特沙弗林用于制备与化疗药物一起使用用于癌症化学增敏的药剂的制作方法

专利名称：特沙弗林用于制备与化疗药物一起使用用于癌症化学增敏的药剂的制作方法
许多常见的人类癌症能抵抗化疗剂的有效治疗。一些类型的肿瘤，尤其是肾上腺癌、结肠癌、肠癌、肾癌和肝癌等，在化疗的开始就产生了有抗药性的细胞(Barrows,L.R.,1995)。在另一些情况中，抗性的产生与微生物的抗药性产生十分相似，即在治疗的过程中由于与抗性相关的遗传变异产生了抗性。具有抗性的子代细胞于是在有药的环境中繁殖。无论何种原因，抗性往往使一个抗肿瘤药物失去疗效。
临床研究表明，编码P-糖蛋白的基因MDR1的表达是导致人类多种癌症中常见的多药抗药性的原因。该糖蛋白的作用是作为细胞膜上能量依赖性的多种药物流出泵，从而降低了胞内细胞毒性药物的浓度。这种抗药机理可说明常见肿瘤如结肠癌和肾癌一开始就有抗药性的原因。对于在常见的血液肿瘤如急性非淋巴细胞白血病和恶性淋巴瘤中观察到的获得性抗性也能用上述机理解释。虽然这种类型的抗药性可能较普遍，但并非是细胞变得具有抗药性的唯一机理。
癌症治疗的化学修饰包括使用一些本身无细胞毒性但可以改变宿主或肿瘤以增强抗肿瘤治疗效果的药剂或手法。这样的药剂称为化学增敏剂。使用化学增敏剂的先驱研究表明，这些药物可使一部分病人的抗药性逆转。同样这些初步研究也表明，抗药性是多种因素造成的，因为并非全部有抗药性的病人带有P-糖蛋白阳性的细胞，同样，也只有一部分病人从目前使用化学增敏剂的方法中受益。化学增敏研究以前集中于能够逆转或调节实体瘤的多药抗药性的药剂上。已知能够调节P-糖蛋白功能的化学增敏剂包括钙离子通道封闭剂(维拉帕米)，钙调蛋白抑制剂(三氟吡啦嗪)，吲哚生物碱(利血平)，喹啉(奎宁)，亲溶酶体剂(氯喹)，类固醇(孕酮)，三苯乙醇类似物(他莫昔芬)，去污剂(聚乙二醇化合物Cremophor EL)，和环肽抗生素(环孢菌素)(De Vita，等1993)。
一篇研究化学增敏剂应用的文献综述得出如下结论ⅰ)持续的高剂量的静脉内维拉帕米治疗可引起明显的心血管副作用，并且有剂量限制，ⅱ)化学增敏剂如三氟吡啦嗪和他莫昔芬的剂量限制毒性是由于化学增敏剂自身固有的毒性造成的，而并非增强了化疗毒性，ⅲ)用高剂量环孢菌素A作为化学增敏剂可引起血胆红素过高的副作用，并且ⅳ)需要进一步研究开发低毒高效的化学增敏剂以用于临床(De Vita，等1993)。
在诊断时认为对药物敏感但在复发时获得了多药抗药性表型的肿瘤是临床上尤为棘手的问题。在诊断期，仅有少量肿瘤细胞可表达P-糖蛋白，化疗在疾病初期提供了对这些少数P-糖蛋白的阳性细胞的选择优势。另外一种可能是，天然产物来源的化疗实际上引起多药抗药性基因MDR1的表达，从而导致复发时成为P-糖蛋白阳性肿瘤。在疾病早期使用化学增敏剂可以通过消除早期少量的P-糖蛋白阳性细胞以防止多药抗药性的出现。体外研究表明，通过联合使用维拉帕米和阿霉素选择抗药性细胞确可防止P-糖蛋白的产生，但另外一种抗药性机理则得到发展，该机理是改变了的拓扑异构酶Ⅱ的功能引起的(Dalton,W.S.,1990)。
目前使用化学增敏剂逆转临床上多药抗药性失败的原因可用下述几个原因解释ⅰ)在肿瘤部位化学增敏剂的水平不足，ⅱ)随着肿瘤的发展，P-糖蛋白的水平增加，ⅲ)MDR1基因突变，导致结合在P-糖蛋白上化学增敏剂减少，ⅳ)治疗过程中，其它不受化学增敏剂作用的非P-糖蛋白机理也可能引起抗性，ⅴ)化学增敏剂缺乏对肿瘤细胞的选择性，也提高了正常组织对化疗毒性作用的敏感度。一种非P-糖蛋白机制是由于拓扑异构酶Ⅱ功能的改变，这种非P-糖蛋白机制产生了对蒽环类抗生素和表鬼臼毒素的抗性(De Vita，等1993)。
急切需要更有效更低毒的化学增敏剂以提高化疗的效果。临床上化学增敏剂的应用依赖于其增加化疗药物细胞毒性的能力以及在体内自身的低毒性。本发明致力于这些问题并提供了一类新的化学增敏剂，提供了癌症治疗的一个新途径。
本发明提供了增加化疗药物活性的方法。具体地说，它是关于使用特沙弗林(texaphyrin)作为化学增敏剂以增加化疗药物的细胞毒性。提供了以特沙弗林作为化学增敏剂治疗白血病、淋巴瘤、癌和肉瘤等癌症的方法。
特别是，本发明提供了一种化学增敏方法，包含给需要的受治疗者使用化疗药剂和特沙弗林。“化学增敏”一词，在这里是指与不合并使用特沙弗林时化疗药物的细胞毒性水平相比，特沙弗林对化疗药物细胞毒性的增加或加强。也就是说，特沙弗林使癌细胞对化疗药物更加敏感，使化疗药物更为有效。已知特沙弗林自身并无抗癌的化疗活性。
本发明的一个实施方案是一种用于治疗患者癌症的方法，该方法包括给受治疗者使用化疗药物和特沙弗林。癌症可以是白血病、淋巴瘤、肉瘤或癌。在优选的方案中，对患有某种癌症并施以化疗的患者在两次化疗药物治疗的间隙，服用特沙弗林。
化学增敏可以与光能治疗联合使用，这是因为特沙弗林是光敏分子，在重要的生理波长700-900纳米有吸收(参见本文引用的关于特沙弗林的美国专利，此处引用此文献作为参考。)。这种方法包括用化疗药物和光敏性特沙弗林治疗癌症患者，并且照射肿瘤的附近部位。在这种联合治疗过程中，特沙弗林可以是不含金属的，也可能与金属形成配合物。如果带有金属，则该金属是一种抗磁性的金属阳离子，这种抗磁性金属阳离子可以是Lu(Ⅲ)、La(Ⅲ),In(Ⅲ),Y(Ⅲ),Zn(Ⅱ)和Cd(Ⅲ)。优选的金属阳离子为Lu(Ⅲ)。
造影可以与化学增敏联合进行。因为钆特沙弗林是磁共振造影中优秀的对比剂(参见本文引用的关于特沙弗林的美国专利，此处引用此文献作为参考)。这种方法是指给患有癌症的病人服用化疗药物以及顺磁性金属-特沙弗林配合物以治疗癌症。用此法治疗癌症，当有特沙弗林时能加强化疗药物的活性，同时也可以监测诸如肿瘤的位置和大小等情况。这种顺磁性的金属阳离子可以是锰(二价)，锰(三价)，铁(三价)或是除去镧(三价)，镥(三价)和钷(三价)之外的三价镧系金属阳离子。较优选的顺磁性金属有锰(二价)，锰(三价)，镝(三价)或钆(三价)，最优选镝(三价)或是钆(三价)。
本发明还提供了一种治疗患者肿瘤的方法，包括先用化疗药物和有放射增敏特性的特沙弗林给受治疗者服用，再用离子化放射线对患者的癌症部位附近进行照射。已证明特沙弗林具有放射增敏特性。与对照实验相比，可以增强在特沙弗林附近离子化放射线的细胞毒性(见PCT公开文本WO95/10307，此处引用此文献作为参考。)。离子化放射线包括但不局限于如X-射线，内部或外部伽玛射线放射性同位素和离子化粒子。在这种联合治疗中，特沙弗林可以与金属配合，虽然对于特沙弗林的放射增敏特性而言，金属并非关键。
本发明的另一方面，特沙弗林可以用作表皮的化学增敏剂。表2中指明了5-氟尿嘧啶用于治疗局部癌前期皮肤损伤的例子。本发明人预见到特沙弗林可用于增强表皮化疗药物的细胞毒性。
本发明的另一实施方案是一种选择与作为化学增敏剂的特沙弗林联合使用的化疗药物的方法。此方法包括以下几个步骤ⅰ)在有或没有特沙弗林存在下检定候选化疗药物的细胞毒性，ⅱ)选择当存在特沙弗林时细胞毒性高于没有特沙弗林时的细胞毒性的化疗药物，作为与化学增敏剂特沙弗林联合使用的化疗药物。实施例1中引用的目前优选的体外检定方法是MTT细胞毒性检定法。在实施例2中描述了体内检定的例子。
遵照一贯的专利法惯例，本申请及权利要求书使用的词“一种”意味着“一个或多个”。
