重新构建的人抗hm1.24抗体的制作方法

专利名称：重新构建的人抗hm1.24抗体的制作方法
技术领域：
本发明涉及重新构建的人抗HM1.24抗体和嵌合的抗HM1.24抗体及其编码基因，生产所述抗体的方法以及所述抗体的用途。本发明的重新构建的人抗体和嵌合抗体可用作药剂，例如用于骨髓瘤。
背景技术：
人B细胞经过各种根据表达的表面抗原种类分类的分化过程，并最终发育成熟为产生抗体的浆细胞。在其分化的最后阶段，一方面，B细胞获得产生胞质免疫球蛋白的能力，另一方面诸如细胞表面免疫球蛋白、HLA-DR、CD20、Fc受体、补体C3受体等的B细胞相关的抗原消失(Ling,N.R.等，Ⅲ型白细胞(1986)第320页，Oxford,UK,Oxford)。
目前，已有对于诸如抗PCA-1(Anderson,K.C.等，免疫学杂志(1983)130,1132)，抗PC-1(Anderson,K.C.等，免疫学杂志(1983)132,3172)，抗MM4(Tong,A.W.等，血液(1987)69,238)等的单克隆抗体识别浆细胞膜上的抗原的报道。但是，抗CD38单克隆抗体仍然用于检测浆细胞和骨髓瘤细胞(Epstein,J.等，新英格兰医学杂志，(1990)322,664,Terstappen,L.W.M.M.等，血液(1990)76,1739,Leo,R.等，血液学年鉴(1992)64,132,shimazaki,C.等，美国血液学杂志(1992)39,159,Hata,H.等，血液(1993)81,3357,Harada,H.等，血液(1993)81,2658,Billadeau,D.等，实验医学杂志(1993)178,1023)。
然而，抗CD38单克隆抗体是与T细胞激活相关的抗原而不是与B细胞分化相关的抗原，并且在包括除B细胞的多种细胞上表达。此外，尽管CD38在一些淋巴浆细胞样细胞(lymphoplasmacytoid)上不表达，但是在造血前身细胞上大量表达。因此，认为抗CD38单克隆抗体不适宜用于研究人B细胞的分化和成熟或用于治疗浆细胞疾病。
Goto,T等已报道了识别在B细胞系上特异表达具有29至33Kda分子量的抗原的小鼠抗HM1.24抗体(血液(1994)84,1922-1930)。事实上认为抗HM1.24单克隆抗体识别的抗原与B细胞的终末分化相关(Goto,T.等，日本临床免疫学杂志(1992)16,688-691)，并且对浆细胞瘤移植的小鼠施用抗HM1.24抗体导致抗体在肿瘤处特异积累(shuji Ozaki等，第19次日本骨髓瘤研究大会会议集，总演讲3)，因此建议放射性同位素标记的抗HM1.24抗体可用于诊断肿瘤位置，导弹治疗如放射免疫治疗等。
此外，上述的血液杂志描述了抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞系RPMI8226有补体依赖的细胞毒性活性。
骨髓瘤是肿瘤疾病，其特征在于单克隆浆细胞(骨髓瘤细胞)聚集在骨髓中。骨髓瘤是这样的一种疾病，其中产生和分泌免疫球蛋白或浆细胞的终末分化的B细胞主要在骨髓中呈单克隆增加，并且因此在血清中可测出单克隆免疫球蛋白或其组成成份，L链或H链(Masaakikosaka等，Nippon Rinsho(1995)53,91-99)。
常规化疗剂已用作治疗骨髓瘤，但未发现可以引起骨髓瘤减少和延长骨髓瘤病人存活期的有效治疗试剂。因此，长期以来骨髓瘤有治疗效果的药物的出现。
小鼠单克隆抗体在人体中有高免疫原性(有时称作“抗原性”需要对。于是，小鼠单克隆抗体在人类中的医用治疗价值受到限制。例如，给人体施用的小鼠抗体可能被作为外源物质代谢掉，致使人体中的小鼠抗体半衰期相对较短，因此不能充分发挥其预期效果。此外，对施用的小鼠抗体有抗性的人抗小鼠抗体可能引起对病人有害和危险的免疫应答，如血清疾病，其它过敏反应等。因此，不能经常给人类施用小鼠单克隆抗体。
为解决上述问题，已开发了减少诸如鼠源单克隆抗体的非人源抗体的免疫原性的方法。如这样一个例子，有一种生产嵌合抗体的方法，其中抗体可变区(V区)来自鼠，而其恒定区(C区)来自适当的人抗体。
因为这样获得的嵌合抗体包含完整形式的原始的小鼠抗体的可变区，预期具有与原始人鼠抗体一样的与抗原结合特异性。此外，嵌合抗体中非人源的氨基酸序列的比率大大减少，因此预期抗体与原始的小鼠抗体相比有低免疫原性。嵌合抗体以与原始小鼠单克隆抗体相同的方式结合抗原，并且尽管减少了免疫原性，但可能包括针对小鼠可变区的免疫应答(LoBuglio,A.F.等，美国国家科学院院报，86,4220-4224,1989)。
尽管减小小鼠抗体免疫原性的第二种方法更复杂得多，但可以进一步显著减小小鼠抗体的潜在免疫原性。在此方法中，仅将小鼠抗体可变区的互补决定区(CDR)移植到人抗体的可变区以制备“重新构建的”人抗体可变区。
然而，为使重新构建的人抗体可变区的CDR的结构尽可能与原始的小鼠抗体的CDR结构相似，如果需要，可将支持CDR的构架区(FR)氨基酸序列的一部分从小鼠抗体的可变区移植到人抗体的可变区。然后，将人源化重新构建的人抗体的这部分V区连接到人抗体的恒定区。最后在重新构建人源化抗体中来自非人源氨基酸序列的部分是CDR和FR的一部分。CDR是由不表现种特异序列的高度可变的氨基酸序列构成的。因此，携带小鼠CDR的人源化抗体不应比具有人抗体CDR的天然人抗体的免疫原性强。
对于人源化抗体，参见Riechmann,L.等，自然，332,323-327,1988；Verhoeye,M.等，科学，239,1534-1536,1988；Kettleborough,C.A.等，蛋白质工程，4,773-783,1991；Meada,H.等，人抗体和杂交瘤，2,124-134,1991；Groman,S.D.等，美国国家科学院院报，88,4181-4185,1991；Tempest,P.R.等，生物/技术，9,266-271；1991；Co,M.S.等，美国国家科学院院报，88,1869-2873,1991；Carter,P.等，美国国家科学院院报，89,4285-4289,1992；Co,M.S.等，免疫学杂志，148,1149-1154,1992；及Sato,K.等，癌症研究，53,851-856,1993。
Queen等(国际申请公开号WO90-07861)描述了一种生产人源化抗体，抗IL-2受体抗体抗Tac的方法。然而，即使按照WO90-07861所述的方法也难以将所有抗体完全人源化。因此，WO90-07861没有描述人源化抗体的通用方法，而仅仅描述了一种将抗IL-2受体抗体之一抗Tac抗体人源化的方法。此外，即使完全按照WO90-07861的方法，也难以制备具有与原始小鼠抗体完全相同活性的人源化抗体。
通常，每个抗体的CDR/FR氨基酸序列是不同的。因此，对于人源化抗体的构建将要替代的氨基酸残基的确定和可替代上述氨基酸残基的氨基酸残基的筛选随特定抗体变化。所以，如WO90-07861所述的制备人源化抗体的方法不能应用于所有抗体的人源化。
Queen等，美国国家科学院院报，(1989)86,10029-10033具有与WO90-07861相似的公开内容。此文献描述了根据如WO90-07861所述的方法生产的人源化抗体仅得到原始小鼠抗体的三分之一活性。换句话说，这表明WO90-07861的方法本身不能生产与原始小鼠抗体活性相同的完全人源化抗体。
Co等，癌症研究(1996)56,1118-1125由上述的Queen等的研究组公开。此文献描述了即使根据WO90-07861所述的生产人源化抗体的方法也不能构建与原始小鼠抗体活性相同的人源化抗体。因此，事实不仅表明WO90-07861方法本身不能生产与原鼠抗体活性相同的完全人源化抗体，而且表明如WO90-07861所述的构建人源化抗体的方法不能应用于所有抗体的人源化。
Ohtomo等，分子免疫学(1995)32,407-416描述了小鼠ONS-M21抗体的人源化。此文献揭示了用于WO90-07861中抗Tac抗体人源化的氨基酸残基与活性无关并且不能使用如WO90-07861所述的方法。
Kettleborough等，蛋白质工程(1991)4,773-783公开了通过替代氨基酸残基从小鼠抗体构建几个人源化抗体。但是，需要替代的氨基酸残基比如WO90-07861所述的抗Tac抗体的人源化方法中建议的多。
前述文献表明WO90-07861所述的生产人源化抗体的方法是仅适用于其中所述抗Tac抗体的技术并且即使使用该技术也不产生与原始小鼠抗体相同的活性。
这些文献中所述的原始小鼠抗体具有不同于WO90-07861中所述的抗Tac抗体的氨基酸序列。于是，能用于抗Tac抗体的构建人源化抗体的方法不能用于其它抗体。相似地，因为本发明的小鼠抗HM1.24抗体具有不同于抗Tac抗体的氨基酸序列，所以不能使用构建抗Tac抗体的人源化抗体的方法。此外，本发明的成功构建的人源化抗体具有不同于WO90-07861中所述的人源化抗Tac抗体的氨基酸序列。这一事实表明相同方法不能用于具有不同CDR-FR序列的抗体的人源化因此，即使用于人源化的原始小鼠抗体是已知的，也要在反复实验后可证实有活性的人源化抗体的CDR-FR序列的相同性。WO90-07861没有提及本发明所构建的人源化抗体中结合的FR序列以及从与FR、较少的CDR序列的结合得到有活性的人源化抗体这一事实。
如前述的，预期人源化抗体可用于治疗目的，但是人源化的抗HM1.24抗体是未知的或未提及的。此外，没有能普遍适用于任何抗体的人源化抗体生产的标准方法，并且需要用于构建表现足够结合活性、结合抑制活性和中和活性的人源化抗体的各种发明(例如，sato,K.等，癌症研究，53,851-856,1993)。
发明公开内容本发明提供抗HM1.24抗体的重新构建的抗体。本发明还提供在构建所述重新构建的抗体的方法中有用的人/小鼠嵌合抗体。本发明进一步提供重新构建的抗体的片段。此外，本发明提供生产嵌合抗体、重新构建的抗体及其片段的表达系统。本发明进一步提供生产抗HM1.24抗体的嵌合抗体及其片段和抗HM1.24抗体的重新构建的抗体及其片段的方法。
更具体地，本发明提供特异识别具有SEQ ID No:103中所列出的氨基酸序列的多肽的嵌合抗体和重新构建的抗体。将编码所述多肽的cDNA插入pUC19载体的XbaⅠ切割位点间，并制备为质粒pRS38-pUC19。按照布达佩斯条约条款，将包含质粒pRS38-pUC19的大肠杆菌作为大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)于1993年10月5日保存在国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术代理处，MITI(Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki prefecture，日本)并得到保藏号为FERM BP-4434(见日本未审查的专利公开号(Kokai)7-196694)。
作为这种嵌合抗体或重新构建的抗体的一个实施方案，提及了嵌合的抗HM1.24抗体或重新构建的人抗HM1.24抗体。以下将给出嵌合的抗HM1.24抗体或重新构建的人抗HM1.24抗体的详细描述。
因此，本发明还提供包含人轻(L)链恒定区(C区)和抗HM1.24抗体的L链可变(V)区的嵌合L链，以及包含人重(H)链恒定区和抗HM1.24抗体的重(H)链V区的嵌合H链。
本发明进一步提供包含以下部分的嵌合抗体(1)包含人L链C区和抗HM1.24抗体的L链V区的L链；和(2)包含人H链C区和抗HM1.24抗体的H链V区的H链。
本发明进一步包括抗HM1.24抗体的重新构建的人L链V区，包含(1)人L链V区的构架区(FR)和(2)抗HM1.24抗体的L链V区的互补决定区(CDR)；以及抗HM1.24抗体的重新构建的人H链V区，包含(1)人H链V区的FR和(2)抗HM1.24抗体H链V区的CDR。
本发明进一步提供抗HM1.24抗体的重新构建的人L链，包含(1)人L链C区和(2)包含人L链FR和抗HM1.24抗体L链CDR的L链V区；以及抗HM1.24抗体的重新构建的人H链，包含(1)人H链的C区，和(2)包含人H链FR和抗HM1.24抗体的H链CDR的H链V区。
本发明进一步提供抗HM1.24抗体的重新构建的人抗体，包含(A)L链，包含(1)人L链C区和(2)包含人L链的FR和抗HM1.24抗体的L链CDR的L链V区；以及(B)H链，包含(1)人H链C区和(2)包含人H链的FR和抗HM1.24抗体的H链CDR的H链V区。
本发明进一步提供编码抗HM1.24抗体的L链V区的DNA和编码抗HM1.24抗体的H链V区的DNA。
本发明进一步提供编码嵌合L链的DNA，包含(1)人L链C区和(2)抗HM1.24抗体的L链V区；以及编码嵌合H链的DNA，包含(1)人H链C区和(2)抗HM1.24抗体的H链V区。
本发明进一步提供抗HM1.24抗体的重新构建的人L链V区，包含(1)人L链V区的FR和(2)抗HM1.24抗体的L链V区的CDR；以及编码抗HM1.24抗体的重新构建的人H链V区的DNA，此V区包含(1)人H链V区的FR和(2)抗HM1.24抗体的H链V区的CDR。
本发明进一步提供编码抗HM1.24抗体的重新构建的人L链的DNA，包含(1)人L链C区和(2)包含人L链的FR和抗HM1.24抗体L链的CDR的L链V区；以及编码抗HM1.24抗体的重新构建的人H链的DNA，包含(1)人H链C区和(2)包含人H链的FR和抗HM1.24抗体H链的CDR的H链V区。
本发明进一步提供包含任意上述多种DNA的载体。
本发明进一步提供用上述载体转化的宿主细胞。
本发明还提供生产抗HM1.24抗体的嵌合抗体的方法，此方法包括培养用含有编码所述嵌合L链的DNA的表达载体和含有编码所述H链的DNA的表达载体转化的宿主细胞以及回收所需抗体。
本发明进一步提供生产抗HM1.24抗体的重新构建的人抗体的方法，此方法包括培养用含有编述所述重新构建的人L链的DNA的表达载体和含有编码所述重新构建的人H链的DNA的表达载体转化的宿主细胞以及回收所需抗体。
本发明进一步提供包含所述嵌合抗体或重新构建的人抗体的药物组合物，特别是骨髓瘤的治疗剂。
本发明进一步提供含有特异识别具有SEQ ID No:103所列出的氨基酸序列的多肽的嵌合抗体为活性成份的药物组合物，以及含有特异识别具有如SEQ ID No:103所列出的氨基酸序列的多肽的重新构建的人抗体为活性成份的药物组合物。作为药物组合物，特别提供骨髓瘤的治疗剂。
附图简述

图1表示在使用人骨髓瘤细胞系KPMM2的FCM分析中与对照抗体相比，嵌合的抗HM1.24抗体的荧光强度与小鼠抗HM1.24抗体的荧光强度以相似的方式变化。
图2表示在使用WISH细胞的细胞ELISA中，与小鼠抗HM1.24抗体相似的嵌合抗HM1.24抗体抑制生物素酰基化的小鼠抗HM1.24抗体与WISH细胞以剂量依赖方式结合。
图3表示对照的人IgG1或小鼠抗HM1.24抗体没有细胞毒性而嵌合的抗-HM1.24抗体对E/T比例增加的RPMI8226细胞显示细胞素性增强。
图4是通过PCR方式中CDR移植构建的重新构建的人抗HM1.24抗体L链的方法图示。
图5是在制备重新构建人抗HM1.24抗体H链中用PCR方法组装RVH1,RVH2,RVH3和RVH4的寡聚核苷酸的方法图解。
图6是用PCR方法构建人鼠杂交的抗HM1.24抗体H链V区的方法图解。
图7是用PCR方法构建鼠人杂交的抗HM1.24抗体H链V区的方法图解。
图8表示重新构建的人抗HM1.24抗体L链a型具有与嵌合抗HM1.24抗体相同的抗原结合活性。-1和-2表示为不同的批号。
图9表示重新构建的人抗HM1.24抗体和嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性，在重新构建的人抗HM1.24抗体中L链的a型与H链的a,b,f或h型结合。
图10表示重新构建的人抗HM1.24抗体及嵌合的抗HM1.24抗体的结合活性，在重新构建人抗HM1.24抗体中L链的b型与H链的a,b,f或h型结合。
图11表示重新构建的人抗HM1.24抗体及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性，在重新构建的人抗HM1.24抗体中L链的a型与H链的a,b,f或h型结合。
图12表示重新构建的人抗HM1.24抗体及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性，在重新构建的人抗HM1.24抗体中L链的b型与H链的a,b,f或h型结合。
图13表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,b,c和d型，以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图14表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a和e型，以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。-1和-2表示不同的批号。
图15表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,c,p和r型，以及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性。
图16表示人鼠杂交的抗HM1.24抗体，鼠人杂交的抗HM1.24抗体，以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图17表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,b,c或f型，以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图18表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,g型以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图19表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a和g型以及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性。
图20表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的h和I型以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图21表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的f,h和j型以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图22表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的h和I型以及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性。
图23表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的f,h和j型以及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性。
图24表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的h,k,l,m,n和o型以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图25表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,h,p和q型以及嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图26表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的h,k,l,m,n和o型以及嵌合的人抗HM1.24抗体与WISH细胞结合的抑制活性。
图27表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,h,p和q型以及嵌合的抗HM1.24抗体的结合抑制活性。
图28表示重新构建的人抗HM1.24抗体H链的a,c,p和r型和嵌合的抗HM1.24抗体的抗原结合活性。
图29表示重新构建的人抗HM1.24抗体S型与重新构建的人抗HM1.24抗体的r型具有相同的抗原结合活性。
图30表示重新构建的人抗HM1.24抗体的类型与重新构建的人抗HM1.24抗体的r型具有相同的结合抑制活性。
图31表示纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体与嵌合的抗HM1.24抗体具有相同的抗原结合活性。
图32表示纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体与嵌合的抗HM1.24抗体具有相同的结合抑制活性。
图33表示在人骨髓瘤细胞移植的小鼠中，与施用对照人IgG1比较，施用嵌合的抗HM1.24抗体引起存活期的延长。
图34表示将来自健康人外周血的细胞用作效应细胞时，对照人IgG1对KPMM2细胞无细胞毒性并且小鼠抗HM1.24抗体也有弱的细胞毒性，然而重新构建的人抗HM1.24抗体对KPMM2细胞有强的细胞毒性。
图35表示将来自健康人外周血细胞用作效应细胞时，对照的人IgG1对ARH-77细胞无细胞毒性并且小鼠抗HM1.24抗体也有弱的细胞毒性，而重新构建的人抗-HM1.24抗体对ARH-77细胞有强的细胞毒性。
图36表示将来自SCID小鼠的骨髓细胞用作效应细胞时，对照的人IgG1对KPMM2细胞无细胞毒性，而重新构建的人抗HM1.24抗体对KPMM2细胞毒性随抗体浓度的增加而增加。
图37表示在人骨髓瘤细胞移植的小鼠中，施用对照人IgG1后血清IgG水平较施用前水平增加，而施用重新构建的人抗HM1.24抗体抑制血清人IgG水平的增加。
图38表示在人骨髓瘤细胞移植的小鼠中，与施用对照人IgG1比较，施用重新构建的人抗HM1.24抗体会延长存活期。
图39表示在人骨髓瘤细胞移植的小鼠中，与施用前相比施用苯丙氨酸氮芥和对照人IgG1后的血清人IgG水平增加。
图40表示在人骨骨髓瘤细胞移植的小鼠中，与施用苯丙氨酸氮芥或对照人IgG1相比，施用重新构建的人抗HM1.24抗体会延长存活期。
实施本发明的方法1．嵌合抗体的构建(1)编码小鼠抗-HM1.24单克隆抗体V区的DNA的克隆mRNA的制备用如胍超离心方法(Chirgwin,J.M.等，生物化学(1979),18,5294-5299),AGPC方法(Chomczynski,P，等，(1987)162,156-159)等已知方法从收获的骨髓瘤中制备总RNA以便克隆编码小鼠抗-HM1.24单克隆抗体V区的DNA，并可用寡脱氧胸苷酸纤维素离心柱等和mRNA纯化试剂盒等(Pharmacia生产)来制备mRNA。此外，使用QuickPrep mRNA纯化试剂盒(Pharmacia生产)可不经过提取总RNA步骤制备mRNA。
cDNA的制备和扩增用逆转录酶从上述mRNA制备方法中得到的mRNA来合成L链和H链的V区的cDNA。用AMV逆转录酶第一条链cDNA合成试剂盒合成L链V区的cDNA。将适当的引物与抗体基因的前导序列和C区杂交以扩增所合成的cDNA(例如，MKV引物含有SEQ ID No:29至39所示的碱基序列，而MKC引物含有SEQ ID No:40所示的碱基序列)。
通过5’-RACE方法(Frohman,M.A.等，美国国家科学院院报，85,8998-9002,1988,Belyavsky,A.等，核酸研究，17,2919-2932,1989)的PCR(聚合酶链反应)用5’-AmpliFINDER RACE试剂盒(CLONTECH)来合成和扩增H链V区的cDNA。Ampli FINDER Anchor连接到上述合成的cDNA5’-端，并作为扩增H链V区的引物，可以使用与锚定引物(SEQ ID No:77)和小鼠H链(如MHC22引物含有SEQ IDNo:42所示的碱基序列)恒定区(Cr区)杂交的引物。
DNA纯化及其碱基序列的测定用已知方法对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳以分离目的DNA片段，并回收和纯化DNA，然后将其连接到载体DNA中。
用商业试剂盒(如GENECLEAN Ⅱ；BI0101)纯化DNA。可用已知载体DNA(如pUC19,Bluescript，等)保存DNA片段。
