。在这之中，注射剂是最合适的。
例如在注射剂的制备时，除了作为有效成分的蝶呤衍生物之外，可以任意使用例如生理盐水或林格氏液等水溶性溶剂、植物油或脂肪酸酯等非水溶性溶剂、葡萄糖或氯化钠等的等张化剂、增溶剂、稳定化剂、防腐剂、悬浊化剂或乳化剂等。
此外，本发明的药物组合物也可以采用缓释性多聚物等的缓释性制剂方式进行给药。例如，可以将本发明的药物组合物装入多聚乙烯乙酸乙烯酯片中，再将此片用外科手术植入要治疗的组织中。
本发明的药物组合物不仅限于这些，它可以含有蝶呤衍生物或其药剂学允许的盐0.01～99％重量，优选0.1～80％重量。
利用本发明药物组合物的活性氧消除作用时的给药量因疾病种类、患者年龄、性别、体重、症状的程度、或给药方法等不同而异，没有特别的限制，通常对于成人可以给予相当6-甲酰蝶呤0.1～100mg/kg体重、1日1～4次口服或非口服给药。
因为上述式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或药剂学允许的盐具有活性氧消除作用或可以衍生具活性氧消除作用的化合物，所以可以用作为化妆品组合物的有效成分。皮肤为机体的最外层，因环境因素(特别是紫外线的作用)而受到活性氧的影响。作为活性氧影响引起的皮肤疾病，例如有炎性皮肤病、胶原病、角化症、水疱症、或光过敏症等。由于皮肤的角质层具有屏障功能，给与化妆品等外用剂形时有效成分主要只作用于表皮，例如已知对表皮的脂质过氧化反应的抑制力可以相当有效。所以，本发明的化妆品组合物可以消除以紫外线作用为代表的放射线、二氧化氮或香烟烟雾等在皮肤表面产生的活性氧，能够避免、减轻或预防活性氧引起的皮肤损伤。
在本发明的化妆品组合物中，上述式(I)所示的蝶呤衍生物或其环状体或盐的配比率没有特殊的限制，可以含有0.01～99％重量，优选0.1～80％重量。
本发明的化妆品组合物可以和一般化妆品中使用的其他成分，如油分、抗氧化剂、表面活性剂、保湿剂。香料、水、醇、增粘剂、防腐剂、防霉剂、包素、粉末和/或药剂等进行适当的配伍。此外，它也可以根据需要和大家都知道的紫外线吸收剂，例如苯甲酸类紫外线吸收剂(例如对氨基苯甲酸)、邻氨基苯甲酸类紫外线吸收剂(例如同甲基-N-乙酰邻氨基苯甲酸酯)、水杨酸类紫外线吸收剂(例如水杨酸戊酯)、肉桂酸类紫外线吸收剂(例如肉桂酸辛酯)和/或二苯甲酮类紫外线吸收剂(例如2，4-二羟二苯甲酮)等配合使用。
本发明的化妆品组合物可以作成溶液、乳化液、混凝状混合物，固形物(压制品)、粉末等任意的形态，可以利用它制造日晒化妆品、防日晒化妆品、化妆粉底、充填料、化妆水、粉底、乳膏、乳液、香波、染发液、头发化妆品等。如前所述，因在强紫外线存在下活性氧会过量产生，所以强紫外线下使用的日晒化妆品或防日晒化妆品优选，例如太阳油、太阳洗液、太阳乳膏、防日晒乳膏、防日晒洗液、防日晒用粉底、防日晒用化妆粉底或防日晒用混合剂等。
对于6-甲酰蝶呤，用大鼠进行急性毒性实验时，对10只大鼠静脉注射6mg/kg体重的6-甲酰蝶呤，观察3个月，没有见到死亡例。
本发明的活性氧消除剂的用途并不仅限于药品和化妆品，可以有其它各种各样的用途，例如可以作为功能性食品或健康食品以饮料、食品的形式给与，更可以作为饲料给与非人动物(特别是饲养动物)，此外还可用作往保存器官移植用器官的保存液中加入的添加剂。
实施例以下根据实施例对本发明作具体的说明，但并不对本发明构成限制。实施例16-甲酰蝶呤活性氧消除活性的测定(PMN-PMA体系)采取健康成人10毫升静脉血，分离采取的嗜中性粒细胞(polymorphonuclear leukocyte；简称PMN)，用HBSS(Hanks′balanced saltsolution，Hand′s平衡盐溶液)悬浊成约1×106细胞/毫升的悬浊液。将化学发光物质(即在活性氧存在时产生化学发光的化合物)2-甲基-6-苯基-3，7-二氢咪唑-(1，2-α)-吡嗪-3-酮(以下称为CLA)用磷酸缓冲溶液(以下称为PBS溶解)，制成50μM的溶液。将能够刺激中性粒细胞产生活性氧的所谓中性粒细胞刺激剂佛波醇肉豆蔻酯醋酸酯(phorbol myri state acetate；简称PMA)用PBS溶解，制成20微克/毫升的溶液。将这样配制好的中性粒细胞悬浊液、CLA溶液和PMA溶液在测定之前都用冰冷却保存。
