作为遗传物质转移系统的阳离子病毒体的制作方法

专利名称：作为遗传物质转移系统的阳离子病毒体的制作方法
技术领域：
本发明涉及基因生物技术和基因治疗领域，并且涉及用于有效地向靶位置转移遗传物质的新的病毒体，即膜中包含病毒糖蛋白的正电荷脂小泡，涉及其制备方法和有用的应用。本发明阳离子病毒体特别适合体外和体内向靶细胞特异性的和非特异性的，非感染性的基因运送。
背景技术：
脂质体被广泛用作药物运送的载体和用作有效期短的药物或者抗体液(生物)化学侵害的保护性掩蔽剂。包含来自病毒被膜的重组膜蛋白或其部分的脂质体通常称之为“病毒体”(Sizer等，生物化学(Biochemistry)26:5106-5113,1987)。其已经被用来非特异性运送各种药物和DNA分子(Vainstein等，酶方法(MethodsEnzymol.)101:492-512,1983)。其主要缺点在于这些病毒体与靶细胞的细胞膜融合，导致运送的物质没有控制地释放到靶细胞的细胞质中，在那里没有保护的物质容易被细胞内降解过程破坏。
WO92/13525，其全文在此引入作为参考，报道了来自流感病毒的病毒刺突蛋白所指向的，并且有细胞特异性标记例如单克隆抗体的磷脂双分子层膜制备的病毒体，根据通过受体介导的内吞作用的类病毒穿入机理，非常有效地与膜模型和动物细胞融合。在这些病毒体成功地应用于将化学物质和期望的药物运送到靶位置的同时，关于稳定掺入和转移带电荷分子，例如负电荷核酸，其仍有一些缺点。
在过去的几年里，脂质体中掺入的遗传物质的运送，特别是细胞特异性运送越来越引起关注且越来越重要，特别是关于在抗癌和基因治疗中的应用。目前有几种方法适合向细胞运送DNA或RNA病毒介导的方法，脂质介导的方法，和其它方法，象微注射和电穿孔。目前基因转移技术的优点和缺点可以总结如下8)病毒介导的基因转移基因可以通过利用逆转录病毒载体而被稳定且有效地导入哺乳动物细胞。但是基因向非复制型细胞的转移的效率非常低，因为逆转录病毒只感染分裂的细胞。而且，一般所关心的安全问题和与例如癌基因可能的激活有关的逆转录病毒载体的使用有关。复制缺陷腺病毒成为大多数研究人员的基因转移载体的选择。腺病毒载体介导的基因运送包括期望的基因向缺陷腺病毒粒子的插入或者要插入的DNA和腺病毒外被之间通过运铁蛋白-聚赖氨酸桥的复合物的生成。该体内非常有效的系统的缺点是有感染或炎症的危险尽管有使病毒对于复制是有缺陷的之E1基因缺失，但是剩余的病毒基因组仍包含数个编码病毒蛋白质的可读框(Yang等，1994；美国国家科学院学报91,4407-4411)。病毒蛋白质通过转导细胞的表达引起动物和人体内体液和细胞免疫应答，因此可以引起炎症和增生。
在HVJ(仙台病毒)介导的方法中，外来DNA与脂质体相复合。然后脂质体负载了灭活的仙台病毒(日本的血凝病毒；HVJ)。该方法已经用于体内对各种组织的基因移植。另外，业已报道了细胞通过HVJ-脂质体摄入反义寡核苷酸(Morishita等，1993；细胞生物化学杂志(J.Cell.Biochem.)17E,239)。但是一个特别的缺点是HVJ-脂质体有非特异性结合红细胞的倾向。b)脂质介导的基因转移由阳离子脂类制备的带正电荷脂质体表现出使用安全方便，并且对于体外转移DNA和反义寡核苷酸是有效的。高负电荷核酸自发与阳离子脂质体相互作用。通过简单地混合聚核苷酸和预先生成的阳离子脂质体，已经实现了DNA-脂质体复合物的完全生成。但是，由于脂质体膜上缺少融合蛋白和细胞特异性标记，所以体内转染的效率非常低，并且培育时间长，为了达到期望的效果不得不高剂量给药。结果是，可以发生不期望的副作用，因为有证据证明大量的阳离子脂质在体内可以表现出毒副作用。
目前正在试验小的寡核苷酸作为治疗癌症的治疗药物和作为抗病毒药物。只有两个DNA链中的一股被转录来合成信使RNA(mRNA)。被转录为RNA的DNA链称之为编码链或正义链。互补，非编码或反义链具有和mRNA相同的序列。当转录非编码链时，其产生能结合目的(正义)mRNA的反义RNA分子。一旦反义RNA结合正义RNA，则得到的RNA双链分子不能被翻译，并且蛋白质的产生被阻断。通常情况下，18-22个碱基的短的合成的反义寡核苷酸有效结合mRNA并抑制mRNA翻译。通过这种机理，反义寡核苷酸能终止人癌细胞的增殖。癌所涉及的基因表现出其通过其正常结构蛋白质的超表达的作用。基因例如c-fos,c-myc,L-myc,N-myc,c-myb,abl,bcr-abl,c-raf,c-erb-2,K-ras可能是反义癌症治疗的潜在的靶物。反义寡核苷酸也是常规药物的令人注意的潜在的替代物，所述常规药物是例如抗病毒剂，例如人免疫缺陷病毒(HIV)tat和gag基因反义寡核苷酸。
如文献所述(Stegmann等；EMBO J.6:2651-2659,1987)包含重组病毒被膜的脂质体膜可以称为病毒体。其通常包括包含磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)的磷脂双分子层和病毒被膜，例如包埋在膜中的刺突蛋白质。将遗传物质插入到PC,PE-病毒体中的常规方法缺点在于核酸掺入的极低的效率。
发明概述因此本发明涉及新的阳离子病毒体，由于其特异的膜组成而可以非常有效地负载任何期望的遗传物质，包括长链和短链DNA或RNA，寡脱氧核苷酸，核糖核苷酸，肽核酸(PNA)，核糖酶(有酶活性的RNA分子)，基因，质粒和载体，因此令人信服地克服现有技术的缺陷。
本发明进一步涉及流感病毒A特别是A/Singapore株的血凝素有效重组为大量单层阳离子脂小泡，导致生成平均直径大约是120-180nm的阳离子病毒体和连接的脂质双分子层的方法，其基本上没有了很多常规病毒体制剂所见的渗漏的缺点。-优选单层的-阳离子双分子层膜的结构向含水相取向，而疏水脂肪酸尾部向双分子层中心取向。电子显微镜显示重组病毒刺突蛋白质(血凝素)在脂质双分子层中整合，并且从阳离子小泡表面伸展(

图1)。
小泡膜脂质组成包括阳离子和/或聚阳离子脂质和任选地磷脂，例如磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺。最多的情况下，证明选择包含-以总的脂质为基础-下面组成之一的膜的脂质组成是有利的(ⅰ)100％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质；或(ⅱ)90-95％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰胆碱。
在优选的实施方案中，本发明也涉及细胞特异性标记与阳离子病毒体不可逆的共价键合，所述阳离子病毒体包括但不限于用于选择性探测和结合靶细胞的单克隆抗体，抗体片段，例如F(ab’)2和Fab’片段，细胞因子，和/或生长因子。其与小泡膜连接从而提供关于受体检测和结合的外部的和外露的基本上全功能活性。
例如Marting等(生物化学杂志，257:286-288,1982)描述的细胞特异性标记例如抗体片段与先成的小泡的偶联经常导致低的且常常不可重复的偶联率-对目的策略施与显著限制性的复杂的情况。因此，根据本发明的优选实施方案，标记物在去污剂存在下偶联先成的磷脂酰乙醇胺-交联剂分子，例如N-[4-(对-马来酰亚胺-苯基丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)。
为了实现最好的可能的结果，证明为了避免蛋白水解消化或者分子内S-S键的减少引起的灭活而在重组之前小心分离和纯化病毒糖蛋白是有利的。因此，优选用活化的琼脂糖基质，优选用还原的硫丙基Sepharose 6B，通过亲和层析从未接合的磷脂酰乙醇胺-交联剂分子(例如MPB.PE)分离接合的标记物，例如标记-MPB.PE。然后在阳离子病毒体生成之前将纯化的接合的标记物(磷脂酰乙醇胺-交联剂-标记物分子复合物)等份加入到含有溶解的膜脂质，融合肽和其它期望的成分的混合物的去污剂溶液中。
