新的分散性脂类掺合物及其用途的制作方法

专利名称：：新的分散性脂类掺合物及其用途的制作方法相关申请本申请是1995年3月9日提交的，序号为08/401,974的共同待审的美国申请的部分继续申请，而上述申请是1993年11月30日提交的序号为08/159,687的美国申请的部分继续申请，该申请又是1993年6月6日提交的序号为08/076,239，现在为美国专利5,469,584的美国申请的部分继续申请，后者为1993年2月17日提交的序号为08/018,112，现已放弃的美国申请的部分继续申请。该申请为1992年10月27日提交的序号为07/967,974现为美国专利5,352,435的美国申请的分案申请，该申请又为1992年1月8日提交的序号为07/818,069现为美国专利5,230,882的美国申请分案申请，该申请为1991年8月26日提交的序号为07/750,877现为美国专利5,123,414的美国申请的分案申请，该申请为1990年8月20日提交的序号为07/569,828现为美国专利5,088,499的美国申请的分案申请，该申请为序号为07/455,707现已放弃的共同待审美国申请的部分继续申请。
背景技术：
：发明领域本发明涉及冷冻干燥的脂类组合物和充气微球体的制备方法。冷冻干燥的脂类组合物在按本发明方法制备充分微球体中特别有用。按这些方法制备的微球体特别适用于，例如，超声成像和治疗传送系统。
背景技术：
：常规的脂类和脂类掺合物的制剂通常被分散于有机溶剂如环己烷∶乙醇混合物中形成均匀的分散系，接着经冷冻及随后的真空干燥(冷冻干燥)形成混合物。脂类分散系或干燥的脂类掺合物的常规制剂的制备仅限于脂类在物理性质(即溶解系数，极性)与水或水基制剂不同的有机溶剂中溶剂化。其中的问题是该分散系很难被水基制剂再水化。另外，该脂类组合物的均匀程度很低，不同于由本发明脂类的比例所具体说明的完全的均匀性。常规分散系在药学可接受的制剂中再水化的时间和能力都很有限。脂类颗粒经常不能充分地水合，为非分散性的，不溶的，药学上不能接受的制剂形式，脂类颗粒不能通过一个或多个0.2μm的灭菌过滤滤器。在先技术的脂类制剂不能很好地分散。因此也就不能使用0.22μm滤器从溶液中过滤。未过滤的部分导致该组合物中脂类的比例一批与另一批不一致。过去常常测定脂类分散系中最终分散在制剂中的总的脂类。这种测定不能被接受，因为这种方法常常导致它所测定的分散系难于制备制剂并且所得制剂中脂类的量是未知的。另外，由于该方法所用的时间和费用，它也是无效的和不能实施的。这些问题和/或其他问题将在本发明中提出。现有技术简述Janoff等在U.S.4,880,635、公开的PCT申请WO86/01103、和公开的欧洲专利申请0562641A1和0562424A1中公开了通过在一种或多种保护性糖如双糖的存在下减压干燥脂质体制剂而制备的脱水脂质体。如遇到下列条件脂质体有多分子层脂类；未在预先冷冻下脱水，以及脱水结束时在制剂中要保持每摩尔脂类中含至少12摩尔水以保持多分子层脂类的完整性时，保护糖可以被省去。Huang等在U.S.4,927,571中公开了脂质体中阿霉素的胶囊化。Huang等的脂质体制备方法包括1)薄膜水合作用，从而通过干燥制备非常薄的干燥薄膜和2)注入溶剂，制备高浓度的分散系(超过40mM脂类)。Gamble在U.S.4,753,788公开一种通过微乳化制备微小脂类囊的方法。将一种脂类和脂固醇溶于氯仿并干燥形成薄膜。所得薄膜在真空下干燥并且再水化。Schneider等在复审U.S.B14,229,360公开了一种脂质体的脱水方法，以便将其以粉末形式贮存，从而可在晚些时候使用该脂质体。Hauser在U.S.5,089,181中公开了一种通过在防腐添加剂的存在下在60℃到150℃的温度下蒸发含有含水介质的微囊使单层脂类微囊脱水的方法。Collins在公开的PCT申请WO95/12387公开了一种用药物释放的包封及分散生物活性物质的方法，该包封方法包括一次或多次冷冻熔化脂质体的循环并对脂质体分散系脱水，形成脂类粉末。因此，目前仍需要新的和/或更好的冷冻干燥组合物和微球体及其制备方法。本发明的目的正是为满足这些以及其他重要的需求。发明概要首先，本发明提供了一种充入含氟气体的微球体，其中包含水基载体中的由冷冻干燥脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)、和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)组成的掺合物和全氟化碳气体。微球体的脂类优选地由约70到约90mol％DPPC、约5到约15mol％DPPE-PEG、和约5到约15mol％DPPA组成。分散在药学上可接受的水基载体中的脂类的总的浓度优选地为约0.1mg/ml到约5mg/ml，更优选约3mg/ml，甚至更优选约1mg/ml。本发明脂类组合物和微球体中使用的聚乙二醇(PEG)的分子量可为约4,000到约200,000，更优选约1,000到约20,000，甚至更优选约2,000到约8,000，最优选约5,000。第二方面，本发明提供了一种冷冻干燥的脂类组合物。该脂类组合物包括比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。冷冻干燥前含水溶液中脂类的总的浓度优选地为约20mg/ml到约50mg/ml，更优选地为约40mg/ml，更优选地为约30mg/ml，甚至更优选地为约25mg/ml。第三方面，本发明包括一种制备充入含氟气体的微球体的方法，该方法包括得到一种冷冻干燥脂类组合物，其中包括比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸，其中冷冻干燥前含水溶液中脂类总的浓度为约20mg/ml到约50mg/ml；将上述冷冻干燥组合物以约0.1mg/ml到5mg/ml的浓度分散在药学上可接受的水基载体中，得到形成微球体的含水溶液；将含氟气体引入形成微球体的含水溶液，得到含氟的形成微球体的含水溶液；以及摇动该形成微球体的含水溶液，得到充入含氟气体的微球体。第四方面，本发明提供了一种制备冷冻干燥脂类组合物的方法，该方法包括将比例分别为约70到约90mol％DPPC、约5到约15mol％DPPE-PEG、和约5到约15mol％DPPA的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20mg/ml到约50mg/ml的浓度分散在含水载体中，得到含脂类的含水溶液；以及将上述含脂类的含水溶液冷冻干燥，得到二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的均匀的冷冻干燥脂类组合物。下面的详细描述将更清楚说明本发明的这些方面和其他方面。附图的简要描述附图1为使用非线性梯度得到的高压液相层析(HPLC)图谱。HPLC分离用ASTEC5μm球形二醇键合的250×4.6mm钢分析柱(AdvancedSeparationTechnologies,Inc.,Whippany,NewJersey)进行。展开的流动相为氯仿∶甲醇∶30％氨水混合物(90∶9∶1.0,v∶v∶v)，浓缩相为氯仿∶甲醇∶水∶30％氨水混合物(60∶34∶4.0∶2.0,v∶v∶v∶v)。附图2A为由实施例6的乙醇∶环己烷混合物分散并冷冻干燥的脂类掺合物的HPLC图谱。附图2B为由实施例6含水掺合物分散并冷冻干燥的脂类掺合物的HPLC图谱。发明详述除非另外指出，上述及整个申请文件中使用的术语具有下列意义。“冷冻干燥”指通过迅速冷冻并在冷冻状态下脱水(有时也称升华)，从而制备干燥形式的脂类组合物。冷冻干燥应在可使脂类结晶形成脂类基质的温度下进行。