专利名称：牛泌乳相关的亲免疫性蛋白(cd14),编码基因以及在b细胞激活中的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于免疫学，生物化学以及细胞与分子生物学的领域，涉及称为LAIT蛋白能激活B细胞的蛋白质或者那些转录时修饰的和/或转录后修饰的蛋白质。本发明也涉及该蛋白在药用制剂中的应用，和包含LAIT蛋白或其功能衍生物的药用组合物。本发明也涉及编码牛LAIT蛋白或其功能衍生物的核酸分子以及纯化激活B细胞的天然和重组形式的上述蛋白质的方法。
背景技术：
骨髓来源的“B”淋巴细胞，通常称为B细胞，是在淋巴结、血液，以及免疫系统的次级淋巴器官中存在的一种白血球。B细胞是抗体分泌细胞，浆细胞的前体细胞，它们对体液免疫反应的诱导是主要的。
在成年人中大部分体液免疫反应的诱导包括许多在胸腺来源的T淋巴细胞，通常称为T细胞，抗原递呈细胞(APC)，和B细胞之间的细胞相互作用〔《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)147:1159,1978；PNAS77:1612,1982；PNAS79:1989,1989；《免疫学综述》(Immunol,Rev.)95:914,1987〕。
正如目前的理解，T细胞依赖的B细胞激活包括T细胞一旦识别抗原后的激活，该抗原与主要组织相容性复合物(MHC)所编码的蛋白质相结合由APC递呈，这些蛋白质表达于APC的细胞表面。该抗原特异的和MHC限制的T细胞APC相互作用导致两种细胞的相互激活，以及T细胞生理功能的改变，如它的辅助功能变得明显。
辅助T细胞可以激活抗原特异的B细胞。T细胞-B细胞相互作用的抗原特异性因B细胞最终能够作为APC发挥功能而被保持。这样，尽管静态的B细胞不是有效的APC(PNAS 79:1989,1982)，但是它们通过膜结合的免疫球蛋白与抗原特异性地相互作用，该特异性反应了其子细胞将分泌的免疫球蛋白的特异性(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)140:904,1974)。
免疫球蛋白介导的特异性B细胞的抗原内化-包括另一类APC，滤泡树突状细胞，的递呈-导致B细胞起始抗原加工过程，上调MHCⅡ类分子和B7的表达，以及与MHC相结合的抗原衍生肽的递呈(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)178:2055,1993)。通过该途径激活的B细胞是激活的辅助T细胞的靶细胞。
T细胞的辅助功能包括T细胞-B细胞相互作用，以及T细胞来源的可溶性介质，称为细胞因子，与B细胞膜上被表达的其同源配体之间的相互作用所传递的信号。T细胞-B细胞相互作用也是MHC限制的，类似于T细胞-APC相互作用(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)12:627,1982；《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)12:634,1982)。然而，那些介导这两种淋巴细胞系之间MHC限制的相互作用的分子，尤其是T细胞抗原受体(TcR)，和B细胞表达的MHC/抗原复合物的特异性相互作用并不表明B细胞增殖和分化的诱导(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)18:375,1988)。
主要的分子相互作用，由T细胞-B细胞之间相互作用的需求来反映，是通过B细胞浆膜上表达的CD40，和其同源配体，gp39(或CD40L)它表达于T细胞的浆膜上，来介导的(PNAS89:6550,1992；《自然》(Nature)357:80,1982)。与该模型一致的观察是随着T细胞-APC的相互作用，后者在细胞膜上的表达增加，T细胞-B细胞的相互作用亦然(PNAS 89:6550,1992)。再者，膜免疫球蛋白介导的B细胞与抗原的相互作用导致CD40在膜上的表达增加(Sem.inImmunol 6:303,1994)。CD40与CD40L之间的相互作用表明了B细胞增殖，B细胞分化成免疫球蛋白分泌细胞，以及免疫球蛋白独特型转换的诱导(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)198:1567,1993)。
与该模型相一致的观察是可溶性CD40L，或CD40特异的单克隆抗体(mAb)可以诱导B细胞增殖并分化成免疫球蛋白分泌细胞(Sem.in Immunol)6:267,1994；PNAS 83:4494,1986；《免疫学杂志》J.Immunol.140:1425,1988)。
除了必需T细胞-B细胞相互作用之外，许多T细胞来源的细胞因子，IL-2,IL-4和IL-5对B细胞增殖和分化也是重要的。B细胞对这些细胞因子的敏感性很大程度上受到以前与T细胞相互作用的限制。这样，随着与T细胞的相互作用，B细胞增加了细胞因子特异性膜受体的表达(PNAS 80:6628,1983；《免疫学杂志》(J.Immunol.)145:2025,1990；《免疫学杂志》(J.Immunol.)146:1118,1991)。已经证实IL-2和IL-5能促进激活B细胞的增殖(PNAS 77:1612,1980；《免疫学综述》(Immunol.Rev.)52:115,1980)。再者，IL-4和抗免疫球蛋白已经证实能够协同促进B细胞的增殖(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)155:914,1982)。
在该事件中值的注意的例外是静止B细胞对IL-4和IL-5的反应。IL-4诱导MHCⅡ类蛋白的从头转录和翻译(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)155:914,1982；PNAS 81:6149,1984；《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)160:679,1984)，而IL-5能够在缺乏细胞增殖的情况下促进静止B细胞分化成免疫球蛋白高分泌细胞(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)22:2323,1992)。
在任一事件中，来自T细胞和B细胞膜分子之间分子相互作用的信号，以及来自T细胞来源的细胞因子与它们在B细胞上的同源配体相互作用的信号均是复杂信号系统的组成部分。每一信号都驱使B细胞进展到激活的另一时相，使它对随后的进展信号敏感。这些信号相互补充，而不是单独具有驱动B细胞增殖和分化全过程的能力(《免疫学综述》(Immunol.Rev.)95:177,1987)。
1988年，发现了羊初乳中的独特活性(《免疫学杂志》(J.Immunol.)140:1366,1988)。采用蛋白质纯化的经典技术已经部分纯化了脯氨酸富集的蛋白质(PRP)。已经证明该蛋白质能够促进静止B细胞诱导进入细胞周期，并且促进它们分化成免疫球蛋白高分泌细胞。很明显，这是介导这些功能的哺乳动物蛋白质的第一例报告。
随后制备羊PRP特异的单克隆抗体。当PRP制剂通过已用抗体准备的亲和柱时，所有的PRP被层析柱截获，这通过对洗脱液和流出液的Western杂交分析评估。然而，所有的B细胞刺激活性均见于流出液中。这样，已发表的羊初乳中存在的B细胞系生物活性的特征不能归因于PRP(未发表的资料)。
发明概要本发明描述一种新牛蛋白质以及编码该蛋白质的分离核苷酸序列，该蛋白质能够激活哺乳动物来源的B细胞。基本纯化的LAIT蛋白或其转录时和/或转录后修饰的蛋白质形式可通过生化纯化来制备，或通过重组的方法在基本上不含其它与之天然相关的蛋白质的原核或真核宿主中进行制备。再者，本发明也包括从牛初乳乳清中纯化LAIT蛋白或翻译时和/或翻译后修饰形式的本发明LAIT蛋白的方法，其包括(ⅰ)对所述的样品中所包含的蛋白质进行盐析(ⅱ)利用经典的蛋白质分离技术从已在(ⅰ)步中盐析的蛋白质中富集和最终纯化LAIT蛋白。
在每种情况下所述的蛋白包含所需要的生物活性。
本发明也涉及包含编码LAIT蛋白质的核苷酸序列的核酸分子。该核酸分子可以是cDNA或基因组DNA。
所分离的牛蛋白与人CD14和小鼠CD14具有同源性，因而也称之为牛CD14。本发明包括激活B细胞的方法，尤其是通过施用CD14，该蛋白质的重组形式，或其功能性衍生物在需要该激活的哺乳动物中激活B细胞的方法。
在优选实施方案中，哺乳动物是病人。
根据一方面，本发明包括将CD14加入到婴儿饮食配方中。本发明包括将CD14施用于婴儿，给婴儿喂该饮食配方是施用的优选方式。
在另一方面中，本发明包括将CD14掺入使之成为接种的成分。本发明包括将CD14和抗原施用于需要免疫的病人，施用的优选方式包括施用含CD14和抗原的单一制剂。
在另一方面中，本发明包括CD14施用于患T细胞免疫缺陷的病人。在优选方面中，本发明包括将CD14施用于患gp39低表达或病人T细胞表面完全缺乏的特定T细胞功能障碍的病人。
在另一方面中，本发明包括将抗CD14抗体施用于患功能障碍的病人，其中由于血清CD14高于正常水平因而病人的B细胞是高度活化。在优选的方面中，本发明包括将抗CD14抗体施用于患类风湿关节炎的患者，其中由于B细胞被血清CD14的激活而分泌类风湿因子。
