专利名称：Age－1多肽和相关分子以及方法
背景技术：
本发明涉及与衰老有关的多肽和核酸序列，以及它们使用的方法。
随着美国和其它国家的人群的平均年龄的增加，人们对于努力延缓衰老进程的兴趣不断增加。长期以来，大家公认，触发DNA损坏或者换句话说对细胞有毒性的环境因子可能对寿命有负面影响。在此过程中的遗传作用也日益被接受，并且已导致研究参与和控制老化或衰老的基因。这些基因是有价值的，因为它们可以编码延缓衰老或死亡的治疗产物。或者，可以将这些蛋白用作拮抗型药物设计或分离的靶，这些药物本身延长寿命或延缓衰老相关条件的发动。
发明概述概括地说，本发明描绘基本纯的AGE-1多肽的特征，该多肽具有的氨基酸序列至少50％(而且最好是70％或90％)与图6(SEQ ID NO:1)的多肽相同。最好是，该AGE-1多肽包括在等同位置上包括下列图6(SEQ ID NO:1)氨基酸序列中的50％(而且最好是70％或90％)相同的氨基酸氨基酸Gly-32、Leu-73、His-78、Phe-81、Glu-109、Phe-114、Leu-123、Leu-125、Phe-129、Lys-181、Ser-208、Lys-211、Arg-321、Leu-325、Leu-351、Ser-355、Met-373、Leu-381、Leu-393、Thr-432、Tyr-451、Glu-475、Pro-507、Ile-514、Gly-518、Glu-530、Val-538、Leu-582、Tyr-606、Pro-643、Phe-665、Leu-744、Leu-745、Arg-762、Leu-789、Arg-794、Ala-827、Arg-829、Trp-835、Ser-842、Asn-905、Gly-917、Asp-975、Ile-990、Asp-1006、His-1020、Lys-1104、Thr-1105、Gly-1130、Phe-1140和Lys-1144。特别推荐位于等同氨基酸827的丙氨酸。在另一个最佳实施方案中，该AGE-1多肽得自动物，例如，Caenhorabditis elegans或哺乳动物，例如人。
本发明也描绘AGE-1多肽的有用片段的特征；特别是，推荐的片段包括图6(SEQ ID NO:1)的氨基酸387-641、387-1146、1-130、1-150、1-658或1-404。
在相关的方面，本发明描绘编码任一上述AGE-1多肽的纯化DNA(例如，cDNA)或包括AGE-1核酸序列的纯化DNA，该核酸序列至少30％(并且最好是40％、50％、70％、80％或90％)与图4(SEQ ID NO:2)的核酸序列相同。另外，本发明描绘包括与图4(SEQ ID NO:2)、图4(SEQID NO:2)的核苷酸64-852基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA；与核苷酸865-912基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA；包括与图4(SEQ ID NO:2)的核苷酸919-975基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA；包括与图4(SEQ IDNO:2)的核苷酸1003-3090基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA；包括与图4(SEQ ID NO:2)的核苷酸3094-3501基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA；或包括与图4(SEQ ID NO:2)的核苷酸2620-2655基本相同的AGE-1核酸序列的纯化DNA。本发明也描绘载体和细胞，它们均包括本发明的纯化DNA；以及产生重组AGE-1多肽的方法，该方法包括提供用编码用于在细胞中表达定位的AGE-1多肽的DNA转染的细胞、在表达该DNA的条件下培养该转染的细胞、以及分离该重组的AGE-1多肽。本发明还描绘通过本发明纯化DNA的这种表达产生的重组AGE-1多肽、以及特异性识别并结合AGE-1多肽的基本纯的抗体。
另外，本发明描绘鉴别AGE-1调制化合物的方法。第一个方法涉及能降低AGE-1基因表达的调制化合物的鉴别，包括(a)提供表达该AGE-1基因的细胞和(b)将该细胞与候选化合物接触，与该候选化合物接触后的AGE-1表达的降低鉴别调制化合物。第二个方法涉及能降低AGE-1活性(例如激酶活性)的调制化合物的鉴别；该方法包括(a)提供表达AGE-1多肽的细胞和(b)将该细胞与候选化合物接触，与该候选化合物接触后的AGE-1活性(例如，激酶活性)的降低鉴别调制化合物。
在两种方法的最佳实施方案中，该AGE-1基因编码或AGE-1多肽包括与显示在图6(SEQ ID NO:1)中的氨基酸序列至少50％(并且最好是70％或90％)相同的氨基酸序列；并且该AGE-1基因或AGE-1多肽是来自动物(例如，C.elegans)，而且最好是来自哺乳动物(例如，人)。在其它最佳实施方案中，在线虫或其它动物中实施该方法，或该方法涉及在体外分析AGE-1活性。
本发明还描绘通过上述方法鉴别的调制化合物以及增加哺乳动物寿命的方法，该方法包括给予哺乳动物(例如，人)这种化合物。另外，本发明描绘生产增加哺乳动物(例如，人)寿命的药物的方法。
另外，本发明描绘确定动物寿命的方法。该方法涉及在来自动物的样品中测定AGE-1基因表达或AGE-1活性(例如，激酶活性)，以及相对于野生型样品的AGE-1表达或活性的降低是该动物寿命增加的指示。
在最佳实施方案中，该动物是哺乳动物(例如，人)；通过分析样品中AGE-1多肽的量(例如，通过免疫学方法)测定AGE-1基因的表达；或通过分析样品中AGE-1 mRNA的量(例如，通过用AGE-1-特异性核酸序列的杂交或PCR技术)测定AGE-1基因的表达。
在本发明中也包括实施上述方法的试剂盒。这种试剂盒最好包括特异性地识别并结合AGE-1多肽的基本纯的抗体，并且也可以包括检测和定量抗体结合的工具。或者，该试剂盒可以包括可用于杂交或PCR目的的AGE-1核酸序列的全部或片段，以及也可以包括检测和定量该杂交或扩增产物的工具。
“AGE-1多肽”是指参与控制衰老的磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)。
“蛋白”或“多肽”是指氨基酸的任何链，与长度或翻译后修饰(例如，糖基化或磷酸化)无关。
“基本纯”是指含至少60％(重量)(干重)目的化合物(例如，AGE-1多肽或AGE-1特异性抗体)的制剂。优选该制剂含至少75％(重量)目的化合物，更优选含至少90％(重量)目的化合物，而最优选至少99％,(重量)目的化合物。可以通过任何适当的方法，例如柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳或HPLC分析测定纯度。
“纯化DNA”是指这样的DNA，它与在它来源的有机体天然存在的基因组中直接连接的两个编码序列(一个在5’末端而一个在3’末端)不直接连接。因此该术语包括例如插入载体的重组DNA；插入自主复制型质粒或病毒的重组DNA；或插入原核或真核生物的基因组DNA的重组DNA，或以独立于其它序列的单独分子(如cDNA或通过PCR或限制性内切酶处理产生的基因组DNA片段)存在的重组DNA。它也包括编码另一多肽序列的杂种基因部分的重组DNA。
“基本相同的”核酸是指其编码的多肽仅仅由于以下原因而不同的核酸序列保守氨基酸取代，例如以一个氨基酸取代同种的另一个氨基酸(如缬氨酸取代甘氨酸，精氨酸取代亮氨酸等)；或位于氨基酸序列上不损害该多肽(分析多肽，如这里描述的)功能的位置的一个或多个非保守的取代、缺失或插入。最好是，该编码的序列在氨基酸水平上与图6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域(如这里描述)的序列至少30％相同。在其它最佳实施方案中，该编码的序列在氨基酸水平上与图6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域的序列至少40％、优选50％、更优选60％,、而最优选70％相同。在另外的最佳实施方案中，该编码的序列在氨基酸水平上与图6(SEQ ID NO:1)或其AGE-1域的序列至少80％,、优选85％,、更优选90％、而最优选95％相同。如果比较核酸序列，则“基本相同的”核酸序列是与图4(SEQ ID NO:2)或编码其AGE-1域的序列至少30％、更优选40％、而最优选50％相同的核酸序列。在其它最佳实施方案中，基本相同的核酸序列是与图4(SEQ ID NO:2)或编码其AGE-1域的序列至少75％、更优选85％、而最优选95％相同的核酸序列。核酸序列比较的长度将通常至少是50个核苷酸、优选至少60个核苷酸、更优选至少75个核苷酸，而最优选110个核苷酸。
通常用序列分析软件(如，遗传学计算机组的序列分析软件包，University of Wisconsin Biotechnology Center,1710 UniversityAvenue,Madison,WI 53705,BLAST，或PILEUP/PRETTYBOX程序)测定同源性。这类软件通过规定对各种取代、缺失和其它修饰的同源性程度，匹配相似的序列。保守取代通常包括在以下组内的取代甘氨酸、丙氨酸；缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸；天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、精氨酸；和苯丙氨酸、酪氨酸。
“表达定位”是指将该DNA分子靠近指导该序列的转录和翻译的DNA序列定位(即有利于AGE-1蛋白的产生)。
“纯化抗体”是指至少60％(重量)不含与其天然相连的蛋白和天然存在的有机分子的抗体。优选该制剂是至少75％(重量)的抗体、更优选至少90％(重量)的抗体、而最优选至少99％(重量)的抗体。
