专利名称：多种生物医学用途的无朊病毒胶原和胶原衍生物以及植入物及其制备方法
技术领域：
本发明涉及一种清除胶原或胶原衍生物中朊病毒的方法，特别是通过脱水热灭活或化学灭活。
在生物学材料中，胶原特别是Ⅰ型胶原是各种结缔组织包括骨中的一种主要成分。由于胶原的存在，用人或动物来源的组织如皮肤或骨移植物替代人的组织加速创伤愈合过程。因而，由于(ⅰ)这些产物的天然结构作为细胞的生物学支持物和组织修复或再生的支架，(ⅱ)可避免取出植入物的生物可降解性和(ⅲ)它们的生物相容性，胶原衍生物作为生物材料的应用在生物医学中具有巨大的作用。胶原已被用于设计生物材料，如创伤敷料、人造皮肤、骨或肌腱替代物、组织工程设备和整形外科中的可注射材料1-5。利用动物特别是来自牛的胶原的一个优点是便于制备大量的纯的Ⅰ型或Ⅰ/Ⅲ型胶原。
新的病毒或新的感染性疾病的出现，特别是自从发现蛋白质如朊病毒的传播同感染相关(即牛海绵状脑病)6后，要求提高对生物制剂安全的警惕性。针对朊病毒的生物产品安全性评价由于缺少能够在初始材料中检查瘙痒症样因子的检测方法而复杂化。从人源纯化的胶原也可能是人海绵状脑病7或者病毒性疾病(已知和未知)的载体。
瘙痒症因子对热和物理灭活具有极强抵抗力8。常规的瘙痒症样因子的灭活和消毒建议延长暴露于浓NaOH溶液以及在130℃以上温度高压灭菌的时间9。然而，对于这种方法是否仅仅延长孵育时间仍然有争议10。此外，只有NaOH可被用于胶原，因为高压灭菌破坏胶原。
在相似的浓度和孵育时间下(推荐的)由NaOH处理胶原已被研究用于清除其它感染性因子，如细菌或病毒(RNA或DNA病毒)。在碱性环境中，我们已经通过琼脂糖凝胶间接地证明DNA和RNA并未被充分片段化，以实现清除感染性疾病及其传播。
在另一研究中，我们比较了通常用于交联胶原产品(即Yannas皮肤、心脏生物瓣膜、血管移植物以及其它生物学植入物)的戊二醛处理的效果。已经测试了两种用戊二醛溶液处理胶原的方法。一种是利用水而另一种用稀乙酸作为交联胶原的缓冲液。后者的条件描述于Yannas专利U.S.4,060,081，这是关于人造皮肤的。许多研究人员声称戊二醛处理胶原及其衍生的产品(即明胶胶囊)可以消毒最终的交联化产物。利用这两种戊二醛处理方法，我们的研究(利用琼脂糖凝胶)清楚地显示掺入我们的胶原中的DNA和RNA没有被完全降解，而随后极有可能有病毒和细菌传播的风险。
其它如8M尿素的处理也已被推荐。然而，观察到了DNA和RNA的部分降解。这种降解是部分的而不足以提供无病毒产品的保证。另一方面，蚁酸(FA)、SDS、氟化醇以及三氟乙酸(TFA)对同瘙痒症感染性的失活相关的朊病毒(PrP27-30)的二级和三级结构具有显著的效果11-12。在该领域没有胶原会耐受那些处理的迹象。
如上所述，当前联合NaOH和高压灭菌用于清除朊病毒。我们已经证实NaOH本身不能保证DNA或RNA的分解。另外已知在大约130℃高压灭菌破坏胶原。将其它利用剧烈的脱水热处理的方法用于交联聚合物成分。脱水热处理也已用于消毒产品以及交联聚合物成分。没有人研究过是否加热消毒可以清除朊病毒而保留含胶原产品的完整性。
由于上述原因，需要有一种制备无朊病毒的含胶原产品的方法，其中朊病毒被清除而胶原没有超出预期程度或不可避免程度的显著变性。
本发明的目的是提供一种从含胶原产品中清除朊病毒而基本保留这些产品的完整性的方法。
在本发明的一个具体的实施方案中，这样一种方法利用一种溶液pH低于大约2的强酸。在一个优选的实施方案中，通过浸渗作用被直接用于冻干的含胶原产品的强酸是纯三氟乙酸或氟乙酸(pH1)。反应的时间可依酸的性质从大约1到5小时而变化，如酸性越强，清除朊病毒而不影响产品完整性所需的时间越短。
在本发明的另一实施方案中，脱水热处理取代化学灭活例如强酸。在该特定的方法中，将胶原或胶原衍生物如明胶用足以清除朊病毒而不对胶原完整性产生超过预期范围的显著影响的温度和时间条件处理。在一优选的实施方案中，那些条件是在干气氛中(高度真空下)110℃的温度和1-3天的时间。
在本发明的另一实施方案中，将上述的两个消毒方法结合。首先，用TFA处理胶原一段时间，这依是否欲期将胶原转变为明胶而定。当希望有向凝胶的实质转变时，可以用TFA或一种具有等价作用的酸处理胶原5个小时以上，优选在6到12小时之间。然后将胶原或胶原衍生物(例如胶原、TFA处理过的胶原或明胶)进行具有清除朊病毒和可能有的交联产品的效果的脱水热处理。加热处理具有通过交联而稳定产品以及清除朊病毒的双重效果。
本发明的另一目的是提供含有通过酸和/或加热灭活方法制备的胶原和胶原衍生物的产品，上述灭活方法具有获得一种安全的无朊病毒胶原的优点。在制备胶原产品中作为一种初始材料的胶原，已制成薄膜、海绵、药物输送系统或创伤敷料的胶原；联接于其它酸稳定分子的胶原以及胶原衍生物或片段都是可进行灭活处理的材料的例子。
通过下列特定的实施例和附图对本发明进行描述，其目的是用于阐明而不是限制本发明的范围。