将本发明活性氧消除剂的有效成分6-甲酰蝶呤用PBS溶解，制成100μM、250μM和500μM的溶液，在测定使用前加温到37℃。与此同时将作为对照使用的PBS也在测定使用前加温到37℃。
测定时按以下顺序进行。往从中性粒细胞悬浊液2毫升离心分离的中性粒细胞中加入各种浓度的6-甲酰蝶呤溶液，并加入PBS调整总体积为1930微升，置入试管在37℃下加温15分钟。加入50微升CLA溶液后，置于化学发光测定器，开始测定化学发光量。测定开始1分钟后，用注射器往试管中洲入PMA溶液20微升。测定在37℃下每10秒进行一次，持续10分钟。
结果如图1所示。图1中的图表示每10秒的发光量每次累积的合计发光量。曲线a表示对照组，即代替6-甲酰蝶呤，只加入PBS时的测定结果；曲线b表示加入100μM6-甲酰蝶呤时的测定结果；曲线c表示加入250μM6-甲酰蝶呤时的测定结果；曲线d表示加入500μM6-甲酰蝶呤时的测定结果。和代替6-甲酰蝶呤只加入PBS时的对照(曲线a)相比，加入100μM6-甲酰蝶呤时(曲线b)，化学发光量，即活性氧量被显著抑制；更进一步，加入250μM和500μM 6-甲酰蝶呤时(曲线c和曲线d)，化学发光量，即活性氧量几乎消失。实施例26-甲酰蝶呤活性氧消除活性的测定(来源于超氧化钾)往20毫升二甲亚砜(DMSO)中加入超氧化钾(KO2)28毫克，配制成饱和溶液，DMSO中于是产生活性氧。在这里使用2，2，6，6-四甲基哌啶-N-氧化物(TEMPO)作为标准物质，将其加入DMSO中分别作为0.1、0.3、0.5、0.7、1、1.2和1.5mM的溶液，进行测定。所得电子自旋共振信号(77K下测定)进行积分，作成标准曲线。根据此标准曲线，测得DMSO中活性氧的浓度约为0.5mM。
将本发明活性氧消除剂的有效成分6-甲酰蝶呤用DMSO溶解，作成10mM的溶液。用低温(77K)电子自旋共振法测定上述KO2溶液中不加6-甲酰蝶呤时的活性氧产生量(对照)和上述KO2溶液加入预定浓度6-甲酰蝶呤时的活性氧产生量。
测定结果如图2所示。6-甲酰蝶呤在DMSO中最终浓度从0.001mM到1mM每10倍上升时从KO2的活性氧产生量可以从箭头A所示位置，即328mT的位置所示峰(微分型)进行二次积分求得值的大小程度求出。曲线a为对照，即没有加6-甲酰蝶呤时的测定结果；曲线b～e分别表示加入0.001mM、0.01mM、0.1mM和1mM 6-甲酰蝶呤时的测定结果。
与未加入6-甲酰蝶呤的KO2溶液相比，向KO2溶液中加入6-甲酰蝶呤，6-甲酰蝶呤浓度达到0.1mM，KO2产生的活性氧量下降，6-甲酰蝶呤浓度达到1mM，KO2产生的活性氧几乎消失。
正如先前已经确认的，20毫升DMSO中加入28毫克KO2体系的活性氧产生量约为0.5mM，而认为6-甲酰蝶呤大约以1∶1的比例消除从KO2产生的活性氧。实施例3羟甲基体活性氧消除活性的测定(来源于超氧化钾)用0.01mM～10mM的6-羟甲基蝶呤〔上述式(I)中R1和R2为氢原子、X为羟甲基、n为0时的化合物〕代替0.001mM～1mM的6-甲酰蝶呤，在此之外重复上述实施例2相同操作，测定6-羟甲基蝶呤的活性氧消除活性，可以观察到在具有和6-甲酰蝶呤相同的活性氧消除活性时，6-羟甲基蝶呤浓度是6-甲酰蝶呤的10倍。实施例4因活性氧消除作用而对迟发性神经元坏死的抑制将全身麻醉的砂鼠(体重约80克)颈部切开，直视下用夹子结扎两侧颈动脉，从而阻断血流。5分钟再通血流，缝合创部。血流再灌注30分钟后，对照组腹腔给予生理盐水1毫升，给药组腹腔给于50mM 6-甲酰蝶呤(溶于生理盐水)1毫升；在这之后动物从麻醉中觉醒，饲养1周时间。1周后，将上述砂鼠全身麻醉摘出脑，作成组织切片，对特异描述神经细胞的微管结合蛋白2(microtuble-associated protein2；MAP2)进行染色，评价脑海马的迟发性神经元坏死(delyed neuronaldeath；DND)程度。
