专利名称：具有免疫调解剂作用的酰化n－羟甲基酞胺哌啶酮－前药的制作方法
技术领域：
本发明涉及酞胺哌啶酮的前药，其制备方法，以及它们作为药物活性成分的应用。
过量细胞分裂素TNF-α(肿瘤坏死因子α)的形成在下述疾病的病理中起着核心作用移植物抗宿主反应综合症、多发性硬化、移植排斥、口疮性口炎、结节性红斑麻风、Boeck症、类风湿性关节炎和其它各种与炎症有关的疾病。治疗这些疾病的一个基础是施用诸如地塞米松、己酮可可碱或酞胺哌啶酮等免疫调节活性成分以有目的地抑制TNF-α的释放。
在治疗口疮性口炎时，已经证明酞胺哌啶酮优于传统的免疫抑制剂。酞胺哌啶酮对其显示出良好效果而又不产生一般的免疫抑制作用的其它疾病的实例包括皮肤的红斑狼疮、坏疽性脓皮病和伴有Behcet症的口一生殖器溃疡，以及HIV感染病人的溃疡形成，它们在解剖学上与口疮溃疡没有什么不同，并且不同于大多数与HIV相关的粘膜皮肤损坏——检测不出有微生物起作用。由于不同于炎性的口疮，这种损坏是以大面积的口疮为特征，可出现在整个消化道，如果出现的部位在咽部或在食管时，可能会出现进食困难，并且还会造成口服给药困难，因为这会引起疼痛。病理因素是内源性中介体，它们对内皮和循环的白细胞起作用。在局部形成的TNF-α或其它细胞分裂素的作用下，内皮对白细胞的粘着性显著增加，它对静脉炎的发展有一定作用。有些物质，例如酞胺哌啶酮，可抑制内皮的这些变化，而不会同时阻断特定细胞的免疫防御，从而在治疗上有很大的优势。
在严重的咽部或食管溃疡已造成口服给药困难，甚至不可能服用的情况下，以及在与HIV有关的，严重的腹泻使口服用药达不到预期的效果的病理状况下，将活性组分经肠胃外施用是适当的。但是，酞胺哌啶酮在水中的溶解度低(0.012mg/ml，Arch..Pharm.,321,371(1988))是将此活性组分经肠胃外给药的障碍。
由DE 4211812可知的酞胺哌啶酮衍生物是在戊二酰亚胺残基的氮原子上含有带氨基取代基的苯甲酰氧基甲基基团，这些酞胺哌啶酮衍生物比酞胺哌啶酮在水中的溶解度高得多。但是，这些化合物的水溶液的pH值比生理上的pH值低很多，因此在施用之前必须提高其pH。在这一步骤中，沉淀出相应的碱，其结果是在很大程度上，甚至是完全丧失了它们在水中有较高溶解的优点。
本发明的目的是开发酞胺哌啶酮前药，该前药在生理pH值范围内具有水溶性。本发明的另一目的是通过分离除去非生理前药残留物，使研制出的化合物不产生任何毒理作用。
已经发现，对所研究的化合物提出的要求可通过选择酞胺哌啶酮前药来实现。
相应地，本发明涉及以其碱或生理酸盐形式存在的下式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药
其中R表示-CHR1-NHR2或-(CH2)nCOOH,R1表示H或C1-4烷基，R2表示H、C1-3烷基、C(O)-CH2-NHR3或氨基保护基团，R3表示H或氨基保护基团，以及n是2-4的整数。
R1表示C1-4烷基基团时的R1定义包括直链或支链的烃基，它们可被OH、COOH、-C(O)NH2、NH2、-NHC(O)NH2、-NHC(NH)NH2或S-C1-3烷基，或取代的或未取代的苯基取代。
R2表示C1-3烷基基团时的R2定义包括直链或支链的烃基。
适于作为酞胺哌啶酮前药的，其中的R表示-CHR1-NHR2的式Ⅰ化合物是其中的R1表示H、CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3，特别是其中R1基团表示H、CH3或-CH(CH3)2和R2表示H、CH3、-C(O)-OC(CH3)3或-C(O)-OCH2C6H5的那些化合物。
在其中的R表示-(CH2)nCOOH的式Ⅰ酞胺哌啶酮前药中，n是2的化合物特别合适。