下列图表组成本发明书的一部分，它们用于进一步描述本发明的某些方面。结合下列给出的详细描述的实施方案和一幅或多幅图，可以更好地理解本发明。


图1提供了数据的标准差分析结果。数据来源于仅注射阿霉毒(亚得里亚霉素)(O)，或者先注射阿霉素随后于第5分钟和5小时(■)注射特沙弗林到皮下移植了EMT6肿瘤的Balb/c鼠的结果。误差标记代表标准差，n=14。
图2展示相对于对照组三种不同浓度的特沙弗林(\\\,50μM；□,100μM；///,150μM)和一种化疗药物对于MES-SA细胞的IC50值差异。与特沙弗林一起受试的药物为紫杉醇，依托泊苷，4-羟环磷酰胺，顺铂和博莱霉素。
图3展示了移植了B-16黑素瘤的C57黑鼠在不经治疗(●，平均存活天数21天)，仅用阿霉素治疗(▲，平均存活天数29天)或用阿霉素治疗后再用特沙弗林治疗(Δ，平均存活天数40天)的存活状况。
本发明是发现特沙弗林是化学增敏剂的结果。使用特沙弗林作为化学增敏剂是指当化疗药物与特沙弗林联合使用时对部分化疗药物的细胞毒性的增强作用。
化疗药物可以是下列药物中的一种一种烷化剂如氮芥、乙撑亚胺或甲基密胺、磺酸烷基酯、亚硝基脲或三氮烯；一种抗代谢药物如叶酸类似物、嘧啶类似物或嘌呤类似物；一种天然产物如长期花碱、表鬼臼毒素。抗生素、酶、紫杉类化合物或生物反应调节剂；其它化疗药物，如铂配位复合物、蒽二酮、蒽环类抗生素、取代脲、甲基肼衍生物或是肾上腺皮质抑制剂；或者是激素或拮抗剂，如肾上腺皮质固醇、孕酮、雌激素、抗雌激素、雄激素、抗雄激素或是促性腺激素释放激素的类似物。表2中指出了烷化剂、抗代谢物、天然产物、其它药物、激素和拮抗剂以及相应的癌症的类型的例子。优选的化疗药物是氮芥、表鬼臼毒素、抗生素、铂配位复合物。更好的化疗药物是博莱霉素、阿霉素、紫杉醇、依托泊苷、4-羟环磷酰胺或顺铂。目前优选的化疗药物为阿霉素或博莱霉素。
特沙弗林化合物其制备及其使用方法见美国专利4,935,498、5,162,509、5,252,720、5,272,142、5,256,399、5,292,414、5,432,171、5,439,570、5,475,104、5,451,576、5,457,183、5,369,101、5,569,759、5,559,207和5,587,463；待批的专利申请USSN08/196,964、08/433,573和08/484,551以及PCT公开文本WO90/10633、WO93/14093、WO94/29316和WO96/38461中的描述。此处每一专利、专利申请和公开文本都引用作为本发明的参考。
由于特沙弗林自身具有的生物定位特性，使特沙弗林作为化学增敏剂使用时有着十分重要的附加优越性。“自身的生物定位特性”是指相对于周围组织而言对特定组织有更高的选择性亲和力。如在美国专利5,252,720中描述，特沙弗林定位在富含脂肪的区域，如肝、肾、肿瘤和粉瘤。这种生物定位性使得在上述区域与普通组织相比有更强的细胞毒性。因而使获得预期作用的化疗药物的用量在有特沙弗林时减少。由于化疗药物的减少，患者所受到的总毒性也相应减少，而在如肿瘤等富含脂肪的地方的细胞毒性反而增强了。
不仅如此，特沙弗林可以与位点导向性分子偶联形成一个在体内定向传输的偶联物。“位点导向”是指对目标位点有特异性。“目标位点特异性”是指在生理性的离子强度、温度、pH值等条件下，目标位点与特沙弗林-位点导向偶联物一接触，就会引起特异性结合。这种反应是通过特异的静电力、疏水作用力、熵或者是通过偶联物上特定基团与目标上特异的基团之间的其他作用，在有利于促进反应的条件下形成稳定的复合物。本发明中考虑的样本位点导向分子包括但不局限于寡核苷酸；聚酰胺(包括对生物受体有亲和力的肽和诸如抗体的蛋白质)；类固醇或类固醇衍生物，激素如雌二醇或组胺；激素类似物如吗啡以及其他大环类化合物如Sapphyrins和Rubyrins。
特沙弗林作为化学增敏剂的作用机理尚不清楚。不拘泥于理论而言，特沙弗林抑制了化疗药物所造成细胞损伤的修复，特沙弗林损害了细胞的能量储存，或是增加了自由基的寿命。由于化学增敏剂的作用与P-糖蛋白无关(参见实施例9)，因此存在一个不依赖于P-糖蛋白的机理。“不依赖于P-糖蛋白的化学增敏剂”是指作为化学增敏剂的特沙弗林的作用独立于使癌细胞产生抗性的MDR1机制。特沙弗林作为化学增敏剂对表达MDR基因和不表达MDR基因的细胞系均有作用，这一特点使特沙弗林区别于现有的仅克服MDR抗性机制的化学增敏剂。
特沙弗林作为化学增敏剂可在化疗药物服用前服用，也可与化疗药物同时或服用化疗药物后再服用。目前优选服用化疗药物后再服用特沙弗林。特沙弗林可一次服用，也可以在一定时间间隔内分两次或多次服用。特沙弗林可在服用化疗药物后约1分钟到约12小时内服用，优选范围从约5分钟到约5小时。当以两剂或多剂服用特沙弗林时，特沙弗林的服用间隔时间为约1分钟到约12小时，优选约5分钟到约5小时，最优为约4到5小时。服用方法可以重复例如1到3次。一个成功的体内服用的时间表为服用化疗药物约5分钟和约5小时后，服用特沙弗林，每周一次持续三周。特沙弗林的使用剂量为40μmol/公斤体重。用药可在静脉、腹膜内、非肠道途径、肌肉内或者皮下注射、口服或局部用药。优选口服或静脉注射，以静脉注射为更优选。
本发明方法中使用的特沙弗林用药量为药物有效剂量。“药物有效”是指可以增加化疗药物毒性的剂量。具体剂量要根据所选择的具体类型的特沙弗林、使用次数以及服用的化疗药物来决定。这样的剂量按本领域的已知方法或本文中描述的方法无需很多实验就可以确定。
本领域技术人员按照本公开可以认识到上述治疗方案的灵活性，可以不需过多实验就能在具体条件下试验特沙弗林使用的最佳时间和最适剂量。
作为化学增敏剂的特沙弗林或特沙弗林金属配合物可以有如下结构Ⅰ或结构Ⅱ
Ⅰ
ⅡM可以是H，一种二价金属阳离子或是三价金属阳离子。优选为二价或三价的金属阳离子。优选的二价金属阳离子有Ca(Ⅱ),Mn(Ⅱ),Co(Ⅱ),Ni(Ⅱ),Zn(Ⅱ),Cd(Ⅱ),Hg(Ⅱ),Fe(Ⅱ),Sm(Ⅱ)或是UO2(Ⅱ)。优选的三价金属阳离子为Mn(Ⅲ),Co(Ⅲ),Ni(Ⅲ),Fe(Ⅲ),Ho(Ⅲ),Ce(Ⅲ),Y(Ⅲ),In(Ⅲ),Pr(Ⅲ),Nd(Ⅲ),Sm(Ⅲ),Eu(Ⅲ),Gd(UⅢ),Tb(Ⅲ),Dy(Ⅲ),Er(Ⅲ),Tm(Ⅲ),Yb(Ⅲ),Lu(Ⅲ),La(Ⅲ)或是U(Ⅲ)。
R1-R4,R7和R8相互独立地为氢，卤原子，羟基，烷基，链烯基，炔基、芳基、卤代烷基，硝基，甲酰基，酰基，羟烷基，烷氧基，羟烷氧基，羟链烯基，羟炔基，糖类，羧基，羧烷基，氨基甲酰基，氨甲酰烷基，氨基，氨烷基，位点导向分子或是与位点导向分子偶联的配体。
R6和R9独立地选自R1-R4,R7和R8，其前提条件是卤原子不是碘，而且卤代烷基不是碘代烷基。
R5和R10-R12相互独立地为氢，烷基，链烯基，炔基，芳基，羟烷基，烷氧基，羟烷氧基，羟链烯基，羟炔基，羧烷基，氨甲酰基，氨甲酰烷基，氨基，氨烷基，与糖基偶联的配体或是与位点导向分子偶联的配体，n是小于或等于5的整数。
R13是烷基，链烯基，氧烷基或羟烷基，其含有至多3个碳原子且围绕第一个结合碳原子有转动挠性。这种转动挠性使得其余基团可定位在特沙弗林分子平面外。例如，优选的链烯基是CH2-CH=CH2。吡咯氮原子的取代基优选甲基。有甲基连于环氮原子上的特沙弗林在美国专利5,457,183中有叙述，该专利引入此处做参考。