“特异性结合”是指抗体识别并结合AGE-1多肽，但是基本不识别和结合天然包含AGE-1多肽的样品(如，生物学样品)中其它分子。“特异性结合”AGE-1的抗体在这类生物学样品中用一种或多种本领域可应用的标准免疫学技术(例如，蛋白质印迹或免疫沉淀)足以检测AGE-1蛋白产物。
“寿命”是指衰老的速度和/或生命周期。
“相对于野生型样品”是指相对于来自一个或多个平均生命周期的个体的相同组织样品。可以通过在有统计学意义数目的群体成员中分析AGE-1水平，确定平均生命周期的个体。
“免疫学方法”是指任何涉及基于抗体的检测技术的分析，包括但不限于蛋白质印迹、免疫沉淀、以及直接的和竞争的ELISA和RIA技术。
“用于检测的工具”是指足以表明目的检测事件的任何一个或一系列组分。这类工具涉及可以被分析或观察的至少一个标记，包括但不限于放射性标记、荧光标记和化学发光标记。
“AGE-1RNA”是指从AGE-1 DNA序列转录的信使RNA。
“杂交技术”是指任何涉及在核酸链之间特异性相互作用(基于互补性)的检测分析，所述相互作用包括DNA-DNA、RNA-RNA和DNA-RNA间的相互作用。如果需要，这类杂交技术可以包括PCR扩增步骤。
“激酶活性”是指AGE-1介导的磷脂酰肌醇P3(PIP3)的产生。
在这里用的“调制化合物”是指任何能或者降低AGE-1表达(即在转录、翻译和翻译后的水平上)或者降低AGE-1蛋白活性(即每单位AGE-1蛋白量活性的量，例如激酶活性的量)的化合物。
本发明的其它描绘和优点将从以下的其详细描述以及从权利要求书中明显看出。
附图简述
图1是显示在age-1(hx546)动物中有缺陷的母本age-1基因活性的图示。在图中age-1(mg44)染色体用sqt-1(sc13)以顺式标记。age-1(mg44)纯合亲本的age-1(mg44)后代显示在左边。age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)杂合亲本的后代显示在中间。+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)杂合亲本的后代显示在右边。将sqt-1(sc13)遗传标记用于鉴别纯合age-1(mg44)后代。当用另一个标记unc-4标记另一个age-1等位基因m33(它也可能是无效的等位基因)和mg109时，观察到类似的结果(数据未显示)。所示实验中，动物在25℃生长。请注意，age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃发育停滞为持久幼虫，外显率为100％。这与作为对照的age-1(mg44)亲本的age-1(mg44)子代相同。在age-1(mg44)亲本的age-1(mg44)子代的情况下，我们也注意到这些动物的6％(n=30)在L1或L2期停滞。许多这些停滞的动物最终生长成持久样幼虫和不育的成体。相反，1％的+/sqt-1(scl3)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃发育停滞为持久幼虫。来自能育成体的age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代就像+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代。这表明，对于非持久生长，age-1(hx546)表达足够的合子age-1水平，而不是母本age-1水平。
在20℃，几乎没有age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代停滞发育为持久幼虫；大多数作为持久样动物继续发育，是黑的和不育的。首先已注意age-1(mg44)的这种温度依赖性持久停滞(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.Genetics 137,107-120(1994))。我们不能将高温下更严重的表型认为是age-1(hx546)的任何温度敏感性引起的结果。与25度不同，在20度在age-1(hx546)中有可检测的母本age-1活性age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的4％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代是能育的(数据未显示)，不像age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.Genetics 137,107-120(1994))。相反，在20度，+/sqt-1(sc13)age-1(mg44)亲本的93％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代是能育的。
在该图中，上标a表示一个能育的Sqt成体是重组的sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(sc13)age-1(hx546)。从其它实验中的相同亲代品系挑出两个其它的sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(sc13)age-1(hx546)重组体(数据未显示)。上标b表示在F3中除了三个sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt-1(scl3)重组体，所有可育的Sqt成体均产生Sqt持久型。
通过从原始的非持久型Sqt中挑出各个动物，然后检测其同组动物(brood)，确定所述重组体的基因型。三个sqt-1(sc13)age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)重组体将age-1(hx546)定位在sqt-1(sc13)的右边，因为这些重组体显示，在age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)杂合子中，每次sqt-1(sc13)与age-1(mg44)重组分开，age-1(hx546)回收在sqt-1重组染色体上。也将age-1(hx546)相对于sqt-1(sc13)和lin-29进行三因子作图；根据缺乏age-1(m333)的母本拯救，两个非Sqt的Lin重组体是Age，而10个非Lin的Sqt重组体是非Age。这表明age-1定位在lin-29的左边。
为了进行这些实验，在20℃将age-1(hx546)雄体交配为sqt-1(sc13)age-1(mg44)雌雄同体。将F1非Sqt非Daf杂交后代(3/3)挑到单独的平板。在25度、20度或15度挑选单个杂合子到平板上，并每天转移(20°或25°)或每2-3天转移(20°和15°)。然后对虫计数，并在3天后(25°)、4天后(20°)或7天后(15°)记录持久型和非持久型。为了遗传作图，将age-1(hx546)雄体与sqt-1(sc13)lin-29(n333)/mnC1雌雄同体交配，将单个的野生型杂交后代挑到单独的平板。对于Sqt-非Lin和Lin-非Sqt的重组体，检测分离的野生型、Sqt Lin动物和携带mnCl的无后代的平板。然后将推定的重组体挑到单个的平板，并且选出来自该杂合重组体的后代以建立纯合子重组品系。然后记录到10个Sqt-非Lin和2个Lin-非Sqt重组体在25℃不能母本互补age-1(m333)的持久组成性。将unc-4(e120)age-1(m333)/mnCl雄体与所述重组体交配。在交配前，用微注射针将Lin非Sqt重组体在阴门处打开。将野生型雌雄同体杂交后代挑至25℃，并且记录其后代的unc-4(el20)age-1(m333)纯合后代是否停滞为持久幼虫。
图2A是显示age-1区的物理/遗传图谱的图示，遗传上定向的左边朝向左边。在该遗传定向图谱上，age-1是从右向左转录。C.elegans基因组项目设置该sqt-1 lin-29区间中的粘粒和YAC克隆。当用该粘粒作为探针通过对Df/mnCl DNA的DNA印迹检测时，mnDf75、mnDf76和mnDf86均互补age-1，而不能互补sat-1，在粘粒C24F2中断裂(数据未显示)。用从左边部分重叠C24F2的粘粒W1OC3，在mnDf76中也检测到断裂点，但在mnDf75或mnDf86中没有检测到断裂点。因此，age-1必定定位在这些缺陷的断裂点的右边。用对mnDf90纯合(不能与sqt-1和age-1互补)胚胎的kin-6引物的PCR分析，显示该缺陷缺失kin-6左边的DNA，将age-1置于kin-6的左边。用粘粒B0334作为探针的DNA印迹，从age-1(mg55)/mnCl分离的DNA中检测到一个断裂点，但在从其它age-1等位基因或其它携带mnCl的品系分离的DNA中没有检测到断裂点。该age-1转录物没有按比例画出。
图2B是一DNA印迹分析的照片，显示从野生型(N2)(1道)、age-1(mg55)mnCl(2道)和三个Df/mnCl对照品系(3、4和5道)分离的HindⅢ-消化的基因组DNA与由噬菌体5B的4kb SalI亚克隆制备的探针的杂交。该探针检测编码AGE-1的C-末端区的区域。含有mg55的品系携带来自mnCl上野生型age-1等位基因的5.2kbHindⅢ片段和来自age-1(mg55)等位基因的改变的3.1kb HindⅢ片段，表明mg55断裂点是在粘粒B0334的最右边(rightmost)部分中或其附近。