本发明包括制备分泌所需特异性mAb的杂交瘤的方法，即将B细胞与亚最适量有丝分裂浓度的CD14和用以产生抗体的抗原一起培养。以该方法激活的B细胞群富含激活的抗原特异的B细胞，然后将它们用于制备分泌所需特异性mAb的杂交瘤。
本发明包括CD14在制备用于需要B细胞激活的哺乳动物中激活B细胞的药物中的应用。
天然或重组CD14均可用于本发明。
在本发明的上下文中，术语“CD14”包括小鼠，牛或人CD14。术语定义根据本发明“功能性衍生物”至少保留一部分CD14的功能，例如与特异性抗体结合或与具有允许其利用的所述受体的细胞上的同源受体结合。本文所用的术语“功能性衍生物”包括“片断”或“CD14”的“变体”，这些术语定义如下。
CD14的“片断”指任何亚类的多肽，即，更短的肽。术语“片断”用于指明来源于具有天然存在的蛋白序列，在C末端、N末端，和其序列内的一个或多个位点包含一个或多个氨基酸缺失的CD14的多肽。这些片断应该保留完整CD14多肽或转录时和/或转录后修饰形式的CD14特异性的一种或多种生物活性或功能。
CD14的“变体”是指具有相似于天然CD14或其片断的一级序列的多肽，这样其天然活性至少部分地保留。变体肽可以通过合成法或在编码所述多肽的cDNA中产生突变的方法来加以制备，该多肽保留所述多肽的生物活性，在多肽中包括缺失、插入或保守氨基酸的替代。
本文所用的术语“抗体”是能够被所述蛋白质不保守区中的独特表位结合的免疫球蛋白，因而使抗体能够区别一种蛋白质与另一种蛋白质。术语“表位”意思是指任何分子中能够被抗体结合的部位。术语“抗体”包括多克隆抗体，单克隆抗体(mAbs)或嵌合抗体。
多克隆抗体是来自抗原免疫的动物血清的异质抗体分子群。
单克隆抗体是能够结合抗原上一个独特表位的均一抗体群。MAbs可通过本领域中的技术人员熟知的方法获得。这些抗体可以是任何一类免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、IgD，以及它们的任一亚类。术语“抗体”也包括完整的分子以及它们的片断，例如，Fab和F(ab′)2，它们能够结合抗原。Fab和F(ab′)2缺乏完整抗体的Fc段，更迅速地从血液循环中清除，并且比完整抗体有更少的非特异性组织结合(Wahl等，J.Nucl.Med.24:316-325,1983)。
嵌合抗体是这样一种分子，其不同的部分来自不同的动物种类，例如具有来自小鼠mAb的可变区和来自人免疫球蛋白的恒定区的嵌合抗体。
“抗原”是能被抗体结合的一种分子或分子的一部分，它另外能够诱导动物产生能与该抗原的表位相结合的抗体。抗原可以具有一个或不止一个表位。当抗体对多肽，片断，或其变体被述为“特异的”，或者被述为能与多肽，片断或其变体结合的时候，意思是抗原以高度选择性的方式与其相应抗体反应而不与被其它抗原激发的大量其它抗体反应。
附图简述
图1A-1C表示天然牛LAIT(nBo-LAIT)蛋白的纯化。图1A表示已装载了50mg 62％(v/v)(NH4)2SO4沉淀物的阴离子柱〔FPLC-Mono-Q,Pharmacia〕的洗脱图。结合的蛋白质用10mMBis-tris丙烷中50-400mM的梯度NaCl洗脱，同时pH梯度7.5-9.5。表1A表示具有高峰活性的样品，样品#57，的生物活性，正如以前所述分离出高悬浮密度的小鼠脾B细胞(《免疫学杂志》(J.Immunol131:581,1983)，并在0.2ml无血清培养基中以5×104个细胞培养于96孔平底组织培养板中(Costar)。在含，或不含0.25μg/ml LPS的情况下加入每一样品至终浓度10％(v/v)。在40小时时，培养物中加入1μCi的3H-TdR,6小时后收集到滤纸盘上，并用闪烁计数仪评估胸苷摄取情况。数字代表cpm×10-3。图1B表示已装载了20mg样品#57(图1A)的分子筛柱〔FPLC-Superdex 75,Pharmacia〕的层析图。柱子在含0.45M NaCl pH8.0的20mM tris-HCl中平衡。表1B表示高峰样品，样品#38，的生物活性，如图1A所述进行评估。图1C表示已装载了1mg样品#38(图1B)的羟基磷灰石柱〔FPLC-羟基磷灰石，Pharmacia〕的洗脱图。结合的蛋白质用含1mM NaClpH6.8 1-500mM K2HPO4的梯度缓冲液洗脱。表1C表示高峰样品，样品#25，的生物活性，如图1A所述进行评估。图中的插入表示从样品#25中取出的大约5μg蛋白质的银染SDS-PAGE胶。左泳道样品#25；右泳道MW标志物，从顶端开始分别是97、66、45、31、21和14kD。
图2表示人CD14(SEQ ID NO:5)的已知序列和nBo-LAIT的序列片断。Bo-LAIT片断来自亲和纯化的初乳nBo-LAIT(见图3)。与人CD14残基235-264和344-355相应的片断分别是主要和次要肽，每一片断大约18kD，用CnBr裂解产生，并通过反相HPLC(C8柱，Pharmacia)分离。与人CD14残基53-67相应的片断是CnBr裂解所产生的24kD片断的部分序列，并通过SDS-PAGE分离而且电转到PVDF膜上。与人CD14残基19-36和151-165相对应的片断是用胰蛋白酶裂解产生的，并通过反相HPLC分离(C8柱，Pharmacia)。对每一片断将牛序列与人CD14预计序列重叠的长度标以下划线。短线表示相同氨基酸，而不同于人序列的那些被标出。
图3表示从牛和人中亲和纯化的初乳LAIT蛋白的SDS-PAGE和银染。泳道1MW标志物，如图1C中所示；泳道2牛初乳乳清中的62.5％(v/v)(NH4)2SO4沉淀物；泳道3从#842-Sepharose亲和柱中pH2.5的洗脱液；泳道4从CD14特异性mAb63D3(PNAS77:6764,1980)-Sepharose亲和柱，已装载了泳道5中代表的物质，中pH2.5的洗脱液；泳道5Sephacryl S 100HR分离的人初乳乳清。泳道1-5中每一泳道均含5μg蛋白质。5×104高悬浮密度的小鼠脾B细胞在指定的刺激物存在下培养于无血清培养基中至40小时，加入1μCi的3H-TdR,6小时后收集到滤纸盘上，通过液体闪烁计数仪来评估胸苷摄入，所获得的结果示于表2，数字代表cpm×10-3。生物测定的详细情况如图1A所述。对照cpm×10-3无刺激物，0.3；50μg/mlLPS,75.0；0.25μg/ml LPS〔LPS↓〕,0.8；和1μg/ml mlgM特异的mAbb-7-6(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)14:753,1984),0.7。
图4A和4B表示热不稳定性和抗体介导的nBo-LAIT活性的抑制。图4A表示在95℃已加热10分钟的指定浓度的亲和纯化的nBo-LAIT存在下，按图1A所述而培养的5×104高悬浮密度的小鼠脾B细胞的胸苷摄入情况(●)，和未被加热的nBo-LAIT存在下的胸苷摄入情况(○)。在40小时培养物中加入3H-TdR,6小时后收集，然后液体闪烁计数仪评估胸苷摄入。插入表示含指定浓度LPS的培养物的反应，LPS已按照对nBo-LAIT的处理被加热(或未加热)。图4B表示在0.25μg/ml亲和纯化的nBo-LAIT或50μg/ml LPS存在下，按图4A所述而建立的培养物的胸苷摄入。这些刺激物每一种均在指定浓度的多克隆兔IgG抗-Bo-LAIT,#842，或正常兔IgG存在下进行培养。#842 IgG对nBo-LAIT和LPS介导的刺激的胸苷摄入的抑制百分数示于括号中。正常兔IgG介导的对nBo-LAIT和LPS刺激的抑制水平分别为9～20％，和12～31％。#842 IgG在0.4和50μg/ml单独直接诱导的CPM分别为454±53～764±69，对正常兔IgG来说，在0.4和50μg/ml分别为297±34的420±31。未刺激的对照对两组实验均为195±29。
图5A表示含牛CD14基因的7.1kb EcoRl-Xhol片断的限制性图谱。限制性位点的简称是X,Xhol；P,Pstl；O,Ncol；B,BamHⅠ；N,Notl；D,BssHⅠ；T,BstEll；M,Smal；S,Sacll；C,Hpal；R,EcoRⅤ；A,Sphl；G,BglⅡ；H,HindⅢ；E,EcoRⅠ。图5B是牛CD14位点的图表。阴影区表示基因的编码区，空白区是内含子序列。ATG起始密码子上游的短线区是5′非翻译区，而TAA终止密码子下游的短线区是3′非翻译区。图5C是表示所采用的测序策略的图表。箭头表示测序的方向。片断数在右侧指明(详见正文)。
图6表示牛(SEQ ID NO:1)，人(SEQ ID NO:2)和小鼠(SEQ ID NO:3)CD14编码区的核酸序列的比较图。第一个碱基的位置对应于ATG密码子的第一个核苷酸，最后一个核苷酸对应于TAA终止密码子的第三个核苷酸。采用DNA STAR-Megalign软件，利用具有重要残基表的Clustal法进行序列对比。在该对比中使用的人cDNA序列(登记号PO8571)和小鼠cDNA序列(登记号PO8571)均来自瑞士-蛋白质数据库。
图7表示牛(SEQ ID NO:4)，人(SEQ ID NO:5)和小鼠(SEQ ID NO:6)CD14蛋白质氨基酸序列的比较图。氨基酸序列是从示于图6的相应cDNA序列中推导出来的。与PAM250残基重要性表相结合，采用J.Hein所述的方法(《酶学方法》(Methods inEnzymology)183:626,1990)将DNA Star-Megalign软件用于进行该序列对比。