上面描述的结构Ⅰ中，典型的n为小于或等于5的整数。在含有二价或三价金属阳离子的碱性大环类化合物中，n是1或2；然而，本领域技术人员按照本公开可以认识到，n值可随着取代基R1-R12的电荷数或随着共价结合的位点导向分子的电荷数而改变。本领域技术人员可以理解本发明描述的配合物有一个或多个附加配基使其达到电中性或者和/或使金属离子达到配位饱和。这样的配基包括氯离子，硝酸根，乙酸根和氢氧根及其他。
本发明中用作烷基取代基的代表性烷烃包括甲烷、乙烷，直链、支链或环状异构的丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷和癸烷。优选甲烷、乙烷和丙烷。多至三十，四十或约五十个碳原子的烷基也在本发明的预期中。代表性的烷基取代基包括被两个或者多个本文描述的功能团取代的烷基。
用作链烯基取代基的代表性例子包括乙烯，直链、支链或环状异构的丙烯、丁烯、戊烯、己烯、庚烯、辛烯、壬烯和癸烯，优选乙烯和丙烯。多至三十、四十或五十个碳原子和多至五个双键优选多至三个双键的链烯基也包括在本发明的预期中。
用作炔基取代基的代表性炔包括乙炔、直链、支链及环状异构的丙炔、丁炔、戊炔、己炔、庚炔、辛炔、壬炔和癸炔，其中优选乙炔和丙炔。多至三十或五十个碳原子和多至五个或三个三键的炔基也包括在本发明的预期中。
芳基可以是带有苯、萘、菲和蒽等特征性环状结构或者类似结构的化合物，可以是6-碳环的苯，也可以是其它芳香族衍生物的缩合的6-碳环。如芳基可以是未被取代的苯基或萘基，也可以是由硝基，羧基，磺酸，羟基，烷氧基或卤原子取代的苯基或萘基。在这些情况中，苯基或萘基的取代基可以在形成大环的缩合反应后通过合成步骤加入。
在卤取代基中，除去R6和R9不为碘外，本发明的实践中预计使用氯、溴、氟和碘。R6和R9可以是氯、溴和氟取代基。本发明中有代表性的卤代烷包括卤代甲烷、乙烷、丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷。优选甲烷、乙烷和丙烷的卤代物，优选氯代物或溴代物。
羟烷基是指醇烷基。优选的是带有1到20，尤其是1到10个羟基的羟烷基。羟烷基意在包括二元醇和聚二醇；烷二醇，优选C1-10烷二醇，尤其优选C1-3烷二醇；也包括聚乙二醇，聚丙二醇和聚丁二醇及含有亚乙基、亚丙基和亚丁基的组合的聚亚烷基二醇。
氧烷基的代表性例子包括这里描述的带有醚键的烷基。“氧烷基”意在包括含有一个或多个功能团的聚醚。取代基中氧烷基的重复数可多至200个，优选1到20个，更优选1到10个，最优选1到5个。一个优选的氧烷基是O(CH2CH2O)xCH3，其中x等于1到100，优选1到10，最优选为1到5。
氧羟烷基是指含有醚键或酯键、含有羟基、取代的羟基、羧基、取代的羧基或其它基团的烷基。
巯烷的代表性例子有乙硫醇、直链、支链或环状异构的丙烷、丁烷、戊烷、己烷、庚烷、辛烷、壬烷、癸烷的硫醇。优选乙硫醇(C2H5SH)和丙硫醇(C3H7SH)。硫酸基取代的烷基包括上面描述过的烷基由一种或多个硫酸基因取代，代表性例子有硫酸二乙酯((C2H5)2SO4)。
磷酸酯的代表性例子有磷酸酯或聚磷酸酯基。磷酸取代的烷基的代表性例子有用一个或多个磷酸基团取代的上面描述过的烷基。
羧基代表性例子包括上面描述过的烷基的羧酸和芳香羧酸如苯甲酸。代表性的氨甲酰例子包括伯氨甲酰(CONH2)，仲氨甲酰CONHR′和叔氨甲酰(CONR＇R″)，其中R′和R″是描述过的功能基团。
代表性胺基的例子包括上面描述过的烷基的伯、仲和叔胺。“氨甲酰基”是指带有仲或叔酰胺键或类似键的烷基。“羧烷基”是指带有羟基、羧基或酰胺取代的醚键或酯键，带有从醚或类似物中去除的叔酰胺键的烷基。
“糖基”包括氧化的、还原的或取代的糖；六碳糖如D-葡萄糖、D-甘露糖或D-半乳糖；五碳糖如D-核糖或D-阿拉伯糖；酮糖如D-核酮糖，或D-果酮糖；双糖如蔗糖、乳糖或麦芽糖；衍生物如乙缩醛、胺和磷酸化的糖；寡糖和各种糖的开链形式。氨基衍生化糖的例子有半乳糖胺、葡萄糖胺、唾液酸和D-葡萄糖胺的衍生物如1-氨基-1-脱氧山梨糖醇。本文所用的“位点导向分子”可以是寡核苷酸、抗体、激素、对生物受体有亲和力的肽、Sapphyrin分子或是类似的分子。优选的位点导向分子是激素，如雌二醇、雌激素、孕酮或是类似的分子。位点导向分子对治疗位点有特异性结合能力。生物受体也分布在治疗位点。特沙弗林-寡核苷酸偶联物能够将化疗活性定位在特定期望的位点，其中的寡核苷酸可以是癌基因mRNA的互补物。美国专利5,194,482；5,110,802和5,216,144中讨论了反义技术，此处引用这些文献作为参考。
类固醇代表性例子包括有下列五种类固醇激素孕酮(如黄体酮)、糖皮质激素(如皮质醇)、盐皮质激素(如醛固酮)、雄激素(如睾丸酮)和雌激素(如雌二醇)。
肽或多肽的氨基酸代表性例子包括带有简单的脂肪族侧链的氨基酸(如甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)，带有芳香族侧链的氨基酸(如苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸和组氨酸)，带有含氧和硫侧链的氨基酸(如丝氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸)，带有羧酸或酰胺基的侧链的氨基酸(如天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺)，带有强碱性基团侧链的氨基酸(如赖氨酸和精氨酸)，和脯氨酸。肽的代表性例子有由上述氨基酸衍生而来的自然存在的或人工合成的二、三、四亚肽或更长的肽。(如，内啡肽、脑啡肽、表皮生长因子、聚-L-赖氨酸或是激素)。多肽的代表性例子有由上述氨基酸和肽衍生而来的自然产生的和人工合成的多肽(如胰岛素、核糖核酸酶和内啡肽)。
“对生物受体有亲和力的肽”一词是指在适宜的离子强度、温度、pH等条件下肽与生物受体一旦接触，就会发生特异性结合。这种反应可以在特异的静电力、疏水作用力、熵的作用下完成，也可通过肽上特定的氨基或糖残基与受体上特定的氨基或糖残基在促进反应的条件下形成稳定的复合物。此反应可能改变参与反应的肽或受体的空间构象、功能或活性。对生物受体有亲和作用的肽可以包括内啡肽、脑啡肽、生长因子如表皮生长因子、聚-L-赖氨酸、激素、蛋白质中的一个肽段等。激素可以是例如雌二醇。
配体可以描述为一个接头，即通过设计的活性基团反应形成的共价产物，它可以共价结合另一个与特沙弗林大环分隔的分子。接头或配体的例子有酰胺，氨，二硫键，硫醚，醚，酯或磷酸酯共价键。
在最优选的实施方案中，偶联物和附加基团通过碳-碳，碳-氮，碳-硫或碳-氧键共价结合到特沙弗林上，更优选的是碳氧键和碳氮键。
一般而言，此处描述的应用中优选保留亲脂性的水溶性特沙弗林。“水溶性”是指水中的溶解度大于等于约1mM。“保留有亲脂性”是指对富含脂肪的组织或材料的亲和力大于周围的非富含脂肪的组织。“富含脂肪”是指含有较多的甘油三酯，胆固醇和脂肪酸等。