图1未处理的(A)和由蚁酸(B)；三氟乙酸(C)；三氟乙醇(D)和六氟-2-丙醇(E)处理的(暴露时间为1小时)胶原材料的FTIR谱图。图2纯蚁酸(FA)和三氟乙酸(TFA)的FTIR谱图。图3在光谱去褶合之前(a&b)和之后(c&d)在酰胺Ⅰ区中胶原材料的FTIR谱图。将未处理的胶原(全线)同由蚁酸(点划相间的线)、三氟乙酸(划线)、三氟乙醇(点线)和六氟-2-丙醇(划双点相间的线)处理1小时(a&c)或5小时(b&d)的胶原比较。图4细胞生长。将人皮肤成纤维细胞接种于多孔板液体培养基中同未处理的(空心正方形)或经暴露于FA(实心三角形)、TFA(实心正方形)、TFE(实心圆形)或HFIP(空心圆形)处理的胶原海绵接触。通过计数细胞随时间的变化确定细胞的生长。给出了均值和均值的标准差(N=18)。图5FA(A,B&C)、TFA(D)和TFE(E)处理过的胶原海绵的观察。在植入之前(A组织切片，×181；B:TEM,×19,200)，FA对有孔胶原海绵的处理导致具有周期性的胶原束(箭号)的崩溃结构(B)。在小鼠中进行皮下植入，随后分析。给出了第30天取出的植入物的组织切片(C,D&E；×90)。在此期间，在植入的胶原材料的胶原束(箭号)之间出现细胞浸润(箭头)。在B中，注意到细胞外基质(*)的沉积。在D中，在胶原材料中出现脂肪组织(f)以及炎性细胞(ⅰ)。图6在牛Ⅰ型胶原中和经下列不同化学处理过的胶原中所含的核酸的平均片段长度。A中的泳道含有胶原海绵加5μg酵母RNA；B中的泳道含有胶原海绵加5μg牛胸腺DNA；而C中的泳道仅含有胶原海绵。这些样品都用下列化学物质处理无化学物质(1号泳道)、蚁酸(2号泳道)、三氟乙酸(3号泳道)、三氟乙醇(4号泳道)和六氟-2-丙醇(5号泳道)。将1.5％的琼脂糖凝胶用溴化乙锭(1μg/ml)染色。该凝胶的第一个和最后一个泳道分别含有HindⅢλ噬菌体+HaeⅢ消化的φX174DNA分子量标准。图7经暴露于FA或TFA处理1小时的冻干胶原海绵的水的摄取量。在用FA或TFA处理之前和之后还比较了复合PEG-胶原材料。图8在由FA或TFA处理1小时的胶原和PEG-胶原海绵中吸收的放射性标记的生长因子(125I-bFGF)的动力学曲线。海绵被植入不同的时间阶段并测量作为植入后时间函数的放射性。图9透明的胶原水凝胶和薄膜的光密度。用不同的波长对于由TFA处理8小时的多种胶原材料的研究。材料和方法化学试剂蚁酸(FA)(23.4N)购自BDH公司(Ville St-Laurent,QC,加拿大)；三氟乙酸(TFA)(安瓿中的游离酸)购自Sigma化学公司，(St-Louis,MI,美国)；2,2,2-三-氟乙醇(99％；TFE)和1,1,1,3,3,3,-六氟-2-丙醇(99％；HFIP)购自Aldrich化学公司(Milwaukee,WI,美国)。样品制备从成年牛皮中通过乙酸分散体提取胶原并通过NaCl盐沉淀纯化以获得不溶胶原纤维束的分散体13-14。如以前所报道的14，这些胶原纤维的周期性是高度保守的。按以前所描述的14，通过冻干一种1％的胶原分散体(w/v胶原比水)来获得胶原海绵。然后，按照由Safar等11所描述的方法将海绵暴露于纯FA(pH:1)、TFA(pH:1)、TFE(pH:5)和HFIP(pH:4.5-5)不同的时间。然后将真空干燥的样品重新水化于蒸馏的并去离子的水中，在室温下充分洗涤24小时。在这个过程中，pH在不到1小时内恢复到最初水的5-6的pH范围并保持稳定。然后空气干燥大部分样品以用于分析。对于细胞培养和动物研究，在无菌环境中操作海绵。傅立叶变换红外光谱法(FTIR)用装备了MCT/A探测器和锗包被的KBr光束分裂器的NicoletMagna-550傅立叶变换光谱仪记录FTIR光谱。常规需要100次以0.5cm的光学迟滞的扫描，经三角形变迹及傅立叶转换来获得2cm-1的分辨率。以装备有一个Si半球形、3mm直径内部反射元件的Split Pea附件以衰减的全反射模式来记录胶原海绵的红外光谱。按照所描述的15利用7.5的收缩因子和0.14的变迹滤波器进行酰胺Ⅰ光谱区的傅立叶去褶合。将这些参数用来最小化在未观察到胶原带的1720-1750cm-1区的侧波瓣。每种处理对不同的胶原批次包括对照进行三次测定。差异扫描量热法(DSC)在Perkin Elmer DSC7差异扫描量热仪上测定变性温度。为了便于测量，制备一种3％(v/w)胶原分散体然后空气干燥以获得致密的薄膜。将样品引入一洁净的可卷曲铝盘并加入大约15ml蒸馏水。将注入相同体积蒸馏水的对照盘设置在设备的参照口中。在DSC中注入液氮并用氦吹清。在-50℃到90℃以10℃/min的加热率进行分析。通过测定达到变性峰最高点的温度确定变性温度。重复进行测量，并且变性温度值具有±3℃的精确度范围。胶原酶测试对于胶原酶测试，将干的胶原海绵浸入含有缓冲液A(25mM Tris缓冲液和10mM CaCl2)的胶原酶(每mg胶原250单位胶原酶；来自溶组织梭状芽孢杆菌(Clostridium histolyticum)的LA型，Sigma)中性溶液(pH7.5)。