图8表示用于扩增牛CD14 cDNA编码区的引物。图8A表示用于杆状病毒表达系统的正向(SEQ ID NO:7)和反向(SEQ IDNO:8)引物。图8B表示用于哺乳动物表达系统的正向(SEQ IDNO:9)和反向(SEQ ID NO:10)引物。
图9表示天然和重组牛CD14的免疫印迹。采用Western杂交分析来评估和比较nBo-LAIT蛋白与重组CD14蛋白的大小。250ngCD14蛋白在12.5％ SDS聚丙烯酰胺凝胶上电泳并在180mA电泳转移到PVDF膜(Millipore)上30分钟。膜在溶于TBST(20mM TrisHCl,pH7.5,150mM NaCl,0.025％ Tween20)的5％脱脂奶粉中封闭1小时，随后在补充了5％脱脂奶粉的TBST中与浓度为2.5μg/ml的兔抗Bo-LAIT#842共育1小时。在TBST中将杂交的斑点冲洗3次，每次10分钟。用偶联了辣根过氧化物酶(BioRad)的羊抗兔IgG来检测兔抗体。然后该膜用TBST冲洗3次(10分钟/次)。利用ECL试剂盒(Amersbam)使蛋白质显现。泳道1:MW标志物；泳道2:nBo-LAIT-842-Sepharose亲和纯化的nBo-LAIT蛋白；泳道3:rBo-Sf9-12CA5亲和纯化的，Sf9昆虫细胞来源的重组牛CD14；泳道4:rBo-C127-842-Sepharose亲和纯化的，C127小鼠乳腺肿瘤细胞系来源的重组牛CD14。
图10比较nBo-LAIT和LPS的增殖促进活性。按图1A所述制备，培养和收集高悬浮密度的静止小鼠脾B细胞。在培养开始时加入指定浓度的亲和纯化的nBo-LAIT，(按图1所述亲和纯化的)或LPS，其来源于S.typhosa(Difco)。
图11比较nBo-LAIT和LPS的分化促进活性。按图1A所述制备和培养高悬浮密度，静止的，小鼠脾B细胞。用10μg/ml LPS〔S.typhosa(Difco)〕，或500ng/ml亲和纯化的nBo-LAIT开始复孔培养，并在指定时间收集。利用商业上可获得的ELISA试剂盒定量测定上清中存在的IgM来评估累积的IgM产量。
图12比较nBo-和rBo-LAIT蛋白与LPS的生长促进活性。按图1A所述制备，培养，并收集高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞。在培养开始时加入指定浓度的nBo-LAIT〔按图1A所述纯化的〕，在昆虫细胞或哺乳细胞中产生的rBo-LAIT，和LPS〔S.typhosa(Difco)〕。来自昆虫细胞的重组Bo-LAIT是从已转染了Bo-LAITcDNA的Sf9细胞的培养上清中亲和纯化的。表达载体包括编码来自流感血凝集素(HA tag)的非肽的3′27聚体。亲和纯化是通过将Sf9上清通过mAb12CA5偶联的Sepharose来进行的(《细胞》(Cell)57:787,1984)，其中该抗体能识别HA标志。来自哺乳动物表达系统，C127，的重组Bo-LAIT的亲和纯化如同对nBo-LAIT进行的一样，采用已偶联了IgG的Sepharose，该IgG是从来自兔842的多克隆抗血清中分离的。
图13表示nBo-LAIT对纯化的原代B和T细胞群的增殖促进活性的比较分析。按图1A所述制备高悬浮密度的、静止的、小鼠脾B细胞。原代T细胞是从脾B细胞分离的相同动物的淋巴结中分离的。具体地说，根据制造商的说明，以及按照以前的描述(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)24:967,1994)将淋巴结悬液通过抗Ig柱(Biotex labora)。通过免疫荧光染色和FACS分析来评估T细胞群是＞95％CO3+，以及＜0.5％mIg+。左侧表示含1.5×105纯化的T或B细胞的培养物对指定浓度亲和纯化的nBo-LAIT的增殖反应。右侧表示相同数量的B或T细胞对50μg/ml的LPS〔S.typhosa(Difo)〕或1μg/ml的伴刀豆球蛋白A(Sigma)的增殖反应。采用无血清的培养条件，并且所有的刺激物在培养开始时加入。在40小时，培养物中加入1μCi的3H-TdR,6小时后收集到滤纸盘上，并用闪烁计数仪来评估胸苷摄入。标明的数字代表复孔培养的平均cpm。
图14表示nBo-LAIT介导的小鼠B细胞增殖的胎牛血清的非依赖性。按图1A所述制备，培养，并收集高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞。无血清培养基补充指定浓度的热灭活的(56℃1小时)胎牛血清(Gibco BRL)以及不加刺激物(■)，0.5μg/ml亲和纯化的nBo-LAIT(○)，或50μg/ml LPS(S.typhosa(Difco))(●)。在40小时，培养物中加入1μCi3H-TdR,6小时后收集到滤纸盘上，并用闪烁计数仪评估胸苷摄入。标明的数字代表复孔培养的平均cpm。
图15表示包含于以下细胞中的CD14的Northern杂交分析(1)未分离的脾细胞，(2)按图1A所述制备的高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞，以及(3)来自后者高悬浮密度静止群的FACS分类的mlg+细胞。为了进行FACS分类，高悬浮密度的细胞与FITC偶联的mAb187.1-对小鼠IgK特异的(Hybridoma 1:5,1981)-共育。三种细胞群每一种中的mlg+细胞的比例被指明。根据制造商的说明用Trizol法(Gibco BRL Life Tochnologies)从三种细胞群的每种107个细胞中分离总RNA并且溶于1.2％的甲醛凝胶中。用真空杂交系统(Pharmacia)将RNA转移到尼龙膜(GenenScreen)上。按照膜制造商的推荐进行交联，预杂交和杂交。小鼠CD14特异的探针来自通过PCR获得的基因组小鼠CD14片断，PCR采用正向引物5′- CTA GAA TTCTCT CCC GCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3′(SEQ ID NO:11)，和反向引物5′-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATCTCC TAG G-3′(SEQ ID NO:12)。扩增的片断通过琼脂糖凝胶电泳分离，酶切并纯化。L32cDNA探针(Nucl.Acid.Res.16:10751,1988)，对大核糖体亚单位蛋白组成性表达的mRNA是特异的，被用于标化RNA负荷(loading)。该探针(每种100ng)用寡核苷酸标记试剂盒(Pharmacia)标记至特异性活性0.2-1×109cpm/μgDNA。然后膜在65℃于0.2×SSC,1％SDS中冲洗2小时并对X光胶片(Kodak,Biomax MS)曝光1-5天。
图16表示已按图15所述为mlg+细胞而进一步纯化的，或未纯化的，高悬浮密度，静止的，小鼠脾B细胞对50μg/ml LPS〔S.typhosa(Difco)〕和0.5μg/ml亲和纯化的nBo-LAIT的反应。建立培养，加入氚标记的胸苷，收集，并按对图1A所述来评估胸苷摄入。标明的数字代表复孔培养的平均cpm。
图17表示重组Bo-LAIT介导的B细胞激活对CD40的非依赖性。高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞分离于常规C57BL/6小鼠。或者通过CD40位点的靶向破坏而制备的CD40缺陷动物(《免疫学》(Immunity)1:167,1994)。细胞(1.5×105)在10μg/ml LPS，或指定浓度的来源于昆虫细胞表达系统的rBo-LAIT存在下进行培养。如图1A所述加入胸苷并收集培养物。标明的数字代表复孔培养的平均cpm。
图18比较来源于人(nHu)，牛(nBo)和小鼠(nMo)的天然CD14的银染(左侧)和免疫杂交(右侧)分析。按以前所述，nHu从肾病病人的尿中分离(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)24:1779,1994)。按图3所述nBo从牛初乳中亲和纯化。nMo从小鼠杂交瘤OKT3(PNAS USA77:4914,1980)的上清中分离，利用CD14特异性mAb3C10固化的Sepharose4B通过亲和层析进行(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)。为了进行银染，1μg的每种样品在200V于10％SDS-PAGE上分离45分钟。按照制造商的说明蛋白质通过银染(Biorad)使之显色。为了进行免疫杂交，250ng样品在180mA通过10％SDS-PAGE分离45分钟，在180mA电泳转移到PVDF膜(Millipore)上30分钟。膜在溶于TBST(20mM TrisHCl,pH7.5,150mM NaCl,0.025％吐温20)的5％脱脂奶粉中封闭1小时，随后在补充了5％脱脂奶粉的TBST中与浓度为10μg/ml的mAb3C10(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)共育1小时。杂交斑点在TBST中冲洗3次，每次10分钟。用偶联了辣根过氧化物酶(BioRad)的羊抗小鼠IgG来检测小鼠抗体。然后膜用TBST冲洗3次(10分钟/次)。用ECL试剂盒(Amersham)使蛋白质显色。