本发明还涉及制备式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药的方法，式Ⅰ中的R表示-CHR1-NHR2,R1表示H或C1-4烷基，R2表示H、C1-3烷基、C(O)-CH2-NHR3或氨基保护基团，R3表示H或氨基保护基团，该方法的特征是在碳化二亚胺或羰基二咪唑存在下，使N-羟甲基酞胺哌啶酮与氨基官能基被保护的一种氨基酸反应，如果需要，接着将氨基保护基通过酸解除去。
叔丁氧羰基和苄氧羰基基团特别适合用作氨基官能团的保护基团。N-羟甲基酞胺哌啶酮与保护的氨基酸之间的反应在有机溶剂如二氯甲烷、氯仿、丙酮、二甲基甲酰胺和/或吡啶之中，在有等摩尔至2倍摩尔量的碳化二亚胺如二环己基碳化二亚胺，或羰基二咪唑存在下进行。反应也可在催化剂如4-吡咯烷基吡啶(4-pyrrolidinopyridine)或4-二甲氨基吡啶存在下进行。
氨基保护基团的酸解去除优选用三氟乙酸进行，可选择在有机溶剂如二氯甲烷存在下进行。
本发明还涉及制备其中R表示-(CH2)nCOOH的式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药的方法，其特征是在胺存在下，使N-羟甲基酞胺哌啶酮与酸酐反应。
琥珀酸酐优选用作所述的酸酐。三乙胺和/或吡啶适合用作胺，相对于使N-羟甲基酞胺哌啶酮其用量通常为等摩尔至二倍摩尔量。反应通常在有机溶剂如二氯甲烷、氯仿、吡啶和/或二甲基甲酰胺中，在有催化剂如4-吡咯烷基吡啶或4-二甲氨基吡啶存在下进行。
本发明化合物与例如下述生理上相容的酸的盐可由相应的碱获得，或者由三氟乙酸盐获得盐酸、氢溴酸、硫酸、甲磺酸、甲酸、乙酸、草酸、琥珀酸、酒石酸、扁桃酸、富马酸、乳酸、柠檬酸、谷氨酸和天冬氨酸。为了制备盐酸盐，优选借助于弱碱性阴离子交换剂将相应的三氟乙酸盐转化成盐酸盐。短链的脂肪醇如甲醇优选作为溶剂。
本发明化合物可作为在生理pH7.0-7.5范围内可溶解于水的物质施用，并且是无毒的。相应的，本发明还涉及式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药作为药物活性成分的应用，该药物优选作为肠胃外用药。
除了至少有一种式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药外，本发明的药物中还含有载体物质、填充剂、溶剂、稀释剂、着色剂、和/或黏合剂。这些辅剂物质及其用量的选择取决于药物是通过静脉内、腹膜内、真皮内、肌内、鼻内或局部的何种方式给药。
给患者施用的活性组分的量取决于患者的体重、肠胃外用药的类型、适应症和疾病的严重程度，通常为0.1-10mg/kg式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药。
由于具有显著的免疫调解功能而又不会引起常有的免疫抑制，式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药适用于治疗所有以形成高含量TNF-α为特征或以病灶性脉管炎为特征的疾病。
实施例制备本发明化合物用叔丁氧羰基保护的氨基酸可按照Hoppe-Seyler在Z.Physiol.Chem.,357,1651(1976)中所述的方法制备。
柱色谱分离按下述条件进行硅胶，颗粒大小为0.05-0.2mm，购自Merck公司。
水中的溶解度用UV分光光度计，在300nm和25℃测定。