将样品在37℃孵育并在孵育过程中以5分钟的间隔进行观察。导致胶原海绵完全消失(即所有片段)的孵育时间认为与材料对酶降解的抗性相关。另外，根据以前描述的一种方法16，在胶原酶消化1小时后测定羟脯氨酸含量。测定三次样品，并利用学生t检验同设定为≤0.05的显著水平进行比较。成纤维细胞培养用以1×103细胞/cm2的低细胞密度接种于孔底的人包皮成纤维细胞进行细胞培养研究。将胶原材料引入细胞培养插入物(3.0μm聚乙烯对苯二酸酯有孔滤膜，购自Becton Dickinson Labware)。在37℃下含5％CO2的潮湿空气中将细胞培养于添加5％胎牛血清的Dulbecco修饰的Eagle培养基(Sigma)中。在24、72小时和7天，按照所描述的追踪细胞的方法17利用体外活体DNA染料(Hoechst 33342；Polysciences,Inc.)在孔中直接确定细胞数。利用Wilcoxon秩和(双尾)检验来进行统计分析。皮下植入麻醉下在小鼠中进行海绵的皮下植入。按照加拿大动物照料委员会的准则并由研究性动物照料委员会批准后，在无菌条件下进行外科手术。在每只动物的背部通过医学切口在每一侧制备两个皮下囊。在同一动物中植入FA、TFA、TFE和HFIP处理的海绵(1平方厘米)，在4个囊的每一个中植入一块海绵。每个植入时间段用3只动物。在植入后第7、15、30和90天处死动物。收集胶原标本并固定在甲醛中，进行组织学评价(2个连续切片)并用苏木素-根皮红-藏红花染色。通过在筛网上直接干燥胶原分散体随后用柠檬酸铅和乙酸双氧铀染色进行透射电镜观察。DNA和RNA检测的样品处理及琼脂糖凝胶对于DNA和RNA的检测，有3组5个样品1组包括胶原和RNA，2组包括胶原和DNA，而3组只包括胶原。对于含有DNA或RNA的样品，在胶原海绵制备的分散步骤中引入牛胸腺DNA(CalbiochemCorp.)和酵母RNA(Boehringer Mannheim)。DNA和RNA所用的浓度为0.2-0.5μg/mg胶原，其相当于每个样品最终DNA或RNA的量分别为5μg。对于每个组，将每个样品用如上所述的化学试剂处理或不处理(对照组)。化学试剂处理后，将海绵用高度纯化的胶原酶(Ⅶ型，购自Sigma)在37℃于缓冲液A中消化2小时。胶原酶消化后立即在1.5ml体积中进行蛋白酶K消化。向胶原酶缓冲液中加入NaCl、EDTA(pH7.8)、蛋白酶K和SDS至终浓度分别为85mM、12.5mM、300μg/ml以及0.5％。在37℃孵育样品3小时。2小时后，如果海绵没有被消化为小片，则每管加入额外的200μg蛋白酶K。在3次酚-氯仿抽提前，3小时消化阶段后所有海绵全部消化。为了沉淀核酸，加入2μl糖原(20μg/μl)和80μl 5M NaCl、420μl H2O和4ml 100％乙醇。将核酸重悬于200μl水中并转入1.5ml微量试管中。使水蒸发，并加入20μl水将核酸重悬于较小的体积。加入5μl的5×上样缓冲液〔5×TAE(40mM Tris-乙酸和1mM EDTA,pH:8)，0.025％溴酚蓝，30％购自Pharmacia的Ficoll 400水溶液和2％SDS〕。将每个样品的全部体积(25μl)上样于中性琼脂糖凝胶中，于TAE中在50伏电压下电泳2小时10分钟。结果和讨论胶原的化学处理和其物理化学特性通过FTIR光谱学和DSC的研究可以分别确定胶原二级结构中的构象变化，以及在胶原分子中实现从三螺旋向随机卷曲结构转变所需的温度。这些与分子内和分子间键相关。
由于这些样品的红外光谱同纯胶原的红外光谱几乎重合，所以FTIR数据提示在胶原样品和TFE或HFIP之间未观察到强的相互作用(图1)。因而，这些试剂不会促进胶原的任何化学修饰，而且在洗涤过程中被从胶原海绵中清除。另一方面，用FA或TFA处理的样品表现出一些额外的带，主要的一条带对于FA定位于大约1190和1715cm-1而对于TFA则定位于大约1170和1782cm-1(图1)。这些新的红外峰的频率和相对强度同那些在纯FA和TFA的红外光谱中所观察到的紧密相配，表明这些分子仍存在于胶原结构中(图2)。由于蛋白质肽键的振动，分别位于1650和1550cm-1附近的酰胺Ⅰ和酰胺Ⅱ带的频率表明这些分子采用的二级结构。如图3中所见，由于如氨基酸组成、在三联体中残基的序列、复合物的凝集状态、样品的湿度以及溶剂类型的几种因素，酰胺Ⅰ带表示一种多成分的结构。胶原酰胺Ⅰ带的主要红外特征是中心位于1631cm-1(图3A和3B)，这是胶原中非亚氨基酸残基的特征。虽然对于TFE处理过的样品酰胺Ⅰ光谱区保持不变，但当同未处理过的胶原相比较时，对于用FA、TFA和HFIP处理过的样品可以观察到一种酰胺Ⅰ带形状的改变。在图3C和3D中去褶合酰胺Ⅰ带提供了在以前被归为胶原中亚氨基酸残基的在1655cm-1处的一种额外光谱成分的证据。除了TFE处理的胶原海绵，一旦与FA、TFA和HFIP相互作用，所有的化学试剂都引起1655/1631吸收值比率的降低。