用已知的连接反应试剂盒(由Takara Shuzo生产)将上述DNA和DNA载体连接得到重组载体。在筛选氨苄青霉素抗性克隆并根据已知方法制备载体DNA后(J.Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港实验室出版社1989)，将得到的重组载体导入大肠杆菌JM109。在用限制性内切酶消化上述载体DNA后，通过已知方法(如双脱氧方法)测定目的DNA的碱基序列(J.Sambrook等，“分子克隆”，冷泉港实验室出版社，1989)。根据本发明，可以用自动测序系统(DNA测序仪373A；由ABI有限公司生产)。
互补决定区H链V区和L链V区形成抗原结合位点，两者整个结构有相似特征。因而，四个构架区(FR)中每一个构架区与三个高变区即互补性决定区(CDR)连接。FR的氨基酸序列相当保守而CDR区氨基酸序列的变异极高(Kabat,E.A.等，“免疫有关蛋白的序列”，美国健康和人类服务部，1983)。
上述四个FRs的大部分有β-折叠结构导致三个CDR形成环。CDR有时可以形成β折叠结构的一部分。三个CDR在空间上互相靠得很近并形成有配对区的三个CDR的抗原结合位点。
根据这些事实，将小鼠抗HM1.24抗体可变区的氨基酸序列与Kabat等制备的抗体氨基酸序列数据库(“免疫有关蛋白的序列”，美国健康和人类服务中，1983)相比来观察其同源性并可以发现CDR区。
(2)嵌合抗体的表达载体的构建一旦克隆了编码小鼠单克隆抗体L链和H链V区的DNA，通过将这些小鼠V区与编码人抗体恒定区的DNA连接然后通过表达就可以得到嵌合的抗HM1.24抗体。
构建嵌合抗体的基本方法包括连接已克隆的cDNA中的小鼠前导序列和V区序列哺乳动物细胞表达载体中已有的编码人抗C区的序列可选择地，此方法包括先将已克隆的cDNA中小鼠前导序列和V区序列与编码人抗C区的序列连接，然后再连接到哺乳动物的表达载体。
人的抗体C区可以是任何一个H链的C区和任何一个L链的C区。例如，人H链的Cγ1,Cγ2,Cγ3或Cγ4，或L链的Cλ或Cκ。
构建了两种表在载体产生嵌合抗体它们是包含编码在如增强子/启顿动子系统的表达调节区控制下小鼠L链V区和人L链C区的DNA的表达载体，以及包含编码在如增强子/启动子系统的表达调节区控制下小鼠H链V区和人H链C区的DNA的表达载体。然后，用这些表达载体共转化如哺乳动物细胞的宿主细胞，并在体外或体内培养转化细胞以产生嵌合抗体(例如，WO91-16928)。
选择地，将已克隆的cDNA中编码小鼠前导序列和小鼠L链V区和人L链C区的DNA及编码小鼠前导序和小鼠H链V区和人H链C区的DNA导入单表达载体(见国际申请公开号WO94-11523)，并用所述载体转化宿主细胞。然后在体外或体内培养转化的宿主细胞来产生目的嵌合抗体。
1)嵌合的H链的构建通过将编码小鼠H链V区的cDNA导入含基因组CDN或编码人抗体H链C区的cDNA的适当表达载体就可以得到适于嵌合抗体H链的表达载体。所提及的H链C区有例如Cr1,Cr2,Cr2或Cr4。
含Cr基因组DNA的嵌合H链的表达载体的构建可以使用含Cr1为H链C区的基因组DNA的表达载体，例如HFE-PMh-gγl(国际申请公开号WO92/19759)或DHFR-ΔE-RVh-PM1f(国际申请公开号WO92/19759)。
用PCR方法可以导入合适的碱基序列以便将编码小鼠H链V区的cDNA插入这些表达载体中。通过PCR方法用PCR引物可导入这些适当的碱基序列，一个PCR引物设计为其5’末端具有适当的限制性内切酶识别序列并紧接起始密码子前有Kozak保守序列，另一个PCR引物设计为其3’末端具有适当的限制性内切酶识别位点和剪接供体部位，在此部位基因组DNA的初级转录物经适当剪接成为mRNA。
用适当的限制性内切酶处理这样构建的编码小鼠H链V区的cDNA，将其插入到上述表达载体中，就可以构建含Cγ1DNA的嵌合H链表达载体。
cDNA嵌合H链的表达载体的构建按以下步骤可以构建含Cγ1为H链C区的cDNA的表达载体，先从CHO细胞中制备mRNA，其中编码人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区Cr1(N.Takahashi等，细胞29,671-679,1982)的基因组DNA表达载体DHFR-ΔE-RVh-PM1f(国际申请公开号WO92/19759)及编码人源化PM1抗体L链V区和人抗体L链的K链C区的基因组DNA的表达载体RV1-PM1a(国际申请公开号WO92/19759)已整合到此细胞中；通过RT-PCR方法对含人源化PM1抗体H链V区和人抗体H链C区Cr1的cDNA进行克隆，并通过合适的限制性内切酶位点将其连接到动物细胞的适当的表达载体。
用PCR方法导入适当的碱基序列以便将编码小鼠H链V区的cDNA与编码人抗H链C区Cr1直接连接。例如，用PCR引物通过PCR方法可以导入这些适当的碱基序列，一个引物设计为在其5’末端具有适当限制性内切酶识别序列并紧邻起始密码子前为Kozak保守序列，另一个PCR引物设计为其3’末端具有用于H链C区Cr1直接连接反应的适当限制性内切酶的识别序列。
通过用适当限制性内切酶处理这样构建的编码小鼠H链V区的cDNA，将其连接到含H链C区Cγ1的上述cDNA中，并插入如pCOS1或pCHO1的表达载体中就可以构建含cDNA嵌合的H链的表达载体。
2)嵌合抗体的L链的构建通过将编码小鼠L链V区的cDNA与编码人抗体L链C区的基因组DNA或cDNA连接，然后将其导入适当的表达载体中，就可以得到嵌合抗体L链的表达载体。所述的L链C区是例如κ链或λ链。
嵌合L链的κ链cDNA的表达载体的构建用PCR方法可以导入适当的碱基序列以便构建含编码小鼠L链V区的cDNA的表达载体。例如，通过PCR方法用PCR引物可导入这些适当的碱基序列，一个PCR引物设计为在其5’末端具有适当限制性内切酶的识别序列和Kozak共有序列，另一个PCR引物设计为在其3’端具有适当限制性内切酶的识别序列。
从如含基因组DNA的HEF-PM1K-gk(见国际申请公开号WO92/19759)中可以构建与小鼠L链V区连接的人L链C区K链。构建cDNA嵌合抗体的L链κ链的表达载体的方法包括，通过PCR方法在编码L链C区K链的DNA的5’末端或3’末端异入限制性内切酶识别序列，将这样构建的小鼠L链V区和L链C区κ链连接，然后将其插入如pCOS1或pCHO1的表达载体中。
2．重新构建的人抗体的构建(1)设计重新构建的人抗HM1.24抗体的V区小鼠单克隆抗体FR和人抗FR间必须具有高同源性以便构建重新构建的人抗体，其中小鼠单克隆抗体的CDR已移植到人抗体上。因而，使用蛋白质数据库将小鼠抗HM1.24抗体的L链和H链的V区与所有已知结构清楚的抗体V区比较。
小鼠抗HM1.24抗体L链V区与人抗体(HSGⅣ)L链V区Ⅳ亚群最为相似，同源性为66.4％。另一方面，它与HSGⅠ,HSGⅡ和HSGⅢ的同源性分别为56.9％、55.8％和61.5％。
与已知的人抗体L链V区相比，小鼠抗HM1.24抗体的L链V区与人抗体L链V区亚群I中的人抗体REIL链V区有67.0％的同源性。因此，REI的FR用作构建重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的原材料。
设计重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的a型。在此类型中，使人抗体FR和重新构建的人CMPATH-1H抗体的REI为基础的FR相同(见Riekchmann,L.等，自然，322,21-25,(1988)，国际申请公开号WO92-19759中所述的重新构建的人PM-1抗体L链V区模型a含FR)，并使小鼠CDR和小鼠抗HM1.24抗体L链V区中的CDR相同。
小鼠抗HM1.24抗体H链V区与人抗体(HSGⅠ)H链V区的共有序列最相似，其同源性为54.7％。另一方面，它与HSGⅡ和HSGⅢ的同源性分别为34.6％和48.1％。小鼠抗HM1.24抗体H链V区与已知的人抗体H链V区相比时，FR1至FR3与人H链V区亚类Ⅰ中的人抗体HG3H链V区最相似(Rechavi,G.等，美国国家科学院院报，80,855-859)，同源性为67.3％。
因此，人抗体HG3的FR用作构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的原材料。
然而，因为人抗体HG3的FR4的氨基酸序列未公开，所以将与小鼠抗-HM1.24抗体FR4有最高同源性的人抗体JH6的FR4的氨基酸序列(Ravetch,J.V等，细胞，27,583-591)用作FR4。JR6的FR4与小鼠抗HM1.24抗体H链FR4除仅有一个氨基酸不同外，其它氨基酸序列相同。
在重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的第一个模型a中，除了人FR1第30位和人FR3第71位与小鼠抗HM1.24抗体的氨基酸相同，及CDR与小鼠抗-HM1.24抗体H链V区的CDR相同外，使VFR1至FR3与人抗体HG3的FR1到FR3相同。
(2)重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的构建通过CDR移植用PCR方法构建重新构建的人抗HM1.24抗体L链。此方法图解见图4。使用8个PCR引物构建含来自人抗体RE1的FR的重新构建的人抗HM1.24抗体(a型)。将外侧引物A(SEQ ID No:47)和H(SEQ ID No:48)设计为可与HEF载体HEF-VL-gk的DNA序列杂交。
CDR移植引物L1S(SEQ ID No:49),L2S(SEQ ID No:50)和L3S(SEQID No:51)具有正义DNA序列。CDR移植引物L1A(SEQ ID No:52),L2A(SEQ ID No:53)和L3A(SEQ ID No:54)具有反义DNA序列，每个引物分别有引物L1S,L2S和L3S的5’末端DNA序列的互补DNA序列(20至23bp)。
在PCR反应的第一阶段进行四种反应A-L1A,L1S-L2A,L2SA-L3A，及L3S-H并纯化每个PCR产物。第一次PCR的四个PCR产物根据其各身的互补性可相互装配(见WO92-19759)。然后，加入外侧引物A和H扩增编码重新构建的人抗-HM1.24抗体L链V区的全长DNA(第二个PCR)。在上述PCR中，将编码基于人抗体REI源FR的重新构建人ONS-M21抗体L链V区模型a的质粒HEF-RVL-M21a(见国际申请公开号WO95-14041)用作模板。
在PCR的第一阶段，使用了模板DNA和每个引物。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化PCR产物A-L1A(215bp),L1S-L2A(98bp),L2S-L3A(140bp)和L3S-H(151bp)并在第二次PCR中使其装配。在第二次PCR中，使用了第一次PCR产物和每个外侧引物(A和H)。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化来自第二次PCR的516bp DNA片段，经BamHⅠ和HindⅢ消化，并将此得到的DNA片段克隆进HEF表达载体HEF-VL-gk。包含含有重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的正确氨基酸序列DNA片段的质粒在确定其DNA序列后命名为质粒HEF-RVLa-AHM-gk。此质粒HEF-RVLa-AHM-gk所含的L链V区的氨基酸序列和碱基序列见SEQ ID No:9。
通过诱变用PCR可以构建重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的b型。诱变剂引物FTY-1(SEQ ID No:55)和FTY-2(SEQ ID No:56)设计为能使第71位的苯丙氨酸突变为酪氨酸。
在用质粒HEF-RVLa-AHM-gk作为模板扩增以上引物后，纯化最终产物。经BamHⅠ和HindⅢ消化得到的DNA片段克隆到HEF表达载体HEF-VL-gk中可得到质粒HEF-RVLb-AHM-gk。此质粒HEF-RVLb-AHM-gk所含L链V区的氨基酸序列和碱基序列见SEQ IDNo:10。
(3)重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的构建3-1重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a至e型的构建将编码重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的DNA设计如下。通过连接编码人抗体HG3的FRs1至3和人抗体JH6的FR4的DNA序列与编码小鼠抗HM1.24抗体H链V区的CDR的DNA序列，可以得到编码重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的全长DNA。
然后，将HindⅢ识别位点/KOZAK共有序列和BamHⅠ识别位点/剪接供体序列分别添加到此DNA序列的5’末端和3’末端使之可以插入HEF表达载体。
这样设计的DNA序列分为四段寡核苷酸，接着，用计算机分析可以潜在阻碍这些寡核苷酸装配的寡核苷酸的二级结构。
SEQ ID No:57至60列举了RVH1至RVH4的四个寡核苷酸序列。这些寡核苷酸长度为119至144个碱基并有25至26bp重叠区。在这些寡核苷酸中，RVH2(SEQ ID No:58)和RVH4(SEQ ID No:60)含有正义DNA序列而RVH1(SEQ ID No:57)和RVH3(SEQ ID No:59)含的反义DNA序列。通过PCR方法装配这四段寡核苷酸的方法如图所示(见图5)。
使用四段寡核苷酸和作为外侧引物的RHP1(SEQ ID No:60)和RHP2(SEQ ID No:62)进行PCR。
纯化扩增的438bpDNA片段，用HindⅢ和BamHⅠ消化，然后克隆进入HEF表达载体HEF-VH-gγl。包含编码H链V区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒在确定其碱基序列后命名为HEF-RVHα-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHa-AHM-gγl中所含的H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:11所示。
如下构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的b,c,d和e型。在构建每个重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的b至e型中，要构建小鼠抗HM1.24抗体V区的三维结构模型以便预测抗体分子中可替代的氨基酸位置。
用设计将第66位精氨酸突变为赖氨酸的诱变剂引物BS(序列63)和BA(SEQ ID No:64)及质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板通过PCR方法扩增b型来得到质粒HEF-RVHb-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHb-AHM-gγl中所含的H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ IDNo:13所示。
用设计为将第66位精氨酸突变为赖氨酸和第73位苏氨酸突变为赖氨酸的诱变剂引物DS(序列67)和DA(SEQ ID No:68)并以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA通过PCR方法，扩增模型d以得到质粒HEF-RVHd-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHd-AHM-gγl中所含的H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:14所示。
用设计将第67位缬氨酸突变的丙氨酸和第69位蛋氧酸突变为亮氨酸的诱变剂引物ES(序列69)和EA(SEQ ID No:70)并以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，扩增模型e得到质粒HEF-RVHe-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHe-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:15所示。
3-2H链杂交V区的构建通过构建H链杂交V区，可以研究哪一个人源化抗体V区FR与结合活性和结合抑制活性有关。在所构建的两个V区中，一个V区的FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体及FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体(鼠人杂交的抗HM1.24抗体)H链V区的模型a，另一个FR1和FR2的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型及FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体(人鼠杂交的抗HM1.24抗体)。CDR区的氨基酸序列都来自小鼠抗HM1.24抗体。
通过PCR方法可以构建两个H链杂交V区。此方法图解见图6和图7。使用四个引物构建两个H链杂交V区。将外侧引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)设计为能与HEF表达载体HEF-VH-gγl的DNA序列杂交。将H链杂交的构建引物HYS(SEQ ID No:73)设计为含有义DNA序列及H链杂交引物HYA(SEQ ID No:74)设计为含有反义DNA序列以便这些DNA序列相互互补。
在PCR的第一阶段进行用质粒HEF-1.24H-gγl为模板，外侧引物a和H链杂交引物HYA的PCR，及用质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板，H链杂交引物HYA和外侧引物h的PCR来构建H链杂交V区，其中FR1和FR2氨基酸序列来自于小鼠抗HM1.24抗体及FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区模型a，并且纯化每个PCR产物。
第一次PCR的两个PCR产物可根据其自身的互补性进行装配(见国际申请公开号WO92-19759)。然后在第二个PCR阶段通过加入外侧引物a和h扩增编码H链杂交V区的全长DNA，在V区中FR1和FR2的氨基酸序列源自小鼠抗HM1.24抗体及FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区a型。
在PCR的第一阶段进行用质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板，外侧引物a和H链杂交引物HYA的PCR及用质粒HEF-1.4H-gγl为模板，H链杂交引物HYS和外侧引物h的PCR以便构建H链杂交V区并纯化每个PCR产物，在杂交V区中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型及FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。
第一次PCR的两个PCR产物根据其自身的互补性进行装配(见国际申请公开号WO92-19759)。然后在第二个PCR阶段通过加入外侧引物a和h扩增编码H链杂交V区的全长DNA，在V区中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型及FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。
根据“实施例9，重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的构建”所示方法进行第一个PCR，纯化PCR产物，装配，第二个PCR并克隆进HEF表达载体HEF-VH-gγl。包含编码H链杂交V区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒在确定DNA序列后命名为HEF-MH-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列源自小鼠抗-HM1.24抗体及FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型。
此质粒HEF-MH-RVH-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:75所示。包含编码H链杂交V区正确氨基酸序列的DNA片段质粒也可命名为HEF-HM-RVH-AHM-gγl，在V区中FR1和FR2的氨基酸序列源自重新构建的人抗HM1.24抗体a型及FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体H链V区。此质粒HEF-HM-RVH-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:76所示。
3-3重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区f到s型的构建如下构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的每种类型f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r、和s。在构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的f至s型中，如上所述应构建小鼠抗HM1.24抗体V区的三维结构模型以便预测抗体分子中替代的氨基酸残基位置。
用设计将第75位苏氨酸突变为丝氨酸和第78位缬氨酸突变为丙氨酸的诱变剂引物FS(序列78)和FA(SEQ ID No:79)并以质粒HEF-RVHe-AHM-gγl为模板DNA通过PCR方法扩增f型以得到质粒HEF-RVHf-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHf-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:16所示。
用设计将第40位丙氨酸突变为精氨酸的诱变剂引物GS(序列80)和GA(SEQ ID No:81)并以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl主模板DNA，扩增g型以得到质粒HEF-RVHg-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHg-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:17所示。
用诱变剂引物FS和FA并以质粒HEF-RVHb-AHM-gγl为模板DNA扩增h型以得到质粒HEF-RVHh-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHh-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:18所示。
用设计将第83位精氨酸突变为丙氨酸和第84位丝氨酸突变为苯丙氨酸的诱变剂引物IS(序列82)和IA(SEQ ID No:83)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA扩增I型以得到质粒HEF-RVHi-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHi-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:19所示。