该过程可在真空及足以在室温下保持冷冻状态的产品与含容器的环境温度的压力下进行，该压力优选地小于约500mTorr，更优选小于约200mTorr，甚至更优选小于约1mTorr。由于用于制备本发明脂类组合物的脂类的量小，冷冻干燥不难进行。与现有技术相比本发明减小了脂类的用量并且由于滤掉了大(＞0.22μm)颗粒物质，脂类组合物配制过程中最大限度地减小了损失，因此本发明的脂类组合物比常规微球体组合物更有优越性。过滤步骤对于具有净负电荷的脂类(即磷脂酸)特别重要，这是因为它们在水基稀释剂中的溶解性很差。“再生”指通过在原来的部分中加入含水载体恢复成原来的组合物。也就是在冷冻干燥的82％DPPC:8％DPPE-PEG:10％DPPA(mol％)中加入含水载体，再生出原来的脂类掺合物。按本发明的方法制备的冷冻干燥脂类组合物在组合物的所有部分都具有单一的脂类比例。这样，脂类比例的一致性使药学上可接受的水基载体中的组合物容易再生。冷冻干燥脂类组合物的不同部分中二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例是相同的，分别为约70到约90mo1％、约5到约15摩尔比、和约5到约15mol％方法。这主要保证了脂类组合物取样的一致性，得到既使不同一，也是相似的脂类组合物微球体，因此具有提高的性质。另外，优选的冷冻干燥脂类组合物为絮凝状的，具有片状粉末外观。可以相信，整个组合物中脂类的比例均匀至少部分是由于制备冷冻干燥脂类组合物的三步方法包括脂类在水基载体中的水合，因而为掺合物建立了适当的物质基质，将该基质冷冻，通过干燥除去基质中的水。与组合物中脂类均匀分布和在含水载中易于再生一样，令人意想不到地，按本发明方法制备的充气微球体还具有一些令人吃惊的有益性质。例如，由于它们的生物相容性以及当微球体破裂后亲脂化合物易于通过细胞膜，充气微球体很有用处。本发明的微球体对超声波也具有强烈的回波发生性，对压力具有高稳定性，和/或一般具有长的贮存期，不论是干燥贮存还是悬浮在液体介质中。微球体的回波发生性对于按本发明制备的微球体的诊断和治疗用途是非常重要的。充气微球体还具有很多优点，例如，稳定的大小、低毒性和柔软的膜。显然，充气微球体柔韧的膜可有助于将这些微球体集中并定向于组织如脉管和肿瘤。本发明充气微球体对超声波对比成像具有优越的特性。在水或组织介质中，充气微球体对增强的声音吸收产生界面。“微球体”指特征为存在内部空间的球状实体。优选的微球体由脂类包括本申请所述的各种脂类配制。在所有给出的微球体中，脂类可以单层或双层形式存在、单或双层脂类可用于形成一个或多个单或双层。在超过一个单或双层的情况下，该单或双层一般同心。这里所述的微球体包括一般称为脂质体、胶囊、气泡、微气泡、囊等的实体。因此，脂类可用于形成单层微球体(包括一个单层或双层)、寡层微球体(包括约二或约三个单层或双层)或多层微球体(包括多于三个的单层或双层)。微球体的内部空间由含氟气体，全氟化碳气体，更优选全氟丙烷或全氟丁烷，氢氟化碳气体，或六氟化硫填充；如果需要，还可进一步含有固体或液体材料，例如靶配体和/或生物活性剂。“脂质体”指两亲化合物的一般的球状物或聚集体，典型地具有一个或多个同心层。充气脂质体更优选地由单层(即unilamellar)或单个单层脂类构成。尽管优选的脂质体组合物包括比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸，但是组成脂质体的脂类也可有很大变化，包括磷脂和非离子表面活性剂(例如niosomes)。充气脂质体中最优选的脂类在生理温度下为凝胶态。脂质体可交联成聚合，在其表面可带有聚合物如聚乙二醇。对准内皮细胞的靶配体可与充气脂质体表面键合。最优选的脂质体内部实际上不存在水。本发明特别涉及一种冷冻干燥的脂类组合物，其包括比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸，冷冻干燥前含水溶液中脂类的总的浓度为约20mg/ml到约50mg/ml，更优选约40mg/ml，更优选约30mg/ml，甚至更优选约25mg/ml。本发明脂类组合物和微球体中使用的聚乙二醇的分子量可为约4,000到约200,000，更优选约1,000到约20,000，甚至更优选约2,000到约8,000，最优选约5,000。充气微球体也为本发明的优选方案，该微球体包括药学上可接受的水基载体中的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的冷冻干燥脂类掺合物和全氟化碳。药学上可接受的载体中的脂类的总的浓度为约0.1mg/ml到约5mg/ml。优选的全氟化碳为全氟丙烷和全氟丁烷。本发明也提供了一种制备冷冻干燥脂类组合物的方法，其中包括将比例分别为约70到约90mol％、约5到约15摩尔、和约5到约15摩尔的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20mg/ml到约50mg/ml的浓度分散在含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；以及冷冻干燥上述含脂类的含水溶液，得到其中二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂醇的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的均匀的冷冻干燥的脂类组合物。本发明的另一优选方案为制备充入含氟气体的微球体的方法。该方法包括得到二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的冷冻干燥组合物，其中在冷冻干燥前脂类在含水溶液中的总的浓度为约20mg/ml到约50mg/ml；以约0.1mg/ml到约5mg/ml的浓度将上述冷冻干燥的组合物分散在药学上可接受的水基载体中，得到形成微球体的含水溶液；在形成微球体的含水溶液中引入含氟气体，得到含氟气体的形成微球体的水溶液；以及摇动形成微球体的含水溶液得到充入含氟气体的微球体。本发明提供了另一种制备充入含氟气体的微球体的方法，其中包括将比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到15mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20mg/ml到约50mg/ml的浓度在含水溶液中再生，得到含脂类的含水溶液；将上述含脂类的水溶液冷冻干燥得到其中二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到15mol％的均匀的冷冻干燥组合物；将上述冷冻干燥组合物以约0.1mg/ml到约5mg/ml的浓度分散于药学上可接受的含水载体中得到形成微球体的含水溶液；将含氟气体引入形成微球体的含水溶液；以及摇动上述形成微球体的含水溶液，得到充入含氟气的微球体。脂类组合物的含水载体可为水、缓冲液、一般盐水、生理盐水等，以及其他本领域技术人员已知的其他含水载体。微球体溶液的药学上可接受的水基载体可为水、缓冲液、一般盐水、生理盐水，比例分别为8∶1∶1或9∶1∶1(v∶v∶v)的水、甘油、和丙二醇的混合物或盐水、甘油、和丙二醇的混合物，比例为9∶1(v∶v)的盐水和丙二醇的混合物等。本发明的另一优选方案中提供了一种新的制备充气微球体的方法，其中包括上述步骤并可进一步包括将形成微球体的含水溶液过滤，从至少一个选择孔径大小的滤器压出的步骤，其中孔径大小可小于10μm，优选约0.22μm。在另一优选方案中，可将形成微球体的含水溶液加热。