优选的功能基方案是当R6和R9不是氢时，R5和R10是氢或甲基；当R5和R10不是氢，则R6和R9是氢，羟基或是非碘的卤原子。其它优选的功能基方案是当R6和R9是氢，则R5,R10,R11和R12相互独立地为氢，苯，低级烷基或低级羟烷基。优选的低级烷基是甲基或乙基，优选甲基。优选的低级羟烷基是1到6个碳原子和1到4个羟基的羟烷基，优选3-羟基丙基。苯基可以是被取代的，也可以是未被取代的。
在其他目前优选的特沙弗林化合物Ⅰ或者Ⅱ中，R1-R12基团见表A和表B中的特沙弗林A1-A88,M则是上面描述过的基团。表中“SDM”是指“位点导向分子”。较为优选的化合物是GdT2BET(化合物Ⅲ，其中M=Gd(Ⅲ))和LuT2BET(化合物Ⅲ，其中M=Lu(Ⅲ))。本发明并不局限于目前优选采用的特沙弗林。
Ⅲ
表A本发明中特弗沙林大环A1-A88上的代表性取代基R1-R6的取代基见表A,R7-R12的取代基见有B.
<p>表A-续前
表A-续前
表A-续前
<p>表A-续前
<p>表A-续前
表B本发明中特弗沙林大环A1-A88上的代表性取代基R1-R6的取代基见表A,R7-R12的取代基见有B。
表B-续前
<p>表B-续前
<p>表B-续前
<p>表B-续前
表B-续前
表B-续前
重要的是，通过特定取代基合成的特沙弗林可以影响特沙弗林的脂-水分配系数，从而更适于与化疗药物联合使用。本文引用关于特沙弗林、特沙弗林制备方法及其应用的美国专利、PCT公开文本和未决申请专利申请作为参考。Sapphyrin化合物在美国专利5,041,078；5,159,065；5,120,411；5,302,714和5,457,195中已经公开，此处引用这些文献作为参考。
有机合成技术人员按照本公开以及作为参考材料的专利、专利申请和公开文本可以扩展或改进上述参考的基本合成路线，从而生产出具有不同取代基的特沙弗林。例如，聚醚连接的多羟基基团，通过乙缩醛糖苷键连接的糖类取代基、寡糖或多糖可用类似方法连接到特沙弗林上。其中羧基通过芳香醚或官能化烷基取代基连接到特沙弗林核的双羧酸特沙弗林可以被转化成不同的酯化产物，其中酯键用以连接更多的带有羟基的取代基。多羟基化特沙弗林可以通过使用仲酰胺键合成。糖基部分可通过酰胺键加入。含有的支链多羟基亚基的多羟基特沙弗林衍生物可以通过芳香醚或酯键加入到特沙弗林核上。
用亚硫酰氯或对硝基苯酚乙酸酯处理羧化的特沙弗林可以产生活化的酰基，适于连接到单克隆抗体或其它感兴趣的生物分子上。可以用标准的就地偶联方法(如，1,1’-羰基二咪唑)进行偶联。
大环B部分(苯环)的R6和R9取代基通过在分子3,6位上与邻苯二胺结合联接到大环上。大环的T部分(三吡咯烷)上R5和R10取代基通过在与取代的邻苯二胺缩合之前的合成步骤P三吡咯烷5位上羧基的适当官能化而引入。
通过缩合结构A的三吡咯烷醛或酮和结构B的取代的邻苯二胺方便地制得非芳香特沙弗林。
取代基R1-R13如文中所述。在一优选的合成方法中，三乙胺或N,N,N′,N＇-四甲基-1,8,-二氨基萘(质子受体)作为布朗斯台德碱，氧化剂是空气饱和有机溶剂、氧、氧化铂、邻氯醌或是2,3-二氯-5,6-二氰基-1,4-苯醌。回流步骤中搅拌或加热的情况包括搅拌或加热回流混合物24小时，有机可溶剂包括甲醇、或是甲醇和氯仿、或是甲醇和苯、或是甲醇和二甲基甲酰胺。
作为化学增敏剂，特沙弗林以药物制剂的形式提供。特沙弗林药剂可单独服用，也可以和药学可接受的载体一道以单一或多个剂量服用。适宜的药物载体包括惰性固体稀释剂或填充剂，无菌水溶液和不同的有机溶剂。由本发明的特沙弗林与药学可接受的载体联合构成的药物组合物可以方便地以不同剂型使用，如注射液。
采用肠道外给药方式时，可以使用特沙弗林在芝麻油或花生油、含水丙二醇或无菌水溶液中的溶液。这样的水溶液如有需要应进行适当的缓冲化，液体稀释剂应先用足量的盐或葡萄糖致等渗。这些特定的水溶液尤其适于静脉内、肌肉内、皮下或腹膜内注射。与此相关，按照本公开本领域技术人员了解可使用的无菌水介质。
适于注射用的剂型包括无菌水溶液或分散剂，或是用于现配现用的无菌注射液或分散剂的无菌粉末。无论何种剂型都必须是无菌的，必须是注射器易于使用的液体。该剂型需在制造、贮藏条件下稳定，且保证不受到诸如细菌、真菌等微生物的污染。载体可以是包括如水、乙醇、多羟基化合物(如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇等)及其适宜的混合物和植物油等的溶剂或分散剂。通过适当的包衣如卵磷脂来维持适当的流动性，对分散剂也可通过维持所需的颗粒大小和使用表面活性剂来维持适当的流动性。可使用抗细菌和抗真菌的药物如对羟基苯甲酸酯类、氯代丁醇、苯酚、山梨酸或乙基汞硫代水杨酸钠等来防止微生物的作用。在许多情况下，优选包括如糖(甘露糖醇或葡萄糖)或氯化钠的等渗剂。更优选的等渗剂是2％～8％的甘露糖醇溶液，最优选的是5％的甘露糖醇。通过在组合物中使用延缓吸收剂如单硬酯酸铝和明胶来获得延缓吸收型注射组合物。
无菌注射液是将活性化合物与其它上面列举的成分以适当的量溶于适当的溶剂中再经过过滤除菌制得的。一般地，分散剂是通过将各种无菌活性成分与带有基本分散介质和上面列举的必需的其它成分一起混合而制得的。对于用于制备无菌注射液的无菌粉末，优选的方法是通过真空干燥或冷冻干燥的方法从预先过滤除菌的溶液产生。产生的无菌粉末中带有活性成分和其它附加的所需成分。
此处所说的“药学可接受的载体”包括任何和全部的溶剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂、等渗和延缓吸附剂等。这样的介质和试剂用于药物活性物质已为本领域周知。除非某些常规介质或试剂与活性成分不相容，药物组合物中使用这样的介质或试剂是在预期之中。补充的活性成分也可以包括在组合物中。
本发明设想特沙弗林可用作不同作用机制的不同化疗药物的化学增敏剂以增加细胞毒性。表2提供了目前已有的按类别分的化疗药物以及相应的病症。
表2用于治疗肿瘤疾病的化疗药物1)表2(续)
表2(续)
表2(续)
1)改编自Calabresi,P.BA.Chabner,“肿瘤疾病的化学治疗”第Ⅻ章，1202-1263页，后者出自《古得曼与吉尔曼治疗的药学基础》(Goodman and Gilman’s The Pharmacological Basis of Therapeutics)第8版，1990年Pergamin出版公司；Barrows,L.R，“抗肿瘤和免疫活性药物”，第75章，1236-1262页，出自Remington《药学的科学与实践》(The Science and Practice of Pharmacy)，Mack出版公司，Easton，宾西法尼亚州，1995；此处引用这些参考文献作为参考。2)肿瘤疾病是指癌，除非别有说明。
虽然一定程度地具体描述本发明，显然按照前述公开，对本领域技术人员而言可以方便地加以改变、修饰和变化。因此，所有这样的改变、修饰和变化，凡是落在本发明的精神和领域范围内的均应认为包括在本发明的权利要求范围中。