证明在制备病毒体之前在分开的过程中进行双功能交联剂与磷脂和细胞特异性标记的偶联程序是有利的。该方法使更好地控制和优化病毒体膜的表面密度，特别是关于连接的细胞特异性标记的数目。包埋在膜中或者与膜连接的蛋白质分子浓度的改进的控制是重要的，病毒体上融合蛋白(例如血凝素)和细胞特异性标记(例如抗体Fab’片段)不平衡的比例可以降低甚至破坏其选择性性质，和-极限下-可以导致小泡的凝块和沉淀。
用抗体片段F(ab’)2和Fab’代替全抗体分子作为细胞特异性标记是特别有利的，因为它们与全抗体相比有小得多的免疫原性。不存在Fc区减小了所不期望的Fc介导的生物和免疫活性的范围，例如通过经典途经的补体活化，和最终导致-通过抗体和其Fc-受体在靶细胞上的相互作用而从靶细胞表面清除附着病毒体的急性体液应答。
与运送核酸的已知的脂质体组成不同，本发明阳离子病毒体通常不需要与原生质细胞膜融合或者使原生质细胞膜不稳定而进入细胞质。它们能通过两步机理进入宿主细胞1．附着和2．穿入。在第一步中，其通过融合肽(例如血凝素)和/或细胞特异性标记结合细胞受体，特别是结合膜糖蛋白或带有末端唾液酸的糖脂质，然后通过受体介导的内吞作用非常有效地掺入。在带有细胞特异性标记例如抗体片段的病毒体情况下，这些标记会另外识别靶细胞表面上的抗原结构，导致通过两种不同的结合机理附着。因此，本发明细胞特异性病毒体因为其在膜上有细胞特异性标记而具有对于各种细胞类型的选择性，同时，由于病毒融合肽例如血凝素而具有通过内吞作用而细胞穿入的高的能力。带有识别肿瘤相关抗原例如TAG72,CEA,17-1A,CA19-9或白血病相关的抗原例如CD10(CALLA=常见的急性淋巴细胞白血病抗原)和CD20的Fab’片段的病毒体将选择性结合其细胞表面带有提到的抗原的肿瘤细胞或白血病细胞。
在第二步中，当通过受体介导的内吞作用进入宿主细胞时，病毒体在核内体截留。随后，核内体中的pH减小到大约pH5-6，其激活血凝素融合肽，并触发核内体膜和病毒体膜的融合。膜融合反应打开病毒体的被膜并将截留的遗传物质释放到胞质中。该机理值得重视地增加了转移的遗传物质在通过消化降解和/或胞吐作用而遭破坏之前达到核的机会。发明的描述本发明主要目的是提供包含阳离子或聚阳离子脂质和内部-通常含水-空间，并且进一步包含至少一种包埋在小泡膜中或者在小泡膜中整合或者与小泡膜共价连接的病毒融合肽的正电荷脂小泡。小泡还优选在膜上包含至少一种细胞特异性标记。本发明又一个目的是提供具有全生物融合活性的小泡，即具有基本上与完整流感病毒一样的融合活性。融合肽是病毒糖蛋白，例如血凝素或其衍生物，或者能诱导所述小泡在内吞作用之后与靶细胞核内体膜的快速融合的合成的融合肽。
新的小泡或病毒体对于将任何期望的遗传物质转移给靶位置，特别是体外和体内转移给动物和人细胞和组织是特别有用的。强调的是新的病毒体不只是能穿入增殖的即复制的细胞，而且能穿入非增殖的即静止细胞，其特性使其广泛应用于生物科学，药学和药物领域，作为研究和/或诊断工具和作为药物。对于作为药物的应用，本发明病毒体可以是进一步含有常规添加剂和药学可接受载体的药物组合物的一部分。优选药物组合物制备成注射液，但是，其它制剂形式，例如用于表面或系统给药的乳液，乳脂，凝胶，软膏，对于某些应用是有利的。
因此本发明又一个目的是使用本发明病毒体制备适合预防性和/或治疗性治疗动物或人个体的药物组合物，动物或人个体从这样的治疗中得到了好处。本发明另一个目的是用本发明病毒体制备用于体外和体内应用的诊断药盒。
在一个实施方案中，本发明小泡通过包括有效重组流感病毒A的血凝素(HA)的方法获得。因此本发明又一个目的是公开制备阳离子病毒体的方法。在优选的实施方案中，该方法进一步包括向阳离子脂小泡中掺入遗传物质的步骤。基本地，制备方法包括下面的步骤1)将阳离子脂质与-优选纯化的-病毒刺突糖蛋白，期望运送的遗传物质和任选地先成的由磷脂酰乙醇胺，交联剂和细胞特异性标记制备的复合物分子一起溶解于非离子去污剂优选八乙二醇单正十二烷基醚(OEG,C12E8)中；和2)通过用去污剂吸附微载体珠，优选具有优选孔度(湿)20-50(0.84-O.30mm)SM-2 Biobeads型聚苯乙烯小球-优选反复地-去除去污剂，生成小泡。
在本发明优选实施方案中，合适的双功能交联剂被用来不可逆连接细胞特异性标记和小泡膜。指向决定着病毒体与细胞特异性结合的细胞受体的细胞特异性标记以其仍然是全生物活性的方式与交联剂结合。优选交联剂以先成的分子-复合物的形式使用，其中交联剂与磷脂酰乙醇胺共价连接或者与磷脂酰乙醇胺和细胞特异性标记共价连接。
由于本发明病毒体功能活性融合肽，被囊化物质主要随着核内体pH的降低而被释放到靶细胞的细胞溶质中(上文略述)。这种释放一方面延长了运送物质在靶细胞中的停留时间，另一方面避免病毒体在核内体中不期望的长期停留，从而减少了病毒体运送的有价值的物质非特异性降解的危险。
在另一个实施方案中，本发明涉及其中膜脂质另外包含磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的小泡，其进一步提高特异性病毒体设计和/或促进融合肽和/或细胞特异性标记瞄定膜的能力。
术语“融合肽”指能诱导和/或促进病毒体膜和靶细胞脂质膜之间融合反应的肽或蛋白质。在最优选的实施方案中，其指包含融合肽的病毒刺突糖蛋白，特别是指其单体，病毒表面刺突的完全的血凝素三聚体，或者指一个或两个包含功能融合肽的裂解亚单位，糖肽HA1和HA2。在本发明另一个实施方案中，该术语指纯化融合肽本身，或者是从天然来源分离的或者是合成制备的。在本发明特别优选的实施方案中，这些包含融合肽的多肽指流感血凝素，特别是A-H1N1亚型的一种。合成的融合肽优选从下面的表1所列的氨基酸序列选择，其中氨基酸通过其相应的单字母码表示(也参见WO92/13525实施例6和图2)。
术语“交联剂”指能连接根据本发明制备的小泡的表面和能结合多肽的有机异双功能分子。在本发明优选实施方案中，该分子包含一个偶联磷脂酰乙醇胺的氨基的N-羟基琥珀酰亚胺基团和接合单克隆抗体片段的马来酰亚胺基团，例如4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸琥珀酰亚胺酯，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基琥珀酰亚胺酯，间-马来酰亚胺基苯甲酰基-N-羟基磺基琥珀酰亚胺酯，4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸琥珀酰亚胺酯，4-(对-马来酰亚胺基苯基)-丁酸磺基琥珀酰亚胺酯；或者其包含偶联细胞因子的N-羟基琥珀酰亚胺基团和光反应性叠氮基，例如N-羟基琥珀酰亚胺辛二酸酯(NHSSA),N-羟基琥珀酰亚胺基-4-叠氮基苯甲酸酯(HASAB),N-琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯(SANPAH),N-磺基琥珀酰亚胺基-6-(4’-叠氮基-2’-硝基苯基氨基)己酸酯。
表1
优选交联剂以交联剂和脂质的先成分子复合物的形式使用，特别是交联剂和磷脂酰乙醇胺，或者脂质加交联剂加细胞特异性标记的复合物。
术语“细胞特异性”蛋白质或标记物指能分别连接交联剂或交联剂-脂质复合物，并且进一步能结合靶细胞受体的蛋白质。在本发明优选实施方案中，该分子指细胞受体特异性化合物，例如单克隆抗体，抗体片段，细胞因子或生长因子。细胞特异性标记提供选择性探测并且结合靶细胞，因此提高病毒体膜中伴随存在的融合肽的作用。优选的抗体片段包括F(ab’)2和Fab’片段，同时细胞特异性标记还包括白细胞介素和其它细胞因子，特别是下面表2中所列出的。表2