这种1655/1631比率的降低已被证实随胶原变性而被观察到。由于处理1小时的样品的红外光谱的酰胺Ⅰ区同未处理的胶原相比已经被修饰，所以这种修饰似乎发生在处理的第一阶段。另外，对于处理1小时的样品的1655和1631cm-1特征值的相对强度同处理5小时的样品非常相似。然而，暴露5小时后的TFA处理样品的红外光谱由于TFA在1740cm-1处光谱供献的存在表现出酰胺Ⅰ特征的带宽的可观的增加。因而，在胶原中存在的TFA量在暴露5小时后比暴露1小时要高。随着暴露时间的增加，在结构构象上的变化可能提高FA或TFA的捕获和植入。通过扩大的去褶合酰胺Ⅰ特征可展示出胶原变性为明胶。然而，发现纯明胶的光谱(即热的胶原)比TFA处理后的光谱更大(资料未示)。另一方面，已经描述了同蛋白质碱性基团形成FA盐，并且FA在肽键处的直接结合也是一种可能性。这些现象表明FA可以结合于我们的胶原。以前已经表明TFA掺入的聚甘氨酸的多聚体导致几乎充分伸展的肽链，其在平行或反平行片层中形成β样结构构型。当将聚-L-赖氨酸溶于TFA中时出现类似的具有可逆性的现象。这些现象在TFA处理的胶原中可能发生。另外，如用有机溶剂时所观察到的氢键断裂引起在胶原壳水合过程中的干扰，这可能影响胶原纤维通过疏水效应的自身相连。后者可以解释胶原结构的失稳定。
同未处理过的胶原变性相关的热致转换引起一个大的吸热峰，跨度从45到80℃，中心位于61±3℃(表1)。这种变性温度同从牛心包中提取的胶原所报道的65℃的值一致22。除了TFE处理的未引起显著变化外，所有化学处理的胶原海绵都表现变性温度的显著降低(表1)。TFA诱导的变性温度降低最大，特别是在暴露于化学试剂很长一段时间后。对于FA、TFA和HFIP处理的胶原所观察到的变性温度的降低可能同二级结构的改变相关。这些试剂也可以引起胶原结构中氢键的减少。另一方面，暴露于TFA5小时后吸热温度也同用明胶所观察到的相近(资料未示)。胶原的化学处理和其生物学特性在胶原酶消化过程中，除了HFIP处理的胶原比用FA或TFE处理的胶原降解得明显更快外，未处理过的胶原海绵的完全降解发生在同处理过的海绵相同的时间内(平均从57到73分钟)。然而，发现在胶原酶处理1小时后，所释放的羟脯氨酸的量在统计学上彼此相近。由于胶原酶以在胶原的三重螺旋部分中的氨基酸序列为靶，所以这个结构在化学处理之后可能被部分保留。
在细胞培养中，细胞生长的测定可以反映化学试剂或副产品从材料泄漏的可能性。除了TFE处理过的海绵以外，在处理过的胶原上细胞的生长以时间的函数增加(图4)，这与用对照海绵所看到的接近。在后一条件下，细胞生长在第7天被明显抑制。对这种抑制的解释还无法明确地确定或联系到特定的改变。相反，如通过FTIR所示的残余FA或TFA产物或副产物的最终泄漏似乎没有作用于培养中的细胞。
未处理过的胶原材料在植入前以形成有孔结构的周期性胶原纤维束形式出现14-23。在TFE或HFIP处理过的胶原中观察到相似的结构。相反，在FA或TFA处理的样品中，胶原纤维束被紧密包裹(图5A)，类似一崩溃的孔结构。如通过透射电镜所观察到的，这些纤维在用FA而不是用TFA处理后仍是周期性的(图5B)。后一观察(即TFA处理)表明在每个纤维中发生了变性而未完全溶化整个胶原材料。相反，FA处理的变性可被局限于某些胶原纤维。
这些材料体内行为的研究使得可以在复杂的细胞和组织环境中探讨它们的生物学特性。植入7天后，细胞浸润由在胶原植入物中的少数炎性细胞和成纤维细胞组成。炎症反应也出现在环绕植入物的组织中，特别是在由TFA和HFIP处理过的海绵中(表2)。至15天时，炎性细胞和成纤维细胞的浸润出现在特别是由FA、TFE和HFIP处理过的植入物中。在TFE处理过的胶原材料内观察到脂肪细胞或脂肪变性。炎症在TFA处理过的胶原的外周尤其可见。至1个月时，在所有化学处理的海绵中出现细胞浸润(图5)。对于FA、HFIP和TFE处理过的胶原，细胞浸润出现在整个胶原材料的内部，另外，在植入的胶原束之间的各个位点处出现新的结缔组织。对于TFA处理过的胶原样品，植入物表现出被脂肪组织部分再吸收以及炎症反应的存在。至90天时，除了HFIP处理过的胶原植入物未收回外，虽然观察到一些残余胶原束，但植入物大部分被再吸收。在变性温度表现出明显降低的FA和TFA处理后，残余的胶原被轻微的炎症反应所包围并被新沉积的胶原浸润。
同其它处理相比，在FA处理的植入物的周围和内部炎症反应是最轻的。另外，反应明显持续少于30天。由TFE处理的海绵也观察到这些反应。相反，TFA处理的海绵引起重要的炎症反应，这可以通过同那些由FA处理的胶原相比在胶原内存在高残余量的TFA来解释。对HFIP处理海绵的炎症反应明显是重的，但局限于植入的早期阶段。