实施例1N-叔丁氧羰基-2-氨基乙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯(1)室温下，将2.88g(10mmol)N-羟甲基酞胺哌啶酮，1.75g(10mmol)N-叔丁氧羰基甘氨酸，2.06g(10mmol)二环己基碳化二亚胺和0.15g(1mmol)4-吡咯烷吡啶于50ml无水二氯甲烷中搅拌24小时，接着滤除沉淀的二环己基脲，滤液先与乙酸，再与水一起震荡，有机相用硫酸镁干燥后蒸馏除去溶剂，残余物用乙醇重结晶，得到2.59g化合物1(理论值的58％)，熔点108-111℃。
实施例22-氨基乙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯盐酸盐(2)室温下，将1.78g(4mmol)实施例1制备得到的化合物1在20ml25％(体积)三氟乙酸和75％(体积)二氯甲烷的混合物中搅拌1小时，接着真空除去溶剂。得到的残余物与二氯甲烷共蒸馏。将得到的三氟乙酸盐溶于160ml甲醇，并通过离子交换色谱(Amberlite IR 45用作离子交换剂，在使用之前用1N盐酸将其转化成Cl的形式)将其转化成盐酸盐。蒸馏除去溶剂后，把得到的残余物悬浮于沸腾的乙醇中，为了形成澄清的溶液用水逐滴进行处理。得到0.81g化合物2(理论值的53％)，熔点227-232℃，在水中的溶解度为49.7mg/ml，相当于每毫升33.6mg酞胺哌啶酮。
实施例3N-叔丁氧羰基-2-甲氨基丙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯(3)室温下，将4.32g(15mmol)N-羟甲基酞胺哌啶酮，3.05g(15mmo1)N-叔丁氧羰基-L-N-甲基丙氨酸，3.09g(15mmol)二环己基碳化二亚胺和0.22g(1.5mmol)4-吡咯烷基吡啶于75ml无水二氯甲烷中搅拌24小时，接着滤除沉淀的二环己基脲，滤液先与乙酸，再与水一起震荡，有机相用硫酸镁干燥后蒸馏除去溶剂，以二氯甲烷/丙酮(体积比9∶1)用柱色谱纯化残余物，得到4.44g化合物3(理论值的63％)，熔点123-125℃。
实施例42-甲氨基丙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯盐酸盐(4)按照实施例2给出的条件将实施例3得到的化合物3转化成化合物4。用甲醇/乙醚结晶得到1.05g化合物4(理论值的64％)，熔点147-151℃，在水中的溶解度大于300mg/ml，相当于每毫升多于190mg酞胺哌啶酮。
实施例5N-叔丁氧羰基-2-氨基-3-甲基丁酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯(5)按照实施例3给出的条件，由4.32g(15mmol)N-羟甲基酞胺哌啶酮，3.26g(15mmol)N-叔丁氧羰基-L-缬氨酸，3.09g(15mmol)二环己基碳化二亚胺和0.22g(1.5mmol)4-吡咯烷基吡啶得到3.85g化合物5(理论值的53％)，熔点82-85℃。
实施例62-氨基-3-甲基丁酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯盐酸盐(6)按照实施例2给出的条件将实施例5得到的1.95g(4mmol)化合物5转化成化合物6。用乙醇/乙醚结晶得到1.01g化合物6(理论值的60％)，熔点145-150℃，在水中的溶解度大于300mg/ml，相当于每毫升多于190mg酞胺哌啶酮。
实施例72-(N-叔丁氧羰基-氨基甲基羰基氨基)乙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯(7)按照实施例1给出的条件，由2.88g(10mmol)N-羟甲基酞胺哌啶酮，2.32g(10mmol)N-叔丁氧羰基甘氨酰基甘氨酸，2.06g(10mmol)二环己基碳化二亚胺和0.15g(1mmol)4-吡咯烷基吡啶得到3.67g化合物7(理论值的73％)，熔点178-181℃。