这里所使用的术语“阳离子脂质”指包含阳离子成分和非极性尾部的有机分子，称之为头-尾两亲物，例如氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA)(Felgner等；美国国家科学院学报84:7413-7417,1987),N-[(1,2,3-二油酰基氧基-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酰酯(DOTAP)；或N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒(Ruysschaert等；生物化学生物物理研究通讯203:1622-1628,1994)。除非另有说明，该术语也包括下面定义的聚阳离子脂质。
术语“聚阳离子脂质”指包含聚阳离子成分和非极性尾部的有机分子例如脂精胺1,3-二棕榈酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)和二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)(Behr等；美国国家科学院学报86:6982-6986,1989)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二铵(THDOB)。
这里所使用的术语“核酸”或“遗传物质”包括短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，磺酸寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸(OPTs)硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸(PNAs)，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶(具有酶活性的RNA分子)，基因，质粒和载体(克隆载体)。
这里所使用的术语“病毒体”指-以其最简单的形式-具有包含阳离子脂质和内部-优选含水的-空间的双分子层膜的脂小泡，其中膜进一步包含病毒蛋白质，特别是病毒糖蛋白。在优选实施方案中，病毒蛋白质包括至少一种具有全生物融合活性的融合肽或蛋白，特别是刺突糖蛋白血凝素和/或流感A病毒(例如A/Singapore)的神经氨酸酶。应该明白病毒蛋白质也包括合成制备的相应于或等于这里所描述的流感病毒融合肽的氨基酸序列。膜脂质包含上面定义的阳离子脂质但是可以任选地进一步包含其它天然的和/或合成的脂质，优选磷脂，例如磷脂酰胆碱(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)。
虽然本发明阳离子病毒体在很多情况下-特另是在体外细胞培养试验中-膜上没有细胞特异性标记就可以成功地应用，但是对于体内应用特别优选其膜上进一步包含至少一种上文所定义的细胞特异性标记。根据电子显微镜和动态光散射测定，小泡的平均直径在120-180nm范围内。
这里所使用的术语“全(生物)融合活性”应该表达为在小泡膜中包含重组病毒蛋白的本发明病毒体基本上具有与通常它们所从中重组的完整的病毒对于靶细胞的相同的融合活性。优选地，阳离子病毒体融合性的比较与完整的流感病毒A不相上下。根据已知的方法测定融合活性，特别是根据Hoekstra等的报道(生物化学23:5675-5681,1984)，或Luscher等的报道(Arch.Virol.130:317-326,1993)。
在反义技术可以在治疗或预防上应用于需要的患者之前，大量的技术问题，特别是涉及开发合适的载体系统，需要在操作之前解决。举例来说，遗传物质，例如反义寡核苷酸，是不稳定的，并且在其到达靶细胞之前就裂解或者或多或少灭活，因此必须使用大量截留在常规阳离子脂质中的这样的物质。由于使用量大，人或动物体内产生潜在的毒性问题。
通过使用本发明阳离子病毒体作为遗传物质的载体，这些问题可以成功地解决，并且可以防止由于毒性产生的不期望的副作用，或者至少大大减少。实现这些有益的效果是因为本发明阳离子病毒体-与迄今为止已知的脂质体或病毒体相比-具有高得多的活性和效率，最多1000-20000个运送截留遗传物质的因子例如反义寡核苷酸进入靶细胞。结论是，比较常规病毒体或阳离子脂质体的功效与本发明阳离子病毒体的功效实际上是不可能的。
附图的简要说明图1给出带有病毒刺突蛋白的D0TAP病毒体的显微照相。
图2给出带有模型脂质体的十八烷基若丹明B标记的DOTAP-病毒体的pH诱发的融合活性。
图3图示带有被囊化的反义FITC-OPT的DOTAP-病毒体掺入人小细胞肺癌细胞。
图4和图5图示反义-L-myc-DOTAP-病毒体进入人小细胞肺癌细胞的超常的摄入和转染效率。
图6图示不同的人小细胞肺癌细胞与反义-L-myc病毒体的培育。
图7a,7b图示对于Jurkat细胞pRSVcat-DOTAP病毒体的转染效率。
图8DOTAP-病毒体与磷脂-脂质体的融合。用37℃下R18测试测定融合。
图9胸腺嘧啶核苷掺入到病毒体处理过的NCI-H209细胞。向每孔5×104细胞/ml加入75μl含有200皮摩尔或者反义，正义，或者mscFITC-OPT的病毒体和625μl含有0.5μCi14C-胸腺嘧啶核苷的新鲜培养基。
图10通过加入含有反义-L-myc-OPT病毒体胸腺嘧啶核苷掺入NCI-H209细胞的剂量依赖性抑制。NCI-H209细胞以每孔每ml1×105的初始细胞浓度培育。取三次试验的平均值±标准误差。
图11不同的人小细胞肺癌细胞系与反义-L-myc病毒体与75μl反义-L-myc病毒体的培育。如所指出的该细胞系中癌基因表达减少H82＜H510A＜H209。第-批病毒体比第二批含有更少量的反义-L-myc。
图12两种不同制备的病毒体制剂对Sp2细胞的转染。
图13两种不同制备的病毒体制剂对P3/NS1细胞的转染。
图14两种不同制备的病毒体制剂对NIH/3T3细胞的转染。
图15,16,17用正义和反义c-myb-DOTAP病毒体处理的KG1细胞的细胞生长。分别加入25,50或100μl含有18,36，或72pmol OPT的病毒体溶液。取三次试验的平均值±标准误差。
图18用DOTAP病毒体加入50μl正义和反义c-myb病毒体溶液处理的CEM-C3细胞的细胞生长。取三次试验的平均值±标准误差。
为了使更全面理解这里所描述的本发明，提出下面的实施例。这些实施例只是为了详细说明的目的而不认为是在任何方面限制本发明。实施例1从含有被囊化的反义L-myc-FITC(=荧光素标记的)-寡脱氧核苷酸的流感病毒制备带有全融合活性病毒体血凝素三聚体的阳离子脂小泡。制备DOTAP病毒体和DOTAP-磷脂酰胆碱(PC)-病毒体根据Skehel和Schild(1971)，美国国家科学院学报79:968-972所述从流感病毒株A/Singapore/6/86分离血凝素(HA)。简要地说，病毒在母鸡卵的尿囊腔中生长，并且通过在蔗糖梯度中超离心纯化两次。纯化的病毒在含有7.9mg/ml氯化钠，4.4g/ml柠檬酸三钠·2H2O，2.1mg/ml 2-吗啉乙烷磺酸，和1.2mg/mlN-羟基乙基-哌嗪-N'-2-乙烷磺酸，pH7.3的缓冲液中是稳定的。53ml含有345μgHA/ml的病毒悬浮液通过以100000×g超离心10分钟沉淀。向流感病毒丸粒中加入含有145mM氯化钠，2.5mM HEPES和54mg/ml非离子去污剂八乙二醇单十二烷基醚(OEG=C12E8),pH7.4的7.7ml缓冲的去污剂。通过在室温下超声2分钟使沉淀完全溶解。溶液以100000×g超离心1小时。得到的上清含有溶解的HA三聚体(1.635mg HA/ml)和痕量的神经氨酸酶。6mg DOTAP加入到3.7ml上清(6mg HA)中并溶解。溶液通过过0.2μm过滤器灭菌，然后转移到含有1.15g灭菌微载体珠优选Biobeads SM-2的玻璃容器中。通过使用购自Heidolph(Kelheim，德国)的摇动器REA×2将容器摇荡1小时。如果必要，用0.58mgBiobeads重复最多3次。操作后得到稍透明的DOTAP病毒体溶液。