图2C是显示邻近用于分离age-1基因显示的基因组和cDNA克隆的age-1基因结构的图示。将该基因相对于该遗传图谱倒转180°，以使转录是左至右取向。白色方块代表预测的非翻译区。句点代表通过RTPCR获得的序列的区域，以检验剪切点和获得将cDNA B和C与A连接的序列。独立的cDNA B和C出现在λ载体相反的方向，并因此代表独立的克隆事件。它们在其N末端终止于相互的30bp内，提示它们限定该age-1mRNA的真正的终点。第三个cDNA(未显示)终止在cDNA C的5bp内，并且是与cDNA C在相同的方向。基于它们不能互补sqt-1，分离所有在图2A、2B和2C中表明的缺陷。在单个停滞的L1幼虫(mnDf75、mnDf76、mnDf86)上进行用来自sqt-1和kin-6的引物对的PCR，或进行来自杂合缺陷/mnCl动物所产的单个死卵(mnDf90)的引物对的PCR。为了实施该单个虫/卵PCR方案，选择单个虫或卵挑入2.5μl的有蛋白酶K的虫裂解缓中液(50mMKCl,10mM Tris pH8.2,2.5mM Mg,0.45％NP-40,0.45％吐温-20,0.01％明胶，60μg/ml蛋白酶K)中。加入矿物油，并将试管在干冰上冰冻，在60℃温育1小时，并在95℃温育15分钟以裂解。然后加入2.5μl的虫裂解缓冲液，并将该反应分为sqt-1引物和kin-1引物的两个PCR反应。sqt-1引物为CTCTGGTTCATTTCCCAACC(SEQ ID NO:3)和TGTAACTCACCTAGTCTTCG(SEQ ID NO:4)。kin-1引物为AACAATTACAGGCCGATCC(SEQ ID NO:5)和ATGCCACGCAAGAAACTCAC(SEQID NO:6)。
从λACT中的Barstaead随机引物cDNA文库(RBⅡ)分离噬菌体B和C。从λgt10中的Ahringer期的胚胎文库分离噬菌体A。从λDash载体中的Browning基因组文库分离噬菌体φ5B。用硫氰酸鈲从混合阶段的虫中制备用于RTPCR实验的RNA。用Clontech的5’-AmplifinderRace试剂盒进行cDNA制备和锚式连接。用对age-1的特异性引物(序列GAAAAGATGGAATGTGACCG)(SEQ ID NO:7)逆转录36μg的总RNA。用该试剂盒的锚式引物和用以下序列的引物进行PCR:ATCTGAAGCGTTCTTATATC(SEQ ID NO:8)(我们随后发现它有一个错误)。再次用该锚式PCR引物和内部引物TGCTCCATTTTCTCCGATCC(SEQ IDNO:9)进行嵌套PCR。
图3是age-1(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列，它是通过对图1中描述的cDNA克隆、扩增逆转录PCR片段和基因组区测序测定的。不进行亚克隆而对PCR产生的模板测序，并通过对多个分离物测序而证实。不进行亚克隆，通过PCR扩增基因组区和对模板直接测序，测定age-1等位基因的序列。通过对独立的扩增模板测序，证实检测的每个突变。将该AGE-1序列与小鼠p110α(登记号P42337)(SEQ ID NO:10)、人p110β(登记号P42338)(SEQ ID NO:11)以及人p110γ(登记号P48736)(SEQ ID NO:12)比较。通过Prettybox选出以灰色和黑色突出的区域，当有高度氨基酸相似性的延伸区域时，通过Pileup程序进行序列对比(Wisconsin软件包的程序手册，版本8，1994年9月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA53711)。在该4个序列的3个中不变的氨基酸以黑色方块显示。4个精确配对的3个突出区中相似的氨基酸以灰色方块突出。在改变的氨基酸上显示等位基因损坏。星号(*)表示改变为终止密码子。围绕age-1(mg55)的括号显示我们定位了age-1(mg55)断裂点的区域。
在这些实验中，用Promega fmol测序试剂盒在cDNA、RTPCR产物和来自该age-1突变等位基因的PCR扩增的基因组区上进行测序。然后将GCG程序、Translate、Pileup和Prettybox用于分析该序列。
图4是age-1cDNA(SEQ ID NO:2)的核酸序列。
图5是说明有小鼠p110α的AGE-1序列的图示。该图示是按比例的，并且延伸超过1146个氨基酸的AGE-1序列。给出了通过Gap程序在进行序列对比的小鼠p110α的每个结构域和AGE-1区之间享有的一致性百分比。标记ras和p85的域已显示在p110α中分别结合ras和p85。脂质激酶域包括与所有脂质激酶享有广泛的同源性的AGE-1区。每个点突变的大约位置相对于Pileup程序预测的假定AGE-1域显示。
图6是AGE-1多肽(SEQ ID NO:1)的氨基酸序列。突出的氨基酸位置最好是在AGE-1变异中未改变(基于它们与人激酶p110α中氨基酸的一致性)。
详细描述如以下更详细描述的，在C.elegans中信息素诱导的神经分泌信号系统在持久滞育期触发发育停滞和寿命增加。age-1是该神经内分泌途径中的关键基因，非停滞发育和正常的衰老都需要其活性。如本文所示，age-1编码磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)催化亚基p110家族的一个成员。4个age-1突变等位基因影响该PI3-激酶的同系物2个损伤是在N-末端至激酶域不同的位置上截短该蛋白的终止密码子，并且因此可能决定age-1的无效表型。在一个基于其寿命增加分离的age-1突变中，母本的age-1活性被特异性地消除。母本的或合子的age-1基因活性的缺乏使生命周期延长，但是发育不停滞，而母本的和合子的age-1基因活性均缺乏导致在持久期停滞。这些数据提示，AGE-1介导的磷脂酰肌醇(3,4,5)P3(PIP3)信号降低导致寿命增加，而完全缺乏该信号导致发育停滞。在C.elegans和其它生物中的滞育在许多动物门中，神经信号途径使感觉输入与生理和发育的内分泌控制偶联。例如，许多无脊椎动物在对信息素、光/黑暗周期或温度触发的神经信号的应答中停滞或改变它们的发育(Tauber,M.J.等，Seasonal Adaptation of Insects(New York,NY,1986),Wilson,E.0.,The Insect Societies(Cambridge,MA,1972))。线虫Caenhorabditis elegans在特定的感觉神经元被暴露于诱导持久的信息素后，在持久滞育期停滞发育(Riddle,D.L.载于The Dauer Larvain The Nematode Caenorhabditis e1egans.(Wood,W.B.编辑)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988))。持久幼虫的形成包括行为的、生理的和形态的变化持久幼虫暂停蜕皮周期和胚系发育、停止进食，但是开始移动(dispersal)行为，并且分泌特化的封闭外皮(Riddle,D.L.载于The Dauer Larva in The NematodeCaenorhabditis elegans中。(Wood,W.B.编辑)393-412(Cold SpringHarbor,NY,1988))。当信息素水平降低时，该持久恢复并重新进入正常进食和蜕皮周期，产生能育的成体动物。持久的形成在C.elegans中也中断正常的衰老。持久停滞的幼虫存活的时间可以比非持久动物的寿命长8倍以上，而在从该持久期恢复后不影响寿命。(Riddle,D.L.载于The Dauer Larva in The Nematode Caenorhabditis elegans中。(Wood,W.B.编辑)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988))。由于总体形态学变化和寿命的改变与持久形成相关，并且由于与其它无脊椎动物中滞育的已知内分泌控制类似(Williams,C.M.,Biol.Bull.103:120-138(1952))，所以可能神经内分泌途径与探测该持久信息素的感觉神经元偶联。
已分离了和表征了许多影响持久形成的突变(daf突变)(riddle,D.L.等，Nature 290:668-671(1981)；Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。这些突变分为两个主要类别持久组成型(daf-c)突变，甚至在缺乏诱导持久的信息素下它也导致动物进入持久期；和持久缺陷型(daf-d)突变，甚至在高信息素的条件下，它也阻止持久形成)。已将这些突变鉴别的基因顺序加入(order into)遗传上位性途径，所述遗传上位性途径可能在由信息素-感觉神经元、分泌细胞和靶组织组成的神经内分泌系统的发育或功能中代表所述步骤(Riddle,D.L.等，Nature 290:668-671(1981)；Vowels,J.J.和Thomas,J.H.等，Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)；Thomas,J.H.等，Genetics 134:1105-1117(1993))。这些基因的两个-daf-1和daf-4编码TGF-β受体的类似物，将该信号途径与信息素信号传导相联系(Georgi,L.L.等，Cell61:635-645(1990)；Estevez,M.等，Nature365:644-649(1993))。