同以前的利用胶原海绵作为创伤支架的研究相比23-24，由于FA和TFA处理导致的崩溃的有孔结构的植入引起快速的细胞浸润。对于变性的胶原植入物或在用明胶混合胶原纤维后也描述过相似的现象25,26。如由FTIR和DSC处理所示，变性和非变性的胶原可出现在我们的材料中。酸中的胶原膨胀，伴有纤维长度和厚度的改变，而三重链单位仍保持完整27。对于FA或TFA的处理，由于我们初始的胶原由硬质纤维单位组成，它们能够通过这些纤维的抵抗力而减慢变性过程，所以在酸处理下胶原完全转变为明胶是不大可能的。然而，如用变性剂和我们的透射电镜观察所证实的，用TFA处理特别是处理5小时后，可能比用FA处理诱导胶原纤维更多地解离。由于在长时间暴露于化学试剂后变性的能力增加，所以将暴露1小时的样品用于进行细胞培养和体内生物相容性研究。化学处理对胶原中核酸的效应在琼脂糖凝胶中的单链RNA片段和双链DNA片段迁移率分布的分析是一种确定同核酸降解程度相关的链断裂频数(由Drouin等29综述)的有效方法。中性琼脂糖凝胶可在0.5cm宽带中显现少至2ng30。对于单链DNA和RNA的灵敏度比双链DNA低5到10倍。这意味着需要大约20ng的单链核酸以便于检测。获自牛皮革的胶原的确含有一些核酸(图7,C中的泳道)。这些核酸可能主要是平均片段长度低于100个核苷酸的RNA。弥漫带的上部可能是聚集的核糖体RNA和tRNA。DNA可能只是牛皮革提取物中存在的核酸的一小部分。微量核酸的存在可能是由于(ⅰ)如通过微生物学分析证实的细菌(环境杆菌和分枝杆菌；“资料未示”)；(ⅱ)病毒(未证实)和/或(ⅲ)在皮革厂从牛皮清除毛发后和/或通过乙酸分散体和盐沉淀纯化后所剩余的细胞残余物。在利用特定DNA染料对冻干纯化的胶原和原胶原海绵的观察中未发现细胞核存在(“资料未示”)。
另一方面，TFA将任何核酸水解为非常小的片段(低于10个核苷酸)，甚至将所加的DNA和RNA完全降解(泳道A3和B3，图6)。FA也将在胶原海绵中所含的任何核酸不可恢复地水解为非常小的片段，而将加入的RNA和DNA降解为低于40个核苷酸的平均片段长度。其它化学处理似乎不产生任何显著数量的链断裂(泳道A4、B4和C4；图6)。FA(pH:1)和TFA(pH:1)处理的非常酸的条件多数情况下引起广泛的DNA变性、核酸脱嘌呤以及RNA和DNA磷酸二酯键的水解。相反，如由大多数生产胶原的公司所推荐的用1N NaOH处理胶原的方法正如最近通过中性琼脂糖凝胶所证实的没有分解DNA或RNA(资料未示)。
在本研究中所测试的每个化学处理都包括一个强的(pH:1)或温和的(pH:4.5-5)酸性环境并且在室温下进行处理至少1小时。在强酸性条件下，出现DNA的变性、DNA和RNA的广泛脱嘌呤以及多聚脱氧核糖核酸和多聚核糖核酸磷酸二酯键的水解31。通过温和的酸处理，易于从DNA中清除嘌呤碱基。在温和的酸性条件下，DNA被部分变性和部分脱嘌呤；RNA基本上无改变以及在RNA和DNA中极少的磷酸二酯键水解。总之，强酸处理胶原海绵绝对使DNA过度脱嘌呤化并使RNA和DNA带有太多的链断裂而不能被任何DNA或RNA聚合酶所利用而具有感染性；而温和的酸性处理留有可被容易地复制以合成DNA的RNA分子，这时DNA的脱嘌呤程度可能非常严重从而杜绝其感染性。另外，通过一种化学的瘙痒症灭活剂(例如，FA或TFA)的处理引起同瘙痒症感染性的灭活相关的朊病毒的β片层样二级和三级结构的丢失11。基于本项关于通过FA和TFA处理降解核酸的研究以及那些以前报道11的结果，我们可以总结出化学处理的胶原无瘙痒症感染性和病毒的传播。总之，这样一种化学处理可以组成一种制备安全的无朊病毒和病毒的胶原/明胶材料的方法。FA因其在降解核酸中作为一种化学灭活物的活性而似乎是四种被测试剂中最有效的，并且尽管其在胶原分子中存在，但它的应用产生一种好的生物可容的胶原/明胶材料。正如用其它生物可降解和非生物可降解生物材料所观察到，后者仅产生一种短暂炎症反应，伴有最轻的炎症。
从上面的结果可以推断出，实现清除朊病毒的两种酸是具有大约1的pH的强有机酸。两种其它具有大约5.0的pH的化合物并不有效。其它强有机酸和/或无机酸只要达到低于大约2.0的溶液pH并且不会将胶原降解至非预期的程度，可能等价于TFA和FA。可根据酸试剂酸性程度调节反应的时间。脱水热处理如上面提到的，为制备安全的胶原产品已经尝试了许多已知的消毒方法(例如NaOH、戊二醛、尿素)。从推荐使用NaOH作为一种胶原的处理方法中可以推断出将避免热处理。然而我们利用较温和的条件而不是在134℃高压灭菌来消毒胶原。将胶原在炉中于真空下在110℃脱水1-3天。通过处理，胶原轻度交联且无菌而未变性。在这些条件中，我们通过琼脂糖凝胶分析了DNA和RNA的降解，并观察到了这些分子被完全分解(利用加入胶原中的DNA和RNA)。当温度固定于110℃时脱水热处理的时间可以从1到3天不等，在较高温度时可或多或少的缩短，而在较低温度时延长。
由于高压灭菌对于维持胶原完整性并不理想，所以显然具有温度和压力值限制，超过此限则胶原被破坏至无法接受的比例，并且这在如高压消毒中出现的湿的条件下或在大气湿度下干加热中都可观察到。如果在升高温度前没有完全消除水蒸气或湿度(例如利用高度真空)，胶原将开始变性然后比病毒、细菌或朊病毒还要快地被降解。