实施例82-(氨基甲基羰基氨基)乙酸-[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲基酯盐酸盐(8)按照实施例2给出的条件由实施例7得到的2.01g(4mmol)化合物7得到1.35g化合物8(理论值的77％)，在水中的溶解度大于300mg/ml，相当于每毫升多于190mg酞胺哌啶酮。
实施例9[3-(1,3-二氢-1,3-二氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-二氧代哌啶-1-基]甲氧基羰基丙酸(9)室温下，将2.88g(10mmol)N-羟甲基酞胺哌啶酮，2g(20mmol)琥珀酸酐，2.8ml(20mmol)三乙胺和0.15g(1mmol)4-吡咯烷基吡啶于50ml无水二氯甲烷中搅拌24小时，接着将反应混合物先与5％盐酸，再与水一起震荡，有机相用硫酸镁干燥后蒸馏除去溶剂，得到的残余物用少量的乙酸乙酯处理，把沉淀出的结晶用乙醇重结晶，得到2.66g化合物9(理论值的68％)，熔点143-146℃，在水中的溶解度为16.7mg/ml，相当于每毫升11.1mg酞胺哌啶酮。
药理学研究在用脂多糖(LPS)刺激后，用人体外周血的单核细胞(T细胞，B细胞和单核细胞)进行TNF-α释放的体外研究，LPS是细菌细胞壁的一种成分，并可刺激单核细胞和巨噬细胞。
由至少三个志愿者的用肝素处理过的血液得到单核细胞。为此，在每种情况下把20ml血用已知的方法通过Ficoll-Paque梯度分离，收集细胞，用细胞培养介质洗涤三次。所用细胞培养介质的组成是RPMI 1640介质，补充2mM谷氨酰胺(Life Technologies,Eggentein),10％胎牛血清(Life Technologies),50(g/l链霉素(Sigma,Deisenhofen),50 IU/ml青霉素(Sigma,Deisenhofen)，和100μM β-巯基乙醇(Merck,Darmstadt)。接着将单核细胞溶于15ml/l细胞培养介质，并在无菌24孔培养板(Sigma)上将其分成每份1ml的一组。在一组的1ml样品中加入1μl二甲亚砜(DMSO,Merck)作为对照组。在各试验组中加入1μl本发明化合物的溶液(DMSO溶液，试验的最后浓度为0.5；5；12.5和50μg/ml)，将它们在CO2孵化室(5％ CO2，空气湿度90％)中孵化1小时。接着除对照组之外，在每组中加入2.5(g LPS(由E.coli 0127:B8,Sigma,Deisenhofen)作为刺激物，将培养物继续孵化20小时。然后，用ELISA试验(Boehringer Mannheim)测定各份细胞培养物上清液中的TNF-α浓度。对TNF-α释放抑制的多少可由对照组和与本发明化合物一起孵化的各组的测定值计算。使TNF-α的释放被抑制50％时的浓度(IC50值)可借助线性回归曲线计算。
下面的表说明了本发明化合物对LPS诱导TNF-α释放的抑制作用。
本发明化合物对动物模型的效果为了进行本发明化合物的免疫药理作用的体内鉴定，选择的试验模型是刺激T-淋巴细胞。此免疫药理学动物模型的相关性起因于为引发免疫响应所必需的细胞一细胞间协同作用。T细胞的活化和克隆扩充的前提首先是由抗原呈递细包如单核细胞和T细胞之间的相互作用建立的。这是抗感染的防御和自身免疫攻击行为或移植排斥或移植物抗宿主反应(移植物抗宿主病)均有的特征。例如，淋巴细胞的浸润形成了慢性移植物抗宿主反应的最初阶段，也形成了在口腔粘膜上的急性口疮损伤的最初阶段，诸如在Behcet症中或在常称之为口疮中发生的情况。