在介导持久神经内分泌途径的功能的许多基因中，已经将daf-2、daf-16和daf-23与寿命的调节最直接相联系(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。强的daf-2等位基因和非母本拯救的强的daf-23等位基因在缺乏信息素时诱导持久形成，而温度敏感型daf-2等位基因或母本拯救的daf-23等位基因增加寿命2至3倍，不形成持久幼虫(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。这提示可以将衰老的调节与持久形成去偶联。daf-16突变既抑制daf-2和daf-23突变体的持久组成型表型，又抑制其寿命的增加(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。其它daf突变不影响寿命，并且不被daf-16突变有效地抑制(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。该遗传上位性分析提示，调节寿命的daf-2、daf-16和daf-23亚途径不是在该持久途径的TGF-β信号组分下游作用，就是平行于TGF-β信号组成作用(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.等，Genetics 130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。AGE-1的克隆和分析在遗传筛选中分离增加寿命的age-1(hx546)(Klass,M.,MechAging Dev 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johrnsorn,T.E.,Genetics 118:75-86(1988))。age-1(hx546)动物的存活时间是野生型的两倍，并且像daf-2和daf-23突变的增加的寿命表型一样，daf-16中的突变抑制寿命的增加(Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。最近，Inoue和Thomas显示，在高于实验室培养中常规使用温度的温度27℃下，age-1(hx546)具有持久组成型表型，并且不能互补daf-23持久组成型等位基因。因为强的daf-23等位基因(如，m333和mg44)在27℃的单倍性不充分(haploinsufficient)(数据未显示)，所以在该温度的互补试验难以解释。我们在较低温度下互补测试age-1(hx546)和持久组成型daf-23等位基因，在该温度下没有这种单倍不充分性(haploinsufficiency)(图1)。结果表明，age-1(hx546)不能互补3个daf-23持久组成型突变等位基因，并且作图到同一遗传区间。因此将age-1确定为增加寿命的等位基因(hx546)和以前称为daf-23的组成型突变等位基因(mg44、mg55、mmg109)，因为该定义的突变等位基因被称为age-1(Klass,M.,Mech Aging Dev 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johnson,T.E.,Genetics 118:75-86(1988))。如以下所显示，age-1(hx546)在母本的age-1基因活性中特异性地缺失，而较强的持久组成型age-1等位基因在母本和合子的age-1基因活性中均缺失。
将用sqt-1(sc13)顺式标记的age-1(mg44)无效等位基因(参见以下)用在该遗传分析中(图1)。只有在它们不接受母本的或合子的age-1贡献时，携带该age-1等位基因的动物才正常停滞发育为持久幼虫(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。例如，+/age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代发育成能育的成体，所述成体然后产生一组(brood)停滞的age-1(mg44)持久幼虫(图1)。age-1(hx546)突变破坏这种母本拯救age-1(hx546)/age-1(mg44)母本的age-1(mg44)子代停滞发育成持久型(图1)。对于另一个可能的无效等位基因age-1(m333)(见下)和age-1(mg109)观察到类似的缺乏age-1(hx546)母本拯救(数据未显示)。与age-1(hx546)突变仅表达母本的age-1一致，父本贡献的age-1(hx546)等位基因可以由合子拯救age-1(mg44)纯合母本后代的持久组成型表型age-1(hx546)雄体与age-1(mg44)/age-1(mg44)雌雄同体交配的age-1(hx546)/age-1(mg44)子代不会停滞发育成持久幼虫，类似于来自与野生型雄体交配的+/age-1(mg44)后代(图1)。遗传作图将age-1(hx546)置于sqt-1和lin-29之间的与daf-23相同的1.2图单位遗传区间中(图1)(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。
如以前的遗传分析(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))和以下的分子分析显示，大多数age-1等位基因的持久组成型表型是可能的无效表型。在大多数温度下age-1(hx546)不是持久组成型(Klass,M.,Mech Aging Der 22:279-286(1983)；Friedman,D.B.和Johnson,T.E.,Genetics 118:75-86(1988)),可能因为该等位基因的合子age-1基因活性足以允许非停滞的发育。该突变体可能是长寿的，因为母本贡献的age-1的减少导致衰老速度的减缓。同样，在+/age-1(m333)亲本的母本拯救的age-1(m333)纯合后代中缺乏合子的表达，也导致没有持久停滞的寿命延长(Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。这些动物只有母本的age-1活性，因为age-1(m333)是无效突变体(参见以下)。因此，正常的衰老可能取决于母本和合子的age-1活性在缺少合子age-1基因活性或拯救的母本age-1基因活性时，动物停滞在持久期。
图1中说明的数据在以下的表格中显示(表1)。表1 age-1产生的寿命的调节和持久的形成年龄表型父本 母本 合子基因型持久的形成 寿命(天) 相对于基因型 基因型 野生型的寿命+/+ +/+ 非持久型(1000) 8.1±0.2(90) 1.0mg44/+ mg44/mg44 非持久型(505)*20.7±0.2(26) 2.6mg44/mg44mg44/mg44 非持久型(505)hx546/hx546 hx546/hx546 非持久型(1000) 16.6±1.0(43) 2.0+/+ mg44/mg44mg44/4非持久型(100) 10.7±0.5(35) 1.3hx546/hx546 mg44/hx546 hx546/mg44非持久型(100) 19.8±1.1(54) 2.4mg44/hx546 mg44/mg44 持久型(406)age-1(mg44)染色体用sqt-1(sc13)顺式标记，并且age-1(mg44)/+品系具有mnCl平衡染色体(balances chromosome)作为+染色体。从L4期至动物对光接触反应的最后一天测定在25℃的寿命，并且表示为平均值±s.e。请注意，age-1(hx546)/sqt-1(sc13)age-1(mg44)的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代在25℃形成持久幼虫，外显率为100％。这同对照的age-1(mg44)亲本的age-1(mg44)子代相同。在两种情况下产生的持久幼虫都有黑暗的肠、咽重建和表皮重建以及该阶段的蜕皮周期特征的停滞3.5。相反，sqt-1(sc13)age-1(mg44)/+的99％的sqt-1(sc13)age-1(mg44)后代不形成持久幼虫，显示母本的age-1活性足以允许非持久型发育。这些动物寿命比野生型虫长2.6倍。合子age-1(+)在缺少母本age-1时可以为正常的生活周期和非持久型发育提供足够的活性，但是合子age-1(hx546)不能为正常的寿命提供足够的活性。用其它的age-1等位基因m333和mg109观察到相似的结果(数据未显示)。我们通过三因子作图，将age-1(hx546)定位于1.2图单位sqt-1 lin-29区间。在该区间中的20个重组体中，4个是在sqt-1和age-1(hx546)之间，而16个在age-1和lin-29之间。这显示age-1(hx546)定位到与age-1(mg44)相同的遗传区间。与该图谱一致，从sqt-1(sc13)age-1(mg44)/age-1(hx546)虫分离出基因型sqt-1(sc13)age-1(mg44)/sqt1(sc13)age-1(hx546)的sqt重组体。将野生型或age-1(hx546)雄体交配为sqt-1(sc13)age-1(mg44)雌雄同体。在25℃将杂交后代挑到独立的平板，并且3天后记录F2子代。为进行遗传作图，从age-1(hx546)/sqt-1(sc13)1in-9(n333)雌雄同体挑出重组体。在25℃下，就不能母本互补age-1(m333)而形成持久方面测试重组体。*这些虫的1％形成持久幼虫，而20％成为不育的成体。
age-1定位的1.2图单位sqt-1 lin-29区间由4个重叠群上大约700kb的DNA组成(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。在该区域内通过用5个小染色体Ⅱ缺陷，将物理图谱和遗传图谱相关联，在小染色体Ⅱ缺陷中某些互补age-1中的突变，而某些不能互补。age-1被确定位于粘粒C24F2的右侧或在粘粒C24F2上，因为不能互补sqt-1，但互补age-1的mnDf75、mnDf76和mnDf86缺陷有粘粒C24F2可检测的断裂点(图2A)。通过用PCR将age-1物理定位到克隆标记kin-6(它位于粘粒C46F8上)的左侧，以确定mnDf90(不能互补sqt-1和age-1的缺陷)纯合的死卵包含kin-6的DNA，反之它们缺失sqt-1(图2A)。这些缺陷将age-1定位在粘粒C24F2和C46F8之间的大约240kb区间。在DNA印迹上采用来自该区间的粘粒作为探针，我们搜寻了与age-1(mg55)γ射线诱导的等位基因相关的断裂点。因为age-1(mg44)在遗传杂交中显示与染色体Ⅰ拟连锁(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994)),怀疑该等位基因与易位相关，并且是显示age-1中断裂点的最佳推测的候选等位基因。来自粘粒B0334的探针和来自重叠B0334最右边区域的基因组克隆的探针检测到age-1(mg55)/mnCl中的一个新断裂点，但是在携带同一mnCl平衡染色体的对照DNA中没有检测到(图2B和2C)。