用设计将第66位精氨酸突变为赖氨酸的诱变剂引物JS(SEQ IDNo:84)和JA(SEQID No:85)并以质粒HEF-RVHf-AHM-gγl为模板DNA，扩增j型以得到质粒HEF-RVHj-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHj-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:20所示。
用设计将第81位谷氨酸突变为谷氨酰胺的诱变剂引物KS(SEQ IDNo:86)和KA(SEQ ID No:87)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增k型以得到质粒HEF-RVHk-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHk-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:21所示。
用设计将第81位谷氨酸突变为谷丙氨酸和第82B位丝氨酸突变为异亮氨酸的诱变剂引物LS(SEQ ID No:88)和LA(SEQ ID No:89)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增1型以得到质粒HEF-RVHl-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHl-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:22所示。
用设计将第81位谷氨酸突变为谷丙氨酸，第82b位丝氨酸突变为异亮氨酸和第87位苏氨酸突变为经氨酸的诱变剂引物MS(SEQ IDNo:90)和MA(SEQ ID No:91)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增m型以得到质粒HEF-RVHm-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHm-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:23所示。
用设计将第82B位丝氨酸突变为异亮氨酸的诱变剂引物NS(SEQ IDNo:92)和NA(SEQ ID No:93)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增n型以得到质粒HEF-RVHh-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHn-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:24所示。
用设计将第87苏氨酸突变为丝氨酸的诱变剂引物OS(SEQ IDNo:94)和OA(SEQ ID No:95)并以质粒HEF-RVHh-AHM-gγl为模板DNA，扩增O型以得到质粒HEF-RVHo-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHo-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:25所示。
用设计将第78缬氨酸突变为丙氨酸的诱变剂引物PS(SEQ IDNo:96)和PA(SEQ ID No:97)并以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，通过PCR方法扩增P型以得到质粒HEF-RVHp-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHp-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:26所示。
用设计将第75位苏氨酸突变为丝氨酸的诱变剂引物QS(SEQ IDNo:98)和QA(SEQ ID No:99)并以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板DNA，通过PCR方法扩增q型以得到质粒HEF-RVHq-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHq-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:27所示。
用诱变剂引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)并以质粒HEF-RVHp-AHM-gγl为模板DNA，通过PCR方法扩增r型以得到质粒HEF-RVHr-AHM-gγl。此质粒HEF-RVHr-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ ID No:28所示。
用设计将第69位蛋氨酸突变为异亮氨酸的诱变剂引物SS(SEQ IDNo:100)和SA(SEQ ID No:101)并以质粒HEF-RVHr-AHM-gγl为模板DNA，扩增S型以得到质粒HEF-RVHs-AHM-gγl。此质粒HEF-HVHs-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列如SEQ IDNo:102所示。
表1表示已构建的L链V区的氨基酸序列，表2至表4表示H链V区的氨基酸序列。表1 L链V区的氨基酸序列FR1 CDR1FR21 2 3 412345678901234567890123 45678901234 567890123456789AHMDIVMTQSHKFMSTSVGDRVSITC KASQDVNTAVA WYQQKPGQSPKLLIYHuSG I DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIYREIDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC WYQQKPGKAPKLLIYRVLa ----------------------- ----------- ---------------RVLb ----------------------- ----------- ---------------
CDR2 FR35 6 7 80123456 78901234567890123456789012345678AHMSASNRYT GVPDRITGSGSGTDFTFTISSVQAEDLALYYCHuSGI GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCREIGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDIATYYCRVLa ------- --------------------------------RVLb ------- --------------Y-----------------CDR3 FR49 10901234567 8901234567AHMQQHYSTPFT FGSGTKLEIKHuSGIFGQGTKVEIKREI FGQGTKVEIKRVLa --------- ----------RVLb --------- ----------表2 H链V区的氨基酸序列(1)FR1CDR1 FR21 2 3 4123456789012345678901234567890 12345 67890123456789AHMQVQLQQSGAELARPGASVKLSCKASGYTFT PYWMQ WVKQRPGQGLEWICHuSGI EVQLVQSGADVKKPGXSVXVSCKASGYTFS WVRQAPGXGLDWVGHG3QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFN WVRQAPGQGLEWMCRVHa -----------------------------T ----- --------------RVHb -----------------------------T ----- --------------RVHc -----------------------------T ----- --------------RVHd -----------------------------T ----- --------------RVHe -----------------------------T ----- --------------RVHf -----------------------------T ----- --------------RVHg -----------------------------T ----- ----R---------RVHh -----------------------------T ----- --------------RVHi -----------------------------T ----- --------------RVHj -----------------------------T ----- --------------RVHk -----------------------------T ----- --------------RVHl -----------------------------T ----- --------------RVHm -----------------------------T ----- --------------RVHn -----------------------------T ----- --------------RVHo -----------------------------T ----- --------------RVHp -----------------------------T ----- --------------RVHq -----------------------------T ----- --------------RVHr -----------------------------T ----- --------------RVHs -----------------------------T ----- --------------表3 H链V区氨基酸序列(2)COR2 FR35 6 7 89012A3456789012345 67890123456789012A8C345678901234AHM SIFPGDGDTRYSQKFKG KATLTADKSSSTAYMQLSILAFEDSAVYYCARHuSGI RVTXTXDXSXNTAYMSLSSLRSEDTAVYYCARHG3 RVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCARRVHa----------------- -----A--------------------------RVHb----------------- K----A--------------------------RVHc----------------- -----A-K------------------------RVHd----------------- K----A-K------------------------RVHe----------------- -A-L-A--------------------------RVHf----------------- -A-L-A---S--A-------------------RVH2----------------- -----A--------------------------RVHh----------------- K----A---S--A-------------------RVHi----------------- K----A---S--A-------AF----------RVHj----------------- KA-L-A---S--A-------------------RVHk----------------- K----A---S--A--Q----------------RVHl----------------- K----A---S--A--Q--I-------------RVHm----------------- K----A---S--A--Q--I-----S-------RVHn----------------- K----A---S--A-----I-------------RVHo----------------- K----A---S--A-----------S-------RVHp----------------- -----A------A-------------------RVHq----------------- -----A---S----------------------RVHr----------------- -----A-K----A-------------------RVHs----------------- ----I-A-K----A------------------表4 H链V区的氨基酸序列(3)CDR3 FR410 1157890ABJK12 34567890123AHM GLRRGGYYFDY WGQGTTLTVSSHuSGIWGQGTLVTVSSJH6 WGQGTTVTVSSRVHa----------- ------------RVHb----------- ------------RVHc----------- ------------RVHd----------- ------------RVHe----------- ------------RVHf----------- ------------RVHg----------- ------------RVHh----------- ------------RVHi----------- ------------RVHj----------- ------------RVHk----------- ------------RVHl----------- ------------RVHm----------- ------------RVHn----------- ------------RVHo----------- ------------RVHp----------- ------------RVHq----------- ------------RVHr----------- ------------RVHs----------- ------------
3．嵌合抗体和重新构建人抗体的合成为合成嵌合抗体或重新构建人抗体，对每个抗体构建两个表达载体，一个表达载体包含编码在如增强子/启动子系统的表达调节区控制下的小鼠H链V区和人H链C区的DNA及编码在如增强子/启动子系统的表达调节区控制下的小鼠L链V区和人L链C区的DNA，或一个表达载体包含编码在如增强子/启动子系统的表达调节区控制下的人源化H链V区和人H链C区的DNA及编码在如增强子/启动子系统的表达调节区控制下的人源化L链V区和人L链C区的DNA。
随后，用这些载体共转化如哺乳动物细胞的宿主细胞，并在体外或体内培养这些转化细胞以产生嵌合抗体或重新构建的人抗体(例如，国际申请公开号WO91-16928)。此外，可将抗体基因导入如山羊等哺乳动物以产生转基因动物，从其乳汁可得到嵌合抗体或重新构建的人抗体。
也可将H链V区和H链C区、L链V区和L链C区与单载体连接以转化适当的宿主细胞然后产生抗体。将编码已克隆cDNA中小鼠前导序列和H链V区和人H链C区的DNA，及编码小鼠前导序列和L链V区和人L链C区的DNA导入单表达载体以表达嵌合抗体(见国际申请公开号WO94-11523)。
将编码人源化H链V区和人H链C区的DNA，及编码人源化L链V区和人L链C的DNA导入单表达载体以表达重新构建的人抗体(见国际申请公开号WO94-11523)。用所述载体转化宿主细胞，并在体内或体外培养这些转化的宿主细胞以产生目的嵌合抗体或重新构建的人抗体。
可培养通过编码目的嵌合抗体或重新构建的人抗体的基因按上述方法转化的转化子，并从细胞内或细胞外分离所产生的嵌合抗体或重新构建的人抗体及纯化成均一的抗体。
用亲和柱分离和纯化本发明的目的蛋白，嵌合抗体或重新构建人抗体。此柱使用蛋白A，例如HyperD、POROS、琼脂糖凝胶F等。可选择地，可以使用蛋白质的常规分离和纯化方法并且此方法不受任何限制。例如，只要合适，也可用各种层析结合方法，超滤、盐析、渗析等来分离和纯化嵌合抗体或重新构建的人抗体。
可以用任何表达方法来产生本发明的嵌合的抗HM1.24抗体或重新构建的人抗HM1.24抗体，包括例如，如动物细胞、已建立的哺乳动物胞系系统、昆虫细胞系统、真菌细胞系统和酵母细胞系统的真核生物细胞，以及如大肠杆菌等细菌细胞的原核生物细胞。本发明的嵌合抗体或重新构建人抗体优选地在COS细胞、CHO细胞、HeLa细胞、Vero细胞、骨髓瘤细胞或BHK细胞中表达。
在此情形中，可用适于哺乳动物细胞表达的普通启动子。例如，优选地使用人巨细胞病毒早期(HCMV)启动子。这些包含HCMV启动子的表达载体实施例包括HCMV-VH-HCγ1,HCMV-VL-HCκ等和源自pSV2neo的载体(国际申请公开号WO92-19759)。
此外，可以使用诸如逆转录病毒、多瘤病毒、腺病素、猿猴病毒40(SV40)等的病毒启动子和诸如人多肽链延伸因子1d(HEF-12)等源自哺乳动物细胞的启动子作为本发明中哺乳动物细胞基因表达的启动子。例如，当使用SV40启动子时，可以用Mulligan等方法(自然277,108(1979)很容易地进行表达，当用HEF-12启动子时就要用Mizushima,S.等方法(核酸研究，18,5322,1990)。
可以使用源自SV40、多瘤病毒、腺病毒、牛乳头瘤病毒(BPV)等的启动子作为复制源，并且表达载体包括氨基糖苷磷酸转移酶(APH)基因、胸苷激酯(TK)基因、大肠杆菌黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Ecogpt)基因、二氢叶酸还原酶(DHRF)基因等作为选择标记以便在宿主细胞系统中扩增基因拷贝数。
4．嵌合抗体或重新构建的人抗体的结合抑制活性(1)抗体浓度的测定通过ELISA或吸收率测定方法测定纯化抗体的浓度。
如下制备测定抗体浓度的ELISA板。用浓度为每毫升1微克的100微开羊抗人IgG抗体固定96孔ELISA板(例如Maxisorp，由NUNC生产)的每个孔。
用每毫升100微克的稀释缓冲液(例如50mM Tris-Hcl,mM Mgcl2,0.15M Nacl,0.05％Tween20,0.02％Nan3,1％胎牛血清白蛋白(BSA),pH8.1)封闭后，向每孔加入可表达嵌合抗体、杂交抗体或重新构建人抗体的如COS细胞或CHO细胞培养物上清液的连续稀释液，或纯化的嵌合抗体、杂交抗体或重新构建人抗体。然后加入与羊抗人IgG抗体结合的100微升碱性磷酸酶，加入每毫升1毫克的底物溶液(由SIGMA生产的Sigma104,p-硝基酚磷酸)，并用微板Reader(Bio Rad)测定其405纳米的吸收值。可用人IgClk(由BInding Site生产)作为浓度测定的标准。通过测定抗体在280纳米的吸收值并以1.350D的每毫升1毫克计算就可得到纯化抗体的浓度。
(2)结合活性通过用人羊膜细胞系WISH(ATCC CCL25)的细胞ELISA测定结合活性。如下制备细胞ELISA。将补充10％小牛血清的PRMI1640培养基中适当浓度的WISH细胞加入96孔板，培养过夜，并用PBS(-)冲洗两次，再用0.1％戊二醛(由Nakalai-teque生产)固定。
封闭后向每孔加入100微升可以表达嵌合抗HM1.24抗体、杂交抗-HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体的如COS细胞或CHO细胞培养物上清液的连续缓冲液，或纯化的嵌合抗HM1.24抗体、杂交抗HM1.24抗体或重新构建的人抗-HM1.24抗体，然后加入过氧化物酶标记的兔抗抗HM1.24抗体(由DAKO生产)。
在室温培养1小时后加入底物溶液，再培养。随后用50微升的6N硫酸停止反应，并用型号为3550的微板阅读仪(由Bio-Rad生产)测定其在490纳米的吸光度。
(3)结合抑制活性的测定通过用人羊膜细胞系WISH(ATCC CCL25)的细胞ELISA测定生物素酰基化的鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。根据上述(2)制备细胞-ELISA板。将补充10％小牛血清的PRMI1640培养基中适当浓度的WISH细胞加入96孔板，培养过夜，并用PBS(-)冲洗两次，再用0.1％戊二醛固定(由Nakalai tesque生产)。
封闭后，向每孔加入50微升可以表达嵌合抗HM1.24抗体、杂交抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体的如COS细胞或CHO细胞培养物上清液的连续稀释液，或纯化的嵌合抗HM1.24抗体、杂交抗HM1.24抗体或重新构建人抗-HM1.24抗体，同时加入50微升的每毫升2毫克的生物素酰基化的鼠抗HM1.24抗体，然后室温培养2个小时，并在冲洗后加入过氧化物酶标记的抗生蛋白链霉素。
在室温培养1小时及冲洗后，加入底物溶液并培养。随后，用50微升的6N硫酸停止反应，然后用型号为3550的微板阅读耙迁由Bio-Rad生产)测定490纳米的吸光度。
ADCC活性的测定如下测定本发明嵌合抗体或重新构建人抗体的ADCC活性。首先，通过密度离心方法从人外周血或骨髓分离出单核细胞并将其制备成效应细胞。通过用上Cγ标记RPMI8226细胞(ATCC CCL155)将人骨髓瘤细胞制备为靶细胞。然后，将需测ADCC活性的嵌合抗体或重新构建人抗体加到标记的靶细胞中并培养，然后将合适比例的效应细胞加入细胞并培养。
培养后取上清液，用r计数器测定其放射性。此时可用1％NP-40测定最大释放放射性。按(A-C)/(B-C)×100计算细胞毒性(％)，其中A是抗体存在时释放的放射性(cpm),B是NP-40释放的放射性(cpm),C是无抗体时培养物液体释放的放射性(cpm)。
当预期抗体C区有ADCC活性或CDC活性时，可用人Cγ1或人Cγ3作为抗体C区。此外，通过添加改变或修饰体C区氨基酸的一部分，可以诱导较高的ADCC活性或CDC活性。
例如，有氨基酸替代引起的IgG的IgM样聚合作用(Smith,R.I.F.和Morrison,S.L,BIO/TECHNOLOGY(1994)12,683-688)，氨基酸添加剂引起的IgM样聚合作用(Smith,R.I.F.等，免疫学杂志(1995)154,2226-2236)，编码L链基因的顺序连接表达(Shuford,W.等，科学(1991)252,724-727)，氨基酸替代引起的IgG二聚作用(Caron,P.C.等，实验医学杂志(1992)176,1191-1195,Shopes,B.J.免疫学(1992)148,2918-2922)，化学修饰引起的IgG二聚作用(Wolff,E.A.等，癌症研究(1993)53,2560-2565)，以及抗体铰链区的氨基酸替代诱导效应物作用(Norderhaug,L.等，欧洲免疫学杂志(1991)21,2379-2384)。用引物进行寡聚物位点指导的诱变，用限制性内切酶切割位点加入碱基序列以及诱导共价键的化学修饰物可以完成这些变化。
骨髓瘤的体内诊断本发明的嵌合抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体通过与如放射性同位素等标记化合物连接可以用于骨髓瘤的体内诊断。
此外，与如放射性同位素等标记化合物连接的嵌合抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体的片段可用于骨髓瘤的体内诊断，例如Fab、F(ab’)2、Fv、或单链Fv(scFv)，其中Fv或H链和L链的Fv由合适接头连接。
通过构建编码这些抗体片段的基因，将其导入表达载体，然后在适当的宿主细胞中表达，或用适当酶消化嵌合抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体可特异地得到这些抗体片段。
可以非肠道方式系统地施用上面提及的骨髓瘤的体内诊断法。
骨髓瘤的药物组合物和治疗剂向骨髓瘤细胞移植的动物施用所述抗体并评估抗肿瘤效果，以证实本发明的嵌合抗HM1.24抗体或人源化抗HM1.24抗体的治疗效果。