该充气微球体制备方法包括将含有形成微球体的含水溶液的容器放入一个室中，改变该室的压力，在该室中引入全氟化碳，使容器上面的空间充满全氟化碳，以及摇动容器形成含全氟化碳的微球体。制备脂类组合物的优选方案中包括将比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约25mg/ml的浓度分散于含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；将上述含脂类的水溶液冷冻干燥，得到二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的均匀的冷冻干燥脂类组合物。制备充气微球体的优选方法包括将比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约25mg/ml的浓度分散于含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；将上述含脂类的水溶液冷冻干燥，得到二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10摩尔的均匀的冷冻干燥脂类组合物；在一个容器中，以约1mg/ml的浓度将该组合物分散在药学上可接受的水基载体中，得到形成微球体的含水溶液；通过孔径约0.22μm的灭菌滤器过滤上述形成微球体的含水溶液；选择性加热上述形成微球体的含水溶液；将该形成微球体的含水溶液置于至少一个容器中，将该容器置于压力室中并抽空该室；在该室中引入含氟气体，使容器上面的空间充满含氟气体；以及摇动容器。优选地，在低于液体由凝胶到液晶的相转移温度的温度下摇动，得到充入含氟气体的微球体。冷冻干燥脂类组合物在本发明特别优选的方案中，冷冻干燥组合物包括三个组分(1)二棕榈酰磷脂酰胆碱，一种中性(例如，非离子或两性离子)脂类，(2)二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇，一种带有亲水聚合物的脂类，以及(3)二棕榈酰磷脂酸，一种带负电荷的脂类。优选地，带负电荷的脂类在总的脂类中的量大于1mol％，并且带有亲水性聚合物的脂类在总脂类中的量也大于1mol％。当使用某种本身不溶于水基载体的脂类时，使用两种或两种以上的脂类可能很有好处。按本发明的冷冻干燥法，通过水分散系将不溶于水的脂类如磷脂酸首先与另一种脂(或脂类)混合可使其的分散更加容易。现已发现在低于用作稳定化合物的脂的凝胶向液晶转化的相转变温度的温度下制备可容易得到稳定的微球体，而这种制备是优选的。该转移温度是脂类双层由凝胶状态向液晶状态转变时的温度。例如，参见Chapman等，J.Biol,Chem.1974,249,2512-2521。人们通常认为，凝胶向液晶转变的相转变温度越高，充气微球体在任何给定温度下越不易渗透。参见DerekMarsh的CRCHandbookofLipidBilayers(CRCPress,BocaRaton,FL1990)，在P.139描述了二酰基-sn-甘油基-3-胆碱磷酸的主链的熔化转变。对于本领域技术人员，很容易了解各种脂类的凝胶态向液晶态转变的相转变温度，例如，它们描述于Gregoriadis,ed.,LiposomeTechnology,Vol.I,1-18(CRCPress,1984)。形成充气微球体的少量即总脂类量的约1到约15mol％的负电荷脂二棕榈酰磷脂酸将有助于提高本发明微球体的稳定性。负电荷脂二棕榈酰磷脂酸可通过抵消微球体相互熔合酸裂的趋势而提高其稳定性，也就是说，负电荷脂趋向在微球体外表面建立均匀的负电荷层，它将排斥其他微球体外表面的相同电荷。因此，微球体可以防止相互贴近，这种贴近常常导致各个微球体的膜或外壳破裂，将临近的数个微球体合并成单个的大微球体。当然，如果这种合并持续发展将导致微球体的明显降解。用于制备本发明充气微球体的脂类包括但不限于以下脂类，如二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇(DPPE-PEG)、和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)。上述脂类的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％；更优选约80到约85mol％、约5到约10mol％、和约5到约10mol％；最优选约82mol％、约8mol％、和约10mol％。本发明脂类组合物和微球体中脂类的比例在各部分都是恒定的。冷冻干燥脂类组合物中脂类的总浓度为约20到约50mg/ml，更优选约30mg/ml，甚至更优选约25mg/ml。显然，脂浓度决定了脂类的混合物或掺合物，为了实现本发明，冷冻干燥脂类组合物中具有至少约50％分散脂类，优选至少约70％分散脂类，甚至更优选约80％分散脂类，最优选约90％分散的脂类。本发明冷冻干燥脂类组合物制备完成后马上用于充气微球体的制备。微球体中脂类的浓度为约0.1到约2mg/ml，更优选约1mg/ml。重要的是微球体制剂中脂类的浓度应允许充气微球体形成而基本上避免充液微球体的形成。本发明基本上避免充液微球体指微球体组合物中具有至少50％充气微球体，优选至少约60％充气微球体，更优选至少约70％充气微球体，甚至更优选至少约80％充气微球体，最优选至少约90％充气微球体。稳定充气微球体特别组分为某些种类的含水包容物质，包括构成微球体的脂类，由于它的疏水/亲水性质，它最稳定的构型可使其成为这样的包容物质。可用于构成这样的含水包容物质的载体或稀释剂包括，但不限于水，即可为去离子水也可在其中溶入一些盐等，这些物质不干扰微球体的构成和维持或其使用；以及一般盐水和生理盐水等，相对于含水载体冷冻干燥前脂类组合物中脂类的浓度为约20到约50mg/ml，更优选约25mg/ml。本发明优选方案中冷冻干燥脂类组合物包括二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇-5000(DPPE-PEG5000)、和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)。这些组合物中最优选的比例为82∶8∶10mol％。DPPC组分实际是中性的，因为磷脂酰部分带负电荷而胆碱部分带正电荷。在最终的充气微球体浓度范围内，第二组分DPPE-PEG在DPPE部分带有一个与脂类键合的聚乙二醇，PEG部分与构成微球体膜或壳的表面游离，因而形成一个物理屏障以对抗体内用于降解外来物质的各种酶和其他内源物质。当它与其他脂类如DPPC和DPPA按给定比例结合时，DPPE-PEG可使脂类组合物再水合时产生更多较小的微球体，使其在压力下更安全更稳定。理论上也可推断PEG可对抗人类免疫系统巨噬细胞的作用，否则它将包围并除去外来物质。结果延长了微球体可作为诊断成像对照介质的时间。根据上面进一步描述的关系负电荷脂类作为附加试剂的机理，加入带负电荷的DPPA组分可提高稳定性。充气微球体本发明的微球体包入了气体，这里使用的术语“充气”表示本发明提供的微球体具有内部空间，其中气体含量至少为约10％，优选至少约25％，更优选至少约50％，甚至优选至少约75％，最优选至少约90％。使用中气体存在的部位很重要，优选微球体内部空间包括至少约10％的气体，优选至少约25％、50％、75％、最优选至少约90％的气体。现已发现含氟气体包括全氟化碳、氢氟化碳和六氟化硫特别于本发明的充气微球体。合适的全氟化碳包括，例如，全氟丁烷、全氟环丁烷、全氟甲烷、全氟乙烷、全氟丙烷、全氟戊烷、全氟己烷，最优选全氟丙烷。合适的氢氟化碳包括1,1,1,2,3,3,3七氟丙烷和1,1,2,2,3,3,3七氟丙烷。