热处理可直接用于明胶，并将具有通过交联来稳定明胶以及制备安全的无朊病毒产品的双倍优点。如果通过用一种如TFA的强酸处理胶原很长的时间(超过5天)来制备明胶，则热处理会提供双倍安全的产品(TFA和热是清除朊病毒的两个步骤)并且还将稳定明胶(其是一种改变的胶原)。例如可将交联的明胶用来实现用于给药的明胶胶囊的肠内抗性。作为给药系统的TFA处理的胶原海绵的性质(ⅰ)TFA处理胶原(暴露1小时)引起高的水分吸附作用和吸收作用(见图7)，而FA处理似乎损害水分吸着作用。这通过肽如生长因子的吸收作用也已经被观察到。我们的研究表明通过放射自显影测定放射性标记的生长因子在TFA处理的胶原有孔结构中是均匀分布的，而在FA处理后，放射性标记的生长因子的分布仍然在海绵周围。TFA的性质对于实现在一胶原材料例如当前所描述的材料上的药物吸收的设计是非常有意义的。
(ⅱ)无朊病毒和病毒胶原海绵的稳定的有孔结构可用作创伤敷料或给药系统。可以用FA或TFA处理如在专利公开CA2,164,262(PEG-胶原)中所描述的通过聚乙二醇(PEG)稳定的胶原材料。然而，为了保留有孔结构，应在PEG接枝后进行FA或TFA处理。已经对这些复合产品的生物相容性进行了研究。它们具有同未处理过的PEG-胶原相似的行为。细胞培养的结果表明产品无细胞毒性(细胞生长同对照相似)，而且动物(小鼠)研究表现轻度的伴有细胞浸润的炎症反应。除了TFA处理的PEG-胶原外，在小鼠中有孔结构保持稳定达180天。TFA处理的PEG-胶原植入后维持90天，随后发生生物降解。这种稳定性的变化对于提供一系列具有一定的生物降解率的产品是有益的。TFA处理的PEG-胶原可进一步进行剧烈的促进交联并增加稳定性的脱水热处理。我们验证了PEG接枝的胶原是否会削弱FA或TFA处理对DNA和RNA的破坏。琼脂糖凝胶清楚地显示正如以前在胶原海绵中所报道的核酸的降解。
(ⅲ)在PEG处理前引入FA和TFA，胶原海绵难以保持有孔。然而，所获的胶原产品允许细胞浸润，伴有伤口愈合过程中的一些延迟。这种有趣的性质可用来稳定如上所述由明胶(如由TFA诱导的)制备的胶囊。
(ⅳ)复合的PEG-胶原可用作生长因子运输系统，因为同单纯胶原比其能维持较高浓度的生长因子。由FA或TFA对这些复合PEG-胶原的处理在体内保留了这种特性(见图8)。另外，通过放射自显影，生长因子良好地分布在有孔结构中。透明产品和植入物依据胶原的批次，通过从6到12小时不等的长时间暴露于TFA可以获得透明胶原。因此，处理过的胶原海绵表现为水凝胶样材料，具有透明的特性。处理过的胶原薄膜(空气干燥的分散体)比处理过的胶原海绵(或水凝胶)更脆弱。
透明的胶原材料可被制成从10到500μm范围内的各种厚度。胶原分散体的浓度也是在获得透明度中的一个重要参数。因此，0.5到0.75％(胶原的重量对水的体积)显得透明。在1％的胶原分散体时，永远也达不到透明。
另一方面，透明质酸(HA)(一种糖胺聚糖)的加入提高胶原的透明度(每份重量的胶原5％(w/w)HA，将HA加入胶原分散体)。这已通过测量在不同波长吸收处的光密度而被证实(见图9)。其它糖胺聚糖和蛋白多糖的加入以及其它百分比的HA在获得更透明的材料中也是有益的。另外，如在细胞培养中所示的，透明质酸的加入刺激细胞浸润进入植入物。
那些透明的材料可被用于眼科应用，而且更具体地是用于透明的角膜创伤敷料。为了同样的目的使用胶原屏。然而，它们是从牛、猪或人制备的。但它们的安全性仍然是一个问题。我们的产品可以安全地使用。
在上文中已经描述了本发明并且对于懂技术的读者来说可以很容易地进行修改而不背离上面的教导。这些修改是在如所附的权利要求中所规定的本发明的范围内的。参考文献1．E.Bell,B.Ivarsson和C.Merril，“体外由不同增殖潜能的人成纤维细胞通过胶原网格的收缩制备一种组织样结构”《美国国家科学院院报》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA),76,1274-1278(1979)。2．I.V.Yannas,J.F.Burke,D.P.Orgill和E.M.Skrabut，“创伤组织可使用多聚物模板合成皮肤的功能性延伸”，《科学》(Science),215,174-176,(1982)。3．T.Miyata,T.Taira和Y.Noishiki，“用于生物医药的胶原工程”，《临床材料》(Clin.Mater.),9,139-148,(1994)。4．G.Ellender.R.Papli,R.Hammond,K.Mitrahgas,J.F.Bateman,V.Glattauer,J.M.Thyer,J.A.Werkmeister和J.A.M.Ramshaw，“在修复建立的牙周缺陷中胶原的成骨能力”，《临床材料》，9,201-209,(1994)。5．J.Keefe,L.wauk,S.Chu和F.DeLustro,“可注射牛胶原的临床应用十年的经验”《临床材料》9,155-162(1994)。