图19比较分析刺激小鼠B细胞增殖的来源于人(nHu)，牛(nBo)和小鼠(nMo)的天然CD14。这三种蛋白按图18中所述来纯化。评估按图1A中所述而分离的高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞对指定浓度的这三种蛋白的反应。在40小时时培养物中加入1μCi3H-Tad并在6小时时收集。标明的数字代表刺激指数，该数是用不含刺激物的复孔培养的平均cpm除已用指定浓度的nHu、nBo，和nMo刺激的复孔培养的平均cpm而得到的。
图20A和B分别表示nBo-LAIT对从脐血和扁桃体中分离的人B细胞的增殖促进活性。图20A表示通过阳性选择而分离的脐血B细胞的胸苷摄入。脐血淋巴细胞悬液用荧光标记的B细胞标记物CD72特异的mAb来加以染色。然后在荧光激活的细胞分类器(FACStar Plus,Becton Dickenson)上分离CD72阳性的脐血淋巴细胞至纯度＞98％。不存在刺激物或2μg/ml nBo-LAIT存在下，按图1A所述来培养B细胞(1.5×105)。无另外的刺激物，或2μg/ml nBo-LAIT存在下，B细胞也培养于已用两种mAbs预包被9小时的培养孔中，两种mAbs一种是人Igκ特异的〔LO-HK3，(《大鼠杂交瘤和大鼠单克隆抗体》“Rat Hybridomas and Rat Monodonal Antibodies”ed,H.Bazin,CRC出版社，Boca Raton,FL，美国)〕，另一个是人Igλ特异的〔LO-HL2，(《大鼠杂交瘤和大鼠单克隆抗体》“RatHybridomas and Rat Monodonal Antibodies”ed,H.Bazin,CRC出版社，Boca Raton,FL，美国)〕，每一种使用1.5μg/ml的包被浓度。在60小时时培养物加入1μCi3H-TdR,12小时后收集到滤纸盘上，用闪烁计数仪评估胸苷摄入。图20B表示采用阴性选择而制备的B细胞所获得的结果。具体地说，白细胞悬液用生物素化的CD3ε特异的mAb(Becton Dickenson)标记，随后用含“微珠”的用铁偶联的亲和素(Beton Dicknson)处理。标记的细胞群通过MACS(Becton Dickenson)，并收集流出液。通过细胞系特异性mAbs的免疫荧光染色所进行的评估，该细胞群含＜1％T细胞，和＞97％B细胞。如图1A所述来培养B细胞(1.5×105)。正如对脐血B细胞的处理一样，扁桃体B细胞在存在和缺乏培养板结合的人Igκ和λ特异性mAbs的条件下进行培养，但在该情况下，培养孔用浓度为0.5μg/ml的每种mAbs进行预包被。培养物加入胸苷，收集并按对图20A所述的那样评估胸苷摄入。
图21表示分娩后乳房奶中CD14随着时间的浓度。乳房奶在分娩后指定的时间从两位供者(A.D.和S.B.)中收集。制备澄清的乳清，并按制造商的说明用CD14特异的ELISA试剂盒(1BL,Hamburg)来评估所含CD14的浓度。
优选实施方案的描述从下所述的实验说明从初乳乳清中纯化天然的牛LATI蛋白(nBo-LAIT)，本文也称为牛CD14。纯化的nBo-LAIT的氨基酸序列分析已列出，而且与人CD14的同源性已证实。纯化人CD14的方法已列出。从杂交瘤上清中纯化小鼠CD14的方法已列出。
对亲和纯化的初乳Bo-LAIT，人初乳CD14，来源于尿的人CD14，和来源于杂交瘤上清的小鼠CD14描述了体外的B细胞刺激试验。来自小鼠的高悬浮密度静止的脾B细胞在对来自这三种的LAIT蛋白的反应中能进入并进展完成细胞周期，而对来自牛的LAIT蛋白的反应中则分化成免疫球蛋白的高分泌细胞。这些激活事件发生在成分明确的无血清培养基中，而且也证明培养基中胎牛血清的存在不影响LAIT蛋白介导的B细胞激活。实验证实nBo-LAIT特异地激活小鼠B细胞，而不激活小鼠T细胞，而且LAIT蛋白激活不能检测到CD14 mRNA的B细胞群，这些实验被描述。也描述了证实牛CD14诱导不表达CD40的B细胞的生长的实验。
本文描述了编码牛CD14的基因组DNA和cDNA的分离，克隆和测序。与文献中已知的小鼠和人CD14s的序列比较表明Bo-LAIT和这些以前已知的CD14s的序列相关性。与重组牛CD14相关的B细胞的增殖和分化也被描述。
描述了重组牛CD14在昆虫和哺乳动物系统中的表达方法。具体地说，杆状病毒表达载体被用于帮助重组蛋白在昆虫细胞中的表达。天然Bo-LAIT(nBo-LAIT)和来源于杆状病毒表达系统的重组Bo-LAIT(rBo-LAIT)对B细胞增殖和分化特性的比较表明后者是功能性的，并且具有nBo-LAIT特异活性的大约50％。
将小鼠乳腺癌细胞系，C127，用作编码来自牛的CD14的cDNA的受者。cDNA被克隆进牛乳头瘤病毒表达载体中。建立稳定的C127转染体，并通过亲和层析从汇合的C127上清中分离出重组CD14蛋白。昆虫细胞和C127来源的重组LAIT蛋白的Western杂交分析表明在两个表达系统中产生了不同的转录时和/或转录后的修饰体。哺乳动物来源的重组牛CD14的特异活性与昆虫细胞来源的重组蛋白相同。
对昆虫细胞和哺乳动物细胞来源的天然Bo-LAIT和重组牛CD14所支持的B细胞增殖促进活性进行了比较。再者，描述了天然Bo-LAIT活性对人B细胞的增殖促进活性，其中B细胞是从扁桃体，或从脐血中分离的。结果证实从新生儿或成年人中分离的人B细胞是对Bo-LAIT介导的增殖敏感的，正如小鼠B细胞一样。
已经证明人初乳，以及分娩后78天的乳房奶中存在的CD14的浓度是健康供者血清中观察到的浓度的3～20倍。方法牛LAIT蛋白的纯化从刚分娩的牛的第一次乳房泌乳中获得5升以上的初乳。
(ⅰ)首先将4420g初乳离心30分钟以除去细胞和细胞残片来制备澄清的初乳乳清。该离心的上清再在250,000g离心2小时。弃去漂浮的脂质和沉淀的酪蛋白，并且对澄清的初乳乳清进行进一步的分离。
在体外评估每一种分离技术来源的每一样品的B细胞生长促进活性。这样，每一样品在宽的浓度范围来评估它刺激小鼠脾来源的高悬浮密度，静止的B细胞增殖的能力，这正如以前所述(《免疫学杂志》(J.Immunol)131:581,1983)。在这些分析中均采用成分明确的无血清培养基〔IMDM(Gibco)，补充5×10-52-β-巯基乙醇，5μg/ml铁饱和的转铁蛋白(Boehringer,Lewes,GB),0.5mg/ml脱脂BSA(Boehringer),100U/ml青霉素(Gibco),100μg/ml链霉素(Gibco)，和必需氨基酸〕。同时结合亚有丝分裂浓度的LPS(0.25μg/ml)，直接检测下述分离计划中获得的样品。因为LAIT蛋白接近纯净，所以表现它直接的促有丝分裂特性，这将在以下加以描述。
(ⅱ)利用在(NH4)2SO4中的系列沉淀来完成初乳乳清制备物中所含蛋白质的盐析。所采用的增加的盐浓度的顺序是42％:50％:62％:65％(v/v)硫酸铵(AS)。这样，在42％沉淀的沉淀物上清中的AS浓度增加到50％；回收在50％沉淀的物质，然后在剩余上清中的AS浓度增加到62％，以此类推。每次AS沉淀的小团溶于10mMTris-HCl pH8.0，它含0.15M NaCl和1mM AEBSF(TNAEBSF)。这些样品进行脱盐并用10DG柱将缓冲液换成TNAEBSF，然后测定生物活性。根据以上步骤大部分B细胞的增殖促进活性分离于62％ AS的沉淀物(数据未列)。
(ⅲ)随后富集活性，并用三步系列蛋白质分离技术最终将其纯化。50mg 62％ AS富集的样品加到阴离子交换柱上，用溶于10mMBis-tris丙烷的50mM～400mM NaCl的盐梯度来分离蛋白质，同时pH梯度7.5～9.5。图1A表示从这个柱上得到的洗脱图，而表1A表示含高峰活性的样品，样品#57。然后20mg样品#57加到已在含0.45M NaCl pH8.0的20mM Tris-HCl中平衡的分子筛柱上。该分离的洗脱图见图1B，高峰样品#38的活性见表1B。
然后将1mg样品#38加以1mM NaCl的羟基磷灰石柱上，并用pH6.8 1-500mM的梯度磷酸钾洗脱。洗脱图见图1C，相关活性见表1C。
图1C中的插入代表银染之后具有高峰活性的样品的SDS-PAGE分析，并且证实了具有相对分子量46-50kD的单一主要条带。牛LAIT蛋白的序列分析对纯化的nBo-LAIT进行序列分析。发现N末端是封闭的。用溴化氰，或胰蛋白酶水解该物质。获得5个片断并在测序前用反相HPLC，或SDS-PAGE然后电转到PVDF上来纯化这些片断。
如图2所示，5个片断均与人CD14对比，具有明显的同源性。从牛和人初乳中亲和纯化LAIT蛋白用经典蛋白质分离技术分离的nBo-LAIT被用于制备兔(#842)多克隆抗体。该抗血清的IgG部分在蛋白质A-Sepharose上纯化，然后偶联于Sepharose4B。
nBo-LAIT和人CD14(HuCD14)的序列同源性表明Bo-LAIT可能是CD14的牛同源物。通过用可获得的HuCD14特异的单克隆抗体(mAb)制备亲和柱来对此进一步探索。该抗体，63D3(PNAS77:6764,1980)，是在包含已偶联于Sepharose 4B的mAb 187.1〔大鼠抗小鼠Kappa(杂交瘤1:5,1981)〕的亲和柱上从相应的杂交瘤上清中纯化的，然后将纯化的mAb偶联于Sepharose 4B。
如上所述，用硫酸铵对牛澄清的初乳乳清进行系列盐析。人初乳乳清在Sephacryl S 100 HR柱上进行分离。然后含高峰B细胞增殖促进活性的样品用针对牛来源物质的842-Sepharose柱，或用针对人来源物质的63D3-Sepharose柱加以亲和纯化。