也优选使用不同类型气体的混合物，如全氟化碳气体和另一类气体如空气、氧气等的混合物。实际上气体的结合特别适用于诊断成像。全氟化碳气体为生物相容的气体。“生物相容的”表示一种气体，被引入病人组织内部时，不会导致任何程度的不能接受的毒性，包括过敏反应和疾病状态，优选地为惰性的。这样的气体也适于制备本申请的充气微球体。也可使用U.S.专利申请No.160,232和159,687所述的稳定剂化合物。因而可根据特定的诊断成像用途调节微球的大小。微球体的直径优选地为约30纳米到约100微米，更优选100纳米到约10微米，甚至更优选200纳米到约7微米。对于特殊用途，例如，脉管的磁共振成像可能需要直径约30μ的微球体，优选更小的，例如直径约12μ的。如果需要，通过备种方法，包括微乳化、旋涡、挤出、过滤、超声波、均化、重复冷冻及熔化循环，通过预定孔径大小的压出，以及相似方法调节充气微球体的大小。用于血管内的微球体的直径通常小于30μ，优选小于约12μ。用于标定的血管，例如，结合某种组织如内皮组织的微球体的直径甚至小于100nm。制备方法本发明的冷冻干燥脂类组合物和充气微球体可按一些适当的方法制备。下面将分别描述这些方法。制备本发明冷冻干燥脂类组合物的方法包括将脂类分散在水基溶液中，以及将含脂类的水基溶液冷冻干燥得到脂类组合物中脂类的比例保持均匀的组合物。制备冷冻干燥的脂类组合物的方法的第一步为将脂类分散或溶解于水基溶液或悬浮液中。将脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸加入水基溶液如水、生理盐水、一般盐水等。水基溶液中总的脂浓度为约20mg/ml到约30mg/ml，更优选约25mg/ml。水基脂类溶液的冷冻干燥步骤包括冷冻和脱水。样品冷冻和脱水的温度为约-50℃到约25℃，优选约-20℃到约25℃，甚至更优选约10℃到约25℃。该温度范围包括但不限于将脂类溶液置于干冰上和液氮中。冷冻干燥优选地在真空下进行，压力应能在室温下保持冷冻的产物与含容器的环境温度，该压力优选地小于约1mTorr。对于脂类组合物的大量制备，如约两升，浓度约25mg/ml，冷冻干燥步骤进行约16小时到约72小时，更优选约24小时到约96小时，甚至更优选约16小时到约24小时。冷冻干燥的结果是组合物易于在另一含水载体如药学上可接受的载体中再分散。冷冻干燥也完全或部分地有益于使组合物中脂类的比例保持均匀。在所得到的脂类组合物中脂类比例保持均匀，为约70到约90mol％二棕榈酰磷脂酰胆碱、约5到约15mol％二棕样品酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和约5到约15mol％二棕榈酰磷脂酸。尽管不限于任何具体的操作理论，但本发明至少部分地将制备冷冻干燥脂类组合物划分为三个步骤，其中包括使脂类在水基载体中水含，然后为掺合物建立合适的物理基质，将该基质冷冻，以及通过干燥除去该基质中的水。所得到的脂类组合物既可以干燥的形式贮存也可分散于水基载体，如诊断和治疗制剂中。本发明优选方案中的组合物为冷冻干燥脂类的絮凝状粉末。在本发明中“絮凝状”指脂类组合物蓬松或片层状外观。絮凝状形式是优选的，因为它易于再生及制备本发明充气微球体。所得冷冻干燥组合物可通过在水基载体，如药学上可接受的赋形剂中使组合物再水化而再生。药学上可接受的载体或赋形剂为以适当的剂量使用使不产生毒副作用的水基载体或赋形剂。选择性地，冷冻干燥组合物可以干燥形式如粉末保存。干燥形式的货架寿命为约一年到约两年。本发明的充气微球体制备中，首先按本申请公开的方法制备冷冻干燥脂类组合物。将冷冻干燥脂类组合物再水化或分散于药学上可接受的含水载体中得到形成微球体的含水溶液，将含氟气体引入该形成微球体的含水溶液，并摇动该溶液。冷冻干燥的脂类组合物易于分散在药学上可接受的载体，形成脂类比例均匀分布的组合物。药学上可接受加载体包括但不限于水、盐水、水∶丙二醇∶甘油的混合物、或盐水∶丙二醇∶甘油的混合物，其中混合物的比例优选地为约9∶1∶1(v∶v∶v)，更优选约8∶1∶1(v∶v∶v)，比例为约9∶1(v∶v)的盐水∶丙二醇，和比例为9∶1(v∶v)的盐水∶甘油等。丙二醇可促进脂类的分散或溶解。丙二醇也可作为增稠剂通过调节微球体膜或壳的表面张力而改善微球体的结果，提高其稳定性。丙二醇也可能进一步形成涂敷在微球体膜或壳的外面，提供附加的稳定性。这样，脂类组合物再水合得到形成微球体的溶液，其中包括比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。但是脂类组合物在药学上可接受的载体中的浓度为约0.1mg/ml到约5mg/ml，优选约3.0mg/ml，更优选约1.0mg/ml。下一步，将含氟气体引入形成微球体的含水溶液，得到注入含氟气体的形成微球体的含水溶液。最优先地，脂质体内部基本上不存在水。在其内部基本上不存在水指本发明提供的微球体的内部空间包含至少约10％的气体，优选至少约25％的气体，更优选至少约50％的气体，甚至更优选至少约75％的气体，最优选至少约90％的气体。在使用中气体的存在是重要的，微球体内部空间优选地包含至少约10％的气体，优选至少约25％、50％、75％的气体，最优选至少约90％的气体。在优选方案中，含氟气体优选地为全氟化碳气体，更优选全氟丙烷或全氟丁烷，置换了形成微球体的含水溶液上面的空气，一旦摇动，便会形成截留了全氟化碳气体、环境气体(例如，空气)，或共同截留了全氟化碳气体和环境空气的充气微球体。然后摇动含全氟化碳的形成微球体的含水溶液，形成充气微球体。优选方案包括在全氟化碳存在下，在低于本发明制备充气微球体所用的脂类凝胶向液晶转变的相转变温度的温度下，摇动含有冷冻干燥脂类组合物的含水溶液的步骤。本申请使用的术语摇动、摇晃、以及各种变化形式表示任何摇动含水溶液使气体从现场环境空间进入含水溶液的运动。摇动必须足够强以形成微球体。摇动可以通过旋动，如通过旋涡、左右或上下运动。可结合作用不同的运动方式。并且，摇动可通过摇动盛脂类含水溶液的容器，也可在容器内摇动含水溶液而不摇动容器本身。另外，摇动既可通过手工也可通过机械。可使用的机械摇动器包括，例如摇动器台，如VWRScientific(Cerritos,CA)shakertable,WIG-L-BUGTMShakerfromCrescentDentalMfg.Ltd.,Lyons,Ill.,ESPECopmixTM,(Seefeld-Oberweis,Germany)和DeGussaMix-o-Mat(Frankfurt,Germany)。在本发明的优选方案中，某些摇动或旋涡方式被用来制备在优选大小范围内的稳定的微球体。摇动为优选的，而摇动优选使用ESPECopmixTM机械摇动器进行。按照上述优选方法，优选地使用往复运动形式生产充气微球体。在本发明的优选方案中，每分钟往复运动的数量，即振动全循环的数量为约1000到约20,000。更优选地，往复运动成振动的数量为2500到8000之间。甚至更优选地，WIG-L-BUGTM的往复运动成振动数超过2600。上述WIG-L-BUGTM为可提供每分钟6000次振动的机械摇动器。当然，振动的数量取决于被摇动的物质的质量(质量越大，振动数量越少)。ESPECapmixTM提供约每分钟4300次的往复运动(RPM)。另一种产生摇动的方式是在高速或高压气体喷射下的运动。显然，如果含水溶液的体积大，摇动的强度也要优选地增加。优选地剧烈摇动被定义为每分钟至少约60次摇动。更优选每分钟至少60-300转的涡旋，最优选每分钟300-1800转的涡旋。一旦摇动便可目测出充气微球体的形成。形成所需稳定程度的微球体所需要的脂类浓度完全取决于所使用的脂类的种类，该浓度可通过常规试验实际测定。