6．S.B.Prusiner,“新型蛋白质感染性颗粒引起瘙痒症”《科学》216,136-144(1982)。7．S.B.Prusiner,“遗传性朊病毒疾病”《美国国家科学院院报》91,4611-4614(1994)。8．P.Brown,P.P.Liberski,A.Wolff和D.C.Gajdusek,“在甲醛固定后瘙痒症感染性对蒸汽高压消毒的抗性和360℃灰化后有限的存活实践和理论应用”《感染性疾病杂志》(J.Infect.Dis.)161,467-472(1990)。9．R.N.Rosenberg,C.L.White,P.Brown,D.C.Gajdusek,J.J.Volpe,J.Posner和P.J.Dyck,“在处理来自确诊或可疑的克雅氏病患者的组织、液体和其它污染材料中的警告”《神经病学年鉴》(Ann.Neurol.)19,75-77(1986)。10．J.Tateichi,T.Tashima和T.Kitamoto,“克雅氏病病原体的灭活”《神经病学年鉴》24,466-(1988)。11．J.Safar,P.P.Roller,D.C.Gaidusek和C.J.Gibbs,“瘙痒症淀粉样(前)蛋白的热稳定性及构象转换同感染性相关”《蛋白质科学》(Protein Sci.)2,2206-2216(1993)。12．W.E.Klunk,C.-J.Xu和J.W.Pettegrew,“在阿尔兹海默尔氏淀粉样蛋白中蚁酸修饰的残基的NMR鉴定”《神经化学杂志》(J.Neurochem)62,349-354(1994)。13．E.J.Miller和R.K.Rhodes,“不同类型胶原的制备和鉴定”《酶学方法》(Methods Enzymol.)82,33-64(1982)。14．M.-F.Cote,E.Sirois和C.J.Doillon,“海绵形基质中胶原的体外收缩率”《生物材料科学杂志》(J.Biomater.Sci.)-Polym.编，3,301-313(1992)。15．P.R.Griffiths和G.L.Pariente,“光谱去褶合导论”《分析化学趋势》(Trends Anal.Chem.)5,209-215(1986)。16．R.A.Berg,“3-和4-羟脯氨酸的确定”《酶学方法》82,372-398(1982)。17．J.L.Ellwart和P.Domer,“利用在Hoechst 33342染色细胞中的光谱移动评价活力”《细胞术》(Cytometry)11,239-243(1990)18．Y.A.Lazarev,B.A.Grishkovskii和T.B.Khromova,“IR光谱的酰胺Ⅰ带和胶原的结构以及相关的多肽”《生物多聚体》(Biopolymers)27,1449-1678(1985)。19．K.Payne,A.Veis,“胶原和明胶溶液的傅立叶变换IR光谱学用于构象研究的酰胺Ⅰ带的去褶合”《生物多聚体》27,1749-1760(1988)。20．A.Veis,明胶的大分子化学，《分子生物学》，第5卷，Horecker,B．Kaplan,N.O.&Scheraga H.A.(编)，学院出版社，纽约-伦敦，(1964)。21．A.V.Kajava,“在Ⅰ型胶原纤维中的分子折叠一个同轴向排列的邻近胶原分子的模型”《分子生物学杂志》(J.Mol.Biol.)218,815-823(1991)。22．J.M.Lee,C.A.Pereira,D.Abdulla,W.A.Naimark和I.Crawford,“用于胶原生物材料的一个多样本变性温度测试仪”《医学工程物理学》(Med.Eng.Phys.)17,115-121(1995)。23．C.DeBlois,M.-F.Cote和C.J.Doillon,“肝素-FGF-血纤蛋白复合物对胶原为基础的材料的体外和体内应用”《生物材料》15,665-672(1994)。24．C.J.Doillon,M.G.Dunn,R.A.Berg和F.H.Silver,“创伤修复过程中的胶原沉积”《扫描显微》(Scan.Microsc.)2,897-903(1985)。25．K.Yoshizato和E.Yoshikawa,“用于生物皮肤的双层明胶底物的发展一种新的由有孔皮肤基质和薄的基底膜组成的皮肤结构框架”《材料科学与工程》仿生材料卷，传感器和系统(Mater.Sci.Eng.C-BiomimeticMaterials,Sensor&Systems)1,95-105,(1994)。26．M.Koide,K.Osaki,J.Konishi,K.Oyamada,T.Katakura,A.Takahashi和K.Yoshizato,“用于人造皮肤的一种新型生物材料纤维和变性胶原的脱水热交联的复合物”《生物医学材料研究杂志》(J.Biome.Mater.Res.)27,79-87(1993)。27．GN Ramachandran,胶原，Ramanathan N.