优选人骨髓瘤细胞作为向动物移植的骨髓瘤细胞，例如有KPMM2(日本未审查的专利公开(Kokai)号7-236474)、RPMI8226(ATCC CCL155)、ARH-77(ATCC CRL1621)和S6845(Suzuki,H.等，欧洲免疫学杂志(1992)22,1989-1993)。优选免疫功能降低或缺失的动物作为所述细胞移植的动物，例如有裸小鼠、SCID小鼠、褐色小鼠和裸大鼠。
此外，根据血清中人免疫球蛋白量的变化，肿瘤体积和/或重量的测定，尿中人本斯-琼斯氏蛋白重量的变化，动物存活期等来证实所评估的抗肿瘤效果。
可以非肠道方式系统或局部施用包含本发明的嵌合抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体作为活性成分的骨髓瘤药物组合物或治疗剂。例如，可选择诸如输注的静脉内注射、肌内注射、腹膜内注射或皮下注射并根据病人年龄和医疗条件选择合适剂量方案。
有效剂量范围是每剂量中每千克体重的0.01毫克至1000毫克药量。可选择地剂量是每千克体重5毫克，优选地是每千克体重50毫克至100毫克。
根据给药途径，含本发明的重新构建抗HM1.24抗体或重新构建人抗HM1.24抗体作为活性成分的骨髓瘤药物组合物或治疗剂可以包含药学可接受的载体或添加剂。
这些载体和添加剂的例子有水、药学上可接受的有机溶剂、胶原、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、羧乙烯聚合物、羧甲基纤维素钠、聚丙烯酸酯、藻酸钠、水溶性葡聚糖、羧甲基淀粉钠、果胶、甲基纤维素、乙基纤维素、黄原胶、阿拉伯树胶、酪蛋白、聚乙二醇、凡士林、石蜡、硬脂醇、硬脂酸、人血清白蛋白(HSA)、甘露醇、山梨糖醇、乳糖、药学可接受表面活性剂等。所用添加剂选自但不限于上述添加剂或其结合形式。
实施例下面更具体地说明本发明。实施例1．编码小鼠抗HM1.24抗体V区的cDNA的克隆1．信使RNA(mRNA)的分离使用3.2版本快速mRNA分离试剂盒(Invitrogen公司生产)，根据其中所附说明，从产生小鼠抗HM1.24抗体的2×108杂交瘤细胞中分离mRNA。
2．通过PCR方法扩增编码抗体可变区的基因。
使用扩增热循环仪(Perkin Elmer Cetus生产)进行PCR。
2-1．编码小鼠L链V区基因的扩增和酶切使用AMV逆转录酶cDNA第一条链合成试剂盒(Life Science生产)从所分离的mRNA中合成单链cDNA并用于PCR。对于PCR的引物，使用能与小鼠Kappa型L链引导序列杂交的在SEQ ID No:29至39所地的MKV(小鼠Kappa可变的)引物(Jones,S.T.等，生物/技术，9,88-89,(1991))。
含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl,0.1mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、1.5mM MgCl2、5单位DNA聚合酶Ampli Taq(PerkinElmer Cetus生产)、0.25mM显示于SEQ ID No:29至39中的MKV引物、3mM显示于SEQ ID No:40中的MKC引物和100ng单链cDNA的100μl PCR溶液用50μl矿物油覆盖，然后在94℃的初始温度加热3分钟，再以94℃1分钟、35℃1分钟、72℃1分钟的顺序循环。此循环重复30次后，反应混合物在72℃温育10分钟。扩增的DNA片段用低熔点琼脂糖凝胶(Sigma生产)纯化，并在37℃用XmaⅠ(New EnglandBioLabs生产)和SalⅠ(Takara Shuzo生产)酶切。
2-2．编码小鼠H链V区的cDNA的扩增和酶切使用5’-RACE方法(cDNA末端的快速扩增；Frohman,M.A.等，美国国家科学院院报，85,8998-9002,(1988),Edwards,J.B.D.M.,等，核酸研究，19,5227-5232,,(1991))扩增编码小鼠H链的V区的基因。使用与小鼠IgG2a的恒定区特异杂交的引物P1(SEQ ID No:41)合成cDNA以后，通过5’-AmpliFINDER cDNA末端快速扩增试剂盒(CLONTECH生产)使用试剂盒所附带的与小鼠IgG2a恒定区特异杂交的引物MHC2a(SEQ ID No:42)和锚定引物(SEQ ID No:77)。扩增编码小鼠H链V区的cDNA。扩增的DNA片段用低熔点琼脂糖胶(Sigma生产)纯化并用EcoRⅠ(Takara Shuzo生产)和XmaⅠ(New England BioLabs生产)于37℃酶切。
3．连接和转化通过在含有50mM Tris-HCl(pH7.6)、10mM mgcl2、10mMdithiothreitol、1mM ATP、50mg/ml聚乙二醇(8000)和1单位T4 DNA连接酶(Gibco-BRL生产)的反应混合物中于16℃反应2.5小时，上述所制备的包含编码小鼠Kappa类型L链的V区基因的DNA片段和经过SalⅠ和XmaⅠ消化的PUC载体连接。相似地，包含编码小鼠H链V区基因的DNA片段和经过EcoRⅠ和XmaⅠ消化的PUC19载体在16℃反应并连接3小时。
然后将10μl上述连接混合物加到50μl大肠杆菌DH52的感受态细胞中，然后在冰上放置30分钟、42℃1分钟、再在冰上放1分钟。接下来在其中加入400μl 2×YT培养基(分子克隆实验室手册，Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989)),37℃培养1小时，然后大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉素的zxYT琼脂培养基上(分子克隆实验室手册，Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989))铺板，然后于37℃过夜培养以获得大肠杆菌转化子。
转化子于37℃在10ml含有50μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中过夜培养，然后使用碱裂解方法(分子克隆实验室手册，Sambrook等，冷泉港实验室出版社，(1989))从此培养物中制备质粒DNA。
如此得到的含有来自产生抗HM1.24抗体的杂交瘤、编码小鼠Kappa类型L链V区基因的质粒命名为pUCHMVL9。上述方法所获得的含有来自产生抗HM1.24抗体的杂交瘤、编码小鼠H链V区基因的质粒命名为pUCHMVHR16。实施例2．DNA碱基序列的测定使用自动DNA测序仪(Applied Biosystem Inc.生产)和Taq染料双脱氧终止循环测序试剂盒(Applied Biosystem Inc.生产)以生产商说明的方法测定上述质粒中cDNA编码区域的碱基序列。
质粒pUCHMVL9中包含的编码小鼠抗HM1.24抗体L链V区基因的碱基序列显示于SEQ ID No:1。质粒pUCHMVHR16中包含的编码小鼠抗HM1.24抗体H链V区基因的碱基序列显示于SEQ ID No:2。实施例3．CDR的测定L链和H链V区的全面结构相互具有相似性，其中四个构架区由三个高度可变的区域即互补决定区(CDR)相连接。构架中氨基酸序列是相对很保守的，但氨基酸序列中的变异是极高的(Kabat,E.A.，等，“免疫目的蛋白的序列”、US Dept.Health and Human Services,1983)。
根据这些事实，将抗HM1.24抗体的可变区的氨基酸序列与数据库中抗体的氨基酸序列相比较以研究同源性，并且如表5中所示的测定CDR区域。表5

实施例4．克隆cDNA的表达的确定(嵌合的抗HM1.24抗体的构建)1．表达载体的构建为了构建表达嵌合抗HM1.24抗体的表达载体，分别将编码小鼠抗HM1.24抗体的L链和H链V区的cDNA克隆pUCHMVL9和pUCHMVHR16通过PCR方法修饰，然后导入HEF表达载体(国际申请公开号，WO92-19759)。
设计对应于L链V区的反向引物ONS-L722S(SEQ ID No:43)和对应于H链V区的反向引物VHR16S(SEQ ID No:44)以使它们能与编码每个V区前导序列开始的DNA杂交，并且它们具有Kozak保守序列(Kozak,M.等，分子生物学杂志，196,947-950,(1987))和HindⅢ限制性内切酶的识别位点。设计对应于L链V区的正向引物VL9A(SEQ IDNo:45)和对应于H链V区的正向引物VHR16A(SEQ ID No:46)以使它们能与编码丁区末端的DNA序列杂交，并且它们具有剪接供体序列和BamHⅠ限制性内切酶的识别位点。
含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mM KCl、0.1mM dNTPs、1.5mMMgCl2、100pmol每一种引物、100ng模板DNA(pUCHMVL9或pUCHMVHR16)和5单位Ampli Taq酶的100μl PCR反应混合物用50μl矿物油覆盖，94％初始变性以后，分别在94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟下加热30个循环，最后72℃温育10分钟。
PCR产物经1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化，并用HindⅢ和BamHⅠ消化，然后对于L链V区克隆入HEF-VL-gκ，对于H链V区克隆进HEF-VL-gγl。DNA序列确定以后，包含含有正确DNA序列的DNA片段的质粒分别命名为HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl。
为制备限制性片段，用HindⅢ和BamHⅠ限制性内切酶从上述质粒HEF-1.34L-gk和HEF-1.24H-gγl中切出编码各个可变区的区域，将此片段插入质粒载体pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位点，它们分别命名为pUC19-1.24L-gκ和pUC19-1.24H-gγl。
含有质粒pUC19-1.24L-gκ和pUC-1.24H-gγl的大肠杆菌分别命名为大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gk)和大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24H-gγl)，并于1996年8月29日在布达佩斯条约的条款下，按国际惯例储存于国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术代理处，MITI(Higashi l-chome 1-3,Tsukuba city,Ibalakiprefecture，日本)，并分别得到保藏号FERM BP-5646和FERM BP-5644。
2．转染入COS-7细胞为了观察嵌合抗HM1.24抗体的瞬时表达，在COS-7(美国典型培养物保藏中心CRL-1651)细胞中检测上述表达载体。使用基因脉冲仪(BioRad生产)通过电穿孔将HEF-1.24L-gκ和HEF-1.24H-gγl共转化入COS-7细胞。将每一份DNA(10μg)加入0.8ml PBS中，其中含1×107细胞/ml COS-7细胞，然后接受1500V和25UF电容的脉冲。
在室温经过10分钟的恢复期之后，将电穿孔的细胞加到30ml含有10％无γ球蛋白的胎牛血清的DMEM培养液(GIBCO生产)中。在CO2培养箱BNA120D(TABAI生产)培养72小时后，收集培养物上清，离心去除细胞碎片，然后用于下面的实验。
3．FCM分析使用KPMM2细胞通过FCM(流式细胞计数)分析嵌合抗HM1.24抗体的抗原结合活性。4.7×105KPMM2细胞(日本未审查专利公开(Kokai)号，7-236475)用PBS(-)洗涤后，加入50μl能够产生上述嵌合抗HM1.24抗体的COS-7细胞培养物和50μl FACS缓冲液(含有2％胎牛血清和0.1％叠氮化钠的PBS(-))，或加入5μl 500μg/ml纯化的小鼠抗HM1.24抗体和95μlFACS缓冲液，在冰上温育1小时。
作为对照，加入50μl 2μg/ml嵌合SK2(国际申请出版号.WO94-28159)和50μl FACS缓冲液。或加入5μl 500μg/ml纯化的小鼠IgG2aR(UPC10)(CAPPEL生产)而不是纯化的小鼠抗HM1.24抗体和95μl FACS缓冲液，并经相似地温育。用FACS缓冲液洗涤以后，加入100μl 25μg/ml的FITC偶联的羊抗人抗体(GAH)(CAPPEL生产)或10μg/ml FITC偶联的羊抗小鼠抗体(GAM)(Becton Dickonson生产)，并在冰上温育30分钟。用FACS缓冲液冲洗以后，悬浮于1ml FACS缓冲液中，用FACScan(Becton Dickinson生产)测量每一个细胞的荧光强度。
如图1中所示，表明嵌合抗HM1.24抗体和KPMM2细胞结合，因为与对照相比在嵌合抗HM1.24抗体中入的细胞中荧光强度的峰向右移动，相似于加入小鼠抗HM1.24抗体的情况。这证实克隆的cDNA编码小鼠抗HM1.24抗体的可变区域。实施例5．能够稳定产生嵌合抗HM1.24抗体的CHO细胞系的建立1．嵌合H链的表达载体的构建用限制性内切酶PvuⅠ和BamHⅠ消化上述质粒HEF-1.24H-gγl以后，用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化得到均2.8kbp的片段，它包含EF1启动子和编码小鼠抗HM1.24抗体H链V区的DNA。接着将上述DNA片段插入约6kbp的片段，此片段是通过PvuⅠ和BamHⅠ消化用于人H链表达载体的表达载体DHFR-ΔE-Rvh-PM1f(见国际申请公开号WO92/19759)而制备的，此载体包含DHFR基因和编码人H链恒定区的基因以构建嵌合抗HM1.24抗体H链的表达载体DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγl。
2．基因导入CHO细胞为了建立嵌合抗HM1.24抗体的稳定合成系统，用PvuⅠ消化使上述表达载体HEF-1.24-gk和DHFR-ΔE-HEF-1.24H-gγl的基因线形化，在与上述(上述对COS-7细胞的转染)相似的条件下用电穿孔方法同时导入CHO细胞DXB11(由医学研究委员会合作中心赠送)。
3．由MTX诱导的基因扩增在基因导入的CHO细胞中，只有L链和H链表达载体都导入的那些CHO细胞才能在加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％胎牛血清的无核苷α-MEM培养液(GIBCO-BRL生产)中生存，因此对它们进行了选择。接下来将10nm MTX(Sigma生产)加入上述培养液。在增殖的克隆中，挑选那些能大量合成嵌合抗HM1.24抗体的克隆。因此获得了合成效率为大约20μg/ml嵌合抗体的克隆#8-13，并命名为嵌合抗HM1.24抗体合成细胞系。实施例6．嵌合抗HM1.24抗体的构建用以下方法构建嵌合抗HM1.24抗体。上述嵌合抗HM1.24抗体合成CHO细胞通过高密度细胞培养仪Verax系统20(CELLEX BIOSCIENCEInc.生产)在含有5％无γ-球蛋白的新生牛血清(GIBCO-BRL)的Iscove修改的Dulbecoo培养基中，继续培养30天。
开始培养后第13、20、23、26和30天，使用压力滤器仪器SARTOBRAN(Sartorius生产)回收培养液，接着使用大体积抗体收集系统Afiprep系统(Nippon Gaishi生产)和超级蛋白质A柱(床体积100ml,Nippon Gaishi生产)，并根据所附说明用PBS作为吸附/冲洗缓冲液和0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液嵌合抗HM1.24抗体进行亲和纯化。向洗脱组分中立即加入1M Tris-HCl(pH8.0)调至pH7.4。通过280nm的吸光度测定抗体浓度，并用1μg/ml相当于1.350D来计算。实施例7．嵌合抗HM1.24抗体的活性测定通过以下结合抑制活性来评估嵌合抗HM1.24抗体。
1．结合抑制活性的测定1-1．生物素化抗HM1.24抗体的构建用0.1M碳酸氢盐缓冲液将小鼠抗HM1.24抗体稀释至4mg/ml后，加入4μl 50mg/ml生物素-N-羟基琥珀酰胺(EY LABS InC.生产)并在室温下反应3小时。之后向其中加入1.5ml 0.2M甘氨酸溶液在室温下温育30分钟终止反应，接着用PD-10柱(Pharmacia Biotech生产)收集生物素化的IgG组份。
1-2．结合抑制活性的测定使用人羊膜细胞系WISH细胞(美国典型培养物保藏中心CCL25)通过细胞ELISA测定生物素化小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。如下制备细胞ELISA板。往96孔板中加入在补加10％胎牛血清的PRMI1640培养基中培养的4×105细胞/ml，过夜培养，用PBS(-)洗两遍后，用0.1％戊二醛(Nakalai tesque生产)固定。
封闭后，向每加样孔中加入50μl嵌合的抗HM1.24抗体或亲和纯化获得的小鼠抗HM1.24抗体的连续稀释液，并同时加入50μl 2μg/ml生物素化的小鼠抗HM1.24抗体，室温下温育2小时，然后加入过氧化物酶标记的抗生素蛋白链霉素(DAKO生产)。室温下温育1小时后冲洗，加入底物溶液。加入50μl 6N硫酸终止反应后，用微板阅读仪3550型(Bio-Rad生产)测定490nm的吸光度。
显示于表2的结果表明嵌合抗HM1.24抗体和小鼠抗HM1.24抗体对生物素化的小鼠抗HM1.24抗体有相同的结合抑制活性。这表明嵌合抗体和小鼠抗HM1.24抗体有相同的V区。实施例8．嵌合抗HM1.24抗体ADCC活性的测定根据免疫学现行方法，第7章，人类免疫学研究，编辑John E,Cokigan et al.,John Wiley&Sons,Inc.,1993所阐明的方法测定ADCC(抗体依赖性细胞毒性)活性。
1．效应细胞的制备通过密度离心的方法从健康者和多发性骨髓瘤患者的外周血或骨髓中分离单核细胞。这样，将等量的PBS(-)加到健康者和多发性骨髓瘤患者的外周血和骨髓中，它们在ficoll(Pharmacia生产)-Conrey(Daiichi Pharmaceutical Co.Ltd.生产)(比重，1.077)上层，400g离心30分钟。收集单核细胞，用补加10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI1640(Sigma生产)洗涤两次，用相同的培养液将细胞稀释为5×106/ml。
2．靶细胞的制备将人骨髓瘤细胞系RPML8226(美国典型培养物保藏中心CCL155)在补加10％胎牛血清(Witaker生产)的RPMI1640(Sigma生产)和0.1mci51Cr铬酸钠RPMI1640中于37℃培养60分钟使之放射性标记。放射性标记后，细胞用HanKS平衡的盐溶液(HBSS)洗三次，浓度调至2×105/ml。
3．ADCC试验在96孔U型底板(Corning生产)中加入50μl 2×105靶细胞/ml，1μg/ml亲和纯化的嵌合抗HM1.24抗体和小鼠抗HM1.24抗体、或对照人IgG(Serotec生产)，4℃反应1分钟。
然后，当效应细胞(E)对靶细胞(T)的比率(E∶T)设为0∶1,5∶1,20∶1，或50∶1时，往其中加入100μl 5×106效应细胞/ml，在CO2培养箱中培养4小时。
取出100μl上清，用计数器(ARC361,Aloka生产)测定释放到培养上清中的放射活性。为了测定最大放射活性，使用1％NP-40。细胞毒性(％)用(A-C)/(B-C)×100计算，其中A是在抗体的存在时所释放的放射活性(cpm),B是NP-40释放的放射活性(cpm),C是不存在抗体单独由培养液释放的放射活性(cpm)。
如图3所示，与对照IgG1相比，当嵌合抗HM1.24抗体加入时，细胞毒性随着E∶T比的增加而增加，这表明这个嵌合抗HM1.24抗体有ADCC活性。此外，因为即使当加入小鼠抗HM1.24抗体时也观察到细胞毒性，这表明当效应细胞是来自人的细胞时，为了获得ADCC活性需要人抗体的Fc部分。实施例9．重新构建的人抗HM1.24抗体的构建1．重新构建的人抗HM1.24抗体V区的设计为了构建重新构建的人抗体，其中小鼠单克隆抗体的CDR已移植到人抗体，优选在小鼠抗体的FR和人抗体的FR之间存在高同源性。这样，使用蛋白数据库将小鼠抗HM1.24抗体的L链和H链V区和结构已清楚的所有已知抗体的V区相比较。
小鼠抗HM1.24抗体L链V区与和人L链V区亚组Ⅳ(HSGⅣ)的保守序列最相似，具有66.4％的同源性。另一方面与HSGⅠ、HSGⅡ和HSGⅢ分别具有56.9％、55.8％和61.5％的同源性。
当将小鼠抗HM1.24抗体L链V区与已知人抗体L链V区相比较时，它表明与人L链V区REI，即人L链V区亚组I之一有67.0％的同源性。因此FRI的FR作为重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区构建的起始材料。
设计重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的a型。在此类型中，人FR和重新构建的人CAMPATH-1H抗体(见Riechmann,L.等，自然，322,21-25,(1988)国际申请专利号WO92-19759中所描述的、重新构建的人PM-1L链V区的a型所含有的FR)所出现的、以REI为基础的FR相同，小鼠CDR和小鼠抗HM1.24抗体L链V区中的CDR相同。
小鼠抗HM1.24抗体H链V区与人H链V区HSGⅠ的保守序列最相似。具有54.7％的同源性。另一方面，它与HSGⅡ和HSGⅢ分别显示有34.6％和48.1％的同源性。当小鼠抗HM1.24抗体H链V区和已知人抗体H链V区相比较时，FR1和FR3和人抗体HG3H链V区，即人H链V区亚组I之一(Rechavi,G.et al.，美国国家科学院院报，80,855-859)最相似，具有67.3％的同源性。
所以，人抗体HG3的FR作为重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区构建的起始材料。然而，因为还未描述人HG3的FR4的氨基酸序列，所以使用与小鼠抗HM1.24抗体H链FR4有最高同源性的人抗体JH6 FR4的氨基酸序列(Ravetch,J.V.等，细胞，27,583-591)。除了一个氨基酸外，JH6的FR4和小鼠抗HM1.24抗体H链FR4有相同的氨基酸序列。
在重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的第一种类型a型中，除了人FR1第30位的氨基酸和人FR3中第71位的氨基酸和小鼠抗HM1.24抗体中的氨基酸相同外，FR1至FR3和人HG3的FR1至FR3相同，CDR和小鼠抗HM1.24抗体H链V区的CDR相同。
2．重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的构建通过PCR方法中CDR的移植构建重新构建人抗HM1.24抗体的L链。方法显示于图4。8个PCR引物用于构建具有起源于人抗体REI FR的重新构建人抗HM1.24抗体(a型)。设计外引物A(SEQ ID No:47)和H(SEQ ID No:48)使之与表达载体HEF-VL-gκ的DNA序列杂交。
CDR移植引物L1S(SEQ ID No:49)、L2S(SEQ ID No:50)和L3S(SEQID No:51)有正义DNA序列。CDR移植引物L1A(SEQ ID No:52)、L2A(SEQID No:53)和L3A(SEQ ID No:54)具有反义DNA序列，每一个分别具有与引物L1S、L2S和L3S 5’末端的DNA序列互补的DNA序列(20至23bp)。
在PCR第一阶段，进行四个反应A-L1A、L1S-L2A、L2S-L3A和L3S-H以纯化每个PCR产物。第一阶段PCR的四个产物能够通过它们自己的互补与另一个进行装配(见国际申请公开号WO92-19759)。接着，加入外引物A和H扩增编码重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的全长DNA(第二次PCR)。在上述PCR中，编码根据人抗体REI起源的FR而重新构建的人ONS-M21抗体L链V区a型的质粒HEF-RVL-M21a(见国际申请公开号WO95-14041)作为模板。