本发明提供下面的实施例用以展示本发明的优选实施方案。本领域的技术人员应认识到下列实施例中公开的技术代表发明人发现在本发明的实施中效果良好的技术，因而应认为构成实施本发明的优选方案。然而，按照本公开，本领域技术人员知晓在所公开的特定实施方案中可以有许多改变，而仍可获得相近或相似的结果，因而没有超出本发明的精神和范围之外。实施例1特沙弗林联合博莱霉素的细胞毒性本实施例提供了钆特沙弗林作为化学增敏剂联合博莱霉素的细胞毒性的研究。博莱霉素是一种基本的糖苷类抗生素，可以引起DNA断裂，抑制胸腺嘧啶结合到DNA上(Barrows,L.R.,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton,宾州，1234-1244页，1995)。钆特沙弗林(GdT2BET)是化合物Ⅱ，其中M为Gd(Ⅲ)。
使用改进的MTT法(Mosmann,1983)进行体外研究。培养在McCoy5A完全培养基(0.2毫升，其中含有3,000-5,000个细胞)中的MES-SA细胞(一种杂交的米勒氏人子宫肉瘤细胞系，斯坦福医学院，斯坦福，加州)加到96孔板中的每一孔。细胞贴壁过夜。GdT2BET(100ml,2mM 5％甘露醇溶液)以50μM,100μM或150μM的浓度加入到每孔中。博莱霉素溶液(100μl,100μM)加入到孔板第一行的每孔中，使药物以1∶3比例稀释。每孔中的培养基充分混匀后取100ul移到对应的下一行的孔中得到相应的稀释液。重复上述稀释步骤，保留最后一行的孔作为对照，丢弃最后100μl含有药物和特沙弗林的培养基。系列稀释转移步骤得到了原药博莱霉素浓度1∶3,1∶9,1∶27,1∶81和1∶243比例的梯度稀释液。
细胞在含有药物和GdT2BET的培养基中生长48小时。每孔中加入溶于磷酸盐缓冲液(PBS)中的MTT(20μl,5mg/ml)。(MTT，学名为3-(4,5-二甲基-噻唑-2-基-2,5-二苯基溴化四唑，Sigma,St.Louis,Mo))。孔板在37℃且CO2含量为5％的组织培养箱中培养。培养2-3小时后，轻轻倒掉培养基，加入0.1～0.15ml用0.1N盐酸酸化的异丙醇(JT Baker化学有限公司，Phillipsburg，新泽西)以溶解细胞形成的甲替结晶。用多孔分光光度计(MR-580型，DynatechLaboratories,Alexandria,VA)读取570nm波长和参考波长630nm的孔板的吸收值。每一浓度的药品重复测定四次。存活百分率根据经过药物处理的细胞的光密度值(OD)与对照细胞的比值计算。
不同浓度的博莱霉素在50μM,100μM和150μM GdT2BT存在下对MES-SA细胞的细胞毒性数据说明，存在特沙弗林时，细胞的存活百分率明显要低。在受测试的博莱霉素各种浓度下及特沙弗林受测试的三个浓度均显示有细胞毒性增强作用。实施例2特沙弗林联合阿霉素的细胞毒性本实施例提供了以GdT2BT特沙弗林作为化学增敏剂联合阿霉素的细胞毒性的研究。阿霉素是一种蒽环类抗生素，它可以结合到DNA上，抑制核酸合成，抑制拓扑异构酶Ⅱ作用以及产生氧自由基；它具有最宽的抗肿瘤谱并且是应用最广的抗肿瘤药物(Barrows,L.R.,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton，宾州，第1249页，1995)体外研究的方法按实施例1中所描述的方法用阿霉素(100μl,1000nM)和GdT2BET(2mM溶于5％甘露醇；50μM,100μM和150μM)来进行研究。这些研究表明特沙弗林有保护性作用。下面提供的阿霉素体内实验结果表明，上面的体外实验结果由于是同时服用阿霉素和特沙弗林得到的，可能是异常结果。
为检证这一假设，按如下方法又进行一次体外实验。按照实施例1中的方法，但是只是先将阿霉素自身加入到96孔板中第一行的每一孔中，然而依次连续稀释。细胞在有药情况下培养24小时，然后用培养基洗涤孔板，吸去培养基。将GdT2BET(150μM)加入到新鲜培养基中，再将该培养基加到每个孔中。特沙弗林和细胞一起培养24小时，然后加入MTT，剩余检测方法如实施例1中描述。第二次体外实验的结果表明，在有特沙弗林时阿霉素的细胞毒性增强了。
用皮下移植了EMT6瘤的Balb/c小鼠进行体内实验。EMT6瘤是一种鼠乳癌，阿霉素的体内抗肿瘤活性已经在MTV乳癌中由Grandi等人(1988)和Di Marco等人(1972)描述过。在本研究中，阿霉素以2mg/ml的浓度溶于乳酸盐林格溶液中。GdT2BET以2mM的浓度溶解在5％的甘露醇中。EMT6瘤(获自J.Martin Brown博士，斯坦福医学院，斯坦福，加州)移植到Balb/c鼠的右侧胁腹皮下(Simonsen Laboratories,Gilroy,加州)；14只小鼠为一组。研究方案见表3。实验方案每周重复一次，共持续三周；每周用游标卡尺测量肿瘤2～3次，注射药物前称小鼠体重。
在所有实验组中，实验结果表明，注射阿霉素后注射特沙弗林可以明显增加细胞毒性。在ADR+2GdT2BET组中两例治愈。“治愈”一词是指研究结束后无疾病证据，即动物看上去没有肿瘤。表3用特沙弗林增加阿霉素(Adriamycin,ADR)作用效果的体内化学增敏研究方案
利用上述ADR对照，ADR+2GdT2BET方案以及一个包括GdT2BET(40μmol/kg)注射后5小时，再注射ADR(7.5mg/kg)，5分钟后再次注射GdT2BET(40μmol/kg)的三步骤注射方案进行进一步研究。实验方案每周重复一次共三周，每周用游标卡尺测量肿瘤直径2-3次。结果表明，有钆特沙弗林时，细胞毒性得到增强，其中ADR+2GdT2BET组观察到两例治愈。实验数据还显示使用特沙弗林/ADR/特沙弗林的三步治疗法细胞毒性可能过大，因为该组六只动物中有三只死亡，其中首次注射特沙弗林死亡两只，另一只在第二次注射特沙弗林后死亡。
对仅注射阿霉素(ADR)组和注射阿霉素5分钟和5小时后再注射特沙弗林(ADR+2GdT2BET)组的实验数据进行标准差分析，结果见图1。在ADR+2GdT2BET组中观察到四例治愈，九天后的P值小于0.05。
进一步体内研究用胁腹侧移植了B-16F10黑素瘤的45只C57BL/6N小鼠进行。实验动物分成三组，每组15只，各组分别按如下方案处理ⅰ)对照组(不处理)；ⅱ)仅使用阿霉素处理，7.5mg/kg，ⅲ)用阿霉素(7.5mg/kg)后5小时再用20μmol GdT2BET/公斤体重处理。治疗组在第0,7,14日接受治疗。对照组平均存活时间为21天，仅使用阿霉素组平均存活时间为29天，而使用阿霉素和特沙弗林的组平均存活时间为40天(见图3)。与仅使用阿霉素治疗的动物组相比，使用阿霉素+GdT2BET组的存活曲线的对数秩分析表明存活率有明显提高(P=0.0047)。单独使用GdT2BET的动物组其存活率与对照组相同。
本实施例的数据清楚地表明特沙弗林的化学增敏效果。在用适当的治疗方案联合阿霉素使用特沙弗林时，可以增加细胞毒性。实施例3特沙弗林联合紫杉醇的细胞毒性本实施例提供了用钆特沙弗林作为化学增敏剂联合紫杉醇的研究结果。紫杉醇(Paclitaxel，这是Bristol-Myers Oncology对紫杉醇的商品名)通过稳定丝裂纺锤体和不当地促进其形成来抑制细胞有丝分裂(Barrows,L.R,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton，宾州，第1249页，1995)。