C.elegans基因组项目(Sulston,J.等，Nature 356:37-41(1992)已测定了粘粒B0334的序列。在检测到age-1(mg55)断裂点的4kb区的DNA序列分析揭示了显示与哺乳动物磷脂酰肌醇3-激酶(PI3-激酶)p110催化亚基最后88个氨基酸有强的序列一致性的2个假定的外显子(Hiles,I.D.等，Cell70:419-429(1992))。C.elegans基因组项目在粘粒或噬菌体中没有克隆到预期包含其余age-1的B0334右边的区域，并且用逆转录RNA的锚式聚合酶链式反应(PCR)分离和测定age-1编码区的序列(图2C)。为了证实age-1的剪接形式，与预期的剪切点的基因测序一起使用逆转录PCR(RTPCR)。通过测定对应于该预期编码序列的基因组片段的序列，进一步证实通过cDNA克隆和锚式PCR预期的序列。因为3个独立的cDNA克隆终止于相互之间的30个碱基对内，并且因为这些克隆编码与哺乳动物p110(参见以下)共同延伸的蛋白，我们总结出装配的age-1 cDNA可能是完整的。C.elegansage-1 cDNA的核酸序列显示在图4。
age-1 DNA序列的分析揭示1185个氨基酸的开放阅读框架。age-1开放阅读框架带有4个框内蛋氨酸残基，它们是潜在的翻译起始位点。而第二个蛋氨酸显示与C.elegans翻译开始共有序列比较匹配，Kozak翻译起始规则偏爱mRNA中的第一个蛋氨酸(Kozak,M.,Nucleic Acids Research15:8125-8132(1987)；Kozak,M.,Proc.Natl.Acad.Sci.92:2662-2666(1995)；Krause,M.载于Caenorhabditis elegans Modern Biological Analysis of anOrganism中(Epstein,H.F.和Shakes,D.C.编辑)483-512(SanDiego,CA,1995))。从第一起始密码子计数，预期age-1编码1146个氨基酸的蛋白质(图3和6)。从4个age-1 EMS-诱导的等位基因m333、mg44、mg109和hx546中，测定编码该蛋白的age-1基因组区，揭示在从3个age-1等位基因分离的DNA中在该编码区内G→A的点突变(从EMS诱变的预期的突变)(参见以下)。在age-1(hx546)编码区3’UTR中没有检测到改变。因为该突变特异性地影响母本age-1活性，所以它可能位于尚未测序的侧翼转录调节区中。因此4个age-1突变mg55、m333、mg44和mg109影响该开放阅读框架，保证它对age-1基因活性的分配。
AGE-1蛋白与哺乳动物磷脂酰肌醇3-激酶(PI 3-激酶)p110催化亚基家族密切相关(Hiles,I.D.等，Cell 70:419-429(1992)；Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994))。PI3-激酶产生一个膜定位信号分子磷脂酰肌醇P3(PIP3)(Riddle,D.L.载于The Dauer Larva in The Nematode Caenorhabditis elegans(Wood,W.B.编辑)393-412(Cold Spring Harbor,NY,1988)中；Williams,C.M.,Biol.Bull.103:120-138(1952)；Riddle,D.L.等，Nature290:668-671(1981))，它被认为是来自上游受体至尚未知的效应分子的传导信号(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994))。有三种已知的PI3-激酶类型。α和βp110类型由调节性p85或p55亚基导向活化的受体激酶(Kapeller R.和Cantley,L.Cl,Booessays 16:565-576(1994))。这些调节亚基具有识别那些受体和其它蛋白上的磷酸化酪氨酸的SH2域(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994)；Liscovitch,M.和Cantley,L.C.,Cell 81:659-662(1995)；Carpenter,C.L.等，Molecular andCellualar Biology 13:1657-65(1993)；Dhand,R.等，EMBO Journal13:511-21(1994)；Pons,S.等，Molecular and Cellular Biology15:4453-65(1995))。p110α或p1210β型通过它们的N-末端130个氨基酸与p85结合(Kapeller R.和Cantley,L.C.,Bioessays 16:565-576(1994)；Liscovitch,M.和Cantley,L.C.,Cell 81:659-662(1995)；Carpenter,C.L.等，Molecular and CellualarBiology 13:1657-65(1993))。p110α可以磷酸化p85亚基和脂质(Carpenter,C.L.等，Molecular and Cellualar Biology 13:1657-65(1993)；Dhand,R.等，EMBO Journal 13:511-21(1994))；因此PI3-激酶也可以通过蛋白激酶级联传导信号。p110亚基的第三种类型p110γ与异三聚体的G-蛋白结合，并且可推测直接与蛇根碱受体偶联(Stoyanov,B.等，Science 269:690-3(1995))。
Gap和Blast分析(Wisconsin软件包的程序手册，版本8,1994年9月，Genetics Computer Group,575 Science Drive,Madison,Wisconsin,USA 53711)表明，AGE-1与小鼠p110α有29.6％相同，与人p110β有29.8％相同，而与人p110γ有28.0％相同。AGE-1的大区段显示与该激酶中的p110 PI-3激酶蛋白和脂质激酶中保守的上游域的序列一致性多达42％(图3和5)。AGE-1与p110蛋白在介导p110α和β与p85相互作用的N-末端130个氨基酸中(Dhand,R.等，EMBOJournal 13:511-21(1994))的比较显示，在该区域中AGE-1与p110α(22.0％的一致性)比与p110β(17.1％的一致性)或p110γ(9.8％的一致性)更相关。在该区域中，在AGE-1和p110α之间保守的许多氨基酸残基在p110α和p110β之间也是保守的，它们在该区域享有45％的氨基酸一致性(图3)。AGE-1与这些p110α激酶序列对齐(aligment)的随机可能性是极低的对于p110α是e-113，对于p110β是e-101，而对于p110γ是e-93(与它比较，例如与PI4-激酶的随机对齐的可能性是e-22或对DNA修复激酶为e-8)。在AGE-1中保守的区域提示，该蛋白可能与p85样蛋氨酸激酶接合体偶联，而不是与Gβγ样接合体蛋白偶联。然而，在这整个蛋白上，小鼠p110α更类似于其它哺乳动物p110类，而不是AGE-1(小鼠p110α与人p110β有42.0％相同，而与人p110γ有34.5％相同，与之比较，与AGE-1有30.1％相同)，提示AGE-1可能是分支的PI3-激酶类。
age-1母本作用持久组成型突变可能是无效的等位基因。age-1(mg44)是在激酶区和大多数保守域上游截断AGE-1的Trp405Amber突变(图3)。该突变是限定age-1无效表型的好的候选物。age-1(m333)突变也是在大多数保守区上游截断AGE-1蛋白的Trp6590pal，并且也可能是无效的等位基因。age-1(mg55)断裂点从AGE-1蛋白和age-13’UTR除去该激酶域的C末端部分(图2A)。age-1(mg109)导致在AGE-1和哺乳动物PI3-激酶中保守的蛋白区中的Ala845Thr取代(图3)。在该位置，AGE-l和哺乳动物p110α都有Ala，而p110β和γ在该位置有Lys(图3)。age-1(mg109)表型的高度保守和严格性提示该区在AGE-1中执行必需功能。
所有这些age-1等位基因，包括那些预期截断该AGE-1蛋白的age-1等位基因，显示可由野生型母本基因活性拯救的持久组成型表型。另外，当提供母本的而不是合子的age-1基因活性时，age-1(m333)等位基因(它可能是一个无效的等位基因)显示寿命明显增加(Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995))。这些数据表明，AGE-1PI 3-激酶同系物在控制持久发育停滞和衰老的特定信号途径中起作用，并且与更普通的AGE-1需要不一致。另外，这表明母本AGE-1介导的磷脂酰肌醇信号足以拯救合子AGE-1信号的缺乏，以在持久期停滞，而不是降低衰老。因为在age-1(hx456)中，减少母本AGE-1磷脂酰肌醇信号也导致寿命增加，这些数据提示正常的衰老依赖于来自母本AGE-1和合子AGE-1的磷脂酰肌醇信号。
AGE-1与哺乳动物PI3-激酶享有的强的序列相似性提示PIP3信号可能在调节持久发育和衰老中起作用的种种可能的作用。在哺乳动物中，PI3-激酶信号和神经的发育以及激素信号有关。PI3-激酶抑制剂渥曼青霉素抑制来自PC12细胞中的Trk激酶受体和神经突突起的神经生长因子信号(Kimura,K.等，J.Biol.Chem 269:18961-7(1994)；Yao,R.和Cooper,G.M.,Science 267:2003-6(1995))。PI3-激酶也和肥大细胞的组胺分泌有关(Yano,H.等，J.Biol.Chem.268:25846-25856(1993))，并且与代谢控制激素胰岛素下游的信号传导有关(Levy-Toledano,R.等，J.Biol.Chem 269:31178-31182(1994))。因此，在神经内分泌途径中可能需要的许多步骤上PI3-激酶功能有先例，这些步骤包括神经元和靶组织的发育和分化、分泌事件以及在靶组织中的信号传导。