(编)，WileyInterscience,纽约，(1962)。28．J.H.Lillie,D.K.MacCallum,L.J.Scaletta和J.C.Occhino,“胶原结构胶原纤维的一种螺旋组构的证据”《超结构研究杂志》(J.Ultrastruct.Res.)58,134-143(1977)。29．R.Drouin,S.Gao,G.P.Holmquist,“用于DNA损伤分析的琼脂糖凝胶电泳”于《用于DNA损伤和突变检测的技术》G.P.Pfeifer(编),Plenum Press,纽约，1996,(出版中)。30．J.Sambrook,E.F.Fritsch和T.Manistis编，分子克隆实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，1989。31．D.M.Brown,“聚核苷酸和核酸的化学反应”于《核酸化学中的基本原理》Ⅱ卷，Ts′O Paul OP编，学院出版社，纽约-伦敦，1-90页(1974)。
表1未处理或化学处理后胶原海绵的变性温度
用FA、TFA、TFE或HFIP化学处理达1小时(A)和5小时(B)暴露时间的胶原海绵。
表2化学处理过的胶原海绵植入后炎症反应的定性衡量
通过相对度量定性评价炎症反应++表示广泛；+表示中度；±表示轻度，以及0表示无到零散轻度。已注明反应在植入物的周围(P)和内部(I)。
权利要求
1．一种用于制备基本上无朊病毒的含胶原产品的方法，其包括以下步骤a)获得预期形式的胶原产品；并且b)用溶液pH低于大约2的有机酸处理步骤a)的含胶原产品至少大约1小时；从而，基本上清除朊病毒而含胶原产品保持基本上未变性。
2．一种用于制备基本上无朊病毒的胶原衍生产品的方法，其包括以下步骤a)获得预期形式的胶原衍生产品；并且b)用溶液pH低于大约2的有机酸处理步骤a)的胶原衍生产品至少大约5小时；从而，基本上清除朊病毒而至少部分胶原转变为明胶。
3．权利要求1或权利要求2中所定义的方法，其中所说的酸是基本上纯的未稀释的有机酸。
4．根据权利要求3的方法，其中所说的有机酸是三氟乙酸或蚁酸。
5．根据权利要求4的方法，其中所说的有机酸是基本上纯的三氟乙酸
6．根据权利要求4的方法，其中所说的有机酸是基本上纯的蚁酸。
7．根据权利要求1和3到6的任一项的方法，其中所说的处理时间是大约1小时。
8．在权利要求2到6的任一项中所定义的方法，其还包括在步骤b)后交联明胶的步骤。
9．根据权利要求8的方法，其中交联是通过一种有机醛或脱水热处理实现的。
10．根据权利要求9的方法，其中脱水热处理包括在高度真空下于大约110℃加热大约1到3天。
11．根据权利要求2的方法，其中步骤a)的胶原产品获自含有大约0.5至大约0.75％(w/v)胶原的溶液，而且其中所说的在步骤b)后获得的胶原产品是透明的。
12．根据权利要求5的方法，其中所说的步骤a)的胶原产品是一种呈有孔样材料形式的聚乙二醇接枝的胶原。
13．一种用于制备基本上无朊病毒的胶原产品的方法，其包括在大约110℃的温度下处理胶原产品达足以清除朊病毒而未使胶原产品实质上变性的一段时间。
14．根据权利要求13的方法，其中所说的一段时间在大约1天到大约3天之间。
15．一种胶原产品，其基本上是无朊病毒的。
16．一种胶原产品，其是通过权利要求1到14中任何一项的方法制备的。
17．一种制成品，其含有在权利要求15或16中所定义的胶原产品。
18．权利要求17中所定义的制成品，其是一种创伤敷料、一种植入物或一种给药系统。
19．一种制成品，其含有通过权利要求11的方法制备的胶原产品，并且其中在所说的步骤a)的胶原溶液中加入糖胺聚糖或蛋白多糖。
20．根据权利要求19的制成品，其中所说的溶液含有每份重量胶原5％(w/w)的透明质酸。
全文摘要
作为一种生物医学植入物的胶原的使用对病毒和朊病毒提出了安全性问题。研究了用热和通过蚁酸(FA)、三氟乙酸(TFA)、四氟乙醇(TFE)和六氟－异丙醇(HFIP)处理过的胶原的物理化学变化以及体外和体内生物相容性。FA和TFA引起核酸的广泛脱嘌呤化而HFIP和TFE有程度较轻的同样作用。FA分子以及最重要的TFA分子仍然保留在胶原内。虽然这两种酸诱导胶原二级结构中的修饰,但对胶原酶的抗性并未受影响,且体外细胞生长未受损害。剧烈的脱水热处理,例如在高度真空下110℃处理1—3天,也成功地彻底清除核酸。因为这种处理也导致轻度的交联,所以可将其有利地用来清除朊病毒和稳定胶原产品。最后,用TFA的长时间处理提供了一种透明的胶原,其透明度通过加入糖胺聚糖或蛋白多糖,特别是透明质酸而被进一步提高。所有的上述处理可以通过提供一种无病毒或朊病毒的产品而为多种生物医学用途提供一种安全的生物相容的胶原衍生材料。
文档编号A61L15/64GK1212707SQ97192757
公开日1999年3月31日 申请日期1997年1月29日 优先权日1996年1月29日
发明者C·多尔隆, R·德罗因, G·拉罗克 申请人:诊断医治公司