体外研究按实施例1中描述方法用紫杉醇(100μl,1000nM)和GdT2BET(50μM,100μM或150μM)加入到每个稀释度的药物中来进行。研究结果表明，特沙弗林对细胞毒性，尤其是在紫杉醇浓度较低时，有增强作用。
用人纤维肉瘤细胞HT1080进行体外研究表明，无论LuT2BET还是GdT2BET在浓度为30μM时，对紫杉醇的细胞毒性没有影响。实施例4特沙弗林联合4-OH环磷酰胺的细胞毒性本实施例提供了使用钆特沙弗林作为化学增敏剂联合4-OH环磷酰胺的细胞毒性的研究结果。环磷酰胺是一种烷化剂(Barrows,L.R,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton，宾州，第1238,1246页，1995)。
体外研究按实施例1中描述的方法用4-OH环磷酰胺(100μl,100μM)和GdT2BET(50μM,100μM和150μM)加入到每个稀释度的药物中来进行。在4-OH环磷酰胺浓度较低时的结果表明特沙弗林有保护作用。这一结果也许是异常的，类似于实施例2中同时使用阿霉素和特沙弗林得到的异常结果。
体外研究用皮下移植了EMT6肿瘤的Balb/c小鼠按实施例2描述的方法进行。4-羟环磷酰胺以5mg/ml的浓度溶于0.9％NaCl中。GdT2BET以2mM浓度溶于5％的甘露醇中。EMT6肿瘤移植到Balb/c小鼠的右侧胁腹部皮下，9只鼠为一组。第1组服用环磷酰胺(CY)40mg/kg；第2组服用环磷酰胺(CY)40mg/kg 5分钟后，再服用GdT2BET(40μmol/kg)；第三组服用环磷酰胺(CY)40mg/kg 5分钟和5小时后，分别服用GdT2BET40μmol/kg。这一处理方案每周重复一次共三周。
研究结果表明，用特沙弗林和环磷酰胺按此治疗方案没有什么化学增敏作用。实施例2中的结果显示，特沙弗林联合阿霉素的化学增敏效果有治疗方案依赖性，进一步研究会阐明环磷酰胺的细胞毒性能否在其它使用特沙弗林的治疗方案中得到增强。实施例5特沙弗林联合依托泊苷的细胞毒性本实施例提供了钆特沙弗林作为化学增敏剂联合依托泊苷的细胞毒性研究结果。依托泊苷主要通过拓扑异构酶Ⅱ的切割破坏DNA，使细胞周期基本停留在G2期(Barrows,L.R.,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton，宾州，第1249页，1995)。
体外研究按实施例中描述的方法用依托泊苷(100μl,100μM)和GdT2BET(50μM,100μM或150μM)加入到每个稀释度的药物中来进行。这些研究结果表明，特沙弗林对细胞毒性，尤其是在低浓度的依托泊苷时有增强作用。
进一步的体外研究中，30μM GdT2BET对依托泊苷治疗人纤维肉瘤细胞HT1080有化学增敏作用，而30μM的LuT2BET则没有。实施例6特沙弗林联合顺铂的细胞毒性本实施例提供了钆特沙弗林作为化学增敏剂联合顺铂的细胞毒性的研究结果。顺铂使DNA交联，从而起类似烷化抗肿瘤药物的作用(Barrows,L.R.,Remington药学科学和实践，Mack出版公司，Easton，宾州，第1249页，1995)体外研究按实施例1描述的方法用顺铂(100μl,100μM)和GdT2BET(50μM,100μM和150μM)加入到每一稀释度的药物中进行。这些研究结果表明特沙弗林对细胞毒性，尤其是在低浓度顺铂时，有增强作用。
进一步用人纤维肉瘤细胞HT1080的体外研究表明，100μMGdT2BET联合10μM的顺铂有化学增敏作用，而100μM的LuT2BET则没有。实施例7体外特沙弗林化学增敏性结果小结本实施例提供了由实施例1和实施例3到6中体外MTT细胞毒性检定法测得的结果小结。图2表明了三种不同浓度的GdT2BET和一种受试化疗药物对MES-SA细胞的IC50值与对照组之差。与特沙弗林联合的受试化疗药物分别为紫杉醇，依托泊苷，4-OH环磷酰胺，顺铂和博莱霉素。由于如实施例2中所描述的体外治疗方案与其它药物有所不同，故阿霉素的研究结果未包括在本小结中。所有研究结果显示有特沙弗林时具有细胞毒性增强的效果。联合博莱霉素时显示特别明显的活性增强作用(图2)。实施例8特沙弗林和阿霉素的血液学研究本实施例提供了钆特沙弗林和阿霉素对普通小鼠的联合毒性作用的血液学研究结果小结。
8只Balb/c小鼠组成的对照组不予处理。第二组8只小鼠按7.5mg/kg剂量注射阿霉素，每周一次共三周。第三组如第二组一样注射阿霉素后5分钟，再以40μmol/kg剂量注射GdT2BET，每周一次共三周。血液学常规数值由加州兽医诊断公司提供(California Veterinary Diagostics,Inc.West Sacramento,加州)。分别于首次注射和末次注射两周后测定白细胞，红细胞，血红蛋白(gm/dL)及血小板数目。
通过测定外周白细胞、血小板数目和血红蛋白值的结果清楚表明，当特沙弗林联合阿霉素使用时，不增加由阿霉素引起的骨髓毒性。在对四个参数的研究中，在两个时间表内，接受阿霉素和特沙弗林组的数值十分接近于仅使用阿霉素治疗的小鼠组中测得的值，两者的差异在误差允许的范围之内。这些结果进一步说明特沙弗林在体内无细胞毒性，尤其是对骨髓无毒性。实施例9MDR和非MDR细胞系对特沙弗林的吸收及化学增敏效果本实施例提供了表明镥特沙弗林的吸收和钆特沙弗林的化学增敏效果不依赖于宿主的多药抗药性表型的数据。
镥特沙弗林的吸收用表达多药抗药性蛋白的鼠白血病细胞系P388/ADR(Gottesman和Pastan,1993)及缺乏此蛋白的细胞系P388(Johnson等，1982)进行测试。P388和P388/ADR细胞以细胞浓度7mg/ml(湿重)悬浮在FHS培养基(Fisher培养基中20mM HEPES,pH7.2,代替NaHCO3)中，与镥特沙弗林(化合物Ⅲ，其中M=Lu(Ⅲ),LuT2BET)一起37℃培养30分钟。荧光测定显示两种细胞系对特沙弗林的吸收无差别。
用GdT2BET联合化疗药物4-OH环磷酰胺，依托泊苷，阿霉素，顺铂和博莱霉素测定对野生型人肉瘤细胞系MES-SA及阿霉素选择性mdr1变株MES-SA/Dx5细胞(斯坦福医学院，斯坦福，加州)的细胞毒性。所有化疗药物在特沙弗林配合下对全部细胞系均有效，表明特沙弗林的作用机制不依赖于P-糖蛋白。实施例10选择可用特沙弗林作为化学增敏剂的化疗药物的方法本实施例提供了选择可用特沙弗林作为化学增敏剂的化疗药物的方法。使用如实施例1中描述的体外细胞毒性检定方法，如MTT细胞毒性检定法，在有特沙弗林时从侯选化疗药物中筛选可增加细胞毒性的化疗药物。此外，还可以用体内模型在有特沙弗林时考察候选化疗药物的细胞毒性的增强效果。实施例2中的鼠的研究就是一个例子。与不存在特沙弗林时的细胞毒性相比，有特沙弗林时细胞毒性增强了的化疗药物可以认为是一种可用特沙弗林作为化学增敏剂的化疗药物。
进一步，培育转基因小鼠来检测潜在化学增敏剂对逆转药物抗性的作用(Mickisch等，1991)。这些小鼠在它们的骨髓细胞中表达MDR基因，对由如蒽环类抗生素等天然产物引起的白细胞减少有抗性。这种药物抗性可以通过剂量依赖性方式加以克服，即同时注射如维拉帕米和奎宁的药物。这种MDR-1转基因小鼠模型也可用于检测可用特沙弗林作为化学增敏剂的化疗药物。