AGE-1-介导的PIP3信号能在该持久神经分泌途径中或在该途径的信息素信号传导中起作用。遗传上位性分析提示，age-1可能在daf基因的下游起作用，daf基因参与该持久信息素信号的感觉加工(sensory processing)，例如参与分泌神经元或靶组织的发育或功能(Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics 137:107-120(1994))。age-1无效突变体的持久停滞由母本拯救的观察与早期age-1作用一致。在L1期通常检测到持久信息素(Riddle,D.L.The Dauer Larva in TheNematode Caenorhabditis elegans.(Wood,W.B.编辑)393-412(ColdSpring Harbor,NY,1988))，提示如果在信息素信号传导中由母本提供AGE-1功能，则age-1mRNA、蛋白质或磷脂酰肌醇信号本身必须从胚系持续至该期。如果age-1介导该途径的发育，则预期神经元和靶组织可能在持久神经内分泌途径起作用，而age-1在胚胎发生中起作用。
age-1突变体的寿命表型提示在衰老中磷脂酰肌醇的直接功能。age-1基因活性的破坏使得在持久入口缺乏的情况下寿命长，提示这些突变体的寿命不是简单的持久入口的影响。更有可能的是，PI3-激酶活性的降低触发一个子集的持久程序，包括衰老速率的降低，但不包括停滞发育。有氧代谢的自由基副产品已提示通过直接破坏包括DNA、蛋白质和脂肪在内的各种必需分子而导致衰老(Finch,C.E.,Longevity,Senescence,and the Genome(Chicago,IL,1990))。如果来自AGE-1的磷脂酰肌醇信号正常地调节自由基的水平，那么在突变体或持久幼虫中降低age-1基因活性，可以导致寿命增加。实际上，age-1突变体和持久幼虫显示过氧化氢酶和超氧化物歧化酶水平增加，以及对产生自由基的药物和治疗有抗性(Larsen,P.,Proc.Natl.Acad.Sci.90:8905-8909(1993)；VanFleteren,J.R.,Biochem.J.292:605-608(1993))。有趣的是，在被哺乳动物中性粒细胞杀伤的细菌中，在超氧化物自由基的产生中需要渥曼青霉素敏感的PI 3-激酶(Okada,T.等，J.Biol.Chem.269:3563-3567(1994)；Thelen,M.等，Proc.Natl.Acad.Sci.91:4960-4(1994))。
age-1鉴别为PI3-激酶提示，在该持久遗传途径中的其它基因可以在体内鉴别PIP3信号的下游靶。daf-2在持久和衰老上位性途径中在与age-1相同的点起作用(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkun,G.,Genetics137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。DAF-2可能是PIP3,信号(诸如p85或p55的PI 3-激酶调节亚基)的下游正调节靶或上游受体。已经用生化方法检测了PIP3信号的正调节下游靶的候选物(Liscovitch和L.C.Cantley,L.,Cell 77:324-34(1994)；Toker,A.等，The Journalof Bio1ogical Chemistry 269:32358-67(1994)；Akimoto,K.等，The EMBO Journal 15:788-798(1996)；Jones,P.F.等，Proc.Natl.Acad Sci.80:4171-5(1991)；Franke,T.F.等，Cell 81:727-736(1995)；Burgering,B.M.T.和Coffer,P.J.,Nature376:599-602(1995))；通过检测daf基因类似物可能确认这类候选物的体内功能。用生化方法尚未检测到PIP3信号的负调节靶。遗传数据表明，daf-16可能是PIP3信号的负调节靶；daf-16中的突变抑制在我们这里讨论的由于丧失PIP3信号产生的age-1突变体寿命的增加和在持久期的停滞(Vowels,J.J.和Thomas,J.H.,Genetics130:105-123(1992)；Gottlieb,S.和Ruvkum,G.,Genetics137:107-120(1994)；Kenyon,C.等，Nature 366:461-464(1993)；Larsen,P.L.等，Genetics 139:1567-1583(1995)；Dorman,J.B.等，Genetics 141:1399(1995))。这些观察提示，在非停滞的正常衰老生长的条件下，AGE-1的小膜结合PIP3产物负调节DAF-16活性以控制c.elegans的寿命。哺乳动物AGE-1多肽的克隆在我们分离新AGE-1基因和cDNA的基础上，用本文描述的序列和标准技术分离另外的哺乳动物AGE-1核酸序列(包括人AGE-1)成为可能。特别是，用全部的或部分的AGE-1序列，人们可以容易地设计AGE-1寡核苷酸探针，包括简并的寡核苷酸探针(即为所有可能的给定氨基酸序列的编码序列的混合物)。这些寡核苷酸可以基于该DNA的任一条链的序列。分离哺乳动物AGE-1序列的典型探针或引物最好对应于氨基酸的保守区组(block)，例如，图6(SEQ ID NO:1)的氨基酸852-864(IFKNGDDLRQDML)(SEQ ID NO:13)或氨基酸1111-1116(HIDFGH)(SEQ IDNO:14)。例如在Ausubel等，Current Protocols in MolecularBiology,1996,Wiley and Sons，纽约，NY；和Guide to MolecularCloning Techniques,1987,S.L.Berger和A.R.Kimmel编辑，Academic Press,New York中，提供了设计和制备这类探针的一般方法。这些寡核苷酸可用于AGE-1基因分离，或者将它们用作与AGE-1互补序列杂交的探针，或作为各种聚合酶链式反应(PCR)克隆策略的引物。如果利用PCR方法，可选地设计所述引物，以允许将扩增的产物克隆入适当的载体。
杂交技术和方法对那些本领域技术人员是公知的，并且已经例如在Ausubel等，同上，和Guide to Molecular Cloning Techniques,同上进行了描述。如果需要，可以将不同的寡核苷酸探针的组合物用于重组DNA文库的筛选。用本领域已知的方法将寡核苷酸例如用32P标记，并且用可检测标记的寡核苷酸探测来自重组DNA文库的滤膜影印物。可以按照本领域已知的方法，如Ausubel等(同上)描述的方法，制备重组DNA文库(例如，人cDNA文库)，或可以从商业来源获得。
为了检测或分离密切相关的AGE-1序列，可以使用高严格性杂交条件；这类条件包括在大约42℃和大约50％甲酰胺下杂交；第一次洗涤在大约65℃、大约2×SSC和1％SDS下进行；接着在大约65℃和大约0.1％SDS、1×SSC下进行第二次洗涤。本文描述的、检测与AGE-1基因具有较少上位性的AGE-1基因的较低严格性条件包括，例如在大约42℃在缺失甲酰胺下杂交；在大约42℃、大约6×SSC和大约1％SDS下进行第一次洗涤；并且在大约50℃、大约6×SSC和大约1％SDS下进行第二次洗涤。
如以上讨论，在PCR克隆策略中，可以将AGE-1寡核苷酸用作引物。这类PCR方法是本领域公知，并且例如在PCR Technology,H.A.Erlich编辑，Stockton Press,London,1989；PCR Protocols:AGuide to Methods and Applications,M.A.Innis,D.H.Gelfand,J.J.Sninsky和T.J.White编辑，Academic Press,Inc.，纽约，1990；和Ausubel等，同上中进行了描述。此外，最好是将对应于AGE-1序列中保守区的序列(例如，以上描述的那些区域)用来分离哺乳动物AGE-1序列。AGE-1多肽的表达通常，可以通过用适当表达载体中的全部或部分的AGE-1编码cDNA片段(如，以上描述的cDNA的一个)转化适当的宿主细胞，产生按照本发明的AGE-1多肽。
那些分子生物学领域的技术人员会理解，可以将任何种类繁多的表达系统用于提供该重组蛋白。所用的准确的宿主细胞对于本发明不是决定性的。可以在原核生物宿主(如，大肠杆菌)中，或在真核生物宿主(如，酿酒酵母；昆虫细胞，如Sf9或Sf21细胞；或哺乳动物细胞，如COS1、NIH 3T3或HeLa细胞)中产生该AGE-1多肽。可从广泛的来源获得这类细胞(如美国典型培养物保藏中心，Rockland,MD；也可参见如Ausubel等，同上)。转化和转染的方法和表达载体的选择将取决于选择的宿主系统。如Ausubel等(同上)中描述了转化和转染的方法；可以从如Cloning Vectors:A Laboratory Manual(P.H.Pouwels等，1985，增刊，1987)中提供的载体中选择表达载体。
一个推荐的表达系统是杆状病毒系统(例如，用Sf9细胞和Ausubel等(同上)的方法)。另一杆状病毒系统利用载体pBacPAK9并可从Clontech(Palo Alto,CA)获得。
或者，例如用稳定转染的哺乳动物细胞系，在哺乳动物系统中产生AGE-1多肽。公众可获得适用于稳定转染哺乳动物细胞的多种载体，如参见Pouwels等，同上；构建这类细胞系的方法也是公众可获得的，如在Ausubel等，同上中。在一个实施例中，将编码AGE-1蛋白的cDNA克隆到包括二氢叶酸还原酶(DHFR)基因的表达载体中。通过在细胞培养基中包含0.01-300μM的氨甲喋呤，选择整合到宿主细胞染色体的该质粒，并因此选择整合到宿主细胞染色体的该AGE-1蛋白编码基因(如在Ausubel等同上中描述的方法)。可以在大多数细胞类型中完成该显性选择。可以通过DHFR-介导的转染基因的扩增，增加重组蛋白的表达。在Ausubel等(同上)中描述了携带基因扩增物的选择细胞系的方法；这些方法通常涉及在含逐渐增加的氨甲喋呤水平的培养基中时间延长的培养。通常用于该目的的含DHFR的表达载体包括pCVSEⅡ-DHFR和pAdD26SV(A)(在Ausubel等，(同上)中描述)。在宿主细胞中，以上描述的任何宿主细胞或最好是DHFR-缺陷型CHO细胞系(如CHO DHFR-细胞，ATCC登记号为CRL9096)推荐用于稳定转染的细胞系的DHFR选择或DHFR-介导的基因扩增。