例如在优选方案中，按本发明方法用于制备稳定的微球体的冷冻干燥脂类掺合物的浓度为每ml盐水溶液约0.1mg到约5mg，更优选约1mg到约3mg，最优选约1mg。如果需要，通过改变程序，包括微乳化、涡旋、压出、过滤、超声波、均化、重复冷冻和熔化、通过预定大小的孔压出等可调节充气微球体的大小。未进一步改变大小而使用本发明制备的微球体也是可以的。本发明制备充气微球体的方法中也包括任选的步骤。这些另加的步骤包括可以灭菌或限制大小的加热和过滤。这些步骤可在该方法的各个阶段进行，优选但不限于，在得到形成微球体的含水溶液前和摇动含气体的形成微球体的含水溶液之后进行。通过从滤器中压出的简单方法可控制充气微球体的大小；滤器孔的大小决定着所得充气微球体的大小分布。通过使用两个或更多串联的滤器，例如，10μ后接着8μ，充气微球体可具有非常窄的大小分布，集中于7-9μm。过滤后，这些稳定的充气微球体可保持24小时的稳定。调节大小或过滤的步骤可任选性地通过在使用前悬浮液从灭菌小瓶中移出时使用集合的滤器而完成，或者更优选地，使用时集合的滤器可安装在注射器上。于是调节微球体大小的方法包括使用由一个针筒，至少一个滤器，和一个针头组成的注射器；通过将微球体通过固定在注射器上针筒和针头之间的滤器压出可实施上述方法，结果在按照本发明使用微球体作为超声诊断对照剂给患者用药之前调节了微球体的大小。压出步骤也可包括将微球体吸入上述注射器中，滤器也将以同样的方式将进入注射器的微球体调节大小。另一种选择性的方法是将已通过其他方式调节大小的微球体充入注射器，在这种情况下滤器的作用是保证微球体在所需要的大小范围内，或保证所需要的极限大小，随后通挤压注射器而给药。注射器可将调节大小的微球体直接注射给患者，或者也可将微球体分散在容器中。可用于进行调节大小或过滤步骤的典型的装置为1995年3月9日提交的，U.S.08/401,974的美国申请的附图2所示的注射器和组合过滤器，该公开全文在此作为参考引入。稳定的化合物溶液或悬浮液可通过滤器压出。摇动前，上述溶液或悬浮液可任选性地被加热灭菌。加热也有助于脂类在载体中的分散。在本发明的充气微球体的制备方法中加热步骤是非强制性的，尽管它是优选的。充气微球体一旦形成，便可按上述将其过滤调节大小。这些步骤在充气微球体形成之前进行比较有利，例如，可降低未水合的稳定化合物的量，并可显著提高充气微球体的产量，以及提供易于对患者给药的灭菌的充气微球体。例如，可在混合容器如小瓶或注射器中充入含全氟化碳的微球体悬浮液，然后在混合容器中灭菌，例如，通过压热灭菌。通过摇动灭菌容器可将气体注入脂类悬浮液中形成充气微球体。优选地，灭菌容器装有定位的滤器，以便使充气微球体在接触患者前通过滤器。将溶液通过滤器压出，分散了干燥的化合物，更大程度地暴露了表面区域以利于水合，因而减少了未水合化合物的量。优选地，滤器的孔径大小为约0.1到约5μm，更优选地，约0.1到约4μm，甚至更优选地，约0.1到约2μm，最优选地，约1μm。未水合的化合物的外观为大小不一的无定形团块，是不理想的。灭菌可使组合物易于对超声诊断的患者给药。优选地，灭菌通过过滤完成。任选性地也可通过压热溶液进行加热灭菌，压热的温度至少为约100℃，更优选地为约100℃到约130℃，甚至更优选地约110℃到约130℃，甚至更优选地约120℃到约130℃，最优选地约130℃。优选地，加热过程为至少约1分钟，更优选地约1到约30分钟，甚至更优选地约10到约20分钟，最优选地约15分钟。如果在某一温度下加热灭菌会导致充气微球体的破裂，那么可采取其他方式灭菌，灭菌可在充气微球体形成后进行。例如，γ射线可在充气微球体形成前和/或后使用。另外，通过将含形成微球体的含水溶液的容器置于一个室中并引入全氟化碳气体，可将含氟气体引入形成微球体的含水溶液。随后摇动该容器形成充入含氟气体的微球体。选择性地，可将含有形成微球体的含水溶液的容器置于压力室中，抽空该室中的气体，充入含氟气体，使容器上面的空间充满含氟气体。同样可摇动容器，得到充入含氟气体的微球体。也可在不将该容器置于一个室的情况下进行这些步骤。选择性地，可在含形成微球体的含水溶液的容器中充入含氟气体，使其充满上部空间，然后摇动该容器。优选的含氟气体为全氟化碳气体，更优选全氟丙烷和全氟丁烷。使用方法新的冷冻干燥脂类组合物用于制备本发明新的充气微球体。用作诊断成像中的对照介质的新的充气微球体适用于所有使用超声成像的领域。本发明提供了一种在患者存在疾病的组织内进行特殊诊断和/或在患者全身成像的方法，通过对患者使用包括本发明的充气微球体的对照介质，然后作用磁共振成像对患者扫描而实施本发明的成像方法，例如，得到患者内部区域的和/或该区域中任何疾病组织的可见图像。通过患者的某一部位，可了解患者全身或患者特殊区域或部分。另外，本发明提供了一种诊断患者疾病组织的方法。本领域技术人员应该意识到，可以各种方式使用各种剂型的本发明的稳定的充气微球体，如静脉注射、口服、直肠给药等。例如，当扫描的区域为心血管区时，优选以静脉注射的方式使用包含本发明的充气微球体的对照介质。当扫描的区域为胃肠道时，优选以口服或直肠给药的方式使用本发明的对照介质。给药剂量或给药方式主要取决于年龄、体重和特定的哺乳动物和被扫描区域以及所使用的本发明的特殊对照介质。典型地，剂量由低水平开始增加直到达到所需的对照值。可使用各种方式的稳定的充气微球体的组合以修饰介质的松驰性质或改变性质，如粘性、渗透性或可口性(如其为口服材料)。下列具体的实施例Ⅰ-Ⅶ进一步说明本发明。但是，这些实施例不以任何方式限制本发明的范围。实施例实施例1脂类制剂制备方法的说明以25mg/ml的最终浓度将60g二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)分散在灭菌水U.S.P.中。将该液体在45℃加热10分钟，接着平衡至室温。然后通过异丙醇/CO2浴或丙酮/CO2浴冷冻以及通过VirtisLyophilizer干燥而使所得分散系冷冻干燥，直到产物呈干燥的絮状物。然后将干燥的絮状产物加入含90％普通盐水(0.9％NaCl):10％丙二醇(Mallinckrodt,St.Louis,Mo.,U.S.P.)的药物制剂，得到脂类浓度为5mg/ml的制剂。然后将该混合物在45℃加热10分钟，接着用两个0.2μmGelmanSuporflow200灭菌滤器(GelmanSciences,AnnArbor,Michigan)过滤。过滤后产物清彻，只有少于0.1％重量的脂类残留在滤器上。实施例2混合脂类制剂的说明如实施例1所述，以每克脂25ml(40mg/ml)的最终浓度将60g比例为90％∶10％,(w∶w)的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)分散在灭菌水U.S.P.中。使用与上述相同的程序，只是制剂中脂类的最终浓度为1mg/ml。过滤产物，只有低于0.1％的脂类残留。实施例3混合脂类制剂的说明如实施例1所述，以每克脂25ml的最终浓度将60g比例为82％∶8％∶10％(摩尔％)(54％∶40％∶6％(重量％))的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷酰乙醇一聚乙二醇5000(DPPE-PEG5000)、和二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPA)分散在灭菌水U.S.P.中。分散和冷冻干燥过程与实施例1所述相同。然后将脂类混合物以每克25ml的浓度分散于含8∶1∶1(v∶v∶v)的0.9％盐水(灭菌水)∶丙二醇∶甘油的药物载体中。产物易于过滤，两次后损失了少于0.1％的残留混合物。