最佳的化学增敏效果可通过变化化疗药物与特沙弗林的剂量、注射时间与方法来找到。每种药物的注射时间与方法、每种药物的剂量、动物对每种药物的昼夜节律反应等因素都需要每次变化一项逐一测试，以达到特沙弗林最佳的化学增敏效果。实施例11特沙弗林光能治疗化学增敏作用特沙弗林的光能治疗化学增敏作用(PDT-化学增敏)包括对患有癌症的患者联合使用特沙弗林和化疗药物，从而使光照部位的化疗药物治疗效果增强的方法。本方法进一步提供了与传统化学增敏作用相比的特异性和定位性优点。
特沙弗林是用于光能治疗(PDT)的有效光增敏剂。它在组织透明的720-770nm范围有较强的吸收，并且可以产生足够量1O2。而且，用特沙弗林进行光能治疗的效果既使在有颜色的组织如黑色素瘤组织中也仍有效。
在本发明的PDT-化学增敏方法中，对打算采用化疗的患有癌症的患者或受试者服用化疗药物和光敏感的特沙弗林，随后对癌症周围部位光照。化疗药物选自表2中所列的药物。光敏感的特沙弗林服用剂量为药物有效剂量。“药物有效剂量”是指与化疗药物联合使用后一经光照就可以增加光照范围附近的细胞杀伤作用的剂量。所需剂量随着所选的特沙弗林种类、给药方案的选择、光照时间和注射的时间等不同而不同。这种剂量用本领域技术人员已知的方法或依本文描述的方法不需过多的实验就可确定。例如LuT2BET可按约5～40μmol/kg剂量静脉注射到接受化疗药物(如用紫杉类化合物治疗乳腺癌)治疗的患者。此后数分钟到几小时使用光照射。光源可以是如激光或是发光二极管。光的波长范围从450nm-900nm，优选700～800nm，最优选730～770nm；光照可以是表面的，内窥镜的或是间质组织的(即通过光导纤维的)形式。
按照本文公开的和权利要求中要求的所有的产品和方法无需过多实验就可以制造和施行。尽管以优选的实施方案的形式描述了本发明中的产品和方法，对于本领域技术人员明显地可在不偏离本发明的概念、精神和范围的基础上，对产品、方法以及此处描述的步骤或步骤顺序加以改变。更确切地讲，显然化学和生理学相关的某些药剂可以替换本文描述的药剂，而获得相同或相似的结果。对那些本领域技术人员而言显而易见的所有这些类似的替代或修饰均被认为属于由权利要求书定义的本发明的精神、范围和概念之内。
下面的参考文献提供了方法、示例或对本文内容的细节补充，本文引用它们做为参考。参考文献Barrows,L.R.,“抗肿瘤和免疫活性药物”，(Antineoplastic andImmunoactive Drugs”)第75章，1236-1262页，雷明顿药学科学和实践”Remington:The Science and Practice of Pharmacy)，马克出版公司(Mack Publishing Co.),Easton,PA,1995。Dalton,W.S.,美国癌症研究协会会报，(Proc.Am.Assoc.Cancer Res.)31:520,1990。De Vita,V.T.等，癌症，肿瘤学原理与实践(Cancer,Princile&amp;Practice ofOncology),第四版，J.B.Lippincott公司，费城，PA,2661-2664页.1993。Di Marco,A.等，癌症化疗报告(Cancer Chemotherapy Reports),56:153-161,1972。Calabresi,P.和B.A.Chabner,“肿瘤疾病的化疗治疗”(Chemotherapyof Neoplastic Diseases”第Ⅻ部分，1202-1263页，古德曼和吉尔曼化疗的药理学基础(Goodmen and Gilman′s The Pharmacological Basisof Therapeutics)第8版，1990,Pergamin Press,Inc。Gottesman,M.M和I.Pastan，生物化学年鉴(Ann.Rev.Biochem.),62:385-427,1993。Grandi,M.等“蒽环类抗生素类似物的筛选”(Screening of anthracycline analogs)，蒽环类和蒽二酮类抗癌症药物(Anthracycline and anthraceneclione-based anticancer agents)生物活性分子(Bioactive Molecules)卷6，第ⅩⅤ章，J.W.Lown编,Elsevier,1988。Johoson,R.K.等，癌治疗报告(Cancer Treat.Rep.)62:1535-1547,1982。Mickisch,G.H等，美国国家科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)88:547-551,1991。Mosmann，免疫学方法杂志(J.Immunological Methods),65:55-63,1983。Raderer,M.和Scheithauer,W.癌症(Cancer),72(12):3553～3563,1993。
权利要求
1．特沙弗林在制备用于与化疗药物一起使用起化学增敏作用的药物组合物中的用途。
2．特沙弗林在制备用于与化疗药物一起治疗受试者癌症的药物组合物中的用途。
3．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林具有结构Ⅰ
其中，ⅠM是氢，二价金属阳离子或三价金属阳离子；R1-R4,R7和R8独立地为氢、卤原子、羟基、烷基、链烯基、炔基、芳基、卤代烷基、硝基、甲酰、酰基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、烃炔基、糖基、羧基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基、位点导向分子或是与位点导向分子偶联的配体；R6和R9独立地选自R1-R4,R7和R8的基团，前提是卤原子不是碘，卤代烷基不是碘代烷；R5和R10-R12独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基或是与糖基或位点导向分子偶联的配体；且n是小于或等于5的整数。
4．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林具有结构式Ⅱ
Ⅱ其中，R1-R4,R7和R8独立地为氢、卤原子、羟基、烷基、链烯基、炔基、芳基、卤代烷基、硝基、甲酰、酰基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、糖基、羧基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基、位点导向分子或是与位点导向分子偶联的配体；R6和R9独立地选自R1上R4,R7和R8的基团，其前提是卤原子不是碘，卤代烷基不是碘代烷基；R5和R10-R12独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基或与糖基或位点导向分子偶联的配体；R13是烷基、链烯基、氧烷基或羟烷基，其含有多至3个碳原子且有围绕第一结合碳原子的旋转挠性。