在PCR的第一阶段，使用含有10mM Tris-HCl(pH8.3)、50mMKCl、0.1mM dNTP、1.5mM MgCl2、100ng模板DNA、100pmol每一引物和5U Ampli Taq的PCR混合物。每一个PCR试管用50μ矿物油覆盖。94℃加热首先变性后，进行94℃1分钟、55℃1分钟和72℃1分钟的一个反应循环，然后72℃温育10分钟。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化PCR产物A-L1A(215bp)、L1S-L2A(98bp)、L2S-L3A(140bp)和L3S-H，并在第二次PCR中装配。在第二次PCR中，含有1μg每一个第一阶段PCR产物和5U Ampli Taq的98μlPCR混合物在94℃2分钟、55℃2分钟和72℃两分钟下温育2个反应循环，然后加入100pmol每一种外引物(A和H)。用50μl矿物油覆盖PCR管子，并在如上的相同条件下进行30个循环的PCR反应。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶从第二次PCR中纯化获得516bp DNA片段，然后用BamHⅠ和HindⅢ消化，将如此获得的DNA片段克隆入HEF表达载体HEF-VL-gκ。确定DNA序列后，含有重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒命名为质粒HEF-RVLa-AHM-gκ。质粒HEF-RVLa-AHM-gκ中含有的L链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:9。
使用PCR通过诱变构建重新构建的人抗HM1.24抗体L链V区的b型。设计诱变引物FTY-1(SEQ ID No:55)和FTY-2(SEQ ID No:56)使得71位的苯丙氨酸突变成酪氨酸。
使用质粒HEF-RVLa-AHM-gκ作模板扩增上述引物以后，纯化并用BamHⅠ和HindⅢ消化终产物。获得的DNA片段克隆进HEF表达载体HEF-VL-gκ以得到质粒HEF-RVLb-AHM-gκ。质粒HEF-RVLb-AHM-gκ含有的L链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQID No:10。
3．重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的构建3-1．重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区a至e型的构建按如下设计编码重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的DNA。通过将编码人抗体HG3 FR1至3和人抗体JH6 FR4的DNA序列连接到编码小鼠抗HM1.24抗体H链V区CDR的DNA序列上，设计编码重新构建人抗HM1.24抗体H链V区的全长DNA。
接着，分别将HindⅢ识别位点/KOZAK保守序列和BamHⅠ识别位点/剪接供体序列加到此DNA序列的5’末端和3’-未端使得插入HEF表达载体。
如此设计的DNA序列分成四个寡核苷酸。接下来有可能阻碍这些寡核苷酸装配的寡核苷酸接受对二级结构的计算机分析。四个寡核苷酸RVH1至RVH4的序列显示于SEQ ID No:57至60。这些寡核苷酸具有119至144个碱基的长度和25至26bp的交错区。在这些寡核苷酸中，RVH2(SEQ ID No:58)和RVH4(SEQ ID No:60)具有正义DNA序列，RVH1(SEQ ID No:57)和RVH3(SEQID No:59)具有反义DNA序列。通过PCR装配这四个寡核苷酸的方法显示于图中(见图5)。
包含100ng每种寡核苷酸和5U Ampli Taq的PCR混合物(98μl)首先在94℃加热2分钟变性，并接受94℃2分钟，55℃2分钟和72℃2分钟的两个循环温育。在加入100pmol RHP1(SEQ ID No:61)和RHP2(SEQ ID No:62)作为外引物后，PCR试管用50μl矿物油覆盖。接着首先在94℃加热1分钟变性，然后于94℃1分钟、55℃1分钟、72℃1分钟30个循环，并在72℃温育10分钟。
用1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化438bp DNA片段，用HindⅢ和BamHⅠ消化，并克隆入HEF表达载体HEF-VH-gγl。碱基序列测定后，含有编码H链正确V区氨基酸序列的DNA片段的质粒命名为HEF-RVHa-AHM-gγl。质粒HEF-RVHa-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:11。
按如下构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的每一类型b、c、d、和e。
设计诱变引物BS(SEQ ID No:63)和BA(SEQ ID No:64)使66位精氨酸突变成赖氨酸，并将质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板，通过PCR方法扩增b型获得质粒HEF-RVHb-AHM-gγl。质粒HEF-RVHb-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:12。
设计诱变引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)使73位苏氨酸突变成赖氨酸，质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板，通过PCR方法，扩增C型以获得质粒HEF-RVHc-AHM-gγl。质粒HEF-RVHc-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:13。
设计诱变引物DS(SEQ ID No:67)和DA(SEQ ID No:68)使66位精氨酸突变成赖氨酸，质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板，通过PCR方法扩增d型以获得质粒HEF-RVHd-AHM-gγl。质粒HEF-RVHd-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:14。
设计诱变引物ES(SEQ ID No:69)和EA(SEQ ID No:70)使67位缬氨酸突变成丙氨酸，69位蛋氨酸突变成亮氨酸，质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板，通过PCR方法扩增e型以获得质粒HEF-RVHe-AHM-gγl。质粒HEF-RVHe-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:15。
3-2．H链杂合V区的构建构建两个H链杂合V区域。一个是小鼠人杂合抗HM1.24抗体，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型。另一个是人小鼠杂合抗HM1.24抗体，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自于重多人抗HM1.24抗体H链V区的a型，FR3和FR4的氨基酸序列来自于小鼠抗HM1.24抗体。CDR区的氨基酸序列都来自小鼠抗HM1.24抗体。
用PCR方法构建两个H链杂合V区。此方法按图式显示于图6和7。为构建两个H链杂合V区，使用四个引物。设计外引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)使它与HEF表达载体HEF-VH-gγl的DNA序列杂交。设计H链杂合构建引物HYS(SEQ ID No:73)使之有正义DNA序列，并设计H链杂合引物HYA(SEQ ID No:74)使之有反义DNA序列以使DNA序列能够相互互补。
为了构建H链杂合V区，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型，在PCR的第一阶段进行以质粒HEF-1.24H-gγl为模板、外引物a和H链杂合引物HYA的PCR和以质粒HEF-RVHa-AHM-gγl为模板、H链杂合引物HYS(SEQ ID No:73)和外引物h(SEQID No:72)的PCR，并纯化每一PCR产物。第一阶段两个PCR产物通过它们自身的互补性能够装配起来(见国际申请公开号WO92-19759)。
接着加入外引物a(SEQ ID No:71)和h(SEQ ID No:72)在第二阶段PCR中扩增编码H链杂合V区的全长DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型。
为了构建H链杂合V区，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型，FR3和FR4的人抗HM1.24抗体H链V区的a型，FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，在PCR的第一阶段进行以质粒HEF-HVHa-AHM-gγl为模板、外引物a上H链杂合引物HYA的PCR和以质粒HEF-1.24--gγl为模板、H链杂合引物HYS和外引物h的PCR，并纯化每一PCR产物。第一阶段两个PCR产物通过它们自来的互补性能够装配起来(见国际申请公开号WO92-19759)。
接着加入外引物a和h，在第二阶段PCR中扩增编码H链杂合V区的全长DNA，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重新构建人抗HM1.24抗体H链V区的a型，FR3和FR4的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体。
进行第一阶段PCR、PCR产物的纯化、装配、第二阶段PCR和克隆入HEF表达载体HEF-VH-gγl的方法按照“实施例9．重新构建人抗HM1.24抗体L链V区的构建”中所示的方法。
DNA序列测定后，含有编码H链杂种V区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒命名为HEF-MH-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自小鼠抗HM1.24抗体，FR3和FR4的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型。质粒HEF-MH-RVH-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No.75。含有编码H链杂合V区正确氨基酸序列的DNA片段的质粒命名为HEF-HM-RVH-AHM-gγl，其中FR1和FR2的氨基酸序列来自重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的a型，FR3和FR4的氨基酸序列来自于小鼠抗HM1.24抗体。质粒HEF-HM-RVH-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:76。
3-3．重新构建人抗HM1.24抗体H链V区f至s型的构建按如下构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的每一类型f、g、h、i、j、k、l、m、n、o、p、q、r和s。
设计诱变引物FS(SEQ ID No:78)和FA(SEQ ID No:79)使75位苏氨酸突变成丝氨酸，78位缬氨酸突变成丙氨酸，质粒HEF-RVHe-AHM-gγl作为模板DNA，通过PCR方法扩增f型以获得质粒HEF-RVHf-AHM-gγl。质粒HEF-RVHf-AHM-gγ1中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:16。
设计诱变引物GS(SEQ ID No:80)和GA(SEQ ID No:81)使40位丙氨酸突变成精氨酸，质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板DNA，扩增g型以获得质粒HEF-RVHg-AHM-gγl。质粒HEF-RVHg-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和人源化重新构建的人抗体显示于SEQ IDNo:17。
设计诱变引物FS(SEQ ID No:78)和FA(SEQ ID No:79)，质粒HEF-RVHb-AHM-gγl作为模板DNA，扩增h型以获得质粒HEF-RVHh-AHM-gγl。质粒HEF-RVHh-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:18。
设计诱变引物IS(SEQ ID No:82)和IA(SEQ ID No:83)使83位精氨酸突成丙氨酸，84位丝氨酸突变成苯丙氨酸，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增i型以获得质粒HEF-RVHi-AHM-gγl。质粒HEF-RVHi-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:19。
设计诱变引物JS(SEQ ID No:84)和JA(SEQ ID No:85)使66位精氨酸突变成赖氨酸，质粒HEF-RVHf-AHM-gγl作为模板DNA，扩增j型以获得质粒HEF-RVHj-AHM-gγl。质粒HEF-RVHj-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:20。
设计诱变引物KS(SEQ ID No:86)和KA(SEQ ID No:98)使81位的谷氨酸突变成谷氨酰胺，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增K型以获得质粒HEF-RVHk-AHM-gγl。质粒HEF-RVHk-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:21。
设计诱变引物LS(SEQ ID No:88)和LA(SEQ ID No:89)使81位的谷氨酸突变成谷氨酰酰胺，82B位的丝氨酸突变成异亮氨酸，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增1型以获得质粒HEF-RVHl-AHM-gγl。质粒HEF-RVHl-AHMH-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:22。
设计诱变引物MS(SEQ ID No:90)和MA(SEQ ID No:91)使81位的谷氨酸突变成谷氨酸胺，82b位的丝氨酸突变成异亮氨酸，87位的苏氨酸突变成丝氨酸，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增m型以获得质质粒HEF-RVHm-AHM-gγl。质粒HEF-RVHm-AHM-gγl中中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:23。
设计诱变引物NS(SEQ ID No:92)和NA(SEQ ID No:93)使82B位的丝氨酸突变成异亮氨酸，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增n型以获得质粒HEF-RVHn-AHM-gγl。质粒HEF-RVHn-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:24。
设计诱变引物OS(SEQ ID No:94)和OA(SEQ ID No:95)使87位苏氨酸突变成丝氨酸，质粒HEF-RVHh-AHM-gγl作为模板DNA，扩增o型以获得质粒HEF-RVHo-AHM-gγl。质粒HEF-RVHo-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:25。
设计诱变引物PS(SEQ ID No:96)和PA(SEQ ID No:97)使78位缬氨酸突变成丙氨酸。质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板DNA，通过PCR方法扩增p型以获得质粒HEF-RVHp-AHM-gγl。质粒HEF-RVHp-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:26。
设计诱变引物QS(SEQ ID No:98)和QA(SEQ ID No:99)使75位苏氨酸突变成丝氨酸，质粒HEF-RVHa-AHM-gγl作为模板DNA，通过PCR方法扩增q型以获得质粒HEF-RVHq-AHM-gγl。质粒HEF-RVHq-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ IDNo:27。
设计诱变引物CS(SEQ ID No:65)和CA(SEQ ID No:66)，质粒HEF-RVHp-AHM-gγl作为模板DNA，通过PCR方法扩增r型以获得质粒HEF-RVHr-AHM-gγl。质粒HEF-RVHr-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:28。
使用PCR通过诱变构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区的S型。设计诱变引物SS(SEQ ID No:100)和SA(SEQ ID No:101)使69位蛋氨酸突变成异亮氨酸。
使用质粒HEF-RVHr-AHM-gγl作为模板DNA扩增上述引物以后，纯化终产物，用BamHⅠ和HindⅢ消化，获得的DNA片段克隆入HEF表达载体HEF-VH-gγl以获得质粒HEF-RVHs-AHM-gγl。质粒HEF-RVHs-AHM-gγl中所含H链V区的氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:102。
编码每一上述质粒HEF-RVLa-AHM-gκ可变区的区域和HEF-RVHr-AHM-gγl用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ消化以制备限制性片段。将它们插入质粒载体pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位点。每个质粒命名为pUC19-RVLa-AHM-gκ和pUC19-RVHr-AHM-gγl。
含有每种质粒pUC19-RVLa-AHM-gk和pUC19-RVHr-AHM-gγl的大肠杆菌分别命名为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gk)和大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)，并在布达佩斯条约的条款下，于1996年8月29日按国际惯例储存在国立生命科学和人体技术研究所、工业科学和技术代理处、MITI(Higashil-Chome1-3,Tsukuba city,Ibalaki Prefecture，日本)，并分别得到保藏号FERMBP-5645和FERMBP-5643。
编码上述质粒HEF-RVHs-AHM-gγl可变区的区域用限制性内切酶HindⅢ和BamHⅠ消化以制备限制性片段。将它们插入质粒载体pUC19的HindⅢ和BamHⅠ位点。获得的质粒命名为pUC19-RVHs-AHM-gγl。
含有质粒pUC19-RVHs-AHM-gγl的大肠杆菌命名为大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)，并在布达佩斯条约的条款下，于1997年9月29日按国际惯例储存在国立生命科学和体技术研究所、工业科学和技术代理处、MITI(Higashil-Chmoe1-3,Tsukuba City,Ibalaki Prefecture，日本)，并获得保藏号FERM BP-6127。
4．重新构建的人抗HM1.24抗体、嵌合的抗HM1.24抗体和H链杂合抗体的构建为了评估重新构建的人抗HM1.24抗体的每一条链，允许重新构建的人抗HM1.24抗体和嵌合抗HM1.24抗体作为正对照表达，在每个b型的构建中和重新构建的人抗-HM1.24抗体H链V区的构建后，为了研究FR中哪一个氨基酸序列应当被替代。允许表达H链杂合抗体。此外，为了评估重新构建的人抗HM1.24抗体L链的a型，将它与嵌合H链联合表达。
4-1．重新构建的人抗HM1.24抗体的表达(1)使用基因脉冲仪(Biorad生产)通过电穿孔将10μg每种重新构建的人抗HM1.24抗体H链的表达载体(HEF-RVHa-AHM-gγl-HEF-RVHr-AHM-gγl)和重新构建的人抗HM1.24抗体的L链的表达载体(HEF-RVLa-AHM-gk或HEF-RVLb-AHM-gk)共转化入COS-7细胞。将每一份DNA(10μg)加入0.8ml溶液中，此溶液是PBS中含有浓度为1×107细胞/ml的细胞，并接受1500V和25UF电容的脉冲。
室温下10分钟的恢复期后，将电穿孔的细胞加到30ml含10％无γ-球蛋白胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO生产)中。在37℃和5％CO2条件下在CO2培养箱BNA120D(TABAI生产)中培养72小时后，收集培养上清，在带有离心转头O3(HITACHI生产)的离心机15PR-22(HITACHI生产)1000rpm离心5分钟去除细胞碎片，用带有离心转头JA-20.1(BECKMAN生产)的离心机J2-21(BECKMAN生产)超滤微量浓缩器(Centricon100,Amicon生产)，并且用于细胞ELISA。重新构建的人抗HM1.24抗体的表达(2)使用基因脉冲仪(Biorad生产)通过电穿孔将10μg每种重新构建的人抗HM1.24抗体H链“S”型的表达载体(HEF-RVHs--AHM-gγl)和重新构建的人抗HM1.24抗体L链的表达载体(HEF-RVLa-AHM-gk)共转化入COS-7细胞。将每一份DNA(10μg)加入0.8ml溶液中，此溶液是PBS中含有浓度为1×107细胞/ml的细胞，并接受1500V和2.5UF电容的脉冲。
室温下10分钟的恢复期后，电穿孔的细胞加到30ml含10无γ-球蛋白胎牛血清的DMEM培养基(GIBCO生产)中。在37℃和5％CO2条件下于CO2培养箱BNA120D(TABAI生产)中培养72小时后，收集培养上清，在带有离心转头O3(HITACHI生产)的离心机05PR-22(HITACHI生产)1000rpm离心5分钟去除细胞碎片，用带有离心转头JA-20.1(BECKMAN生产)的离心机J2-21(BECKMAN生产)通过超滤浓缩微量浓缩器(Centricon100,Amicon生产)，用滤器MillexGVBmm(Millipore生产)进行过滤除菌，然后用于细胞ELISA。
4-2．嵌合抗HM1.24抗体的表达使用10μg每种嵌合抗HM1.24抗体H链的表达载体HEF-1.24-gγl和嵌合抗HM1.24抗体L链的表达载体HF-1.24L-gk，根据上述重新构建的人抗-HM1.24抗体的表达方法制备用于细胞-ELISA的嵌合抗HM1.24抗体。
4-3．包含人a型L链和嵌合H链的抗HM1.24抗体的表达使用10μg的嵌合抗HM1.24抗体的表达载体HEF-1.24-gγl和重新构建的人抗HM1.24抗体L链a型的表达载体HEF-RVLa-AHM-gκ，根据上述重新构建的人抗HM1.24抗体的表达方法制备用于细胞ELISA的含有人a型L链和嵌合H链的抗HM1.24抗体。
4-4．H链杂合抗体的表达使用10μgH链杂种V区的表达载体(HEF-MH-RVH-AHM-gγl或HEF-HM-RVH-AHM-gγl)和重新构建的人抗HM1.24抗体L链的表达载体HEF-RVLa-AHM-gκ，根据上述重新构建的人抗HM1.24抗体的表达方法制备用于细胞ELISA的H链杂合抗体。