为了制备DOTAP-PC病毒体，将3mg DOTAP和3mgPC加入到含有6mgHA的上清中，并且溶解。接下来的步骤与对于DOTAP病毒体的描述相同。制备带有合成的融合肽的病毒体制备膜中带有合成的融合肽的阳离子病毒体的一种可能性包括下面的步骤1．根据Martin等，免疫球蛋白片段与先成小泡不可逆偶联；生物化学杂志257:286-288(1982)的描述，在下面的反应中通过交联剂N-[γ-马来酰亚胺丁酰基氧基]琥珀酰亚胺酯(GMBS)活化磷脂酰乙醇胺(PE)PE+GMBS→MBS-PE+N-羟基琥珀酰亚胺。
2．制备带有活化PE(GMB-PE)脂小泡，其中根据上文对于含有DOTAP病毒体的HA的描述，将20％磷脂酰胆碱，70％DOTAP和10％GMB-PE溶解于缓冲的去污剂溶液中。接下来的制备脂小泡的步骤与对于DOTAP病毒体的描述相同。
3．偶联合成的融合肽和脂小泡，其中使用包含20个氨基酸，具有氨基酸序列G-L-F-E-A-I-A-G-F-I-E-N-G-W-E-G-M-I-D-C的肽，其在N-末端包含一个游离氨基并且在C-末端包含一个酰胺基团。因为C-末端的氨基酸是半胱氨酸，有一个游离硫醇基适于偶联肽和脂小泡膜中的GMP-PE。
为了进行偶联反应PE-GMB膜+HS-Cys-肽→PE-GMB膜-S-Cys-肽在缓冲液(40mM柠檬酸，35mM磷酸二钠，100mM氯化钠，和2mM EDTA,pH5.5)中的新鲜制备的脂小泡溶液与相同缓冲液中的肽溶液混合。混合物在4℃下在氮气中温和搅拌过夜。通过在High Load Superdex×200柱上凝胶过滤从未接合的肽中分离脂小泡。
作为可选择的方法，融合肽也可以利用先成的PE-交联剂-肽复合物与脂小泡偶联，如下文对于Fab’片段的实施例所述。硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸结合到DOTAP病毒体中L-myc基因的反义和正义寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐(OPTs)被用作证明阳离子病毒体在转染中的高效率的实施例。通过亚磷酰胺化合物合成5’-FITC-OPTs(Microsynth GmbH,Balgach,Switzerland)。分别使用十五体(5’-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3’)和十五聚体(5’-FITC-GCGGACATGGACTAC-3’)作为反义OPT和正义OPT。混合的序列对照(msc)OPT由和合成的反义和正义OPTs一样的相同长度核苷酸组成。
向下面各项加入1ml DOTAP病毒体或DOTAP-PC病毒体a)2mg反义FITC-OPT(1.3μmol),b)3.4mg正义FITC-OPT(1.3μmol)，和c)3.1mg msc FITC-OPT(1.3μmol)。
溶解FITC-OPTs，然后通过在26℃下超声处理溶液2分钟。通过在High Load Superdex×200柱(Pharmacia,Sweden)上凝胶过滤从病毒体中分离没有被囊化的FITC-OPTs。用无菌PBS平衡柱子。含有带有被囊化的FITC-OPT的DOTAP病毒体的外水体积级分用PBS洗脱并收集。
病毒体完全溶解于含有0.1％(v/v)Triton X-100的0.1M氢氧化钠中后，荧光测定法测定病毒体-截留的FITC-OPT的浓度。为了校正荧光尺度，将溶解于上述去污剂溶液中的空DOTAP-病毒体的荧光设为0。利用先成磷脂酰乙醇胺-双功能交联剂分子复合物偶联Fab’-片段和病毒体溶解于2.8ml柠檬酸缓冲液(100mM氯化钠，40mM柠檬酸，35mMNa2HPO4·2H2O,2mM EDTA,pH5.5)中的3mg新鲜还原的来自鼠单抗抗-CD10-(抗CALLA)抗体的Fab’加入到含有0.5％正辛基-低聚-氧基乙烯的215μl柠檬酸缓冲液中的0.524mg N-[4-(对-马来酰亚胺-苯基)-丁酰基]磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)的溶液中。然后混合物在4℃在氮气下在温和搅拌下培育。培育后通过一批400μl新鲜还原的湿硫丙基Sepharose 6B(Pharmacia,Sweden)去除没有偶联的MPB-PE。混合物在室温下培育4小时。通过离心去除硫丙基Sepharose 6B，并将得到的溶液中和到pH 7.0。中和的溶液补加OEG(54mg/ml)。
根据上述制备的溶液加入到用于制备DOTAP病毒体的溶液中。在生成病毒体期间Fab’-MPB.PE分子被插入到脂质双分子层中。电子显微镜观察DOTAP的电子照相证实了根据激光散射测定的具有平均直径大约120-180nm的小泡的优选的单层结构。流感病毒的HA蛋白刺突清淅可见(图1)。测定DOTAP病毒体的融合活性以通过Hoekstra等(1984)，生物化学23:5675-5681和Luscher等(1993),Arch.Virol.130:317-326描述的荧光去猝灭(dequencing)为基础，通过定量测试测定本发明DOTAP病毒体的融合活性。通过向荧光探针的薄层干膜加入含有DOTAP和HA的缓冲的OEG(C12E8)溶液，接着振荡5-10分钟以溶解探针，然后按照上述“制备阳离子脂小泡…”的描述继续，来将荧光探针氯化十八烷基罗丹明B(R18)(从Molecular Probes Inc.,Eugene，美国购得)以高密度插入到DOTAP病毒体的膜中。通过培育罗丹明标记的DOTAP病毒体和脂质体模型(DOTAP∶脂质体磷脂=1∶20)，发现猝灭罗丹明的稀释度。通过PERKIN-Elmer1000荧光分光光度计，分别在560和590nm激发波长和发射波长测定荧光。图2给出了以荧光去猝灭百分比(％FDQ)表示的DOTAP病毒体的pH诱导的融合反应。被囊化的反义-L-myc-FITC-OPT的细胞摄入证明用荧光素标记OPT在研究DOTAP病毒体细胞摄入机理中非常有用。表达高水平L-myc基因(Nau等，1985；自然318,69-73)的人小细胞肺癌细胞(ATCC-NCI-H209)在2-孔组织培养分室载玻片中生长(Nunc,Naperville,IL 60566,USA)。向细胞加入50μl FITC-OPT-病毒体。其在37℃培育5,15和30分钟，用PBS冲洗两次后用荧光显微镜检查。如图3所示，带有被囊化的反义FITC-O PT的DOTAP病毒体快速结合到细胞中。通过胸苷结合方法测定反义-L-myc-FITC-OPT-DOTAP病毒体的生物作用的实验以每孔每毫升1×105的初始浓度在24-孔Costar平板中培养人小细胞肺癌细胞(ATCC-NCI-H209，美国典型培养物中心，Rockville，美国)。培育24小时后，去除培养基，并且加入含有0.5μCi14C-胸苷(由[2-14C]胸苷制备，52.0mCi/mmol；Ametsham，英国)的625μl新鲜培养基和含有0.2nmol或者反义，正义，或者msc FITC-OPTs的75μl DOTAP病毒体。培养物在37℃下在非常慢的搅拌下小心振荡，然后转移到培养器中。48小时后去除细胞悬浮液，转移到离心管中离心。将得到的细胞沉淀冲洗两次。当细胞不能充分地分散到单一的细胞悬浮液中时，其主要显露给胰蛋白酶/EDTA溶液。细胞沉淀溶解于1.5ml 0.1M氢氧化钠/Triton-X-100(0.1％)溶液中。向1ml溶液中加入3ml液体闪烁混合物(ReadyProtein+,Beckman,Fullerton,CA,USA)。在液体闪烁计数器(Beckman,Fullerton,CA,USA)中计数14C-放射性。
图4和5清楚地证明反义-L-myc-DOTAP病毒体超常的摄入和转染效率。
图6证明不表达L-myc的细胞不受反义-L-myc病毒体的影响或抑制。并且空病毒体没有表现出对癌细胞和正常细胞的任何作用。因此表明用被囊化在本发明病毒体中的反义OPT的抗癌治疗具有极大的潜力，特别是因为其没有上文所提到的常规阳离子脂质体的缺点。实施例2从含有被囊化的载体pcDNA3的流感病毒，将人IL-6基因克隆到多接头位点(=pcDNA3-IL-6)，制备带有全融合活性病毒血凝素三聚体的阳离子脂小泡制备DOTAP病毒体和掺入pcDNA3-IL-6