5．权利要求3的用途，其中R1是CH2(CH2)2OH,R2和R3是CH2CH3,R4是CH3,R7和R8是O(CH2CH2O)3CH3以及R5、R6、R9-R12是H。
6．权利要求5的用途，其中M是三价金属阳离子，该三价金属阳离子是Lu(Ⅲ)。
7．权利要求5的用途，其中M是三价金属阳离子，该三价金属阳离子是Gd(Ⅲ)。
8．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林是一种光敏感性特沙弗林。
9．权利要求8的用途，其中光敏感性特沙弗林与抗磁性金属阳离子配合，抗磁性金属阳离子是Lu(Ⅲ)、La(Ⅲ)、In(Ⅲ)、Y(Ⅲ)、Zn(Ⅱ)或是Cd(Ⅱ)。
10．权利要求9的用途，其中抗磁性金属阳离子是Lu(Ⅲ)。
11．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林与顺磁性金属阳离子配合。
12．权利要求11的用途，其中顺磁性金属阳离子是Mn(Ⅱ),Mn(Ⅲ),Fe(Ⅲ)或除La(Ⅲ),Lu(Ⅲ)和Pm(Ⅲ)以外的镧系三价金属阳离子。
13．权利要求11的用途，其中顺磁体金属阳离子为Mn(Ⅱ),Mn(Ⅲ),Dy(Ⅲ)或Gd(Ⅲ)。
14．权利要求11的用途，其中顺磁体金属阳离子是Gd(Ⅲ)。
15．权利要求1或2的用途，其中化疗药物是烷化剂、抗代谢物、天然产物、激素或拮抗剂。
16．权利要求1或2的用途，其中化疗药物是铂配位复合物、蒽二酮、蒽环类抗生类、取代脲、甲基肼衍生物或肾上腺皮质抑制剂。
17．权利要求1或2的用途，其中化疗药物是紫杉醇、依托泊苷、4-OH环磷酰胺、顺铂、阿霉素或博莱霉素。
18．权利要求1或2的用途，其中化疗药物是阿霉素或博莱霉素。
19．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林在使用化疗药物后使用。
20．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林在表皮给药。
21．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林通过静脉给药。
22．权利要求1或2的用途，其中特沙弗林作为化学增敏剂通过不依赖P-糖蛋白的机制发挥作用。
23．权利要求2的用途，其中癌症是白血病、淋巴瘤、癌或肉瘤。
24．一种化学增敏方法，其包括给有此需要的受试者服用化疗药物和特沙弗林。
25．一种化学增敏方法，其包括给有此需要的受试者服用化疗药物和光敏感性特沙弗林；且对受试者的特沙弗林周围组织进行光照。
26．一种化学增敏方法，其包括给有此需要的受试者服用化疗药物和有放射性增敏特性的特沙弗林；且对受试者的特沙弗林周围组织进行离子化放射线照射。
27．权利要求24,25或26的方法，其中的特沙弗林具有结构Ⅰ
其中，ⅠM是氢，二价金属阳离子或三价金属阳离子；R1-R4,R7和R8独立地为氢、卤原子、羟基、烷基、链烯基、炔基、芳基、卤代烷基、硝基、甲酰、酰基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、烃炔基、糖基、羧基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基、位点导向分子或是与位点导向分子偶联的配体；R6和R9独立地选自R1-R4,R7和R8的基团，前提是卤原子不是碘，卤代烷基不是碘代烷；R5和R10-R12独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基或是与糖基或位点导向分子偶联的配体；且n是小于或等于5的整数。
28．权利要求24,25或26中的方法，其中特沙弗林具有结构Ⅱ
Ⅱ其中，R1-R4,R7和R8独立地为氢、卤原子、羟基、烷基、链烯基、炔基、芳基、卤代烷基、硝基、甲酰、酰基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、糖基、羧基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基、位点导向分子或是与位点导向分子偶联的配体；R6和R9独立地选自R1-R4,R7和R8的基团，其前提是卤原子不是碘，卤代烷基不是碘代烷基；R5和R10-R12独立地为氢、烷基、链烯基、炔基、芳基、羟烷基、烷氧基、羟烷氧基、羟链烯基、羟炔基、羧烷基、氨甲酰基、氨甲酰烷基、氨基、氨烷基或与糖基或位点导向分子偶联的配体；R13是烷基、链烯基、氧烷基或羟烷基，其含有多至3个碳原子且有围绕第一结合碳原子的旋转挠性。
29．权利要求27的方法，其中R1是CH2(CH2)2OH,R2和R3是CH2CH3,R4是CH3,R7和R8是O(CH2CH2O)3CH3以及R5、R6、R9-R12是H。
30．权利要求29的方法，其中M是三价金属阳离子，该三价金属阳离子是Lu(Ⅲ)。
31．权利要求29的方法，其中M是三价金属阳离子，该三价金属阳离子是Gd(Ⅲ)。
32．权利要求24的方法，其中特沙弗林是一种光敏感性特沙弗林。
33．权利要求25或32的方法，其中光敏感性特沙弗林与抗磁性金属阳离子配合，抗磁性金属阳离子是Lu(Ⅲ)、La(Ⅲ)、In(Ⅲ)、Y(Ⅲ)、Zn(Ⅲ)或是Cd(Ⅲ)。
34．权利要求33的方法，其中抗磁性金属阳离子是Lu(Ⅲ)。
35．权利要求24或26的方法，其中特沙弗林与顺磁性金属阳离子配合。
36．权利要求35的方法，其中顺磁性金属阳离子是Mn(Ⅱ),Mn(Ⅲ),Fe(Ⅲ)或除La(Ⅲ),Lu(Ⅲ)和Pm(Ⅲ)以外的镧系三价金属阳离子。
37．权利要求35的方法，其中顺磁体金属阳离子为Mn(Ⅱ),Mn(Ⅲ),Dy(Ⅲ)或Gd(Ⅲ)。
38．权利要求35的方法，其中顺磁体金属阳离子是Gd(Ⅲ)。
39．权利要求24,25或26的方法，其中化疗药物是烷化剂、抗代谢物、天然产物、激素或拮抗剂。
40．权利要求24,25或26的方法，其中化疗药物是铂配位复合物、蒽二酮、蒽环类抗生类、取代脲、甲基肼衍生物或肾上腺皮质抑制剂。
41．权利要求24,25或26的方法，其中化疗药物是紫杉醇、依托泊苷、4-OH环磷酰胺、顺铂、阿霉素或博莱霉素。
42．权利要求24,25或26的方法，其中化疗药物是阿霉素或博莱霉素。
43．权利要求24,25或26的方法，其中特沙弗林在使用化疗药物后使用。
44．权利要求24,25或26的方法，其中特沙弗林在表皮给药。
45．权利要求24,25或26的方法，其中特沙弗林通过静脉给药。
46．权利要求24,25或26的方法，其中特沙弗林作为化学增敏剂通过不依赖P-糖蛋白的机制发挥作用。
全文摘要
提供了对癌症化学增敏的方法。特沙弗林是可增加化疗药物的细胞毒性的新化学增敏剂。由于特沙弗林在表达P－糖蛋白和不表达P－糖蛋白的细胞系中均有效,故这种增敏作用是P－糖蛋白非依赖性的。提供了使用特沙弗林作为化学增敏剂治疗如白血病、淋巴瘤、癌症和肉瘤的方法。
文档编号A61K38/14GK1213313SQ97192481
公开日1999年4月7日 申请日期1997年1月23日 优先权日1996年1月25日
发明者R·A·米勒, S·W·扬 申请人:环状药物公司