亲和纯化的初乳Bo-LAIT，和亲和纯化的人初乳CD14的SDS-PAGE分析见图3，相关的B细胞增殖促进活性见表2。正如所示，从两种初乳制备物，p46-50牛物质(图3，泳道3)和p50-52人分子(图3，泳道4)，中分离出优势条带。
>*数字代表培养40小时时的cpm×10-3。
表2所示的生物活性证明亲和纯化的Bo-LAIT在浓度100ng/ml时，能刺激静止小鼠B细胞的增殖。当以10ng/ml加入时该物质不再是促有丝分裂的，但是同时加入亚促有丝分裂浓度的LPS，或小鼠IgM,b-7-6特异的mAb时可获得共刺激(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol.)14:753,1984)。亲和纯化的人物质在检测的浓度本身不是促有丝分裂的，但是在10ng/ml时，B细胞增殖被激活，具有与牛物质同样有效的共刺激。
nBo-LAIT的生物活性是热不稳定的。如图4A所示，亲和纯化的Bo-LAIT在95℃处理10分钟消除其相关的B细胞生长促进活性。对LPS进行相似处理不影响其活性(图4A的插入)。再者，多克隆抗体-Bo-LAIT,#842，有效地阻断nBo-LAIT的B细胞生长促进活性，然而不影响LPS的活性。见图4B和插入。基因组牛CD14的分子克隆用人CD14cDNA(从R.Ulevitch,Scripps研究所获得)1.5kb的片断来筛选牛基因组EMBL3 SP6/T7λ文库(Clontech)。获得15个阳性信号，选择最强的信号，克隆“B2”来进一步分析和克隆牛CD14。
从克隆B2分离和纯化的噬菌体DNA具有大约15kb的插入片断。纯化的DNA被酶解，获得的7.1kb的EcoRl-Xhol片断-含人CD14的同源序列-被亚克隆进pBluescriptSK+(Stratagene)。用多种酶酶切再与人CD14探针酶切获得的限制性图谱能在克隆片断内定位牛CD14基因(图5A)。限制性图谱进一步用于将更短的四个片断(Ⅰ-Ⅳ)亚克隆进pBluescriptSK+，并且随后测序大约5kb含全长牛CD14基因的片断(图5C)。片断Ⅰ(EcoRl-BamHl；3.2kb)；Ⅱ(Pstl-Pstl,1.35kb)；Ⅲ(Pstl-Pstl,0.3kb)；和Ⅳ(Pstl-Xhol,0.95kb)被用于构造巢式重叠的单向缺失。这些片断提供了牛CD14位点的相邻序列。图5B描述了牛CD14基因组片断的结构。牛CD14 cDNA的分子克隆从牛外周血单核细胞中分离Poly(A+)RNA，并且用GigapackⅡPackaging Extract(Stratagene)来包装重组λ噬菌体DNAs。采用带节省时间cDNA合成试剂盒的Excell EcoRl/CIP载体(Pharmacia)来制备cDNA文库。
通过PCR用从牛基因组CD14片断的编码翻译区来源的探针筛选文库(详见以下描述携带牛CD14片断的杆状病毒重组表达载体的制备部分)。探针通过随机六核苷酸引物第二链的合成用32P标记(Oligolabelling试剂盒，Pharmacia Biotech)。筛选过程是在高度严格的条件下进行(0.1×SSC,1％SDS,65℃3小时)。所获得的克隆之一(ExCell/BoCD14-1)，含1.4kb的插入片断，它被亚克隆进pBluescriptSK+，并用含渐进重叠单向缺失的pBS/BoCD14亚克隆(Nested Deletion试剂盒，Pharmacia)进行测序。
该牛CD14 cDNA克隆由1327bp组成。ATG起始密码子的下游是1116nt的开放阅读框架，TAA终止密码子在核苷酸1202。开放阅读框架的旁侧是82bp的5′非翻译序列和122bp的3′非翻译序列。多聚腺苷酸信号，5′- ATTAAAA-3′，位于终止密码子3′的105bp处。
牛CD14基因组和cDNA序列的序列比较表明它们从5′cDNA的起始点开始是共线性的(colinear)，直至紧挨ATG起始密码子之后的第一个和唯一的内含子(88bp)。编码序列的其余部分未受影响。这样，以前对人和小鼠CD14描述的内含子-外显子结构在牛CD14中是明确保守的。牛CD14 cDNA翻译的核苷酸序列与人和小鼠CD14cDNA的相同区比较表明在编码区分别有74.2％和62.6％的核苷酸相同(图6)。
牛CD14蛋白质的一级结构是从cDNA序列中推导出来的，由374个氨基酸组成。第一蛋氨酸之后是15个疏水和/或中性的残基，典型的真核细胞信号肽。牛CD14氨基酸序列与人和小鼠CD14的序列比较表明分别有73.1％和62.3％的相同(图7)。有三个潜在的N键糖基化位点(Asn-X-Thr/Ser)，所有这些位点在人和小鼠CD14中均是保守的。再者，牛CD14包括富含10个亮氨酸的重复基元(LXXLXL)，与人和小鼠CD14相同(《免疫学杂志》(J.Immunol 145:331,1990)。重组牛CD14在昆虫细胞中的表达在制备编码重组CD14蛋白的DNA片断的过程中，CD14翻译区的全长片断通过PCR进行制备。根据从牛CD14 cDNA获得的序列信息来设计特异的PCR引物对。5′端的PCR引物包括Nhel的两个识别序列；一个Kozak序列；ATG起始密码子；和翻译编码区最初的17-21核苷酸。3′端的PCR引物包括Nhel的两个识别序列；翻译编码区最后的21-24个核苷酸直至但不包括TAA终止密码子(图8A)。
牛CD14的翻译区用7.1kb的EcoRl-Xhol基因组CD14片断(见上述)作为模板来进行扩增。PCR用Pwo DNA聚合酶(Boehringer)进行。扩增方法包括在100μl的终体积中加入5ng的模板DNA,10mMTris-HCl pH8.85,25mM KCl,5mM(NH4)2SO4,2mMMgSO4,250mM的每种dNTP,250nM的每种引物，和5个单位的DNA聚合酶。用DNA Therma+Cycler(Perkin Elmer)在70℃退火温度对样品扩增30个循环。
扩增的片断用Nhel酶切，并亚克隆进杆状病毒转移载体pETL-HA(C.Richardson,OC1/Amgen)中多面体启动子的下游。该载体来自pETL(《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)，并含编码流感凝集素(HA)来源的非肽的3′30bpNhel-BamHl DNA片断，随后是终止密码子TAG(5′-TAC CAATAC GAT GTT CCA GAT TAC GCT TAG-3′)(SEQ ID NO:13)。重组转移载体每个与野生型杆状病毒苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV,Linear Transfection Module,Invitrogen)共转染进Sf9细胞中(《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)。根据已建立的方案筛选出重组杆状病毒克隆并纯化(《分子生物学方法》(Methods in Molecular Biology)39:161,1995)。以5-10:1的倍数用重组杆状病毒感染Sf9细胞。
分析时间过程以测定感染的Sf9细胞分泌重组CD14蛋白所必须的最适时间段。用抗-HA单克隆抗体12CA5(《细胞》(Cell)57:787,1984)对不同时间点所收集的细胞培养基进行免疫杂交分析表明在96小时时重组CD14蛋白的表达达到最大水平。在随后的实验中选择该时间段以制备生物试验用的重组蛋白(见下)。Sf9来源的重组牛CD14的Western杂交分析见图9所示。重组牛CD14在哺乳动物细胞中的表达我们采用改变版的pBPV Episomal哺乳动物表达载体(Pharmacia)以获得重组牛CD14在哺乳动物细胞中的稳定表达。为了能够直接筛选转化的细胞，pBPV通过包括新霉素抗性基因而进行改良。该抗性基因插入到表达框上游3.4kb处。为此，来自pBCMGSneo(《欧洲免疫学杂志》(Eur.J.Immunol)18:98,1988),1.95kb的HindⅢ-Xbal片断被亚克隆进pCRⅡ(Invitrogen)。重组构建体，pCRⅡ-neo，被纯化，并通过PCR扩增克隆的片断。设计PCR引物以使Sall的识别序列包含在5′和3′端。引物序列互补于pCRⅡ载体的多聚连接子区，位于HindⅢ(引物A)和Xbal(引物B)克隆位点的旁侧。
引物A:5′-GCA GTC GAC ACT ATA GAA TAC TCA AGC-3′(SEQ ID NO:14)引物B:5′-TTC GTC GAC ATT GGG CCC TCT AGA-3′(SEQ ID NO:15)终产物用Sall酶切，凝胶纯化，并亚克隆进pBPV的Sall克隆位点，转录方向与所含的表达框的方向相同。进行改良表达载体，pBPVneo-13，的质粒制备(Plasmid Maxi试剂盒，Quiagen)。
编码牛CD14翻译区的DNA片断通过PCR扩增pETL-HA载体中的基因来制备。该扩增反应中所用的5′端PCR引物包括Xhol识别序列；随后是Nhel识别序列(含在pETL-HA载体中)；Kozak序列；ATG起始密码子；和翻译区最初的11-13个核苷酸。3′端的核心PCR引物包括被延伸的HA编码序列，对5′序列来说，包括一个Xhol识别序列。引物见图8B。
PCR用Pwo DNA聚合酶(Boehringer Mannheim)进行。扩增方法包括在100μl的终体积中加入5ng DNA模板，10mMTris-HCl pH8.85,25mM KCl,5mM(NH4)2SO4,2mM MgSO4,250mM的每种dNTP,250nM的每种引物，和5个单位的Pwo DNA聚合酶。样品在70℃退火温度用DNA Thermal Cycler(PerkinElmer)扩增30个循环。