pcDNA3(Invitrogen Corporation,San Diego,USA)是5.4kb载体，为在真核宿主中高水平稳定地和瞬时表达而设计。根据实施例1所述分离和纯化HA。4mg DOTAP溶解于含有145mM氯化钠，2.5mMHEPES和54mg/ml OEG(=C12E8),pH7.4的缓冲去污剂溶液中，并加入到含有4mg HA的2ml上清液中。向得到的混合物中加入100μgpcDNA3-IL-6并溶解。使溶液超声30秒。如实施例1所述用Biobeads去除OEG。载有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒体转染到鼠骨髓瘤细胞中得到的含有载有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒体的溶液用PBS稀释1∶1000倍。分别将20μl和50μl含有1ng和2.5ng pcDNA-IL-6的该溶液加入到2×106骨髓瘤细胞(P3/SN1/1-Ag4-1；美国典型培养物中心，Rockville,USA)中。培育48小时后通过ELISA测试对细胞培养上清检查人IL-6。测得每毫升含量为20-45 pg IL-6。比较载有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒体和载有pcDNA-IL-6的DOTAP脂质体的转染效率在用含有与DOTAP病毒体相同量的pcDNA-IL-6的常规DOTAP脂质体(其没有病毒融合肽)转染的细胞培养物中没有发现IL-6。为了得到和用载有pcDNA-IL-6的DOTAP病毒体一样的转染结果，必须将载有pcDNA-IL-6的DOTAP脂质体的量提高一千个单位(1000)!!实施例3从包含被囊化的载体pRSVcat的流感病毒制备带有全融合活性病毒血凝素三聚体的阳离子脂小泡制备DOTAP和掺入pRSVcat表达载体pRSVcat(购自ATCC,Rockville,USA)包含编码氯霉素乙酰转移酶(CAT)的CAT基因。该酶催化乙酰基自氯霉素的乙酰基-CoA向3’-羟基位置转移。CAT载体用来监测一般情况下的转染效率。
pRSVca在实施例2所述的条件下被被囊化到DOTAP病毒体中。载有pRSVcat的DOTAP病毒体转染到Jurkat细胞中
Jurkat细胞(106细胞/ml)与不同量的载有pRSVcat的DOTAP病毒体(0.0001μl-25μl)培育。在37℃下培育48小时后，通过CAT-ELISA测试(Boehringer Mannheim，德国)测定Jurkat细胞中的CAT活性。
图7a和7b证明通过加入0.01μl DOTAP病毒体可实现最大转染。与上述相反，在相同培育条件下向Jurkat细胞加入0.01μl载有pRSVcat的DOTAP脂质体没有产生任何可检测的CAT活性。实施例4细胞摄入病毒体病毒体进入靶细胞可以分为两个性质不同的步骤1．附着2．穿入附着包括病毒体通过HA与细胞受体结合，细胞受体是带有末端唾液酸的膜糖蛋白或糖脂质。在特异病毒体情况下，Fab’片段将另外识别靶细胞表面上的抗原结构，导致通过两个不同的结合机理附着靶细胞。因此特异病毒体对特异细胞类型具有选择性。带有识别肿瘤相关抗原例如TAG72,CEA,17-1A,CA19-9或白血病相关抗原例如CD10(CALLA)和CD20的病毒体将选择性结合其细胞表面上带有所述抗原的肿瘤或白血病细胞。小心分离和纯化血凝素糖蛋白。没有通过蛋白水解消化或者通过还原其分子内二硫键(-S-S-)的灭活。
穿入包括病毒体通过受体介导的内吞作用进入细胞。病毒体诱捕到核内体中。核内体中的酸性pH(5-6)触发病毒体膜与核内体膜融合。融合通过病毒刺突糖蛋白血凝素(HA)介导。核内体中的融合反应将病毒体从其脂质被膜释放出来，并提供被囊化的药物进入胞质溶胶的机会。通过荧光去猝灭方法测试这些病毒体制剂的融合活性。病毒体用荧光探针十八烷基若丹明B(R18)标记，并且根据荧光去猝灭监测HA的融合活性，归因于来自病毒体的探针的稀释物进入脂质体靶细胞膜。图8给出向磷脂-脂质体加入用R18标记的DOTAP病毒体所发现的荧光。荧光度开始快速增加表明完整HA介导的融合。细胞的时间依赖性摄入通过培育细胞和14C-标记的病毒体来测定病毒体的摄入。浓度为1×105/ml的P3/NSl细胞与40μl病毒体在37℃培育5,10,15,20和30分钟。清洗后裂解细胞，并测定14C-标记的病毒体的量。如表3所示，细胞摄入非常快在第一个5分钟，结合10％病毒体。更长培育时间不再提高摄入量。1ml病毒体溶液含有大约1011-1012病毒体，因此在5分钟内每个细胞结合4000-40000病毒体。表3
实施例5癌症治疗中的反义策略称之为“反义”的寡脱氧核苷酸(ODN)是根据期望的mDNA目的核苷酸序列的可逆互补制备的DNA短的核苷酸序列。通过形成RNA-DNA双链，信息的翻译被阻止，而且促进了RNaseH对分子的破坏。将ODN指向的癌基因编码的mRNA运送给癌细胞可能与细胞增殖的抑制有关，而且，在某些条件下与细胞死亡有关。
反义ODN具有作为治疗剂的极大潜力。很多临床前动物研究以及Ⅰ-Ⅲ期临床试验表明针对癌基因和病毒基因的反义ODN是有治疗活性的。
功能DNA分子通过载有DNA脂质体或常规病毒体转移到细胞中不是非常有效的。因此研究出带有正电荷脂质双分子层(阳离子)的病毒体用于转移遗传物质。带正电荷脂质双分子层与核酸相互作用，并引起其集中在生成的小泡中。反义-L-mvc-病毒体最先在小细胞肺癌(SCLC)细胞系中发现的L-myc基因常常在SCLC中扩增和超表达。5’-FITC-硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸(OPT)通过亚磷酰胺化合物(Microsynth GmbH,Balgach,Switzerland)合成。分别使用十五体(5’-FITC-GTAGTCCATGTCCGC-3’)和十五聚体(5’-FITC-GCGGACATGGACTAC-3’)作为反义OPT和正义OPT。混合的序列对照(msc)OPT由和合成的反义和正义OPT一样的相同长度核苷酸组成。覆盖翻译起始位点的反义OPT通过抑制靶mRNA的核糖体翻译而作用。反义-L-myc-硫代磷酸寡脱氧核糖核苷酸被被囊化到病毒体中。评价病毒体被囊化的-L-myc反义DNA在SCLC细胞系H209,H510和H82中的抗增殖效果。反义-L-myc病毒体加入到人小细胞肺癌细胞系的细胞中。正义-L-myc病毒体和msc(混合的序列对照物)-病毒体用作对照(图9)。
反义-L-myc病毒体比没有被囊化的反义OPT活性大20000倍。为了诱导相同的效果，如图10所示，不得不向细胞培养物中加入微摩尔范围内浓度的没有被囊化的-L-myc反义OPT。因此阳离子病毒体在运送ODN中比没有被囊化的ODN的细胞摄入有效得多，并且也比阳离子脂质体更有效。
反义-L-myc病毒体的生长抑制效果用在三种SCLC细胞系，H209,H510和H82中L-myc表达的水平校正。从图11得出结论，不表达L-myc基因的细胞不受反义-L-myc病毒体的影响。空阳离子病毒体对正常细胞和癌细胞没有显示出任何作用或者只是极小的作用。因为L-myc基因经常在SCLC中扩增和超表达，并且在成人组织中非常限制地低水平地表达，L-myc可能是反义病毒体治疗的好的靶物。实施例6用于基因治疗的以质粒为基础的载体的非传染性转移通过阳离子病毒体用于哺乳动物表达的载体的转染现行癌基因治疗方法使用以质粒为基础的载体在来自体内或体内在人癌细胞中表达合适的靶基因。评价下面的治疗性基因靶物敏感性基因，例如单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV-TK)基因(Moolten FL；癌症研究46:5276-5281,1986)；指向免疫系统以减少癌细胞的基因，例如细胞因子基因(Tepper RI等；细胞57:503-512,1989)，共同刺激分子编码基因(Townsend SE等；科学259:368-370,1993)，外来组织相容性基因(Plautz GE等；美国国家科学院学报90:4645-4649,1993)；和野生型肿瘤抑制基因的替代，例如p53(Chen PL等；科学250:1576-1580,1990)。