图3～图5表示上述砂鼠脑海马组织切片的显微镜照片。图3为不阻断血流、完全正常的组织状态的组织切片照片，图4为对照组的组织切片照片，而图5则为6-甲酰蝶呤给药组的组织切片的照片。此外，图3(1)、图4(1)和图5(1)分别为放大60倍的照片，图3(2)、图4(2)和图5(2)分别为放大600倍的照片。
图4显示出神经元细胞完全脱落的状态，图5显示出许多神经元细胞保持生存的状态。
上述结果显示，6-甲酰蝶呤因其活性氧消除作用，而能够抑制砂鼠一过性脑缺血模型的迟发性神经元坏死。
工业实用性本发明的活性氧消除剂对种种原因产生的活性氧有效。所以，含有上述活性氧消除剂的本发明药物组合物可望能够对被认为与活性氧有关的各种疾病进行有效的治疗。此外，含有上述活性氧消除剂的本发明的化妆品组合物可望能够减轻和避免因紫外线等作用产生的活性氧的不良影响。
权利要求
1.活性氧消除剂，其特征在于含有式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或其盐作为有效成分
式(I)中R1和R2分别独立地表示氢原子，碳数1～4的烷基，或式R3-CO-所示的酰基，R3为碳数1～4的烷基；X为甲酰基或羟甲基，A为式(Ia)
所示的基团，n为0或1以上的整数；X为羟甲基时n为0，n为1以上整数时R1和R2分别为氢原子、X为甲酰基。
2.根据权利要求1记载的活性氧消除剂，其中含有式(II)所示的6-甲酰蝶呤或其盐作为有效成分。
3.药物组合物，其特征在于含有权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、其环状体或药剂学允许的盐作为有效成分。
4.根据权利要求3记载的药物组合物，用于与活性氧有关疾病的预防和治疗。
5.根据权利要求4记载的药物组合物，其中与活性氧有关的疾病为缺血性损伤、再灌注损伤、炎症性疾病、癌症、糖尿病、白内障、动脉硬化、药物中毒、农药中毒、药物给药过量引起的肝损伤、农药过量摄取引起的肝损伤、早产儿网膜症、光过敏症、放射线损伤。
6.化妆品组合物，其特征在于含有权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐。
7.治疗或预防与活性氧有关疾病的功能性食品，其特征在于含有权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐。
8.预防或治疗与活性氧有关疾病的饲料，其特征在于含有权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐。
9.器官保存液用添加剂，其特征在于含有权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐。
10.与活性氧有关疾病的预防或治疗方法，其中包括将权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐，以预防和治疗活性氧有关疾病的有效量，给与必须对活性氧有关疾病进行预防或治疗的对象。
11.根据权利要求1记载的式(I)所示的蝶呤衍生物、或其环状体或盐用于药物组合物制造中的应用。
全文摘要
本发明公开了含有式(Ⅰ)所示的蝶呤衍生物、其环状体或盐作为有效成分的活性氧消除剂。[式(Ⅰ)中R
文档编号A61K31/519GK1198161SQ97191002
公开日1998年11月4日 申请日期1997年7月30日 优先权日1996年7月31日
发明者荒井俊之, 牧野圭佑, 森健次郎 申请人:阿提米斯株式会社