4-5．抗体浓度的测定用ELISA测定获得的抗体浓度。加入100μl用包被缓冲液(0.1MNaHCO3、0.02％NaN3、pH9.6)稀释为1μg/ml的羊抗人IgG抗体(BIOSOURCE生产)固定96孔ELISA板(MaXi Sorp,NUNC生产)的每一加样个孔。并在室温下温育1小时。用100μl稀释缓冲液(50mMTris-HCl、1mM MgCl2、0.15M NaCl、0.05％Tween 20、0.02％NaN3、1％牛血清白蛋白(BSA)、pH8.1)封闭后，将100μl超滤浓缩的含有重新构建的人抗HM1.24抗体、嵌合的抗HM1.24抗体或H链杂合抗体的COS-7细胞培养上清的每一连续稀释液加到每一孔中，在室温下温育1小时。洗涤以后，加入100μl碱性磷酸酶标记的羊抗人IgG抗体(DAKO生产)。
室温下温育1小时和洗涤后，加入100μl溶解在底物缓冲液(50mMNaHCO3、10mMMgcl2、pH9.8)中的1μg/ml底物溶液(Sigma104、对硝基苯磷酸、SIGMA)，然后使用微板阅读仪3550型(Bio Rad生产)测定405nm的吸光度。使用人IgG1R(binding Site生产)作为浓度测定的标准。
5．稳定合成重新构建的人抗HM1.24抗体的CHO细胞系的建立5-1．对重新构建的人抗HM1.24抗体H链的表达载体的构建用限制性内切酶PvuⅠ和BamHⅠ消化质粒HEF-RVHr-AHM-gγl,通过1.5％低熔点琼脂糖凝胶纯化含有编码EF1启动子和重新构建的人抗HM1.24抗体H链V区DNA的约2.8kbp片段。接着，将上述DNA片段插入6kbp片段的构建重新构建的人抗HM1.24抗体H链的表达载体DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγl，其中6kbp片段是用PvuⅠ和BamHⅠ消化用于人H链表达的表达载体DHFR-ΔE-RVh-pmlf(国际申请出版号，WO92-19759)而制备的，它含有DHFR基因和编码人H链恒定区的基因。
5-2．基因导入CHO细胞为了建立重新构建的人抗HM1.24抗体的稳定合成系统，在与上述(转染入上述COS-7细胞)相似的条件下通过电穿孔方法将用PvuⅠ消化而线性化的上述表达载体DHFR-ΔE-HEF-RVHr-AHM-gγl和HEF-RVLa-AHM-gκ的基因同时导入CHO细胞DXB-11。
5-3．通过MTX的基因扩增在基因导入的CHO细胞中，只有L链和H链表达载体都导入的那些CHO细胞才能在加有500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％胎牛血清的无核苷a-MEM培养基(GIBCO-BRL生产)中成活。接下来，将10nm MTX(Sigma生产)加入上述培养基中。在增殖的克隆中，挑选能大量合成重新构建的人抗HM1.24抗体的那些克隆。因此获得重新构建的人抗HM1.24抗体合成效率约3μg/ml的克隆1，并命名为重新构建的人抗HM1.24抗体合成细胞系。
5-4．重新构建的人抗HM1.24抗体的构建在下列方法中构建重新构建的人抗HM1.24抗体。上述能合成重新构建人抗HM1.24抗体的CHO细胞在37℃和5％CO2条件下，用CO2培养箱BNAS120D(TABAI生产)在加入500μg/ml G418(GIBCO-BRL生产)和10％无γ-球蛋白的胎牛血清的无核苷α-MEM培养基(GIBCO-BRL生产)中培养10天。开始培养后第8天和第10天回收培养液，使用带有TS-9转头的离心机RL-500SP(Tony Seiko生产)在2000rpm下离心10分钟除去细胞碎片，并用具有直径0.45μM滤膜的瓶顶滤器(FALCON生产)过滤除菌。
等量PBS(-)加到能合成重新构建的人抗HM1.24抗体的CHO细胞培养液中之后，根据所附说明使用PBS(-)作为吸附/洗涤缓冲液，0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH3)作为洗脱缓冲液，使用高速抗体纯化系统ConSep LC100(MILLIPORE生产)和超D蛋白A柱(Nippon Gaishi)亲和纯化重新构建的人抗HM1.24抗体。向洗脱组分中立即加入1MTris-HCl(pH8.0)调节到约pH7.2，接着使用离心超滤浓缩仪Centriprep--10(MILLIPORE生产)进行浓缩和对PBS(-)的置换，并使用孔径0.22μM的膜滤器MILLEX-GV(MILLIPORE生产)进行过滤除菌以得到纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体。通过280nm的吸光度测定抗体浓度，并用1.350D相当于1mg/ml进行计算。实施例11．重新构建的人抗HM1.24抗体活性的测定评估重新构建的人抗HM1.24抗体的下列抗原结合活性和结合抑制活性1．抗原结合活性和结合抑制活性测定方法1-1．抗原结活性的测定使用WICH细合胞通过细胞ELISA测定抗原结合活性。如上述实施例7.1-2中所述制备细胞ELISA板。
封闭以后，将100μl从COS-7细胞培养上清浓缩液中获得的或从CHO细胞培养上清中纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体连续稀释液加入每一孔中。室温下温育2小时并洗涤以后，加入过氧化物酶标记的免抗人IgG抗体(DAKO生产)。室温下温育1小时并洗涤后，向每一孔中加入100μl底物溶液。温育后，用50μl 6N硫酸终止反应，使用微板阅读仪3550型(Bio-Rad生产)测定490nm吸光度。
1-2．结合抑制活性的测定用WISH细胞通过细胞ELISA测定通过生物素标记的小鼠抗HM1.24抗体的结合抑制活性。如上述实施例7.1-2所描述制备细胞ELISA板。封闭后，将50μl从COS-7细胞培养上清浓缩液中获得的或从CHO细胞培养上清中纯化的重新构建人抗HM1.24抗体连续稀释液加入每一孔中，同时加入50μl生物素标记的小鼠抗-HM1.24抗体。室温下温育2小时并洗涤后，加入过氧化物酶标记的链霉亲和素(DAKO生产)。室温下温育1小时并洗涤后，每一孔中加入100μl底物溶液。温育后，用50μl 6N硫酸终止反应，使用微板阅读仪3550型(Bio-Rad生产)测定490nm的吸光度。
2．重新构建的人抗HM1.24抗体的评估按所提到的以抗原结合活性的测定来评估重新构建的人抗HM1.24抗体L链的a型。如图8所显示，当L链版本a和嵌合H链联合表达时，它具有相似水平的抗原结合活性。然而考虑到活性的进一步提高以及和H链的相容性，构建L链的b型。当和H链版本a、b、f和g联合，L链的a和b型放在一起评估抗原连接活性和连接抑制活性。如图.9、10、11和12所显示，在L链所有a、b、f和h型中L链a型比b型在两个活性上都有高活性。所以重新构建人抗HM1.24抗体L链a型用于以下实验。
2-2．H链的a至e型按所提到的以抗原结合活性和结合抑制活性的测定和L链a型联合起来对重新构建的人抗HM1.24抗体H链a至e型进行评估。如图11、13、14、和15，结果显示和嵌合抗HM1.24抗体相比所有类型在两个活性上都稍弱。表明需要更多的氨基酸置换。
2-3．H链杂合抗体按所提到的以抗原结合活性的测定对H链杂合抗体进行评估。如图.16所示，结果显示对抗原结合活性人鼠杂合抗HM1.24抗体具有和嵌合抗HM1.24抗体相似的活性。而小鼠人杂合抗HM1.24抗体具有比嵌合抗HM1.24抗体稍弱的活性。这表明为了构建具有与嵌合抗HM1.24抗体相似的抗原结合活性的重新构建的人抗HM1.24抗体，有必要置换H链V区所含的包括在FR3至FR4中的氨基酸。
2-4．H链的f至r型按所提到的以抗原结合活性的测定评估重新构建人抗HM1.24抗体H链的f型。如图17所示，结果显示和嵌合抗HM1.24抗体相比它的结合活性降低，但和上面a至c型相比活性升高，表明在此类型中新置换的67、69、75和78位四个氨基酸负责重新构建的人抗体的活性。
按所提到的以抗原结合活性的测定评估重新构建人抗HM1.24抗体H链的g型。如图18和19所示，结果显示此类型在多数时候具有和上面a型相似活性，揭示如上面H链人小鼠杂种抗体所示，此类型所置换的40位氨基酸不负责重新构建的人抗体活性的提高。
按所提到的以抗原结合活性和结合抑制活性的测定评估重新构建人抗HM1.24抗体H链的h至j型。如图20、21、22和23所示，结果显示和嵌合抗HM1.24抗体相比所有类型在两个活性上较弱与上述f型具有相似活性。表明f型中新置换的四个氨基酸中67和69位氨基酸不负责重新构建的人抗体活性的提高。
按所提到的从抗原结合活性和结合抑制活性的测定评估重新构建人抗-HM1.24抗体H链的k至p型。如图24、25、26和27所示，结果显示和嵌合抗HM1.24抗体相比所有类型在两个活性上较弱和上述版本h具有相似活性，表明在这6个类型中80位氨基酸和之后新置换的氨基酸是不负责重新构建的人抗体活性的提高。
按所提到的以抗原结合活性和结合抑制活性的测定评估重新构建人抗HM1.24抗体H链的q型。如图25和27所示，结果显示此版本和上面h型或p型相比在两个活性上较弱和上述a型具有相似活性，表明78位氨基酸的置换对重新构建的人抗体活性的提高是必要的。
通过上面所提到的方法评估重新构建的人抗HM1.24抗体H链的r型。如图15和28所示，结果表明r型和嵌合抗HM1.24抗体具有相似水平的抗原结合活性和结合抑制活性。
上述结果显示为了具有与小鼠抗HM1.24抗体嵌合抗HM1.24抗体相似水平的抗原结合活性，对于重新构建的人抗HM1.24抗体所需最少的置换是30、71、和78位氨基酸和更进一步73位氨基酸。
重新构建的人抗HM1.24抗体H链a至r型的抗原结合活性和结合抑制活性总结于表6。
表6H链型 抗原结合活性结合抑制活性a + +b + +c + +d + 未测定e + 未测定f ++ ++g + +h ++ ++i ++ ++j ++ ++k ++ ++l ++ ++m ++ ++n ++ ++o ++ ++p ++ ++q + +r+++ +++2.5S型的H链按所提到的以抗原结合活性和结合抑制活性的测定和上述L链a型联合对重新构建的人抗HM1.24抗体H链S型进行评估。如图29和30所示，结果显示S型和r型具有相似水平的抗原结合活性和结合抑制活性。
如上面所提到的，即使一个或多个氨基酸残基被其它氨基酸替换后，本发明的重新构建的人抗HM1.24抗体仍保留有与抗体结合的能力。因此本发明包括重新构建的人抗HM1.24抗体，其中只要它保留原有特性，在H链或L链可变区可用其它氨基酸替换一个或更多氨基酸残基。
3．纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体的评估以上述抗原结合活性和结合抑制活性评估纯化的重新构建的人抗HM1.24抗体。如图31和32所示，结果显示重新构建的人抗HM1.24抗体和嵌合的抗HM1.24抗体具有相似水平的抗原结合活性和结合抑制活性。事实表明重新构建的人抗HM1.24抗体和小鼠抗HM1.24抗体具有相同的抗原结合活性。实施例12.嵌合的抗HM1.24抗体对人骨髓瘤小鼠模型的抗肿瘤效应1．施用抗体的制备1-1．嵌合的抗HM1.24抗体的制备使用离心超滤浓缩仪Centriprep10(Amicon生产)浓缩上面实施例6中得到的纯化的嵌合抗HM1.24抗体，并用PBS(-)替换缓冲溶液。使用具有0.22μM孔径的膜滤器MILLEX-GV(MILLIPORE)过滤除菌。使用过滤除菌的PBS(-)将抗体制备成200μg/ml的浓度，并用于以下实验。用280nm的吸光度测定抗体的浓度，并用1.350D相当于1mg/ml计算。
1-2．对照人IgG1的纯化用作嵌合抗HM1.24抗体对照的人IgG1按如下纯化。将等量的PBS(-)加到纯化的Hu IgG1 Kappa(BINDING SITE生产)中，按照所附说明将PBS(-)作为洗脱缓冲液使用高速抗体纯化系统ConSep LC100(MILIPORE生产)和Hyper D蛋白A柱(Nippon Gaishi生产)亲和纯化人IgG1。向洗脱组分中立即加入1M Tris-Hcl(pH8.0)调节至pH7.4左右，然后使用离心超滤浓缩仪Centriprep10(Amicon生产)进行浓缩和PBS(-)缓冲液的置换，用0.22μM孔径的膜滤器MILLEX-GV1MILLIPORE生产)过滤除菌。用过滤除菌的PBS(-)将人IgG1调至200μg/ml并用于以下实验。用280nm的吸光度测定抗体浓度，并用1.350D相当于1mg/ml计算。
2．小鼠血清中人血清IgG定量的方法通过下面ELISA定量小鼠血清中所含人IgG。用0.1M碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)稀释至1μg/ml的100μl羊抗人IgG加到96孔板(NUNC生产)中，4℃过夜温育以固定抗体。封闭后，将100μl连续稀释的小鼠血清或作为标准的人IgG(CAPPEL生产)加入并在室温下温育1小时。洗涤后，将100μl稀释2000倍的碱性磷酸酶标记的抗人IgG(CAPPEL生产)加入并温育，接着使用微板阅读仪3550型(Bio-Rad生产)测定405nm吸光度。
3．嵌合抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠的抗肿瘤效应3-1．人骨髓瘤细胞移植小鼠的建立按如下建立人骨髓瘤细胞移植小鼠。用加10％胎牛血清(GIBCOBRL生产)的RPMI1640培养基在3×107细胞/ml的浓度下制备用于SCID小鼠(由Nihon CLEA饲养)体内传代的KPMM2细胞。将200μl上述KPMM2细胞悬浮液通过尾静脉注射到SCID小鼠(雄性、8周、由Nihon(LEA饲养)中，此小鼠在前一天已经腹膜注射了100μl抗脱唾液酸GM1(由Wako Pure Chemical Industries Co.,Ltd生产)。
3-2．抗体的施用KPMM2细胞移植后第12天，从上述人骨髓瘤细胞移植小鼠中收集血清，使用上面2中提到的ELISA对血清中人IgG进行定量。通过血清中人IgG水平的上升证实KPMM2细胞已进入骨髓中。KPMM2细胞移植后第14、21和28天，将上面1中所制备的100μl每种抗体腹膜注射入这些小鼠中。
3-3．嵌合抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠的抗肿瘤效果的评估用小鼠存活时间评估基因抗HM1.24抗体的抗肿瘤效果。如图33所示，接受嵌合抗HM1.24抗体的小鼠和接受对照人IgG1的小鼠相比具有延长的存活时期。因而可以确定嵌合抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠有抗肿瘤效果。实施例13．重新构建的人抗HM1.24抗体ADCC活性的测定根据人类免疫研究，编辑John E.Coligan et al.,John Wiley&Sons.Inc.,1993，第七章，免疫学现行方法阐明的方法测定ADCC(抗体-依赖的细胞毒性)。
1．效应细胞的制备通过密度离心的方法从健康者外周血中分离单核细胞。这样，将等量的PBS(-)加到健康者外周血中，它们位于Ficoll-Paque PLUS(Pharmacia生产)上层，并在400g下离心40分钟。收集单核细胞层，用加10％胎牛血清(GIBCO BRL生产)的RPMI1640培养基(GIBCO BRL生产)洗四次，用相同的培养液制备成5×106/ml的细胞密度。
从SCID小鼠(由Nihon CLEA饲养)骨髓细胞中诱导LAK(淋巴因子激活的杀伤细胞)。从小鼠股骨中分离骨髓细胞，并用加10％胎牛血清(GIBCO BRL生产)的RPMI 1640培养基(GIBCO BRL生产)洗两次，用相同的培养基制备成2×105/ml的细胞密度。它们与50ng/ml重组人IL-2(R&D SYSTEMS生产)和10ng/ml重组小鼠GM-CSF(R&D SYSTEMS生产)一起在CO2培养箱(TABAI)中培养7天。用相同的培养基将细胞数目调整为2×106/ml。
2．靶细胞的制备通过在加10％胎牛血清(GIBCO BRL生产)的RPMI1640培养基(GIBCO BRL生产)中和0.1mCi的51Cr铬酸钠(ICN生产)在37℃下培养60分钟，放射标记的人骨髓瘤细胞系KPMM2(日本未审查专利出版(Kokai)号，7-236475)或来自浆细胞白血病的ARH-77[美国典型培养物保藏中心(CL-1621)]。放射标记后，细胞用相同的培养基洗三次并调整为2×105/ml。
3．ADCC实验在96孔U型底平板(Becton Dickinson生产)中加入50μl 2×105靶细胞/ml、50μl重新构建的人抗HM1.24抗体、小鼠抗HM1.24抗体、对照人IgG1(THE BINDING SITE生产)或对照小鼠IgG2a(UPC10,CAPPEL生产)并在4℃下反应15分钟。
当效应细胞(E)和靶细胞(T)的比率(E∶T)设为0∶1、3.2∶1、8∶1、20∶1或50∶1时，100μl效应细胞在CO2培养箱中培养4小时。
取出100μl上清，用r计数器(ARC-300,Aloka生产)测定释放到培养上清中的放射活性。为了测定最大放射活性，使用1％NP-40(Nakalai生产)。通过(A-C)/(B-C)×100计算细胞毒性，其中A是抗体存在时释放的放射活性(cpm),B是NP-40释放的放射活性(cpm),C是没有抗体只有培养基释放的放射活性(cpm)。
图34表示当从健康者外周血中制备的细胞作为效应细胞和KPMM2细胞作为靶细胞时得到的结果。图35表示当从健康者外周血中制备的细胞用作效应细胞和ARH-77用作靶细胞时得到的结果。当加入重新构建的人抗HM1.24抗体时与对照人IgG1相比，细胞毒性随着抗体浓度的增加而增加，表明重新构建的人抗HM1.24抗体具有ADCC活性。
此外，当加入重新构建的人抗HM1.24抗体和小鼠抗HM1.24抗体相比细胞毒性显著增加，表明重新构建的人抗HM1.24抗体比小鼠抗HM1.24抗体有更高的ADCC活性。而且，当KPMM2用作靶细胞时，重新构建的人抗HM1.24抗体以0.1μg/ml或更高浓度加入不引起细胞毒性的改变，表明0.1μg/ml或更高的浓度有充分的细胞毒性。当ARH-77用作靶细胞时，重新构建的人抗HM1.24抗体以0.1μg/ml或更高浓度加入不引起细胞毒性的改变，表明0.1μg/ml或更高的浓度有充分的细胞毒性。
图36表示当从SCID小鼠骨髓中制备的细胞用作效应细胞时获得的结果。当加入重新构建的人抗HM1.24抗体时与对照人IgG1相比，细胞毒性随着抗体浓度的增加而增加，表明重新构建人抗HM1.24抗体具有ADCC活性。此外重新构建的人抗HM1.24抗体以0.1μg/ml或更高浓度加入不引起细胞毒性的改变，表明0.1μg/ml或更高的浓度有充分的细胞毒性。
这些结果显示当所用效应细胞来自于人或小鼠时重新构建人抗HM1.24抗体都有ADCC活性。实施例14．重新构建的人抗HM1.24抗体对人骨髓瘤小鼠模型的抗肿瘤效应1．施用抗体的制备将质粒HEF-RVLa-AHM-gγl和质粒HEF-RVHr-AHM-gγl导入CHO细胞得到的重新构建人抗HM1.24抗体用过滤除菌的PBS(-)稀释至40、200和1000ug/ml的浓度。实施例12.1-2中得到的对照人IgG1用过滤除菌的PBS(-)稀释至200ug/ml的浓度，它们用作施用的抗体。
2．重新构建的人抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠的抗肿瘤效应2-1．人骨髓瘤细胞移植小鼠的建立根据实施例12.3-1建立人骨髓瘤细胞移植小鼠。所用小鼠是SCID小鼠(5周)(由Nihon CLEA饲养)。
2-2．抗体的施用KPMM2细胞移植后第9天，从上面2-1所制备的人骨髓瘤细胞移植小鼠中收集血清，用上面12.2中所提到的ELISA对血清中的人IgG进行定量。通过血清中人IgG水平的上升证实KPMM2细胞进入了骨髓中。KPMM2细胞移植后第10天，将上面1中所制备的100μl每种抗体腹膜注射到这些小鼠中。
2-3．重新构建的人抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠抗肿瘤效果的评估通过小鼠血清中人IgG量以及小鼠存活时间的改变来评估重新构建的人抗HM1.24抗体的抗肿瘤效果。
对KPMM2细胞移植后第35天收集的血清使用实施例12.2中所提到的ELISA，通过测定人IgG来测定小鼠血清中人IgG量的改变。
如图37所示，结果表明在对照人IgG1施用组中与第9天(抗体施用的前一天)相比，KPMM2细胞移植后第35天血浆中人IgG的量增加约1000倍，而在重新构建的人抗HM1.24抗体的施用组中，对任何剂量，血清中人IgG的量几乎等于或低于第9天，这表明重新构建的人抗HM1.24抗体抑制KPMM2细胞的生长。另一方面如图38所示，存活时间与对照人IgG1施用组相比，在重新构建的人抗HM1.24抗体施用组中观察到存活时间的延长。这些表明重新构建的人抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠有抗肿瘤效果。实施例15．重新构建的人抗HM1.24抗体和生存药物苯丙氨酸氮芥之间对人骨髓瘤小鼠模型抗肿瘤效果的比较1．施用药物的制备1-1．施用抗体的制备将质粒HEF-RVLa-AHM-gk和质粒HEF-RVHr-AHM-gγl导入CHO细胞得到的重新构建的人抗HM1.24抗体用过滤除菌的PBS(-)稀释至40和200μg/ml的浓度，实施例12.1-2中得到的对照人IgG1用过滤除菌的PBS(-)稀释至200μg/ml的浓度，它们用作施用的抗体。
1-2．苯丙氨酸氮芥的制备苯丙氨酸氮芥(SIGMA生产)是用于骨髓瘤的生存药物，用0.2％的羟甲基纤维素(CMC)(Daicel Chemical Industries,Ltd生产)配成0.1mg/ml的浓度。
2．重新构建的人抗HM1.24抗体和苯丙氨酸氮芥对人骨髓瘤细胞移植小鼠的抗肿瘤效果2-1．人骨髓瘤细胞移植小鼠的建立根据实施例14.2-1制备人骨髓瘤细胞移植小鼠。
2-2．药物的施用KPMM2细胞移植后第9天，从上面2-1所制备的人骨髓瘤细胞移植小鼠中收集血清，用上面12.2中所提到的ELISA对血清中的人IgG进行定量。通过血清中人IgG水平的上升证实KPMM2细胞进入了骨髓中。KPMM2细胞移植后第10天，将上面1-1中所制备的100μl每一种抗体腹膜注射到这些小鼠中。此外，从移植后第10天，每天一次，连续5天口服200μl 0.2％CMC溶液。另一方面对苯丙氨酸氮芥施用组，从KPMM2细胞移植后第10天，每天一次，连续5天，以每10g体重100μl的量(即1mg苯丙氨酸氮芥/kg)连续5天，以每10g体重100μl的量(即1mg苯丙氨酸氮芥/kg)口服上面1-1所制备的苯丙氨酸氮芥溶液。
2-3．重新构建的抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠抗肿瘤效果的评估通过小鼠血清中人IgG量以及小鼠存活时间的改变来评估重新构建的抗HM1.24抗体的抗肿瘤效果。
对KPMM2细胞移植后第35天所收集的血清使用实施例12.2中所述的ELISA，通过测定人IgG来测定小鼠血清中人IgG量的改变。如图39所示，结果表明在对照人IgG1施用组中与第9天(抗体施用的前一天)相比，KPMM2细胞移植后第35天血清中人IgG的量增加约1000倍，看起来KPMM2细胞在这些小鼠中生长。同样在苯丙氨酸氮芥施用组中，尽管没有对照人IgG施用组中那么高，但与药物施用前相比血清人IgG的量增高很多。这个结果表明丙氨酸氮芥没有很好地抑制KPMM2细胞的生长。另一方面，在重新构建的人抗HM1.24抗体施用组中，对任何剂量，血清中人IgG的量少于移植后第9天，表明重新构建的人抗HM1.24抗体抑制KPMM2细胞的生长。
另一方面，如图40所示的存活期与对照人IgG1施用组或苯丙氨酸氮芥施用组相比，在重新构建的人抗HM1.24抗体施用组中观察到存活时间的延长。以上表明重新构建的人抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞移植小鼠有抗肿瘤效果，本抗体的抗肿瘤效果强于生存药物苯丙氨酸氮芥。
上面结果表明当使用来源于人的效应细胞时，小鼠抗HM1.24抗体对人骨髓瘤细胞几乎无细胞毒性，而重新构建的人抗HM1.24抗体和嵌合抗HM1.24抗体具有很强的细胞毒性。此事实表明人源抗体的重要性，并提供重新构建的人抗HM1.24抗体用于人体的希望。
重新构建的人抗HM1.24抗体在人骨髓瘤细胞移植的SCID小鼠中具有很强的抗肿瘤效果。因此在人体中，效应细胞来自于人体。通常还存在淋巴细胞，预期重新构建的人抗HM1.24抗体有更强的抗肿瘤效果。