由于现今使用的用于基因治疗的以病毒为基础的载体的某些选择性，例如基因转移在指向目的肿瘤细胞中没有特异性，而且因为，考虑到可能诱发第二恶性肿瘤，和重组生成复制的活性病毒，没有安全性，所以需要开发以质粒为基础的表达载体的体内基因运送的非传染性基因转移技术。本文所公开的阳离子病毒体的应用是许可替代的非传染性，受体介导的基因转移技术。
使用商购脂质的一般的转染效率在5-50％之间。不只是提供了比商购脂质体转染率高的病毒体，而且还将DNA截留在病毒体中，也导致细胞稳定的转化作用。
人白介素6(IL-6)基因克隆到pcDNA3多接头位点，设计在真核宿主中高度稳定和瞬时表达的5.4kb载体。该载体包含新霉素抗性标记，从SV40早期启动子表达，以在G418存在下选择稳定的转化物。
载体的被囊化作用通过3种不同方法进行1．透析在生成病毒体的过程中被囊化质粒。通过透析去除去污剂辛基-POE(购自Alexis Corp.,Laeufelfingen,Switzerland)。2．Biobeads在生成病毒体的过程中被囊化质粒。通过Biobeads去除去污剂OEG。3．超声通过DOTAP被囊化质粒，并且得到的DOTAP-脂质体通过超声与DOTAP-病毒体融合。
制备14C-胸苷-标记的pcDNA3-cIL-6-DNA来测定被囊化质粒的量。被囊化方法 被囊化质粒的量透析(1) 每μl病毒体0.02μgDNABiobeads(2) 每μl病毒体0.009μgDNA超声(3) 每μl病毒体0.04μgDNASp2/0-Ag14细胞(杂交，非分泌型，鼠；ID-No:ATCC CRL-1581；本文命名为Sp2),P3/NSl/1-Ag4-1细胞(非分泌型骨髓瘤，鼠；ID-No:ATCC TIB-18；本文命名为P3/NSl)和NIH/3T3细胞(胚胎，接触抑制型，NIH Swiss鼠ID-No:ATCC CRL-1658)，以1ml培养基中1×105的细胞浓度，通过病毒体制剂(1)-(3)转染。转染后10天，通过ELISA测定表达的IL-6的量(图12，图13，图14)。所有的细胞系得自ATCC,1230lParklawn Drive,RockVille,Maryland,USA。
用G418两次选择转染的Sp2和P3/NS1细胞。培养两个月后再次测定IL-6的产生。在表4中列出了数据。表4通过用G418再选择后的转染的细胞的IL-6的产生
调节加入到细胞沉淀中的裂解缓冲液的体积，使每毫升得到大约2×106细胞数。实施例7白血病治疗中的反义策略人白血病中最常见的遗传不正常性是费城染色体(Ph1)易位。原癌基因abl从染色体9易位到染色体22上的断点聚簇区(bcr)，导致形成bcr-abl杂交基因。abl原癌基因正常编码具有酪氨酸激酶活性的蛋白，所述酶促进细胞携带bcr-abl杂交基因。在大部分慢性骨髓性白血病(CML)患者和在Ph1急性淋巴细胞白血病患者中发现bcr-abl转录物。指向CML中的bcr-abl基因很清楚是最合理的治疗方法。与从bcr基因的第二或第三外显子与c-abl的第二外显子拼接产生的bcr-abl转录物的接头互补的合成的ODN表现出体外抑制费城1白血病细胞增殖，并且稀蔬正常骨髓先祖的生长(SzczylikC等；科学253:562-565,1991)。但是bcr-abl反义治疗限于CML患者。
用于反义治疗的另一种分子靶物是是myb基因。Myb，原癌基因c-myb的编码产物，作为DNA结合特异性转录因子而起作用。其优先在造血细胞中表达，并且是造血细胞增殖所必需的。指向c-myb的密码子2-7的18-单体反义ODN强烈抑制或完全破坏白血病T-细胞系(CCRF-CEM)的克隆基因生长，以及所检查的初期急性骨髓性白血病病例的78％，和5例初期慢性骨髓性白血病(CML)中的4例处于胚细胞危象中(Calabretta B等；美国国家科学院学报88:2351-2355,1991)。
净化骨髓被作为治疗几种瘤中的组成部分，包括治疗急性和慢性白血病。现在，通过各种各样的试剂，例如免疫剂和化学治疗剂从骨髓中清除白血病细胞。定向抗对白血病细胞生长有利的一种癌基因的病毒体被囊化的ODN被证明是有治疗用途的，而且最重要的是，在减少白血病细胞的同时稀蔬正常先祖细胞方面，比常规化学治疗剂更具选择性。反义-c-myb病毒体制备相应于c-myb密码子2-9的正义和反义OPT。正义和反义c-myb分别是5’-GCCCGAAGACCCCGGC-3’和5’-TGTCCGGGGTCTTCGGGC-3’。通过用于L-myc DOTAP病毒体的相同的方法将OPT被囊化到DOTAP-病毒体中。人骨髓白血病细胞系KG-1和人急性成淋巴细胞白血病细胞系CEM-C3显露给正义和反义c-myb病毒体。KG-1细胞的增殖取决于原癌基因myb基因的产生，而CEM-C3细胞不取决于myb基因的产生。KG-1细胞分别与含有18,36，和72pmol正义和反义OPT的25,50和100μl正义和反义c-myb病毒体培育。在第2,3和4天测定细胞数。
加入25μl正义和反义c-myb病毒体只是边缘影响细胞生长(图15)。但是加入50μl(图16)和100μl(图17)强烈抑制细胞的生长。较高剂量的正义c-myb病毒体也显示出抑制作用。认为这些作用不是由病毒体膜产生的，因为CEM-C3细胞不受相同病毒体制剂影响(图18)。说明书中使用的缩写2’-Ome2’-O甲基CALLA 常见急性成淋巴细胞白血病抗原CAT氯霉素乙酰转移酶DOTAP N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯DOTMA 氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基铵FITC-OPT 异硫氰酸荧光素标记的寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐G418 Geneticin二硫化物(抗生素G418)HA 血凝素IL-6 白细胞介素6MPB.PE N-[4-(对-马来酰亚胺)-苯基丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(=交联剂-磷脂复合物)msc混合的序列对照物NA 神经氨酸酶Octyl-POE 正辛基-低聚-氧基乙烯ODN寡脱氧核苷酸OEG八乙二醇单十二烷基醚(C12E8)OPT寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐(类)PC 磷脂酰胆碱PE 磷脂酰乙醇胺PNA肽核酸SCLC 小细胞肺癌SV40 猿病毒40
权利要求书1．带有包含阳离子和/或聚阳离子脂质正电荷脂双分子层膜的脂小泡，其中脂小泡进一步包含至少一种功能活性病毒融合肽和至少一种与膜连接的细胞特异性标记，和优选地期望的用于向靶细胞运送的物质。
2．权利要求1的小泡，其中膜包含-以总的脂质为基础的--90-95％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或-45-90％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰胆碱。