实施例4通过在1)乙醇∶环己烷，2)叔丁醇，和3)含水溶剂中分散和冷冻干燥而制备的脂类掺合物的比较按实施例1所述，通过在三种溶剂1)乙醇∶环乙烷；2)叔丁醇(叔丁醇或1,1-二甲基乙醇)，和3)水中分散，接着冷冻干燥而制备如实施例3中所述的脂类掺合物样品。乙醇∶环己烷1∶1(v∶v)和叔丁醇为有机溶剂的例子。然后将各掺合物的样品在如实施例3中所述的含0.9％盐水(在灭菌水中)∶丙二醇∶甘油8∶1∶1(v∶v∶v)的药学上可接受的载体中配制，命名其浓度为每ml载体溶液含1mg总的脂类。将样品装入小瓶，上部空间不少于总体积的65％，加入全氟丙烷。然后将小瓶在Wig-L-BugTM(CrescentDental,Lyons,Ill.)，并以3300rpm的速率摇动60秒，振动样品以形成微球体。然后使用ParticleSizingSystemsModel770(ParticleSizingSystems,SantaBarbara,Calif.)遮光颗粒大小分档处理器分析各瓶微球体的浓度。表1列出了乙醇∶环己烷掺合物、叔丁醇掺合物、和水掺合物的分布。尽管各掺合物导致的大小分布有些相似，但由含水脂类混合物产生的微球体的数量比有机混合物的要多。表1由环己烷-乙醇，叔丁醇，和水掺合物制备的微球体的分析分布*注叔丁醇脂类分散系进入稀释制剂极其困难，需要约3天才能完全分散/溶解。因此从生产的观点看叔丁醇掺合物不是药学上有效的。实施例5通过在1)乙醇∶环己烷和2)含水溶剂中分散和冷冻干燥而制备的脂类掺合物的比较按实施例4所述制备1)乙醇∶环己烷脂类掺合物和2)含水掺合物样品。摇动产物得到微球体，随后采用ParticleSizingSystems(PSS,SantaBarbara,Calit.)Model770遮光颗粒大小分档处理器分析数字加权的平均微球体大小，测定小于10μm的微球体的百分比。小于10μm的微球体的分析很重要，因为微球体在肺毛细血管床的流动受毛细管大小的限制。该说明中没有过滤的步骤。含水掺合物得到形状更小总数更多的微球体，实际上小于10μm的微球的总数更多。从这次研究的结果发现由于产生了更多的微球体，因而含水脂类掺合物更有效；由于大于10μm的微球体更少，特别是避免了固体脂类，因而含水脂类掺合物更安全。实施例6通过在1)乙醇∶环己烷和2)含水溶剂中分散和冷冻干燥而制备的脂类掺合物的比较在BenVenueLaboratories,Bedford,Ohio.由1)乙醇∶环己烷脂类掺合物和2)含水掺合物物备如实施例4所述的82％∶8％∶10％(mol％∶mol％∶mol％)(54％∶40％∶6％(w∶w∶w))的二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二棕榈酰磷脂酰乙醇-聚乙二醇5000(DPPE-PEG5000)、和二棕榈酰磷脂酸(DPPA)的样品。灭菌充气产物制备前，将样品通过GelmanSuporflow0.2μmfilter(GelmanScientific,Boston,Mass.)灭菌过滤。如实施例4所述，然后将样品分装在玻璃小瓶中并在上面空间充入全氟丙烷。使用PerkinElmerSeries200QuaternaryHPLCpump(PerkinElmerCorp.,Norwalk,Conn.)与RheodyneModel9125SampleInjector,20μLsampleloop，和Model70404-Waysolventswitcher进行HPLC分析。使用预平衡到90℃的ACSModel950/14MassDetector(PolymerLabs,Inc.,Amherst,MA)进行蒸发光散射检测，所有数据输入装有PerkinElmerTurbochrome4.1数据收集与分析软件的80486DOS兼容PC计算机。使用ASTEC5μmsphericaldiol-bonded250×4.6mm钢分析柱(AdvancedSeparationTechnologies,Inc.,Whippany,NewJersey)进行HPLC分离，展开用的流动相为氯仿∶甲醇∶30％氨水混合物(90∶9∶1.0,v∶v∶v)，固定相为氯仿∶甲醇∶水∶30％氨水混合物(60∶34∶4.0∶2.0,v∶v∶v∶v)。附图1和表2提供了非线性梯度曲线。表2提供了峰#(数值)、组分名称、从柱中洗脱出来所需时间(分钟)、以微伏计的各峰的面积(秒)；以微伏计的各峰高度；各峰相对于所有峰总面积的面积百分比；以及面积/峰高(秒)。注意图1列出了以微伏计的反应高度(在表2中为微伏(秒))。表2首先在固定相萃取柱中通过4.0ml甲醇。其次，通过3.0mlLPLC用水，接着加入3.0ml样品制剂。将3ml总脂浓度为1mg/ml的含脂混合物的等分试样装在柱上。然后用6.0mlHPLC用水洗脱该柱，弃去以上所有洗脱液。然后用下列洗脱剂1)10.0ml甲醇，2)10.0ml甲醇∶仿(1∶1,v∶v)，和3)20ml甲醇∶氯仿∶水(10∶10,v∶v∶v)从柱上洗脱脂类混合物。合并三种洗脱液并真空浓缩。通过干冰浴冻及干燥而使剩下的主要是含水残留物冷冻干燥，得到白色粉状提取的脂类残留物。将干燥的残留物溶于1ml无水氯仿，并将20μl注射到HPLC作分析。附图2A为脂类掺合物在乙醇∶环己烷混合物中分散及冷冻干燥的HPLC曲线，表3提供了附图2A的详细数据峰#(数值)、组分名称、从柱中洗脱出来所需时间(分钟)、以微伏计的各峰面积(秒)；以微伏计的各峰高度；各峰相对于所有峰总面积的百分比，以及面积/峰高(秒)。注意图2A列出了以微伏计的反应高度(在表3中为微伏(秒))。表3<>附图2B为脂类掺合物在含水掺合物中分散及冷冻干燥的HPLC曲线。表4提供了附图2B的详细数据峰#(数值)、组分名称、从柱中洗脱出来所需的时间(分钟)、以微伏计的各峰面积(秒)；以微伏计的各峰高度；各峰面积相对于所有峰总面积的百分比，以及面积/峰高(秒)。注意图2B列出了以微伏计的反应高度(在表4中为微伏(秒))。表4<>从含水掺合物中定量萃取说明它是按原来脂的比例制备的。特别地，负电荷脂类，磷脂酸在含水掺合物中分散及溶解的更有效，与有机溶剂掺合相比由过滤带的损失更小。这说明含水掺合物易于药物分析，过滤后损失很少，指定的脂的比例改变很不明显。实施例7使用含水掺合物脂类作超声成像比环己烷-乙醇掺合物脂类性能更好的说明用按优质生产规范(GMP)生产的环己烷∶乙醇掺合物脂类(GMP-1)和含水掺合物脂类(GMP-2)作人的Ⅰ期临床试验。在Ⅰ期临床试验中对健康成年男性使用按实施例4制备的微球体。从前臂静脉注射，相对剂量为5μl/kg,10μl/kg，和15μl/kg。用2.5Mhz,3.5Mhz和5Mhz的转导器在心脏部位作超声成像。成像表明使用GMP-2制剂比使用GMP-1制剂时，在心脏心肌层(肌肉组织)区域具有特别灵敏的不透光性。这说明该掺合物性能更好。含水掺合物使制备更容易，工业生产效率更高，并提高了成像性能。本申请中引用或描述的各个专利、专利申请和公布的公开，作为参考在这里全文引入。从前面的描述中，本领域技术人员对除前述以外的本发明的各种改进是显而易见的。这些改进也将落入所附权利要求书的范围之内。权利要求1．一种充气微球体，其中包含分散于药学上可接受的水基载体中的比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰-乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的冷冻干燥的组合脂类的再生掺合物，其中脂类在药学上可接受的载体中的总的浓度为约0.1mg/ml到约5mg/ml，其中充气微球体中的气体为含氟气体。2．