在骨髓瘤模型中与生存药物相比，重新构建的人抗HM1.24抗体有强的抗肿瘤效果，因此预期重新构建的人抗HM1.24抗体在治疗骨髓瘤上会是划时代的药物。参考实施例1．合成小鼠抗HM1.24单克隆抗体的杂交瘤的构建根据Goto,T.等，血液(1994)84,1992-1930中描述的方法制备能合成小鼠抗HM1.24单克隆抗体的杂交瘤。
对来自多发骨髓瘤患者的EB病毒核酸抗原(EBNA)阴性的浆细胞系KPC-32(1×107细胞)(Goto,T.等，日本临床血液学杂志(11991),32,1400)每6周2次腹膜注入BALB/c小鼠(Charles River饲养)。
为了进一步提高抗体合成的滴度，在杀死动物前3天将1.5×106KPC-32细胞注入小鼠脾中(Goto,T.等，Tokushima J.Exp.Med(1990)37、89)。杀死小鼠后，去除脾，将根据Groth,de st.&Schreidegger(肿瘤研究(1981)41,3465)方法取得的脾细胞与骨髓瘤细胞SP210进行细胞融合。
使用KPC-32细胞覆盖的平板通过ELISA(Posner,M.R.等，免疫方法杂志(1982)48,23)筛选杂交瘤培养物上清中的抗体。将5×104KPC-32细胞悬浮于50ml PBS中并等分到96孔板(U型底，Corning,Iwaki生产)中。用含有1％牛血清白蛋白(BSA)的PBS封闭以后，加入杂交瘤上清并在4℃温育2小时。接下来，它与过氧化物酶标记的羊抗小鼠IgG抗体(Zymed生产)一起于4℃反应1小时，洗涤1次，并与邻苯二胺底物溶液(Sumitomo Bakelite生产)在室温下反应30分钟。
用2N硫酸终止反应后，用ELISA阅读仪(Bio-Rad生产)测定492nm的吸光度。为了取得合成抗人免疫球蛋白抗体的杂交瘤，筛选以前吸附到人血清并与其它亚细胞成分有反应性的阳性杂交瘤培养上清。选择阳性杂交瘤，并用流式细胞术研究它们与各种细胞系和人样品的反应性。最终挑选的杂交瘤克隆经两次无性传代，并注射入降植烷处理的BALB/C小鼠的腹腔内，然后从那里获取腹水。
用硫酸铵沉淀和蛋白A亲和层析试剂盒(Ampure PA、Amersham生产)从小鼠腹水中纯化单克隆抗体。用Quick Tag FITC偶联试剂盒(Boehringer Mannheim生产)将纯化抗体偶联上异硫氰酸荧光素(FITC)。
作为结果，30个杂交瘤克隆合成的单克隆抗体与KPC-32以及RPMI8226细胞反应。无性传代以后，研究这些杂交瘤上清与其它细胞系以及来自外周血的单核细胞的反应性。
在它们中间，有三个克隆合成能与浆细胞特异反应的单克隆抗体。这三个克隆之外，挑选能够合成对流式细胞分析有用并对RPMI8226细胞有完全依赖细胞毒性的单克隆抗体的杂交瘤克隆，而且命名为HM1.24。用亚类特异的兔抗小鼠抗体(Zymed生产)通过ELISA测定此杂交瘤合成的单克隆抗体的亚类。抗HM1.24抗体有IgG2aK亚类。合成抗HM1.24抗体的杂交瘤在布达佩斯条约的条款下，于1995年9月14日按国际惯例储存于国立生命科学和人体技术研究所、工业科学和技术代理处、MITI(Higashil-Chome1-3、Tsukuba City、IbvalakiPrefecture、日本)，并得到保藏号FERM BP-5233。参考实施例2．编码HM1.24抗原多肽的cDNA的克隆1．cDNA文库的建立1)总RNA的制备按如下分离编码HM1.24抗原的cDNA,HM1.24抗原是能被小鼠抗-HM1.24单克隆抗体特异识别的多肽。根据Chirgwin等的方法(生物化学，18,5294(1979))从人多发骨髓瘤细胞系KPMM2中制备总RNA。这样2.2×108KPPM2细胞在20ml 4M硫氰酸胍(Nakalai tesque生产)中完全匀浆。
匀浆在离心管中位于5.3M氯化钯上层，然后用Beckman SW40转头在20℃以31,000rpm离心24小时以沉淀RNA。RNA沉淀用70％乙醇洗涤，溶于300μl含1mM EDTA和0.5％SDS的10nm Tris-Hcl(pH7.4)中。往其中加入链霉蛋白酶(Boehringr生产)至0.5mg/ml浓度后，于37℃下温育30分钟。混合物用酚和氯仿抽提以沉淀RNA。然后RNA沉淀溶于200μl含1mM EDTA的10mM Tris-HCl(pH7.4)中。
2)Poly(A)+RNA的制备使用约500μg上面制备的总RNA作为原材料，用Fast Track 2.0mRNA分离试离盒(Invitrogen生产)根据附于试剂盒的说明纯化Poly(A)+RNA。
3)cDNA文库的构建用10μg上面的Poly(A)+RNA作为原材料，用cDNA合成试剂盒Time Saver cDNA合成试剂盒(Pharmacia生产)根据附于试剂盒的说明合成双链cDNA，并使用定向克隆工具盒(Pharmacia生产)，根据附于试剂盒的说明将EcoRⅠ接头连接到双链cDNA上。根据附于试剂盒的说明用限制性内切酶NotⅠ处理EcoRⅠ接头。用1.5％低熔点琼脂糖凝胶(SIGMA生产)分离和纯化约500bp或更长的接头连接的双链cDNA以得到约40μl的接头连接的双链cDNA。
使用T4 DNA连接酶(GIBCO BRL生产)将上面制备的接头连接的双链cDNA连接到pCOS1载体(日本未审查专利出版(Kokai)8-255196)上以建立cDNA文库，其中pCOS1载体事先用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ以及碱性磷酸酶(Takara Shuzo)处理过。构建的cDNA文库转导入大肠杆菌DH5α(GIBCO BRL生产)，总的大小约有2.5×106独立的克隆。
2．通过定向表达进行克隆1)转染入COS-7细胞通过将上面转导的大肠杆菌5×105个克隆在含有50μg/ml氨苄青霉素的2-YT培养基(分子克隆实验室手册、Sambrook等，冷泉港实验室出版、(1989))上培养扩增cDNA，并用碱裂解法(分子克隆实验室手册、Sambrook et al.，冷泉港实验室出版、(1989))从大肠杆菌中回收质粒。获得的质粒使用基因脉冲仪(BioRad生产)通过电穿孔转染进COS-7细胞。
这样，10μg纯化的质粒DNA加到以1×107细胞/ml悬浮于PBS中的0.8ml COS-7细胞中，并接受1500V和25UF电容的脉冲。室温下10分钟恢复期后，电穿孔细胞于37℃和5％CO2的条件下在加10％胎牛血清的DMEM(GIBCO BRL生产)中培养3天。
2)淘选平板的制备用B.Seed等(美国国家科学院院，84,3365-3369(1987))的方法制备用小鼠抗HM1.24抗体覆盖的淘选平板。将小鼠抗HM1.24抗体加到50mM Tris-HCl(pH9.5)中至浓度为10μg/ml。将如此制备的3ml抗体溶液加到直径60mm的组合培养平板中，并在室温下温育2小时。用0.5M NaCl溶液洗涤3次并用含有5％胎牛血清、1mM EDTA和0.02％NaN3的PBS封闭后，这些平板用于以下的克隆。
3)cDNA文库的克隆如上所述转染的COS-7细胞用含5mM EDTA的PBS分离，然后用含5％胎牛血清的PBS洗一次。这些细胞悬浮在含有5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS中至浓度为1×106细胞/ml，然后加到上面制备的淘选平板中，室温下温育2小时。用含5％胎牛血清和0.02％NaN3的PBS洗3次后，用含0.6％SDS和10mM EDTA的溶液从粘附到淘选平板上的细胞中回收质粒DNA。
将回收的质粒DNA再次转导入大肠杆菌DH5α中。按如上扩增质粒DNA后，用碱裂解法提取质粒DNA。按上面所述回收的质粒DNA用电穿孔方法转染入COS-7细胞并从粘附细胞中回收质粒DNA。相同的步骤再重复一次，回收的DNA用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化。因此证实具有0.9kbp大小的插入片段。部分回收质粒DNA转导的大肠杆菌在含有50μg/ml氨苄青霉的2-YT琼脂板上接种。过夜培养后，从单克隆中回收质粒DNA。用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ消化此质粒，获得具有0.9kbp插入子的克隆p3.19。
根据附在试剂盒上的说明，用PRISM染料终止循环测序试剂盒(Perkin Elmer生产)反应并用ABI373A DNA测序仪(Perkn Elmer生产)测序来确定此克隆的碱基序列。其氨基酸序列和碱基序列显示于SEQ ID No:103。
将编码具有如SEQ ID No:103所说明的氨基酸序列的多肽的cDNA插入pUC19载体的XbaⅠ酶切位点，所制备的质粒命名为pRS38-pUC19。含有质粒pRS38-pUC19的大肠杆菌作为大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)在布达佩斯条约的条款下，于1993年10月5日按国际惯例储存于国立生命科学和人体技术研究所、工业科学和技术代理处、MITI(Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki Prefecture,日本)，并得到保藏号FERM BP-4434(见日本来审查专利公开(Kokai)号，7-196694)。
工业应用因为嵌合抗HM1.24抗体含有小鼠抗HM1.24抗体的可变区和人抗体的恒定区，重新构建的人抗HM1.24抗体含有小鼠抗HM1.24抗体的互补决定区、人抗体的构架区和人抗体的恒定区，它对人体有低的抗原性，有希望用作药物成分，尤其是治疗骨髓瘤的药物成份。
保藏生物和有关国际保藏单位的参考名称国立生命科学和人体技术研究所，工业科学和技术代理处，MITI地址Higashil-Chome 1-3,Tsukuba City,Ibalaki prefecture,日本1．大肠杆菌DH5α(pRS38-pUC19)保藏号FERM BP-4434保藏日期1993年10月5日2．小鼠-小鼠杂交瘤HM1.24保藏号FERM BP-5233保藏日期1995年4月27日3．大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHr-AHM-gγl)保藏号FERM BP-5643保藏日期1996年8月29日4．大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24H-gγl)保藏号FERM BP-5644保藏日期1996年8月29日5．大肠杆菌DH5α(pUC19-RVLa-AHM-gκ)保藏号FREM BP-5645保藏日期1996年8月29日6．大肠杆菌DH5α(pUC19-1.24L-gκ)保藏号FERM BP-5646保藏日期1996年8月29日7．大肠杆菌DH5α(pUC19-RVHs-AHM-gγl)保藏号FERM BP-6127保藏日期1997年9月29日序列表关于SEQ ID NO:1的信息长度394类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GGC TTC AAG ATG GAG TCA CAT TTT CTG GTC TTT GTA TTC GTG TTT 48Met Gly Phe Lys Met Glu Ser His Phe Leu Val Phe Val Phe Val Phe-20 -15 -10CTC TGG TTG TCT GGT GTT GAC GGA GAC ATT GTG ATG ACC CAG TCT CAC 96Leu Trp Leu Ser Gly Val Asp Gly Asp Ile Val Met Thr Gln Ser His-5 -1 1 5AAA TTC ATG TCC ACA TCA GTA GGA GAC AGG GTC AGC ATC ACC TGC AAG 144Lys Phe Met Ser Thr Ser Val Gly Asp Arg Val Ser Ile Thr Cys Lys10 15 20GCC AGT CAG GAT GTG AAT ACT GCT GTA GCC TGG TAT CAA 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Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA GAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120关于SEQ ID NO:27的信息长度418类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC TCG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser65 70 75ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120关于SEQ ID NO:28的信息长度418类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC 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序列描述GTCATGGTGA CTTTGCCCTT GAACTT 26关于SEQ ID NO:65的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述ATGACCGCAG ACAAGTCCAC GAGCAC 26关于SEQ ID NO:66的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCAT 26关于SEQ ID NO:67的信息长度46类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAAAGTCAC CATGACCGCA GACAAGTCCA CGAGCAC46关于SEQ ID NO:68的信息长度47类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GTGCTCGTGG ACTTGTCTGC GGTCATGGTG ACTTTGCCCT TGAACTT47关于SEQ ID NO:69的信息长度38类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAGAGCCAC CCTGACCGCA GACACGTC 38关于SEQ ID NO:70的信息长度38类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GACGTGTCTG CGGTCAGGGT GGCTCTGCCC TTGAACTT 38关于SEQ ID NO:71的信息长度18类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述CAGACAGTGG TTCAAAGT18关于SEQ ID NO:72的信息长度17类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCCCCAAAGC CAAGGTC 17关于SEQ ID NO:73的信息长度23类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述ATTTTTCCTG GAGATGGTGA TAC 23关于SEQ ID NO:74的信息长度23类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GTATCACCAT CTCCAGGAAA TAT 23关于SEQ ID NO:75的信息长度418类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GAA TGT AAC TGG ATA CTT CCT TTT ATT CTG TCA GTA ACT TCA GGT 48Met Glu Cys Asn Trp Ile Leu Pro Phe Ile Leu Ser Val Thr Ser Gly-15 -10 -5GCC TAC TCA CAG GTT CAA CTC CAG CAG TCT GGG GCT GAG CTG GCA AGA 96Ala Tyr Ser Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg-1 1 5 10CCT GGG GCT TCA GTG AAG TTG TCC TGC AAG GCT TCT GGC TAC ACC TTT144Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTA AAA CAG AGG CCT GGA CAG GGT CTG 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAA TGG ATT GGG TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT240Glu Trp Ile Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATG ACC GCA GAC ACG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Ala Asp Thr Ser Thr Ser65 70 75ACA GTC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Val Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120关于SEQ ID NO:76的信息长度418类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC 144Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AAG GCC ACA TTG ACT GCA GAT AAA TCC TCC AGT 288Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG CAA CTC AGC ATC TTG GCA TTT GAG GAC TCT GCG GTC 336Thr Ala Tyr Met Gln Leu Ser Ile Leu Ala Phe Glu Asp Ser Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCA AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGC CAA GGC ACC ACT CTC ACA GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser110 115 120关于SEQ ID NO:77的信息长度38类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述CTGGTTCGGC CCACCTCTGA AGGTTCCAGA ATCGATAG 38关于SEQ ID NO:78的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35关于SEQ ID NO:79的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35关于SEQ ID NO:80的信息长度26
类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述TGGGTGCGAC AGCGCCCTGG ACAAGG 26关于SEQ ID NO:81的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述CCTTGTCCAG GGCGCTGTCG CACCCA 26关于SEQ ID NO:82的信息长度41类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述TACATGGAGC TGAGCAGCCT GGCATTTGAG GACACGGCCG T 41关于SEQ ID NO:83的信息长度41类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述ACGGCCGTGT CCTCAAATGC CAGGCTGCTC AGCTCCATGT A 41关于SEQ ID NO:84的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AAGTTCAAGG GCAAAGCCAC CCTGAC 26关于SEQ ID NO:85的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GTCAGGGTGG CTTTGCCCTT GAACTT 26关于SEQ ID NO:86的信息长度23类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAG CCT 23关于SEQ ID NO:87的信息长度23类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGGCTGCTCA GCTGCATGTA GGC 23关于SEQ ID NO:88的信息长度38类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACAC 38关于SEQ ID NO:89的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GATCTCAGGA TGCTCAGCTG CATGTAGGCT GTGCT 35关于SEQ ID NO:90的信息长度50类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCCTACATGC AGCTGAGCAT CCTGAGATCT GAGGACTCGG CCGTGTATTA 50关于SEQ ID NO:91的信息长度50类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述ACGGCCGAGT CCTCAGATCT CAGGATGCTC AGCTGCATGT AGGCTGTGCT 50关于SEQ ID NO:92的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GAGCTGAGCA TCCTGAGATC 20关于SEQ ID NO:93的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA
序列描述GATCTCAGGA TGCTCAGCTC CATGTA 26关于SEQ ID NO:94的信息长度20类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGATCTGAGG ACTCGGCCGT 20关于SEQ ID NO:95的信息长度20类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述ACGGCCGAGT CCTCAGATCT 20关于SEQ ID NO:96的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCACGAGCAC AGCCTACATG GAGCT 35关于SEQ ID NO:97的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGGCTGTGCT CGTGGACGTG TCTGC 35关于SEQ ID NO:98的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GCAGACACGT CCTCGAGCAC AGTCTACATG GAGCT 35关于SEQ ID NO:99的信息长度35类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGCTCCATGT AGACTGTGCT CGAGGACGTG TCTGC 35关于SEQ ID NO:100的信息长度26