3．权利要求1或2的小泡，其中(ⅰ)阳离子脂质包括至少-种选自下面的脂质氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质1,3-二棕榈酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二铵(THDOB)。
4．前面一项或几项权利要求的小泡，其中融合肽选自血凝素三聚体或单体，其一种或两种裂解的亚单位，糖肽HA1和HA2，从天然来源分离的融合肽，和合成的融合肽。
5．前面一项或几项权利要求的小泡，其中膜进一步包含至少一种双功能交联剂，并且其中至少一种融合肽和/或至少一种细胞特异性标记通过所述交联剂与膜连接。
6．权利要求5的小泡，其中膜进一步包含磷脂酰乙醇胺，并且交联剂通过与磷脂酰乙醇胺共价键合与膜连接，并且其中交联剂进一步分别键合融合肽的游离的硫醇基或细胞特异性标记。
7．前面一项或几项权利要求的小泡，其中所述细胞特异性标记选自单克隆抗体，F(ab’)2片段，Fab’片段，细胞因子和生长因子。
8．前面一项或几项权利要求的小泡，进一步包含截留在所述小泡中的所需的遗传物质，优选选自短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶，基因，质粒和载体。
9．前面一项或几项权利要求的小泡，其直径为120-180nm。
10．权利要求1定义的小泡的制备方法，包括步骤a)将至少一种天然的或合成的病毒融合肽溶解于含有非离子去污剂的合适的缓冲液中；b)加入到来自步骤a)的溶液中并将阳离子和/或聚阳离子脂质溶解于其中；c)进一步加入磷脂酰乙醇胺(PE)，交联剂，和至少一种能结合交联剂的细胞特异性标记，优选包括选自交联剂活化的磷脂酰乙醇胺(PE/交联剂)和PE/交联剂/标记复合物的先成分子复合物；d)任选地进一步加入磷脂酰胆碱；e)通过用微载体珠，优选聚苯乙烯Biobeads SM-2，处理溶液来去除去污剂，结果生成正电荷脂双分子层小泡；和f)优选向步骤e)得到的小泡加定量的向靶细胞运送的期望的物质，超声混合物，将物质整合到小泡中，并通过凝胶过滤去除没有整合的物质。
11．制备权利要求1定义的小泡的方法，包括步骤a)将阳离子脂质和/或聚阳离子脂质溶解于含有非离子去污剂的合适的缓冲液中；b)将磷脂酰乙醇胺(PE)和双功能交联剂，优选包括先成的PE/交联剂复合物加入到来自步骤a)的溶液中；或者可选择地b’)将磷脂酰乙醇胺(PE)，双功能交联剂，至少一种融合肽和至少一种细胞特异性标记，优选包括选自PE/交联剂，PE/交联剂/融合肽，和PE/交联剂/标记物的先成的分子复合物加入到来自步骤a)的溶液中，并且删除步骤e)；c)任选地进一步加入磷脂酰胆碱；
d)通过用微载体珠，优选聚苯乙烯Biobeads SM-2，处理溶液来去除去污剂，结果生成正电荷脂双分子层小泡；e)向小泡加至少一种病毒融合肽和至少一种能结合交联剂的细胞特异性标记；和f)优选向步骤e)得到的小泡加定量的向靶细胞运送的期望的物质，超声混合物，将物质整合到小泡中，并通过凝胶过滤去除没有整合的物质。
12．权利要求10或11的方法，其中(ⅰ)阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质1,3-二棕榈酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酸氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二铵(THDOB)。
13．权利要求10-12一项或几项的方法，其中所述缓冲液是HEPES缓冲液，并且每毫升进一步含有10-250μmol所述的非离子去污剂，优选选自八乙二醇单十二烷基醚和正辛基-低聚-氧基乙烯。
14．权利要求10-13一项或几项的方法，其中所述病毒融合肽选自血凝素三聚体或单体，其一种或两种裂解的亚单位，糖肽HA1和HA2，从天然来源分离的融合肽，和合成的融合肽。
15．权利要求10-14一项或几项的方法，其中脂质包含-以总的脂质量为基础的-或者-90-95％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或-45-90％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰胆碱。
16．权利要求10-15一项或几项的方法，其中所述微载体珠具有湿筛目20-50(0.84-0.30mm)，而且用所述微载体珠处理步骤(c)中的溶液最多4次。
17．权利要求10-16一项或几项的方法，其中所述细胞特异性标记选自单克隆抗体，F(ab’)2片段，Fab’片段，细胞因子和生长因子。
18．权利要求10-17一项或几项的方法，其中所述交联剂是异双功能琥珀酰亚胺基衍生物，优选选自双-N-琥珀酰亚胺基衍生物和光反应性琥珀酰亚胺基衍生物。
19．权利要求10-18一项或几项的方法，其中所述先成分子复合物PE/交联剂/融合肽或PE/交联剂/细胞特异性标记通过一个反应而获得，其中融合肽或细胞特异性标记通过硫醇基键合共价连接的交联剂/PE分子的交联部分，优选选自N-[4-(对-马来酰亚胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-磷脂酰乙醇胺(MCC.PE)。
20．权利要求19的方法，其中没有反应的交联剂-磷脂酰乙醇胺分子，特别是没有反应的MPB.PE或MCC.PE通过凝胶层析，优选通过用琼脂糖基质的亲和层析，最优选通过还原的硫代丙基琼脂糖6B，从反应产物中去除。
21．权利要求10-20一项或几项的方法，其中所述所需的运送物质是遗传物质，选自短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶，基因，质粒和载体。
22．权利要求1-9一项或几项定义的和/或通过权利要求10-21一项或几项定义的方法可得到正电荷脂小泡，作为药物运送，特别是用于向靶细胞或组织，特别是向静止或增殖哺乳动物细胞特异性且非传染性运送期望的遗传物质的载体系统。
23．权利要求22的正电荷脂小泡，用于诊断或药物应用，特别是用于人或动物预防性和/或治疗性处理。
24．权利要求22或23的正电荷脂小泡，优选包含至少一种适于反义治疗的反义寡核苷酸用于治疗选自癌症，白血病，和病毒感染的疾病。
25．权利要求24的正电荷脂小泡，其中反义寡核苷酸靶向原癌基因或癌基因编码的mRNA。
权利要求
1．带有正电荷脂双分子层膜的脂小泡，包括阳离子和/或聚阳离子脂质和至少一种在膜中整合的或者与膜共价连接的天然的或合成的病毒融合肽。
2．权利要求1的小泡，其中膜包含-以总的脂质为基础的-(ⅰ)100％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质；或(ⅱ)90-95％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰胆碱。
3．权利要求1或2的小泡，其中(ⅰ)阳离子脂质包括至少一种选自如下的脂质氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’-十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质1,3-二棕榈酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基-酰氨基甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N'-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二铵(THDOB)。
4．前面一项或几项权利要求的小泡，其中融合肽选自血凝素三聚体或单体，其一种或两种裂解的亚单位，糖肽HA1和HA2，从天然来源分离的融合肽，和合成的融合肽。
5．前面一项或几项权利要求的小泡，其中膜进一步包含至少一个细胞特异性标记和至少一种双功能交联剂，并且其中所述细胞特异性标记与所述膜通过所述交联剂连接。