通过给balb/c小鼠在静脉内应用葡萄球菌肠毒素B(SEB；200μg)刺激T细胞，该小鼠预先用半乳糖胺处理过。SEB是超级抗原，它首先将MHC分子结合至抗原呈递细胞，然后使不变的结构与某些T细胞受体群结合。由此使T细胞和单核细胞都活化。用专门鉴定鼠IL-2的商业ELISA试验测定血清中细胞因子白细胞介素-2(IL-2)的浓度，作为T细胞活化的参数。注射SEB使血清中IL-2水平与时间有关地增加提高，在SEB注射2小时后，有-个清楚的最大值。在血清中测出的IL-2来源于T细胞这由向缺乏T细胞的SCID小鼠施用SEB得到证实，在此小鼠中不形成IL-2。
将本发明化合物溶于1％羧甲基纤维素(CMC)的水溶液，在施用SEB之前30分钟给动物经腹膜内用药，剂量为100-400mg/kg，体积为1ml。对照组的动物经腹膜内施用1％CMC水溶液。施用SEB 2小时后测定血清中IL-2的浓度。将本发明化合物处理过的各组与对照组比较，下表中给出了对IL-2水平的最大抑制作用(以％表示)。所引用的百分数表示在各种条件下进行的6-8次分别试验的平均值。使血清中IL-2浓度减少40％时的剂量(ED40值)可借助回归曲线计算。
比较试验表明，与糖皮质激素不同，本发明化合物甚至在用SEB刺激前30分钟时施用时也可以抑制血清中IL-2的增加。但是为了达到糖皮质激素的抑制效果，必须在用SEB刺激前18小时施用此物质。
权利要求
1．碱或生理酸盐形式的下式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药
其中R表示-CHR1-NHR2或-(CH2)nCOOH，R1表示H或C1-4烷基，R2表示H、C1-3烷基、C(O)-CH2-NHR3或氨基保护基团，R3表示H或氨基保护基团，以及n是2-4的整数。
2．权利要求1的酞胺哌啶酮前药，其特征在于R1表示H、CH3、-CH(CH3)2、-CH2CH(CH3)2或-CH(CH3)CH2CH3。
3．权利要求1和2之一或两者的酞胺哌啶酮前药，其特征在于R1表示H、CH3或-CH(CH3)2和R2表示H、CH3、-C(O)-OC(CH3)3或-C(O)-OCH2C6H5。
4．权利要求1的酞胺哌啶酮前药，其特征在于n是2。
5．制备权利要求1中R表示-CHR1-NHR2的式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药的方法，其特征是在碳化二亚胺或羰基二咪唑存在下，使N-羟甲基酞胺哌啶酮与氨基酸反应，其中的氨基官能基是被保护的，以及如果需要，接着将氨基官能团的保护基通过酸解除去。
6．权利要求5的方法，其特征在于所用的氨基酸的氨基官能团是被叔丁氧羰基或苄氧羰基基团保护的。
7．权利要求5和6之一或两者的方法，其特征在于酸解是用三氟乙酸进行的。
8．制备权利要求1中R表示-(CH2)nCOOH的式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药的方法，其特征是在胺存在下，使N-羟甲基酞胺哌啶酮与酸酐反应。
9．权利要求1的酞胺哌啶酮前药作为药物的活性成分的应用。
10．权利要求9的应用，其特征在于该药物是经肠胃外给药。
全文摘要
本发明涉及碱形式或生理酸盐形式的式Ⅰ的酞胺哌啶酮前药,其中R表示－CHR
文档编号A61K31/445GK1215397SQ97193682
公开日1999年4月28日 申请日期1997年3月22日 优先权日1996年4月9日
发明者J·施纳特, W·温特, S·沃南特, K·兹温根伯格, K·艾格, M·艾克曼 申请人:格吕伦塔尔有限公司