权利要求1的充气微球体，其中包含比例分别为约80到约85mol％、约5到约10mol％、和约5到约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。3．权利要求1的充气微球体，其中包含比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。4．权利要求1的充气微球体，其中含氟气体选自六氟化硫和全氟化碳。5．权利要求4的充气微球体，其中全氟化碳选自全氟丙烷、全氟戊烷、全氟己烷、和全氟丁烷。6．权利要求1的充气微球体，其中脂类的结合浓度为每ml药学上可接受的载体约1mg。7．权利要求1的充气微球体，其中药学上可接受的载体选自水、甘油、和丙二醇的混合物，以及盐水、甘油、和丙二醇的混合物。其比例分别为8∶1∶1(v∶v∶v)。8．权利要求1的充气微球体，其中聚乙二醇的分子量在约400到约200,000之间。9．权利要求1的充气微球体，其中聚乙二醇的分子量在约1,000到约20,000之间。10．权利要求1的充气微球体，其中聚乙二醇的分子量在约2,000到约8,000之间。11．权利要求1的充气微球体，其中聚乙二醇的分子量约为5,000。12．一种冷冻干燥的脂类组合物，其中在含水溶液中包含比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酸磷脂酸，该组合物通过使含水溶液中脂类的总的浓度为约20mg/ml到约50mg/ml的物质冷冻干燥而制备。13．权利要求12的脂类组合物，其中包含比例分别为约80到约85mol％、约5到约10mol％、和约5到约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。14．权利要求12的脂类化合物，其中包含比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸。15．权利要求12的脂类化合物，其中包含比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸，其中在冷冻干燥前脂类在含水溶液中的总的浓度为约25mg/ml。16．权利要求12的脂类组合物，其中该组合物为絮凝状。17．权利要求12的脂类组合物，其中含水溶液选自水、缓冲液、生理盐水和一般盐水。18．权利要求12的脂类组合物，其中聚乙二醇的分子量为约400到约200,000。19．权利要求12的脂类组合物，其中聚乙二醇的分子量为约1,000到约20,000。20．权利要求12的脂类组合物，其中聚乙二醇的分子量为约2,000到约8,000。21．权利要求12的脂类组合物，其中聚乙二醇的分子量约为5,000。22．一种制备充气微球体的方法，其中包括a．将含比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的脂类组合物冷冻干燥，其中冷冻干燥前脂类在含水溶液中的总的浓度为约20mg/ml到约50mg/ml；b．将上述冷冻干燥的组合物分散在一种药学上可接受的水基载体中，形成浓度为约0.1mg/ml到约5mg/ml形成微球体的含水溶液；c．在上述形成微球体的含水溶液中引入含氟气体；和d．摇动上述形成微球体的含水溶液，形成充入含氟气体的微球体。23．权利要求22的方法，其中摇动步骤包括涡旋。24．权利要求22的方法，其中进一步包括将上述形成微球体的含水溶液过滤的步骤。25．权利要求22的方法，其中进一步包括将上述形成微球体的含水溶液通过至少一层选择孔径大小的过滤器压出的步骤。26．权利要求25的方法，其中孔径大小为约10μm或更小。27．权利要求25的方法，其中孔径大小为约0.22μm。28．权利要求22的方法，其中进一步包括加热上述形成微球体的含水溶液的步骤。29．权利要求25的方法，其中进一步包括将上述形成微球体的含水溶液分散在至少一个容器中的步骤。30．权利要求22的方法，其中步骤c包括将含上述形成微球体的溶液的容器放入一个室中并在该室中引入含氟气体，步骤d包括摇动该容器以形成充入含氟气体的微球体。31．权利要求30的方法，其中包括对该容器加压。32．权利要求22的方法，其中步骤包括将含上述形成微球体的溶液的容器放入一个压力室，抽空该室中的气体，充入含氟气体，以使容器的液面以上的空间充满含氟气体，以及步骤d包括摇动该容器，以形成充入含氟气体的微球体。33．权利要求22的方法，其中含水溶液选自水、生理盐水和一般盐水。34．权利要求22的方法，其中药学上可接受的载体选自水、甘油、和丙二醇的混合物，以及盐水、甘油、和丙二醇的混合物，其比例分别为8∶1∶1(v∶v∶v)。35．权利要求22的方法，其中含氟气体选自六氟化硫和全氟化碳。36．权利要求35的方法，其中全氟化碳选自全氟丙烷、全氟戊烷、全氟己烷、和全氟丁烷。37．一种制备充入含氟气体的微球体的方法，其中包括a．将比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸在水溶液中以约20mg/ml到约50mg/ml的浓度再生，形成含脂类的水溶液；b．将上述含脂类的水溶液冷冻干燥，形成其中二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的比例分别为约70到约90mol％，约5到约15mol％、和约5到约15mol％的均匀冷冻干燥组合物；c．将上述冷冻干燥组合物分散在药学上可接受的水基载体中，得到形成微球体的含水溶液，使其浓度为约0.1mg/ml到约5mg/ml；d．将含氟气体引入上述形成微球体的含水溶液；以及e．摇动上述形成微球体的含水溶液，得到充入含氟气体的微球体。38．权利要求37的方法，其中摇动步骤包括涡旋。39．权利要求37的方法，其中进一步包括将形成微球体的溶液过滤的步骤。40．权利要求37的方法，其中进一步包括将上述形成微球体的含水溶液通过至少一层选择孔径大小的过滤器压出的步骤。41．权利要求40的方法，其中孔径大小为约10μm或更小。42．权利要求40的方法，其中孔径大小为约0.22μm。43．权利要求37的方法，其中进一步包括加热上述形成微球体的含水溶液的步骤。44．权利要求40的方法，其中进一步包括将上述形成微球体的含水溶液分散在至少一个容器中的步骤。45．权利要求37的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个室中，并在该室中引入含氟气体，步骤e包括摇动该容器，以形成充入含氟气体的微球体。46．权利要求45的方法，其中包括对该容器加压。47．权利要求37的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个压力室，抽空该室中的气体，充入含氟气体，以使容器的液面以上空间充满含氟气体，以及步骤e包括摇动该容器，以形成充入含氟气体的微球体。48．权利要求37的方法，其中含水溶液选自水、生理盐水、和一般盐水。49．权利要求37的方法，其中药学上可接受的载体选自水、甘油、和丙二醇的混合物，以及盐水、甘油、和丙二醇的混合物，其比例分别为8∶1∶1(v∶v∶v)。50．权利要求37的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个室中，并引入全氟化碳，以及步骤e包括摇动该容器，以形成含全氟化碳的微球体。51．权利要求50的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个室中，并在该室中引入选自全氟丙烷和全氟丁烷的全氟化碳，以及步骤e包括摇动该容器，以形成含全氟化碳的微球体。52．