在其它可选择的方法中，在体内或最好是在体外用T7系统产生该AGE-1多肽(参见例如Ausubel等(同上)或其它标准技术)。
一旦表达了重组AGE-1蛋白，则用亲和层析分离AGE-1蛋白。在一个实施例中，可以将抗AGE-1蛋白抗体(如按本文描述产生的)结合于柱子上并用于分离AGE-1蛋白。在亲和层析前，可以通过标准方法裂解和分级分离包含AGE-1蛋白的细胞(参见如Ausubel等，同上)。
一旦分离该重组蛋白，如果需要，可以例如通过高效液相层析(参见例如Fisher,Laboratory Techniques In Biochemistry AndMolecular Biology，编辑，Work and Burdon,Elsevier,1980)将该重组蛋白进一步纯化。
可以通过化学合成产生本发明的多肽，特别是短的AGE-1多肽片段(如通过在Solid Phase Peptide Synthesis，第二版，1984 ThePierce Chemical Co.,Rockford,IL中描述的方法)。
可以将多肽表达和纯化的这些一般技术用于产生和分离有用的AGE-1片段和类似物(本文描述的)。抗AGE-1抗体用以上描述的AGE-1多肽，如以下方法产生抗AGE-1抗体。将编码氨基酸1089-1164的AGE-1 cDNA片段与GST融合，并用标准技术在大肠杆菌中生产融合的蛋白。然后也通过标准技术在谷胱甘肽柱上纯化融合蛋白，并用于免疫兔子。然后将获得的抗血清本身通过Finney和Ruvkun(Cell 63:895-905,1990)的方法在GST-AGE-1亲和柱上纯化。蛋白质印迹显示，该抗血清特异性地鉴别GST-AGE-1。
可以通过这种或替代技术产生其它AGE-1-特异性抗体。例如，可以将本文描述的AGE-1多肽(或免疫原性片断或类似物)用于产生其它多克隆抗血清或单克隆抗体；AGE-1的氨基酸550至965代表一个特别供选择的免疫原性片段。通过重组技术或肽合成技术产生用于抗体生产的多肽(参见例如Solid Phase Synthesis,同上；Ausubel等，同上)。
对于多克隆抗血清，如果需要，可以将所述的肽与诸如Ausubel等(同上)描述的KLH之类的载体蛋白偶联。将该KLH-肽与弗氏佐剂混合，并注射到豚鼠、大鼠或最好是兔子体内。可以通过任何肽抗原亲和层析的方法纯化抗体。
或者，可以用AGE-1多肽(或免疫原性片段或类似物)和标准杂交瘤技术(例如参见Kohler等，Nature 256:495,1975；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:511,1976；Kohler等，Eur.J.Immunol.6:292,1976；Hammerling等，Monclone Antibodies and T Cell Hybridomas,Elsevier,NY,1981；Ausubel等，同上)制备单克隆抗体。
一旦产生多克隆抗体或单克隆抗体，则通过蛋白质印迹或免疫沉淀分析(通过在Ausubel等，同上中描述的方法)，测试多克隆抗体或单克隆抗体的特异性AGE-1识别。特异性地识别AGE-1的抗体被认为是在本发明中有用的抗体；这类抗体可以用于例如测定或监测哺乳动物产生的AGE-1水平的免疫分析，或筛选调制AGE-1产生的化合物的免疫分析。也可以将抗AGE-1抗体用于鉴别表达该AGE-1基因的细胞。
从AGE-1无义等位基因m333和mg44(以上描述)获得的样品为抗血清特异性提供有用的阴性对照。调制AGE-1表达或活性的分子的鉴定和给予AGE-1 cDNA的分离和它与衰老进程相关的知识也促进了降低AGE-1表达或活性的分子(即AGE-1拮抗剂)的鉴定。按照一种方法，在向AGE-1-表达细胞的培养基中加入拮抗分子后测定AGE-1表达。或者，可以将候选拮抗剂直接给予动物(例如线虫或小鼠)并用于筛选拮抗剂。
然后，例如通过标准的RNA印迹分析(Ausubel等，同上)，用AGE-1核酸(或片段)作为杂交探针测定AGE-1的表达。将在存在候选物分子时的AGE-1表达水平与对在相同培养基或测试动物中的相同细胞、但在缺乏候选物分子时测定的水平比较。推荐的用于抗衰老的调制剂是那些导致AGE-1表达降低的调制剂。
或者，用同样的一般途径与标准免疫学检测技术的组合(如蛋白质印迹或与AGE-1-特异性抗体(例如本文描述的AGE-1抗体)的免疫沉淀)，在AGE-1蛋白产生水平测定候选调制剂对表达的影响。此外，有用的抗衰老调制剂鉴定为那些导致AGE-1多肽产生降低的调制剂。
候选调制剂将可以是纯化的(或基本纯化的)分子，或可以是化合物混合物(如得自细胞的抽提物或上清液)的一个成分。在混合的化合物的分析中，针对逐步缩小的候选化合物库(如通过诸如HPLC或FPLC的标准纯化技术产生的；Ausubel等，同上)测试AGE-1表达，直至证明单个的化合物或最少的化合物混合物调制AGE-1表达。
或者，或另外，可以筛选那些拮抗天然的或重组AGE-1活性的候选化合物。在推荐的方法中，将存在候选化合物时或用候选化合物处理后的激酶活性(例如PI3-激酶活性)与在等同条件下缺乏该化合物时的活性比较。此外，这种筛选可以用候选化合物库开始，从中以分步方式分离一个或多个有用的调制剂化合物。
通过任何标准测定可以测定激酶活性，例如可以通过在TLC平板上监测该酶将32P-ATP转移至PIP底物的能力(如例如由Whitman等，Nature322:644-646,1988描述的)测定激酶活性，或可以通过Kimura等(J.Biol.Chem.269:18961-18967,1994)的方法测定激酶活性。如果需要，在分析活性前，例如通过与AGE-1-特异性抗体的免疫沉淀，可以从样品中分离该酶。本文描述的AGE-1突变体(例如mg44、m333和mg109)在这些体外测定中已降低活性，并且可以作为对照样品使用。
候选AGE-1拮抗剂包括肽和非肽分子(如例如在细胞抽提物、哺乳动物血清或已培养哺乳动物细胞的生长培养基上发现的肽或非肽分子)。因为最可能的AGE-1底物是PIP2及其产物PIP3，所以模拟PIP2和PIP3之间转换状态的药物(所谓的转换类似物)是下调AGE-1-介导的PIP3合成并且因此增加寿命的好候选物。因为AGE-1底物和产物均是膜结合分子，所以干扰AGE-1作用的药物可以是疏水性的、降低或消除通常与膜通透性有关的问题。
可以证实发现在细胞AGE-1表达或活性水平上有效的拮抗剂在动物模型(例如线虫或小鼠)中有用。
促进AGE-1表达降低或AGE-1活性降低的分子被认为在本发明中特别有用；可以将这种分子用作例如降低天然的细胞AGE-1水平或活性并因此增加该宿主动物(例如人)的寿命的治疗。
可以将治疗用的AGE-1拮抗剂与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂以单位剂量形式混合。可以使用常规的药学规程以提供给予病人AGE-1的适当的制剂或组合物。虽然最好是静脉注射，但是可以采用任何合适的给药途径，例如胃肠外、皮下、肌内、颅内、眼眶内、眼、心室内、囊内、脊柱内、脑池内、腹膜内、鼻内、气雾剂或口服给予。治疗制剂可以为液体溶液或悬液的形式；对于口服给药，制剂可以为片剂或胶囊形式；而对于鼻内制剂，可以为散剂、滴鼻剂或气雾剂形式。
在例如“Remington’s Pharmaceutical Sciences.”中可找到制备制剂的本领域公知的方法。胃肠外给药的制剂可以包含例如赋形剂、无菌水或盐水、诸如聚乙二醇的聚烷二醇、植物来源的油或氢化萘。可以使用生物相容的、生物可降解的丙交酯聚合物、丙交酯/乙交酯共聚物或聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物以控制所述化合物的释放。AGE-1拮抗剂的其它潜在有用的胃肠外传递系统包括乙烯-乙酸乙烯酯共聚物颗粒、渗透泵、可移植灌注系统和脂质体。吸入制剂可以包含诸如乳糖的赋形剂，或可以是含例如聚氧乙烯-9-月桂醚、甘胆酸盐和脱氧胆酸盐的水溶液，或可以是以滴鼻剂或凝胶形式给予的油性溶液。
如果需要，可以将采用AGE-1拮抗剂的治疗与任何其它抗衰老治疗联合应用。AGE-1杀虫剂也可以将AGE-1拮抗剂用作新的杀虫剂，例如以控制昆虫或线虫。因为AGE-1控制滞育，可以将拮抗其作用的化合物用于不合时宜地触发滞育，伴随进食行为和繁殖的中止(Tauber等，SeasonalAdaptation of Insects,1986,New York,NY,Oxford UniversityPress，第411页)。这类以无脊椎动物滞育事件为靶的杀虫剂对于增加农业产量是有用的，同时对人类健康的危害比通常基于神经递质的杀虫剂更小。寿命的测定由于AGE-1多肽和核酸序列在衰老中的作用，因此它们对于测定有机体(例如人)寿命是有用的。特别是，因为降低AGE-1与增加寿命相关，AGE-1产生水平或活性的降低提供宿主有机体衰老将更缓慢或寿命增加的指示。可以通过任何标准技术分析AGE-1表达或其活性的水平。
例如，可以通过标准RNA印迹分析监测生物学样品中的表达，或可以通过PCR帮助监测(例如参见Ausubel等，同上；PCR Technology:Principles and Applications for DNA Amplification，编辑，H.A.Ehrlich,Stckton Press,NY)。
或者，可以将免疫测定用于检测或监测AGE-1蛋白水平。可以将AGE-1特异性的多克隆或单克隆抗体(如以上描述产生的)用于任何标准的免疫测定程式(如ELISA、蛋白质印迹或RIA测定)，以测定AGE-1多肽水平；再与野生型AGE-1水平比较，而AGE-1产生的降低是寿命增加的指示。如在Ausubel等，同上中描述了免疫测定的实例。免疫组化技术也可以用于AGE-1检测。例如，可以从个体获得组织样品，用抗AGE-1抗体和任何标准检测系统(如包括与辣根过氧化物酶结合的二级抗体的检测系统)将切片染色，以检测AGE-1的存在。在如Bancroft和Stevens,Theory and Practice of HistologicalTechniques,Churchill Livingstone,1982和Ausubel等，同上中可以找到与这类技术有关的一般指导。