扩增的片断用Xhol酶切并且凝胶纯化。这些片断然后亚克隆进pBPVneo-13中小鼠金属硫蛋白1启动子的下游。亚克隆之前，pBPVneo-13用适当的限制性酶预处理，并用牛小肠磷酸酶去磷酸化。重组质粒用Plasmid Maxi试剂盒(Quiagen)进行制备。
以20μg DNA/107个细胞，将重组质粒(pBPVneo13-BoCD14)转入小鼠乳腺肿瘤细胞系，C127(PNAS78:2727,1981)。用Gene pulser(Bio-Rad实验室)在960μF/280v通电穿孔来完成DNA转移。在1.5mg/ml G418(Life Technologies)的存在下筛选出稳定转化体。
高表达膜CD14的转染体(未转染的C127对CD14是阴性的)通过免疫染色，随后用Becton Dickenson FACStar Plus进行荧光激活的细胞分类来加以富集。外源蛋白质的膜表达水平与转染的C127细胞48小时汇合培养物上清中回收的分泌CD14的量密切相关。不象昆虫细胞中合成的重组物质的纯化，已发现用12CA5-Sepharose亲和柱亲和纯化C127来源的物质是不可能的。这可能是由于C127细胞来源的重组蛋白质上缺失了C末端HA标志。因此，C127来源的重组牛CD14在842-Sepharose上亲和纯化。C127来源的重组牛CD14的免疫杂交分析见图9所示。比较nBo-LAIT和LPS的增殖和分化促进活性示于图10的结果说明了天然Bo-LAIT支持高悬浮密度的，静止的，小鼠脾B细胞的增殖，效率大约为LPS的200倍。这样，nBo-LAIT在50ng/ml诱导DNA合成，水平与10μg/ml LPS存在时所观察到的结果相当。
nBo-LAIT诱导B细胞增殖的能力与它诱导高悬浮密度，静止的，小鼠B细胞分化至免疫球蛋白分泌细胞的能力相一致。如图11所示，nBo-LAIT 500ng/ml累积诱导的IgM量可与10μg/ml LPS诱导的量相当。评估培养24小时内的IgM分泌量。500ng/ml的nBo-LAIT在48-72小时培养的24小时之内；72-96小时；和96-120小时分别诱导956±10ng/ml；754±8.7ng/ml；和25±1.4ng/ml IgM。10μg/ml LPS刺激的培养所获得的相应值分别为1442±71ng/ml；874±32ng/ml；和183±3ng/ml。这样，nBo-LAIT以效率可比于用目前已知的最强刺激物刺激B细胞时所观察的效率，具有诱导高悬浮密度静止的小鼠B细胞分泌免疫球蛋白的能力。再者，它在LPS浓度的1-10％时仍具有诱导的能力。
nBo-LAIT诱导小鼠静止B细胞独特型转换的能力进行了评估。上述培养物来源的上清也评定了IgG独特型的存在。已观察到500ng/mlnBo-LAIT和10μg/ml LPS分别诱导IgG1累积量(ng/ml第5天)是7.0±0.1和5.6±0.6；IgG2a:358±3和406±8；IgG2b:8±1和11±2；IgG3:75±5和75±0.5；以及IgA:6.5±1.5和5.0±0.3。这样，nBo-LAIT在缺乏T细胞时有能力诱导静止小鼠B细胞的某些独特型转换。比较nBo-和rBo-LAIT蛋白的增殖促进活性昆虫细胞和哺乳细胞来源的重组形式的牛CD14，均具有诱导高悬浮密度，静止的，小鼠B细胞增殖的能力。如图12所示，昆虫细胞来源的，并在12CA5-Sepharose上纯化的rBo CD14在0.2-3μg/ml的浓度时诱导强烈的DNA合成。哺乳动物表达系统来源的重组物质支持可比的活性，两种重组形式在ng/ml浓度均支持B细胞增殖，与初乳来源的nBo-LAIT所观察到的活性可比。
通过经典蛋白质分离技术，或亲和纯化从牛初乳中分离的nBo-LAIT介导的生物活性，是由被观察的蛋白质所介导的确定证据来自评估重组牛CD14介导的生物活性。如图9所示，没有重组形式的牛CD14的表观分子量与nBo-LAIT相同。所观察到的表观分子量上有差异的原因是不清楚的，但可能是因为不同的转录时和/或转录后修饰，核心蛋白的不同大小，或两者兼而有之。单核细胞来源的可溶性CD14已有文献报道并能以三个已知的机制之一进行制备，每种机制将会导致不同分子量的蛋白质。它可以全长分子被分泌(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)23:2144,1993；《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)25:604,1995)，膜表达的GPI连结的形式可被磷脂酶裂解(《免疫学杂志》(J.Immunol.)141:547,1988；EMBO J.13:1741,1994)，以及膜表达的GPI连结的形式可被丝氨酸/苏氨酸蛋白酶裂解，假设它本身可以表达在单核细胞的外浆膜上，并以尚未理解的方式被激活(《免疫学杂志》(J.Immunol.)147:1567,1991)，仍需确定rBo-LAITs和初乳来源的nBo-LAIT不同的表观分子量是否是因为它们各自的表达系统所支持的重组物质不同的转录时和/或转录后修饰，或不同的核心蛋白大小，或两者兼而有之。nBo-LAIT的增殖促进活性是B细胞特异的检测已经观察到的nBo-LAIT对小鼠B细胞的生物活性，对小鼠T细胞生理功能的影响。分离纯化的B细胞的确对nBo-LAIT发生反应的事实不能排除Bo-LAIT也能激活T细胞的可能性。
按以前所述(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)24:976,1994)淋巴结T细胞在抗Ig柱上(Biotex Labora)通过阴性选择来加以分离。根据免疫荧光染色和FACS分析，所获得的流出细胞群含＞95％CD3+细胞和＞0.5％mlg+细胞。高悬浮密度的脾B细胞也从同一小鼠中分离，淋巴结T细胞和脾B细胞均被评估它们对nBo-LAIT的反应。通过分析它们对B细胞特异性有丝分裂原LPS的反应，和T细胞特异性有丝分裂原，刀豆蛋白A(ConA)，的反应来功能性评估这些细胞群的纯度。如图13的右侧所示，是B细胞，而不是T细胞，对LPS反应，伴随大量的DNA合成，是T细胞，而不是B细胞，对刀豆蛋白A发生反应。如左侧所示，在检测的剂量范围T细胞不对nBo-LAIT发生反应，而B细胞对浓度为10ng/ml或更高的nBo-LAIT发生反应。LAIT蛋白诱导的B细胞增殖和胎牛血清最近已经证实单核细胞对从肾病病人的尿中所分离的可溶性CD14(sCD14)发生反应，伴随产生炎症前(pro inflammatory)细胞因子(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)24:17790,1994)，这是在缺乏血清来源的脂多糖结合蛋白(LBP)的条件下发生的。相比之下，低浓度的LPS刺激表达CD14的单核细胞产生这些相同细胞因子的能力是血清依赖性的(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)176:719,1992)。高浓度的LPS可以克服该血清依赖性。因此，10ng/ml LPS诱导单核细胞产生细胞因子是严格依赖血清/LBP的，然而50μg/mlLPS所诱导的细胞因子合成则不需要。
为了确定胎牛血清LBP的存在是否影响低浓度nBo-LAIT诱导高悬浮密度小鼠B细胞增殖的能力，500ng/ml nBo-LAIT所诱导的反应在宽的FBS浓度范围内进行评估，与50μg/ml LPS诱导的反应相比较。如图14所示，B细胞对这两种刺激物的反应不受培养基中存在的高达9％的FBS的影响。LAIT诱导的B细胞增殖和mCD14B细胞和单核细胞对LPS介导的激活的不同敏感性可能与后者表达膜CD14(mCD14)有关。已经直接证实反应细胞上存在mCD14可以大大增强LPS介导的激活的敏感性。具体地说，已经证实一旦被迫表达外源性GPI联结的mCD14,mCD14阴性的前B细胞系对LPS的敏感增加大约1000倍(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)175:1697,1992)。原代(primary)B细胞是否表达mCD14仍是有争论的。在B细胞的激活中，与LPS相比的Bo-LAIT的高特异性活性与它不依赖mCD14的激活方式相一致。
为了直接评估mCD14的表达在Bo-LAIT介导的B细胞激活中的参与情况，在用作反应细胞的高悬浮密度小鼠B细胞群中评估CD14特异性的mRNA的存在情况。从三种脾来源的细胞群的每种107个细胞中分离总RNA未分离的脾细胞；T细胞缺失的，Percoll分离的，高悬浮密度细胞，那些常规用于LAIT蛋白介导的生长试验的细胞；以及从高悬浮密度的T细胞缺失的细胞群中分离出来的膜Ig表达细胞，其分离方法包括用FITC偶联的小鼠IgK特异的大鼠mAb标记的免疫荧光染色〔187.1(杂交瘤1:5,1981)〕以及随后用Becton DickinsonFACStar Plus细胞分类仪进行纯化。如图15所示，这三种细胞群分别含59.2％；83.5％；和99.8％mlg+细胞。从这种细胞群中分离的RNA在1.2％的甲醛凝胶上分离，并按顺序转移到尼龙膜(GeneScreen)上，交联，预杂交，并与两探针杂交。