权利要求37的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个压力室中，抽空该室气体，并充入全氟化碳，使容器上面充满全氟化碳，以及步骤e包括摇动该容器，以形成含全氟化碳的微球体。53．权利要求52的方法，其中步骤d包括将含上述形成微球体的含水溶液的容器放入一个压力室中，抽空该室气体，并充入选自全氟丙烷和全氟丁烷的全氟化碳，使容器的上面充满全氟化碳，以及步骤e包括摇动该容器，以形成含全氟化碳的微球化。54．权利要求37的方法，其中含氟气体选自六氟化硫和全氟化碳。55．权利要求54的方法，其中全氟化碳气体选自全氟丙烷、全氟戊烷、全氟己烷、和全氟丁烷。56．一种制备充气微球体的方法，其中包括a．将比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷酸酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷酯酸以约25mg/ml的浓度分散在含水溶液中，形成含脂类的水溶液；b．将上述含脂类的水溶液冷冻干燥，形成冷冻干燥的组合物，其中比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷酯酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸均匀地存在于组合物中；c．以约1mg/ml的浓度将上述冷冻干燥组合物分散在药学上可接受的水基载体中，得到形成微球体的含水溶液；d．加热上述形成微球体的含水溶液；e．使用孔径约为0.22μm的滤器过滤上述形成微球体的含水溶液；f.将上述形成微球体的含水溶液分散在至少一个容器中，将该容器放在一个压力室中，并抽空该室；g．在该室中引入含氟气体，使容器上空充满含氟气体；以及h．摇动上述容器，形成充入含氟气体的微球体。57．权利要求56的方法，其中步骤h的温度低于脂类凝胶到液晶的相转移温度。58．权利要求56的方法，其中所述含氟气体选自六氟化硫和全氟化碳。59．权利要求58的方法，其中所述全氟化碳选自全氟丙烷、全氟戊烷、全氟己烷、以及全氟丁烷。60．一种冷冻干燥的脂类组合物制备方法，其中包括a．将比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、和约5到15mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20到约50mg/ml的浓度分散于一种水溶液中，得到含脂类的含水溶液；以及b．将上述含脂类的含水溶液冷冻干燥，形成含比例分别为约70到约90mol％、约5到约15mol％、约5到约15mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的均匀冷冻干燥组合物。61．权利要求60的方法，其中该组合物为絮凝状。62．权利要求60的方法，其中所述含水溶液选自水、生理盐水和一般盐水。63．权利要求60的方法，其中包括a．将比例分别为约80到约85mol％、约5到约10mol％、和约5到10mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20到约50mg/ml的浓度分散于一种含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；以及b．将上述含脂类的含水溶液冷冻干燥，形成含比例分别为约80到约85mol％、约5到10mol％、约5到10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的均匀冷冻干燥组合物。64．权利要求60的方法，其中包括a．将比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约20到约50mg/ml的浓度分散于一种含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；以及b．将上述含脂类的含水溶液冷冻干燥，形成含比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的均匀冷冻干燥组合物。65．权利要求60的方法，其中包括a．将比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的脂类二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸以约25mg/ml的浓度分散于一种含水溶液中，得到含脂类的含水溶液；以及b．将上述含脂类的含水溶液冷冻干燥，形成含比例分别为约82mol％、约8mol％、和约10mol％的二棕榈酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰乙醇胺-聚乙二醇、和二棕榈酰磷脂酸的均匀冷冻干燥组合物。66．权利要求1的微球体，其中所述的脂类包含一个单分子层。67．权利要求66的微球体，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。68．权利要求67的微球体，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。69．权利要求12的冷冻干燥脂类组合物，其中所述的脂类包含一个单分子层。70．权利要求69的冷冻干燥脂类组合物，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。71．权利要求70的冷冻干燥脂类组合物，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。72．权利要求22的方法，其中所述的脂类包含一个单分子层。73．权利要求72的方法，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。74．权利要求73的方法，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。75．权利要求37的方法，其中所述的脂类包含一个单分子层。76．权利要求75的方法，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。77．权利要求76的方法，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。78．权利要求56的方法，其中所述的脂类包含一个单分子层。79．权利要求78的方法，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。80．权利要求79的方法，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。81．权利要求60的方法，其中所述的脂类包含一个单分子层。82．权利要求81的方法，其中所述的气体选自六氟化硫和全氟化碳。83．权利要求82的方法，其中所述的全氟化碳选自全氟丁烷、全氟丙烷、全氟戊烷、和全氟己烷。84．权利要求1的充气微球体，其中包含交联的或聚合的脂质体。全文摘要本发明具体涉及冷冻干燥的脂类组合物以及它们的制备方法。使用冷冻干燥的脂类组合物制备的空气微球体特别适用于,例如,超声成像和治疗药物的传送系统。文档编号A61K49/22GK1216925SQ9719425公开日1999年5月19日申请日期1997年4月2日优先权日1996年4月30日发明者埃文·C·翁格尔,托马斯·弗里茨,特里·马斯安纳格,瓦拉达拉詹·拉马斯瓦米,戴维·耶洛海尔,吴观丽申请人:ImaRx药物公司