6．权利要求5的小泡，其中所述细胞特异性标记选自单克隆抗体，F(ab’)2片段，Fab’片段，细胞因子和生长因子。
7．前面一项或几项权利要求的小泡，进一步包含截留在所述小泡中的所需的遗传物质，优选选自短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-0Me-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶，基因，质粒和载体。
8．前面一项或几项权利要求的小泡，其直径为120-180nm。
9．制备带有正电荷脂双分子层膜和至少一种病毒融合肽的小泡的方法，其中a)将至少一种天然的或合成的病毒融合肽溶解于含有非离子去污剂的合适的缓冲液中；b)将阳离子和/或聚阳离子脂质加入到溶液中并溶解；和c)通过用聚苯乙烯微载体珠，优选Biobeads SM-2处理溶液而去除去污剂，导致生成含有所述正电荷脂双分子层小泡的悬浮液。
10．权利要求9的方法，其中(ⅰ)阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质氯化N-[(1,2,3-二油酰基氧基)丙基]-N,N,N-三甲基铵(DOTMA),N-[(1,2,3-二油酰基氧基)-丙基]-N,N,N-三甲基氨甲基硫酸酯(DOTAP)；N-叔丁基-N’-十四烷基-3-十四烷基氨基丙酰脒；和(ⅱ)聚阳离子脂质包括至少一种选自下面的脂质1,3-二棕榈酰-2-磷脂酰乙醇酰氨基-精胺(DPPES)；二-十八烷基酰氨基-甘氨酰精胺(DOGS)；三氟乙酸2,3-二油酰基氧基-N-[2(精胺甲酰氨)乙基]-N,N-二甲基-1-丙烷铵(DOSPA)；1,3-二油酰基氧基-2-(6-羧基-精胺基)-丙酰氨(DOSPER)；和碘化N,N,N’,N’-四甲基-N,N’-双(2-羟基乙基)-2,3-二油酰基氧基-1,4-丁二铵(THDOB)。
11．权利要求9或10的方法，其中所述缓冲液是HEPES缓冲液，并且每毫升进一步含有10-250μmol所述的非离子去污剂，优选选自八乙二醇单十二烷基醚和正辛基-寡-氧基乙烯。
12．一项或几项权利要求9-11的方法，其中所述病毒融合肽选自血凝素三聚体或单体，其一种或两种裂解的亚单位，糖肽HA1和HA2，从天然来源分离的融合肽，和合成的融合肽。
13．一项或几项权利要求9-12的方法，其中磷脂酰胆碱和/或磷脂酰乙醇胺与步骤(b)的溶液混合。
14．权利要求9-13一项或几项的方法，其中向步骤(b)的溶液中进一步加入至少一种细胞特异性标记和双功能交联剂，优选由磷脂酰乙醇胺，双功能交联剂和细胞特异性标记组成的先成分子复合物形式。
15．权利要求9-14一项或几项的方法，其中步骤(b)包括加入-以总的脂质量为基础的-或者(ⅰ)100％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质；或(ⅱ)90-95％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质和5-10％重量的磷脂酰乙醇胺；或(ⅲ)45-90％重量的阳离子和/或聚阳离子脂质，5-10％重量的磷脂酰乙醇胺和5-50％重量的磷脂酰胆碱。
16．权利要求9-15一项或几项的方法，其中所述微载体珠具有湿筛目20-50(0.84-0.30mm)，而且用所述微载体珠处理步骤(c)中的溶液最多4次。
17．权利要求9-16一项或几项的方法，其中期望的遗传物质被加入到步骤(b)的溶液中。
18．权利要求9-16一项或几项的方法，其中期望的遗传物质被加入到步骤(c)的小泡悬浮液中，其后对得到的混合物超声以将所述期望的遗传物质掺入到所述小泡中，并且从小泡中分离没有结合的物质，优选通过凝胶过滤。
19．权利要求14-18一项或几项的方法，其中所述细胞特异性标记选自单克隆抗体，F(ab’)2片段，Fab’片段，细胞因子和生长因子。
20．权利要求14-19一项或几项的方法，其中所述交联剂是异双功能琥珀酰亚胺基衍生物，优选选自双-N-琥珀酰亚胺基衍生物和光反应性异双功能交联剂。
21．权利要求14-20一项或几项的方法，其中所述先成分子复合物从反应混合物中获得，其中所述细胞特异性标记通过硫醇基键合共价连接的交联剂-磷脂酰乙醇胺分子的交联部分，优选选自N-[4-(对-马来酰亚胺苯基)-丁酰基]-磷脂酰乙醇胺(MPB.PE)和4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸-磷脂酰乙醇胺(MCC.PE)。
22．权利要求21的方法，其中没有反应的交联剂-磷脂酰乙醇胺分子，特别是没有反应的MPB.PE或MCC.PE通过凝胶色谱，优选通过用琼脂糖基质的亲和层析，最优选通过还原的硫代丙基琼脂糖6B，从反应混合物中去除。
23．权利要求9-22一项或几项的方法，其中所述所需的遗传物质选自短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶，基因，质粒和载体。
24．权利要求1-8任一项定义的和/或通过权利要求9-23任一项定义的方法可得到的用于向靶细胞或组织特异性或非特异性运送遗传物质的正电荷脂小泡。
25．权利要求1-8任一项定义的和/或通过权利要求9-23任一项定义的方法可得到的用作药物，优选用于人和/或动物预防性和/或治疗性处理的正电荷脂小泡。
26．带有正电荷脂双分子层膜的脂小泡作为药物运送的载体系统的用途，该小泡包含阳离子和/或聚阳离子脂质，至少一种在膜中整合的或者与膜共价连接的天然的或合成的病毒融合肽，和优选地至少一种与膜连接的细胞特异性标记。
27．权利要求26的用途，用于向静止或增殖的哺乳动物细胞非传染性转移遗传物质。
28．带有正电荷脂双分子层膜的脂小泡制备用于治疗癌症的药物组合物的用途，该小泡包含阳离子和/或聚阳离子脂质，至少一种在膜中整合的或者与膜共价连接的天然的或合成的病毒融合肽，和优选地至少一种与膜连接的细胞特异性标记。
29．权利要求26-28任一项的用途，其中融合肽选自血凝素三聚体或单体，其一种或两种裂解的亚单位，糖肽HA1和HA2，从天然来源分离的融合肽，和合成的融合肽。
30．权利要求26-29任一项的用途，其中细胞特异性标记选自单克隆抗体，F(ab’)2片段，Fab’片段，细胞因子和生长因子。
31．权利要求26-30任一项的用途，其中小泡进一步包含所需的遗传物质，优选选自短链DNA或RNA，脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸，寡脱氧核糖核苷酸硒酸盐，寡脱氧核糖核苷酸硫代磷酸盐，寡脱氧核糖核苷酸磷酰胺，寡脱氧核糖核苷酸甲基膦酸盐，肽核酸，核糖核苷酸，寡核糖核苷酸，寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸磷酸盐，2’-OMe-寡核糖核苷酸硫代磷酸盐，核酶，基因，质粒和载体。
32．权利要求26-31任一项的用途，其中小泡包含至少一种适于反义治疗癌症，白血病，和病毒感染的反义寡核苷酸。
33．权利要求32的用途，其中反义寡核苷酸靶向原癌基因或癌基因编码的mRNA。
34．权利要求1-8任一项定义的和/或通过权利要求9-23任一项定义的方法可得到的正电荷脂小泡用于制备用于诊断应用和/或用于人或动物预防性和/或治疗性处理的药物组合物的用途。
全文摘要
本发明涉及体外和体内向静止或增殖哺乳动物细胞有效运送遗传物质的正电荷病毒体。该病毒体膜包含阳离子和/或聚阳离子脂质,至少一种病毒融合肽和优选地至少一种细胞特异性标记,该细胞特异性标记有利地选自单克隆抗体,抗体片段F(ab’)
文档编号A61K31/00GK1225007SQ97196232
公开日1999年8月4日 申请日期1997年5月4日 优先权日1996年5月8日
发明者E·R·维尔蒂, R·格吕克, P·克莱恩 申请人:尼卡健康产品有限公司