错配检测分析也提供检测AGE-1突变并因此测定寿命的机会。可以将该类型的方法用于在产前筛选中检测AGE-1变异。
最后，可以使用联合方法，以评价AGE-1蛋白产生(例如通过免疫学技术)开始，并且也包括设计来鉴别更多细微AGE-1突变(例如点突变)的基于核酸的检测技术。对于那些本领域的技术人员而言，可以应用多种标准的错配检测分析，并且可以使用任何推荐的技术。通过该方法，可以检测在AGE-1中或者导致AGE-1表达丧失或者AGE-1生物学活性丧失的突变。在该联合方法的变化中，用任何适当的激酶分析系统(如Whitman等，Nature 322:644-646(1988)；或Kimura等，J.Biol.Chem.269:18961-18967(1994)的分析)测定作为激酶活性的AGE-1活性(而不是产生)。AGE-1互作多肽AGE-1序列的分离也促进与该AGE-1蛋白互作的多肽的鉴定。通过任何标准的双杂种系统分离编码这类多肽的序列(例如参见Fields等，Nature 340:245-246(1989)；Yang等，Sciences 257:680-682(1992)；Zervos等，Cell 72:223-232(1993))。例如，可以将全部或部分的该AGE-1序列融合到DNA结合域(如GAL4或LexA DNA结合域)。确定该融合蛋白本身不激活携带适当的DNA结合位点的报道基因(例如lacZ或LEU2报道基因)的表达后，将该融合蛋白用作相互作用靶。然后将与激活域(例如酸性激活域)融合的候选互作蛋白与AGE-1融合物在宿主细胞中共表达，并且通过其接触AGE-1序列并刺激报道基因表达的能力鉴别互作蛋白。通过用与相同激活域融合的非相关测试蛋白(或，如果需要，为更多组的这类测试者蛋白)实施对照实验，消除假阳性相互作用。
一旦鉴别了AGE-1蛋白-蛋白的相互作用，可以筛选破坏该相互作用的化合物。这些化合物为AGE-1拮抗剂提供好候选物，并且可以通过任何以上描述的方法测试和证实。可以将通过该方法鉴别的化合物用于任何上述目的。
其它实施方案在其它实施方案中，本发明包括与图6(SEQ ID NO:1)的AGE-1多肽基本相同的任何蛋白；这类同系物包括基本纯化的天然存在的其它哺乳动物AGE-1多肽(例如人AGE-1多肽)以及等位基因变异体；天然突变体；诱导的突变体；在高严格条件下，或其次的，在低严格条件下(如在2×SSC、40℃下洗涤，用长度至少为40个核苷酸的探针)由与图4(SEQ ID NO:2)的AGE-1 DNA序列杂交的DNA编码的蛋白；以及针对AGE-1多肽的抗血清特异性结合的蛋白。
本发明还包括任何天然存在的AGE-1多肽的类似物。类似物可以由于氨基酸序列的差异、由于翻译后修饰或由于二者，而与天然存在的AGE-1蛋白不同。本发明的类似物通常会显示与天然存在的AGE-1氨基酸序列的同一性至少为50％，更优选为60％，而最优选为85％或甚至95％。修饰包括多肽在体内和在体外的化学衍生，如乙酰化、羧化、磷酸化或糖基化；这类修饰可以发生在多肽合成或加工期间或用分离的修饰酶处理后。类似物也可以由于一级序列的改变而与天然存在的AGE-1多肽不同。这些包括天然的和诱导的(例如通过辐射或暴露于ethanemethylsulfate或通过Sambrook、Fritsch和Maniatis(Molecular C1oning:A Laboratory Manual(第二版)，CSH Press)或Ausubel等(同上)描述的位点特异性诱变导致随机诱变产生的遗传变异体。也包括包含诸如D-氨基酸的非L-氨基酸残基、或诸如β或γ氨基酸的非天然存在的或合成的氨基酸的环化肽、分子和类似物。
除了全长多肽，本发明也包括AGE-1多肽片段。本文使用的术语“片段”指至少20个相邻氨基酸，优选至少30个相邻氨基酸，更优选至少50个相邻氨基酸，而最优选至少60至80个或更多的相邻氨基酸。可以通过本领域技术人员公知的方法产生AGE-1多肽的片段，或可以从正常蛋白加工获得(如从新生多肽中除去生物学活性不需要的氨基酸，或通过可选择的RNA剪接或可选择的蛋白质加工事件除去氨基酸)。推荐的按照本发明的片段包括但不限于图6(SEQ ID NO:1)的氨基酸387-641、387-1146、1-130、1-150、1-658或1-404。
对于某些目的，可以将该AGE-1多肽的全部或部分序列与另一蛋白融合(例如通过重组方法)。在一个实施例中，可以将AGE-1与绿荧光蛋白GFP(Chalfie等，Sciences 263:802-805,1994)融合。这种融合蛋白对于例如体内监测用候选的或已知的拮抗剂处理后AGE-1表达水平(例如通过荧光显微镜)是有用的。
可以将本发明的方法用于测定任何动物(例如人、宠物或家畜)的寿命或筛选AGE-1调制化合物。当处理或诊断非人类哺乳动物时，该AGE-1多肽、核酸或抗体最好是对该物种特异性的。
在本说明书中提到的全部出版物和专利申请通过引用结合到本文中，其程度就象具体地和分别表示每个独立的出版物或专利申请通过引用结合到本文中一样。
其它的实施方案在以下的权利要求中。
权利要求
1．基本纯的AGE-1多肽或其片段制剂，所述多肽具有与图6(SEQID NO:1)的多肽至少50％的氨基酸序列相同。
2．权利要求1的多肽，其中所述AGE-1多肽包括在相同位置上与图6(SEQ ID NO:1)的以下氨基酸相同的氨基酸G1y-32、Leu-73、His-78、Phe-8、Glu-109、Phe-114、Leu-123、Leu-125、Phe-129、Lys-181、Ser-208、Lys-211、Arg-321、Leu-325、Leu-351、Ser-355、Met-373、Leu-381、Leu-393、Thr-432、Tyr-451、Glu-475、Pro-507、Ile-514、Gly-518、Glu-530、Val-538、Leu-582、Tyr-606、Pro-643、Phe-665、Leu-744、Leu-745、Arg-762、Leu-789、Arg-794、Ala-827、Arg-829、Trp-835、Ser-842、Asn-905、Gly-917、Asp-975、Ile-990、Asp-1006、His-1020、Lys-1104、Thr-1105、Gly-1130、Phe-1140和Lys-1144。
3．权利要求1的多肽，其中所述AGE-1多肽在等同的氨基酸827包括丙氨酸。
4．权利要求1的多肽，其中所述AGE-1得自动物。
5．权利要求4的多肽，其中所述动物是C.elegans。
6．权利要求4的多肽，其中所述动物是哺乳动物。
7．权利要求6的多肽，其中所述哺乳动物是人。
8．编码权利要求1的AGE-1多肽的纯化DNA。
9．包含AGE-1核酸序列的纯化DNA，它与图4(SEQ ID NO:2)核酸序列至少有30％相同。
10．包含AGE-1核酸序列的纯化DNA，其中所述DNA序列选自与图4(SEQ ID NO:2)的核苷酸64至852、核苷酸865至912、核苷酸919至975、核苷酸1003至3090、核苷酸3094至3501或核苷酸2620至2655基本相同的核酸序列。
11．包含权利要求8、9或10的纯化AGE-1 DNA的载体。
12．包含权利要求8、9或10的纯化AGE-1 DNA的细胞。
13．产生重组AGE-1多肽的方法，所述方法包含以下步骤(a)提供用权利要求8、9或10的DNA转染的细胞，所述DNA编码在所述细胞中表达定位的AGE-1多肽；(b)在表达所述DNA的条件下培养所述转染细胞；以及(c)分离所述重组AGE-1多肽。
14．按照权利要求13的方法产生的重组AGE-1多肽。
15．特异性地识别并与AGE-1多肽结合的基本纯的抗体。
16．鉴定能降低AGE-1基因表达的AGE-1调制化合物的方法，所述方法包含以下步骤(a)提供表达权利要求8、9或10的AGE-1 DNA的细胞；以及(b)将所述细胞与候选化合物接触，与所述候选化合物接触后AGE-1表达的降低鉴定调制化合物。
17．鉴定能降低AGE-1活性的AGE-1调制化合物的方法，所述方法包含以下步骤(a)提供表达AGE-1多肽的细胞；和(b)将所述细胞与候选化合物接触，与所述候选化合物接触后AGE-1表达的降低鉴定调制化合物。
18．权利要求16或17的方法，其中所述AGE-1基因编码与图6(SEQ ID NO:1)显示的氨基酸序列至少有50％相同的氨基酸序列，或AGE-1多肽包括与图6(SEQ ID NO:1)显示的氨基酸序列至少有50％相同的氨基酸序列。
19．权利要求16或17的方法，其中所述AGE-1基因或AGE-1多肽来自动物。
20．权利要求16或17的方法，其中所述方法在线虫或其它动物中实施。
21．权利要求16或17的方法，其中所述方法涉及在体外分析AGE-1活性。
22．通过权利要求16或17的方法鉴定的AGE-1调制化合物。
23．增加哺乳动物寿命的方法，所述方法包含给予哺乳动物治疗有效量的权利要求22的化合物。
24．测定动物寿命的方法，包括在来自所述动物的样品中测定AGE-1基因表达或AGE-1活性，相对于野生型样品的AGE-1表达或活性的降低指示所述动物寿命增加。
25．权利要求24的方法，其中所述动物是哺乳动物。
26．权利要求24的方法，其中所述哺乳动物是人。
27．权利要求24的方法，其中通过分析所述样品中AGE-1多肽的量测定AGE-1基因表达。
28．权利要求24的方法，其中所述方法涉及分析激酶活性。
全文摘要
公开了基本纯的AGE－1多肽和编码这些多肽的纯化DNA、载体和细胞。也公开了用所述AGE－1序列测定寿命和分离类似物的方法。
文档编号A61P43/00GK1232497SQ97198399
公开日1999年10月20日 申请日期1997年8月7日 优先权日1996年8月7日
发明者G·鲁弗昆, J·莫里斯, H·蒂森鲍姆 申请人:综合医院公司