类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述AGAGTCACCA TCACCGCAGA CAAGTC 26关于SEQ ID NO:101的信息长度26类型核酸拓扑结构线型分子类型合成DNA序列描述GACTTGTCTG CGGTGATGGT GACTCT 26关于SEQ ID NO:102的信息长度418类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述ATG GAC TGG ACC TGG AGG GTC TTC TTC TTG CTG GCT GTA GCT CCA GGT 48Met Asp Trp Thr Trp Arg Val Phe Phe Leu Leu Ala Val Ala Pro Gly-15 -10 -5GCT CAC TCC CAG GTG CAG CTG GTG CAG TCT GGG GCT GAG GTG AAG AAG 96Ala His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys-1 1 5 10CCT GGG GCC TCA GTG AAG GTT TCC TGC AAG GCA TCT GGA TAC ACC TTC l44Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe15 20 25ACT CCC TAC TGG ATG CAG TGG GTG CGA CAG GCC CCT GGA CAA GGG CTT 192Thr Pro Tyr Trp Met Gln Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu30 35 40 45GAG TGG ATG GGA TCT ATT TTT CCT GGA GAT GGT GAT ACT AGG TAC AGT 240Glu Trp Met Gly Ser Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser50 55 60CAG AAG TTC AAG GGC AGA GTC ACC ATC ACC GCA GAC AAG TCC ACG AGC 288Gln Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser65 70 75ACA GCC TAC ATG GAG CTG AGC AGC CTG AGA TCT GAG GAC ACG GCC GTG 336Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val80 85 90TAT TAC TGT GCG AGA GGA TTA CGA CGA GGG GGG TAC TAC TTT GAC TAC 384Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr95 100 105TGG GGG CAA GGG ACC ACG GTC ACC GTC TCC TCA G 418Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser110 115 120关于SEQ ID NO:103的信息长度1013类型核酸拓扑结构线型分子类型cDNA序列描述GAATTCGGCA CGAGGGATCT GG ATG GCA TCT ACT TCG TAT GAC TAT TGC 49Met Ala Ser Thr Ser Tyr Asp Tyr Cys1 5AGA GTG CCC ATG GAA GAC GGG GAT AAG CGC TGT AAG CTT CTG CTG GGG 97Arg Val Pro Met Glu Asp Gly Asp Lys Arg Cys Lys Leu Leu Leu Gly10 15 20 25ATA GGA ATT CTG GTG CTC CTG ATC ATC GTG ATT CTG GGG GTG CCC TTG 145Ile Gly Ile Leu Val Leu Leu Ile Ile Val Ile Leu Gly Val Pro Leu30 35 40ATT ATC TTC ACC ATC AAG GCC AAC AGC GAG GCC TGC CGG GAC GGC CTT 193Ile Ile Phe Thr Ile Lys Ala Asn Ser Glu Ala Cys Arg Asp Gly Leu45 50 55CGG GCA GTG ATG GAG TGT CGC AAT GTC ACC CAT CTC CTG CAA CAA GAG241Arg Ala Val Met Glu Cys Arg Asn Val Thr His Leu Leu Gln Gln Glu60 65 70CTG ACC GAG GCC CAG AAG GGC TTT CAG GAT GTG GAG GCC CAG GCC GCC289Leu Thr Glu Ala Gln Lys Gly Phe Gln Asp Val Glu Ala Gln Ala Ala75 80 85ACC TGC AAC CAC ACT GTG ATG GCC CTA ATG GCT TCC CTG GAT GCA GAG337Thr Cys Asn His Thr Val Met Ala Leu Met Ala Ser Leu Asp Ala Glu90 95 100 105AAG GCC CAA GGA CAA AAG AAA GTG GAG GAG CTT GAG GGA GAG ATC ACT385Lys Ala Gln Gly Gln Lys Lys Val Glu Glu Leu Glu Gly Glu Ile Thr110 115 120ACA TTA AAC CAT AAG CTT CAG GAC GCG TCT GCA GAG GTG GAG CGA CTG433Thr Leu Asn His Lys Leu Gln Asp Ala Ser Ala Glu Val Glu Arg Leu125 130 135AGA AGA GAA AAC CAG GTC TTA AGC GTG AGA ATC GCG GAC AAG AAG TAC481Arg Arg Glu Asn Gln Val Leu Ser Val Arg Ile Ala Asp Lys Lys Tyr140 145 150TAC CCC AGC TCC CAG GAC TCC AGC TCC GCT GCG GCG CCC CAG CTG CTG529Tyr Pro Ser Ser Gln Asp Ser Ser Ser Ala Ala Ala Pro Gln Leu Leu155 160 165ATT GTG CTG CTG GGC CTC AGC GCT CTG CTG CAG TGA GATCCCAGGA 575Ile Val Leu Leu Gly Leu Ser Ala Leu Leu Gln ***170 175 180AGCTGGCACA TCTTGGAAGG TCCGTCCTGC TCGGCTTTTC GCTTGAACAT TCCCTTGATC 635TCATCAGTTC TGAGCGGGTC ATGGGGCAAC ACGGTTAGCG GGGAGAGCAC GGGGTAGCCG 695GAGAAGGGCC TCTGGAGCAG GTCTGGAGGG GCCATGGGGC AGTCCTGGGT CTGGGGACAC 755AGTCGGGTTG ACCCAGGGCT GTCTCCCTCC AGAGCCTCCC TCCGGACAAT GAGTCCCCCC 815TCTTGTCTCC CACCCTGAGA TTGGGCATGG GGTGCGGTGT GGGGGGCATG TGCTGCCTGT 875TGTTATGGGT TTTTTTTGCG GGGGGGGTTG CTTTTTTCTG GGGTCTTTGA GCTCCAAAAA 935AATAAACACT TCCTTTGAGG GAGAGCACAC CTTAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 995AAAATTCGGG CGGCCGCC 101权利要求
1．包含人轻(L)链恒定区(C区)和抗HM1.24抗体的L链可变(V)区的嵌合L链。
2．根据权利要求1所述的嵌合L链，其中所述的L链V区具有如SEQ ID No:1列出的氨基酸序列。
3．根据权利要求1所述的嵌合L链，其中所述人L链C区是Cκ。
4．包含人重(H)链恒定区和抗HM1.24抗体的H链可变(V)区的嵌合H链。
5．根据权利要求4所述的嵌合H链，其中所述的H链V区具有如SEQ ID No:2列出的氨基酸序列。
6．根据权利要求4所述的嵌合H链，其中所述的人H链C区是Cγ。
7．一种嵌合抗体，包含(1)含有人L链C区和抗HM1.24抗体的L链V区的L链；和(2)含有人H链C区和抗HM1.24抗体的H链V区的H链。
8．根据权利要求7所述的嵌合抗体，其中所述的L链V区含有如SEQ ID No:1列出的氨基酸序列，而所述的H链V区含有如SEQ ID No:2列出的氨基酸序列。
9．抗HM1.24抗体的重新构建的人L链的V区，包含(1)人L链V区的构架区(FR)，和(2)抗HM1.24抗体的L链V区的互补决定区(CDR)。
10．根据权利要求9所述的重新构建的人L链的V区，其中所述CDR含有由以下氨基酸序列表示的氨基酸序列CDR1:Lys Ala Ser Gln Asp Val Asn Thr Ala Val Ala(SEQID No:3)CDR2:Ser Ala Ser Asn Arg Tyr Thr(SEQ ID No:4)CDR3:Gln Gln His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr(SEQ ID No:5)。
11．根据权利要求10所述的重新构建的人L链的V区，其中所述FR来自人亚群Ⅰ(HSGⅠ)的人抗体的FR。
12．根据权利要求11所述的重新构建的人L链的V区，其中所述FR来自人抗体REI的FR。
13．根据权利要求11所述的重新构建的人L链的V区，其中所述FR基本上与人抗体REI的FR相同。
14．根据权利要求11所述的重新构建的人L链的V区，其中所述的L链V区具有如表1中RVLa为代表的氨基酸序列。
15．抗HM1.24抗体的重新构建的人H链的V区，包含(1)人H链V区的FR，和(2)抗HM1.24抗体的H链V区的CDR。
16．根据权利要求15所述的重新构建的人H链的V区，其中所述CDR具有由以下氨基酸序列表示的氨基酸序列CDR1:Pro Tyr Trp Met Gln(SEQ ID No:6)CDR2:Ser Ile Phe Gly Asp Gly Asp Thr Arg Tyr Ser Gln LysPhe Lys Gly(SEQ ID No:7)CDR3:Gly Leu Arg Arg Gly Gly Tyr Tyr Phe Asp Tyr(SEQID No:8)。
17．根据权利要求16所述的重新构建的人H链的V区，其中所述FR来自HSGⅠ的人抗体的FR。
18．根据权利要求16所述的重新构建的人H链的V区，其中所述FR1-3来自人抗体HG3的FR1-3。
19．根据权利要求16所述的重新构建的人H链的V区，其中所述FR1-3基本上与人抗体HG3的FR1-3相同，并且所述FR4基本上与人抗体JH6的FR4相同。
20．根据权利要求16所述的重新构建的人抗体的H链，其中根据Kabat定义所述FR1中第30位氨基酸是苏氨酸，根据Kabat定义所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，根据Kabat定义所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
21．根据权利要求16所述的重新构建的人抗体的H链，其中根据Kabat定义所述FR3中第73位氨基酸是赖氨酸。
22．根据权利要求17所述的重新构建的人H链的V区，其中所述的H链V区含有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs代表的氨基酸序列。
23．抗HM1.24抗体的重新构建的人L链，包含(1)人L链C区，和(2)包含人L链FR和抗HM1.24抗体的L链CDR的L链V区。
24．根据权利要求23所述的重新构建的人L链，其中所述的人L链C区是人Cκ区，所述的人L链的FR来自HSGI的人抗体的FR，并且所述的L链CDR具有权利要求10所示的氨基酸序列。
25．根据权利要求23所述的重新构建的人L链的V区，其中所述的FR来自人抗体REI的FR。
26．根据权利要求23所述的重新构建的人L链的V区，其中所述FR基本上与人抗体REI的FR相同。
27．根据权利要求23所述的重新构建的人L链，其中所述的L链V区具有如表3中RVLa所代表的氨基酸序列。
28．抗HM1.24抗体的重新构建的人H链，包含(1)人H链C区，和(2)包含人H链FR和抗HM1.24抗体的H链CDR的H链V区。
29．根据权利要求28所述的重新构建的人H链，其中所述的人H链C区是人Cγ1区，所述的人H链FR来自HSGⅠ的人抗体FR，并且所述的H链CDR具有权利要求16中所示的氨基酸序列。
30．根据权利要求28所述的重新构建的人H链，其中所述的FR1-3来自人抗体HG3的FR1-3并且所述的FR4来自人抗体JH6的FR4。
31．根据权利要求28所述的重新构建的人H链，其中所述FR1-3基本上与人抗体HG3的FR1-3相同并且所述FR4基本上与人抗体JH6的FR4相同。
32．根据权利要求28所述的重新构建的人抗体的H链，其中根据Kabat定义所述FR1中第30位氨基酸是苏氨酸，根据Kabat定义所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，以及根据Kabat定义所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
33．根据权利要求28所述的重新构建的人抗体的H链，其中根据Kabat定义所述FR3中第73位氨基酸是赖氨酸。
34．根据权利要求28所述的重新构建的人H链，其中所述的H链V区具有如表2至表4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
35．抗HM1.24抗体的重新构建的人抗体，包含(A)L链，包含(1)人L链C区，和(2)包含人L链的FR和抗HM1.24抗体的L链CDR的L链V区；以及(B)H链，包含(1)人H链C区，和(2)包含人H链的FR和抗HM1.24抗体的H链CDR的H链V区。
36．根据权利要求35所述的重新构建的人抗体，其中所述的L链CDR具有权利要求10中所示的氨基酸序列并且所述的H链CDR具有权利要求16中所示的氨基酸序列。
37．根据权利要求35所述的重新构建的人抗体，其中所述的L链CDR具有权利要求10中所示的氨基酸序列；所述的H链CDR含有权利要求16中所示的氨基酸序列；所述的人L链的FR来自HSGⅠ的抗体的FR；所述的人H链的FR来自HSGⅠ的人抗体的FR；所述的人L链C区是人Cκ区；并且所述的人H链C区是人Cγ1区。
38．根据权利要求35所述的重新构建的人抗体，其中所述的L链的FR来自人抗体REI的FR，所述的H链的FR1-3来自人抗体HG3，并且所述的H链的FR4来自人抗体JH6的FR4。
39．根据权利要求35所述的重新构建的人抗体，其中所述的L链V区具有如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
40．根据权利要求35所述的重新构建的人抗体，其中所述的H链V区具有如表2至表4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
41．编码抗HM1.24抗体的L链V区的DNA。
42．根据权利要求41所述的DNA，其中所述的L链V区编码如SEQID No:1中列出的氨基酸序列。
43．根据权利要求41所述的DNA，其中编码所述L链V区的DNA具有SEQ ID No:1中列出的核苷酸序列。
44．编码抗HM1.24抗体的H链V区的DNA。
45．根据权利要求44所述的DNA，其中所述的H链V区编码如SEQID No:2中列出的氨基酸序列。
46．根据权利要求44所述的DNA，其中编码所述H链V区的DNA具有如SEQ ID No:2中列出的核苷酸序列。
47．编码嵌合L链的DNA，包含(1)人L链C区；和(2)抗HM1.24抗体的L链V区。
48．根据权利要求47所述的DNA，其中所述的L链V区编码如SEQID No:1中列出的氨基酸序列。
49．根据权利要求47所述的DNA，其中所述的L链V区含有如SEQID No:1中列出的核苷酸序列。
50．编码嵌合H链的DNA，包含(1)人H链C区；和(2)抗HM1.24抗体的H链V区。
51．根据权利要求50所述的DNA，其中所述的H链V区编码如SEQID No:2中列出的氨基酸序列。
52．根据权利要求50所述的DNA，其中所述的H链V区具有如SEQID No:2中列出的核苷酸序列。
53．编码抗HM1.24抗体的重新构建的人L链V区的DNA，包含(1)人L链V区的FR；和(2)抗HM1.24抗体的L链V区的CDR。
54．根据权利要求53所述的编码重新构建的人L链V区的DNA，其中所述CDR具有权利要求10中所示的氨基酸序列。
55．根据权利要求53所述的编码重新构建的人L链V区的DNA，其中所述FR来自HSGⅠ的人抗体的FR。
56．根据权利要求53所述的编码重新构建的人L链V区的DNA，其中所述FR来自人抗体REI的FR。
57．根据权利要求53所述的编码重新构建的人L链V区的DNA，其中所述FR基本上与人抗体REI的FR相同。
58．根据权利要求51所述的DNA，其中所述的L链V区编码如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
59．根据权利要求53所述的编码重新构建的人V区的DNA，具有如SEQ ID No:9中列出的核苷酸序列。
60．编码抗HM1.24抗体的重新构建的人H链V区的DNA，包含(1)人H链V区的FR；和(2)抗HM1.24抗体的H链V区的CDR。
61．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，其中所述CDR具有权利要求16中所示的氨基酸序列。
62．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，其中所述FR来自HSGI的人抗体的FR。
63．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，其中所述FR1-3来自人抗体HG3的FR1-3。
64．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，其中所述FR1-3基本上与人抗体HG3的FR1-3相同。
65．根据权利要求60所述的编码重新构建的人抗体H链V区的DNA，其中根据Kabat定义所述FR1中第30位氨基酸是苏氨酸，根据Kabat定义所述FR3中第71位氨基酸是丙氨酸，根据Kabat定义所述FR3中第78位氨基酸是丙氨酸。
66．根据权利要求60所述的编码重新构建的人抗体H链V区的DNA，其中根据Kabat定义所述FR3中第73位氨基酸是赖氨酸。
67．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，其中所述H链V区具有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk、RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr或RVHs所代表的氨基酸序列。
68．根据权利要求60所述的编码重新构建的人H链V区的DNA，具有如SEQ ID No:18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或102中列出的核苷酸序列。
69．编码抗HM1.24抗体的重新构建的人L链的DNA，包含(1)人L链C区；和(2)包含人L链的FR和抗HM1.24抗体L链的CDR的L链V区。
70．根据权利要求69所述的DNA，其中所述的L链V区编码如表1中RVLa所代表的氨基酸序列。
71．根据权利要求69所述的DNA，其中所述的L链V区具有SEQ IDNo:9中列出的核苷酸序列。
72．根据权利要求69所述的DNA，其中所述的L链C区是人L链的Cκ区。
73．编码抗HM1.24抗体的重新构建的人H链的DNA，包含(1)人H链C区；和(2)包含人H链的FR和抗HM1.24抗体H链的CDR的H链V区。
74．根据权利要求73所述的编码重新构建的人H链的DNA，其中所述H链V区具有如表2至4中RVHf、RVHh、RVHi、RVHj、RVHk RVHl、RVHfm、RVHn、RVHo、RVHp、RVHr、或RVHs所代表的氨基酸序列。
75．根据权利要求73所述的编码重新构建的人H链的DNA，其中所述H链V区具有如SEQ ID No:18、19、20、21、22、23、24、25、26、28或102中列出的核苷酸序列。
76．根据权利要求73所述的编码重新构建的人H链的DNA，其中所述的人H链C区是人H链的Cγ1区。
77．包含根据权利要求41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75和76中任意一项所述的DNA的载体。
78．用含根据权利要求41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75和76中任意一项的所述DNA的载体转化的宿主细胞。
79．一种生产抗HM1.24抗体的嵌合抗体的方法，包括以下步骤培养用包含根据权利要求41、42、43、47、78和49中任意一项所述DNA的表达载体和包含根据权利要求44、45、46、50、51和52中任意一项所述DNA的表达载体；并回收所需抗体。
80．一种生产抗HM1.24抗体的重新构建的人抗体的方法，包含以下步骤培养用包含根据权利要求53、54、55、56、57、58、59、69、70、71和72中任意一项所述DNA的表达载体和包含根据权利要求61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、和76中任意一项所述DNA的表达载体共转化的宿主细胞；并回收所需抗体。
81．含嵌合抗体为活性成分的药物组合物，所述嵌合抗体特异识别具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
82．含嵌合的抗HM1.24抗体为活性成分的药物组合物。
83．含嵌合抗体为活性成分的骨髓瘤治疗剂，所述嵌合抗体识别具有SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
84．含嵌合的抗HM1.24抗体为活性成分的骨髓瘤治疗剂。
85．含重新构建的人抗体为活性成分的药物组合物，所述抗体特异识别具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
86．含重新构建的抗HM1.24抗体为活性成分的药物组合物。
87．含重新构建的人抗体为活性成分的骨髓瘤治疗剂，所述抗体识别具有如SEQ ID No:103中列出的氨基酸序列的多肽。
88．含重新构建的人抗HM1.24抗体为活性成分的骨髓瘤治疗剂。
全文摘要
重新构建的人抗HM1.24抗体,包含:(A)L链,包含:(1)人L键C区和(2)含有人L链构架区(FR)和小鼠抗HM1.24抗体L链互补决定区(CDR)的L链V区;以及(B)H链,包含:(1)人H链C区和(2)含有人H链FR和小鼠抗HM1.24抗体CDR的H链V区。因为此抗体大部分来自人抗体并且CDR抗原性较弱,所以这种重新构建的人抗体对人具有弱抗原性,因此预期可用于治疗。
文档编号A61K39/395GK1235639SQ97199215
公开日1999年11月17日 申请日期1997年10月3日 优先权日1996年10月4日
发明者小野浩一郎, 大友俊彦, 土屋政幸, 吉村康史, 小石原保夫, 小阪昌明 申请人:中外制药株式会社