小鼠CD14探针通过PCR来自基因组DNA。具体地说，扩增方法包括Pwo DNA多聚酶(Bcehringer Mannheim)加到0.4μg的Balb/c基因组DNA中，同时加入正向引物5′-CTA GAA TTC TCT CCCGCC CCA CCA GAG CCC TGC G-3′(SEQ ID NO:11)；和反向引物5′-CTA GAA TTC TTA AAC AAA GAG GCG ATC TCCTAG G-3′(SEQ ID NO:12)。样品在DNA Thermal Cycler(Perkin Elmer)上以55℃的退火温度扩增30循环。扩增的片断通过琼脂糖凝胶电泳分离，从胶上切下，并纯化。L32探针(《核酸研究》(Nucl.Acid.Res.)16:10751,1988)用于RNA负荷标准化。每种探针(100ng)用寡核苷酸标记试剂盒(Pharmacia)进行标记至特异性活性0.2-1×109cpm/μg DNA。膜与探针杂交并在0.2×SSC,1％SDS中于65℃冲洗2小时，然后曝光。
如图15所示，从未分离的脾细胞，和T细胞缺失的高悬浮密度脾细胞中分离的RNA含有CD14特异的mRNA，然而FACS纯化的B细胞则不含。在T缺失的高悬浮密度脾细胞-在此之前称为静止B细胞-中的CD14信号可能是由于污染的单核细胞，因为根据免疫荧光染色和FACS分析的评估这些细胞85-90％为mIg+，而且＞98％为MHCⅡ类+。因此有可能在该细胞群中Bo-LAIT介导的B细胞增殖是间接的，并且是通过所含的单核细胞的激活来介导的。
比较T缺失的，Percoll分离的脾细胞，和从该细胞群来源的FACS纯化的mlg+细胞对nBo-LAIT，和LPS诱导的增殖的反应。如图16所示，两细胞群对两种刺激物均强烈反应。用99.8％纯度的B细胞群所获得的高10倍的刺激指数是因为在这些培养物中降低的非刺激背景(图16)。LAIT蛋白诱导的B细胞增殖和CD14如上所述，已经观察到CD40特异的mAbs，其在B细胞膜上表达，能诱导小鼠B细胞的增殖(Sem,in Immunol6:267,1994；PNAS83:4494,1986；《免疫学杂志》(J.Immunol.)140:1425,1988)。
为了确定抗CD40和LAIT蛋白诱导的B细胞激活之间是否存在某种关系，检测rBo-LAIT刺激高悬浮密度脾B细胞增殖的能力，其中B细胞是从常规C57BL/6小鼠或者已通过靶基因破坏而除去CD40表达的C57BL/6小鼠中分离的(《免疫力》(Immunity)1:167,1994)。如图17所示，在检测的rBo-LAIT浓度范围内未观察到这些B细胞的反应中有差异。
这些结果表明CD40本身不必参与LAIT蛋白的信号传递，但是CD40和LAIT蛋白假定的膜受体共享第二位使产生系统的可能性不能排除。比较分析人、牛和小鼠CD14检测已经观察到的nBo-LAIT和rBo CD14对小鼠B细胞的活性，从体液而不是初乳中分离的小鼠CD14(Mo)和人CD14(Hu)的活性。已经证实Hu-CD14存在于肾病人的尿中(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)24:1779,1994)。Hu-CD14是用改良法分离的。尿液通过加入饱和(NH4)2SO4至终浓度45％(v/v)来加以沉淀，并且沉淀物质在14000g离心30分钟来澄清。然后该离心上清中的(NH4)2SO4浓度增加到75％(v/v)。沉淀物在14000g离心30分钟聚集成小团，然后溶于含10mM Tris,150mM NaCl，和“完全”蛋白酶抑制剂鸡尾酒(Boehringer Mannheim)的TN缓冲液pH8.0中。不溶物在13000g离心15分钟去除。该离心的上清在已于TN缓冲液pH8.0中平衡的G-10柱(Bio Rad)上脱盐。然后将其通过人CD14特异性mAb,3C10(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)15:126,1983)，已经偶联的Sepharose 4B。结合物在100mM乙酸盐，150mMNaCl,pH2.8中洗脱，并立即加入10倍体积的1M Tris,pH8.0加以中和。洗脱液在Speed-vac中浓缩，并比色法测定蛋白质浓度。
小鼠CD14从小鼠杂交瘤OKT3(PNAS USA77:4914,1980)的上清中分离。在细胞群筛选分析CD14特异性mRNA表达的过程中，观察到每种测定的杂交瘤均含信号。因此，如果供体和融合配体均是鼠源的，那么所产生的CD14也是鼠源的。杂交瘤OKT3满足这些标准。为了评估CD14蛋白是否能被OKT3产生，并达到足够的量允许分离，1升OKT3培养上清中所含的物质在3C10-Sepharose上亲和纯化，按以上对人尿来源的CD14的描述进行。3C10的特异性已定位到人CD14的残基7-10上(《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.)270:361,1995)。这些残基在牛和小鼠CD14中是高度保守的。
图18的左侧比较亲和纯化的人尿CD14(nHu)，初乳牛CD14(nBo)，和OKT3起源的小鼠CD14(nMo)每种1μg的银染分析。图18的右侧比较相同三种CD14每种250ng的免疫杂交分析，用mAb3C10作探针检测。正如所示，所有这三种制品的纯度是可比的，它们与mAb3C10的反应性也一样。
伴随各自cDNAs编码的氨基酸数目有差异的这三种CD14在分子量上的明显差异可能是由于转录时和/或转录后修饰的缘故。在本文中，明显看出小鼠，人，和牛CD14s分别含5,4和3个潜在的N糖基化位点。
评估这三种CD14制品刺激小鼠B细胞增殖的能力。如图19所示，从这三种属中分离的CD14具有可比的特异性活性，并且在ng/ml浓度范围是有活性的。结果也证实同源物质是功能性的，具体地说，小鼠CD14可以激活小鼠B细胞。结果也证实初乳CD14在其刺激B细胞的能力方面不是奇特的，因此不可能是泌乳的特定环境中所产生的特定分子形式。nBo-LAIT对人脐血B细胞的增殖促进活性检测已观察到的nBo-LAIT对小鼠B细胞的多种生物活性，对人B细胞生理功能的影响。采用两种来源的B细胞。因为LAIT蛋白的一个可能作用是参与增强新生儿免疫系统的发育，所以需要评估其刺激来自新生儿的B细胞，具体地说，是从脐血分离的B细胞，发生增殖的能力。
脐血在磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)中1∶1稀释，并加在ρ=1.077的Percoll(Pharmacia)之上。如图1A所述进行梯度离心。收集ρ=1.077/1.000的界面并在补充了5％胎牛血清(FBS)的PBS中冲洗两次。然后用已偶联了B细胞膜标记物CD72特异的mAb的荧光素对所获得的淋巴细胞染色。随后通过FACS阳性筛选CD72阳性的脐血淋巴细胞，纯度＞98％。其后这些阳性选择的B细胞培养于无血清培养基，正如对小鼠B细胞的处理一样。在小鼠和人B细胞增殖试验中的唯一区别是后者是在60小时用胸苷处理，维持12小时，而不是在40小时，维持6小时。
如图20A所示，nBo-LAIT在其诱导新生儿B细胞增殖的能力方面与Igκ和Igλ特异性mAb发生作用。尽管固化的(培养板结合的)抗轻链mAbs和2μg/ml nBo-LAIT单独均可诱导超过背景的胸苷摄入增加，但两者的组合支持5倍的增加。
这些结果表明在缺乏完全发育的T细胞区时，有可能乳汁喂养的新生儿所消耗的LAIT蛋白作为T细胞的替代物发挥功能，帮助刺激已遇到抗原的B细胞增殖和分化成Ig分泌细胞(《实验医学杂志》(J.Exp.Med.)169:2149,1989；《科学》(Science)245:749,1989；Intl,Immunol.2:859,1990；Intl Immunol.2:869,1990)。人初乳和正常血清中的CD14为了测定在初乳和正常血清中存在的CD14的浓度，用特异性ELISA(IBL-Hamburg)测定来自两位供者的初乳，和来自五位健康供者的血清样品中CD14的存在。如表3所示，来自该健康个体群体的血清所包含的CD14浓度为1.7-3.2μg/ml，并且是性别非依赖性的。这些结果与Grunwald等人报道的结果非常符合(《免疫学方法杂志》(J.Immunol.Method)155:225,1992)。
>*2.6-3.4μg/ml根据ELISA试剂盒制造商(IBL,Hamburg)如图21所示，分娩后22小时采集的初乳(A.D.)，以及分娩后4天采集的早期乳奶(S.B.)中含的CD14均大约是正常血清中所含量的20倍。在试验的筛选期中，从一位供者(S.B.)获得延长到分娩后78天的多份样品，尽管CD14的浓度与第4天所观察到的相比已大大下降，但它们仍然是正常血清中所观察到的大约3～5倍(图21)。
在泌乳妇女中关于血清CD14浓度的资料仍不能得到。因此，仍需确定在初乳和乳奶中所观察到的高浓度CD14是限于这些体液，还是反映了泌乳妇女所有体液中CD14浓度的普遍增加。
可能是新生儿免疫系统对初乳CD14的B细胞增殖和分化活性的短暂暴露在新生儿免疫反应机制的发育中发挥部分作用。该活性在初乳中存在的生理相关性符合该观察结果，正如以上所述，在新生儿中T细胞功能是受损的，这可能是由于在初乳和早期乳奶中存在高浓度的TGFβ1和TGFβ2(《细胞生物学杂志》(J.Cell.Biol.)105:1039,1987；《细胞》(Cell)49:437,1987；EMBO J.6:1633,1987)。如表2所示，亚促有丝分裂浓度的CD14与亚促有丝分裂浓度的膜免疫球蛋白特异的mAb组合，支持B细胞的活化。CD14在发育的新生儿免疫系统中可能作为T细胞的替代物发挥功能。因此，在缺乏合成的饮食配方时，通过暴露于CD14的免疫刺激效果新生儿可从CD14作为婴儿饮食配方添加剂的应用中获益。nBo-LAIT对人扁桃体B细胞的增殖促进活性评估nBo-LAIT对从成年人分离的B细胞的生物活性，单独，以及与固化的(培养板结合的)抗轻链mAbs组合，以刺激从人扁桃体中分离的B细胞。
扁桃体B细胞通过阴性选择来加以制备。扁桃体淋巴细胞按照对脐血淋巴细胞的处理进行制备。所得到的细胞群用生物素化的CD3ε特异的mAb标记(Becton Dickenson)，然后用含铁的“微珠”标记。冲洗1次后，标记的细胞群通过MACS(Becton Dickenson)，并收集流出液。根据系特异性mAbs免疫荧光染色的评估，该细胞群含＜1％T细胞，和＞97％B细胞。这些B细胞然后在Percoll不连续密度梯度上进一步分离，与分离高悬浮密度小鼠B细胞所用的步骤相同。所述的试验采用在ρ=1.085/1.079界面上的那些B细胞。这些阴性选择的，密度分离的静止B细胞按以下所述培养，脉冲处理，并按对脐血B细胞的处理来收集。
如图20B所示，与用新生儿分离的B细胞所获得的结果相比，nBo-LAIT在300ng/ml的低浓度时，单独激活这些静止扁桃体B细胞的强烈增殖。再者，当与固化的抗轻链mAbs组合时，在一些浓度下的nBo-LAIT反应被大大增强(图20B)。
成熟人B细胞对nBo-LAIT的增殖促进活性是敏感的，当与B细胞抗原受体的同时结合相组合时，该活性被放大。这些结果表明了LAIT蛋白潜在应用于疫苗载体，帮助增加它们的佐剂性，或可能降低对佐剂的需要。
接种技术的限制是特定抗原制剂的免疫原性。某些佐剂被认为是通过聚集和激活抗原特异性T细胞来发挥功能。CD14，作为抗原特异性B细胞反应的T细胞替代物，可提供改善的方式来激活抗原特异性B细胞以使它们不仅仅扩增和分化成抗体分泌细胞，而且一旦激活，将会作为聚集T细胞的有效APC来发挥功能。这会增特异性免疫反应的放大和T细胞介导的独特型转换。
T细胞的免疫缺陷是已知的。由于缺乏gp39(CD40L)(已定位至X染色体)的表达而致的与T细胞功能障碍有关的免疫缺陷已被鉴定(ⅰ)X连锁的高IgM综合征(HIM)；(ⅱ)常见多变型免疫缺陷(CVI)；和(ⅲ)X连锁的无丙种球蛋白血症(XLA)。在某些这些疾病中(HIM)，已经证明从病人中分离的T细胞不能够激活B细胞(《科学》(Science)259:990,1993)，并且该表型与功能性gp39(CD40L)的缺乏有关。在这些情况下，CD14，或者目的为诱导特异性体液反应，或者作为多克隆B细胞激活剂来使用，均能发挥功能以诱导/维持同系Ig的水平，这与抗潜在的环境病原体的每日屏障的保护相一致。
CD14在初乳中的存在是与它在乳儿中发挥刺激B细胞的作用相一致。CD14在辅助新生儿免疫系统发育中的有效性可在动物模型中加以评估。
CD14缺陷的雌性动物，通过CD14位点的有意破坏来制备，将与异源性的或CD14缺陷的雄性动物交配。这将能够在表达或不表达CD14的幼狗中评估初乳CD14的缺乏对B细胞发育的影响。具体地说，将比较B细胞的个体发育和血清IgM和IgG水平的累积发展，以及这些幼狗增强特异性免疫反应的能力。
再者，评估血清CD14(sCD14)在维持“天然”IgM循环量中发挥的作用。循环的IgG和IgM量是处在不同的调控下。血清IgG在无抗原环境中饲养的小鼠中实际上是缺乏的，然而IgM却不受影响。为说明sCD14在血清IgM水平调控中潜在作用，来自上述交配的CD14充足和缺乏的小鼠将限菌饲养。
sCD14的表达调节障碍与特定疾病的病理学相关。sCD14量在患类风湿关节炎(RA)的病人的血清中是增加的(Clin.Exp.Immunol91(2):207,1993)。也已经报道活化CD14+单核细胞的数目在RA病人的滑液中有增加(Br.J.Rheumatol,29(2):84,1990；《风湿病学》(J.Rheumatol),22(4):600,1995)。尽管仍需确定sCD14的量在RA病人的滑液中是否是增加的，但是CD14+单核细胞一旦激活，就能表达膜相关的能裂解膜CD14的蛋白酶，导致产生sCD14(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.)25:604,1995)。与sCD14激活人B细胞的能力相一致，RA病人滑液中含有大量的活化B细胞，至少一部分B细胞能产生类风湿因子(《临床免疫学与免疫病理学》(Clin Immunol.Immunopathol31(2):272,1984；Clin.Exp.Immunol.55(1):91,1984)。这样，出现一种模型，它涉及sCD14在RA病人合成增加，以及它可能参与B细胞的激活，导致类风湿因子产生。因此抗体介导的sCD14的清除可使症状缓解，该缓解是由B细胞激活和RA病人中类风湿因子产生的调节障碍所介导的。再者，抗体介导的sCD14的清除会缓解炎症，该炎症是由sCD14诱导单核细胞产生炎症前细胞因子所支持的(《欧洲免疫学杂志》(Eur,J.Immunol.) 24:1779,1994)。
常规制备人单克隆抗体(mAbs)存在多种困难，非常重要的是不能够富集所需抗原特异性的活化人B细胞。sCD14具有诱导所需抗原特异性的人B细胞的能力。sCD14在体外诱导人B细胞增殖和分化的能力使之可能用于制备抗原特异性mAbs。在此我们表明高浓度(0.5-1μg/ml)的sCD14以多克隆的方式激活人B细胞。然而，亚最适量促有丝分裂浓度的sCD14被证明能与B细胞抗原受体(BcR)特异的mAb协同发挥作用。因此，亚最适量促有丝分裂浓度的sCD14优选激活那些通过BcR收到互补信号的B细胞。在这些情况下，BcR特异的mAb作为抗原替代物发挥功能。如果特异性是强加在BcR信号的传递过程中，那么随之发生的B细胞反应也将是特异的。因此，当抗BcR由特异性抗原替代时，sCD14同时存在所提供的协同刺激将会全部集中在抗原特异性B细胞上。这样，随之发生的抗体的合成将是抗原特异的。以该方式激活的B细胞群对活化的，抗原特异的B细胞来说是高度富集的，因此有利于制备分泌所需特异性的mAb的人杂交瘤。
CD14在接种技术中作为佐剂的有效性可用动物模型加以评估。Bo和Hu-CD14将用半抗原TNP加以改良。半抗原化的物质将被评估其体外诱导多克隆B细胞激活的能力，以确保半抗原化没有改变CD14的生物活性。偶联物将进行皮下或肌肉内注射，并随着时间，测定血清中特异性抗体的含量。使用另外系列的小鼠，收集引流的淋巴结，并计数所包含的抗体分泌细胞。另外，某些受者将用变量的CD14和蛋白质或细胞抗原组成的混合物来进行免疫。然后计算血清抗体滴度，以及抗原特异性的，和所有Ig分泌细胞的数目。
CD14的毒性可在小鼠，大鼠和猴的急性静脉内的研究中加以评估。可以进行大鼠的急性皮下灌注研究，以及在长期研究中，在三种动物中涉及多次皮下和静脉内注射的研究。将进行大体病理学(Grosspathologic)和组织病理学的评估，以及血清化学和血液病学的分析。基因毒性潜力可在体外哺乳动物细胞，和小鼠小核试验中进行。致畸潜力可在受孕小鼠，大鼠，和猴中进行评估。
将CD14施用于人受试者时，可采用常规的制药实践。作为婴儿饮食配方的添加剂，它可以在生产时加入到饮食配方中。它可以制备成片剂或胶囊，或仅在使用前混合的粉末。在疫苗制剂的情况下，根据其它标准步骤它可以作为所制备的疫苗的成分而包括在内。使用法可以采取任何方便的方式，例如，静脉内、皮下、肌肉内、胃内、颅内、囊内、脊柱内、脑池内、腹腔内，或口服。
肠胃外的制剂可以是液体溶液或悬液的形式。
本领域中已知的用于制备制剂的方法均可见于，如，“雷明顿制药科学”(Remington’s Pharmaceutical Sciences)。肠胃外用药的制剂，例如，可以包含作为赋形剂的无菌水或盐，聚二醇如聚乙二醇，植物油，氢化萘等。
CD14使用的浓度将根据，如，使用量和使用途径，而有所变化。
在CD14天然氨基酸序列的变异方面，至少，可以进行保守的替换。保守替换见述于专利文献，例如，见美国专利No.5,2264,558。因此期望，例如，非极性脂肪族中性氨基酸甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸，之间的互换可能是可行的。同样，极性脂肪族中性氨基酸丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天门冬酰胺和谷氨酰胺，之间的替换可能是可行的。带电荷的酸性氨基酸，天门冬氨酸和谷氨酸，之间的替换可能是可行的，带电荷的碱性氨基酸，赖氨酸和精氨酸，之间的替换也是如此。芳香族氨基酸，包括苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸之间的替换也可能是可行的。这些替换和互换对本领域的那些技术人员来说是熟知的。其它的替换也是很可能的。当然，也预期变异蛋白质与天然存在的蛋白质的同源性百分数越大，代谢活性的保持也越高。
权利要求
1．具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的能够激活哺乳动物B细胞的多肽，或保留该多肽生物活性的该多肽的片断；或保留该多肽生物活性的该多肽的变体；保守替换的该多肽变体；或具有该多肽生物活性的其片断或变体的偶联物。
2．SEQ ID NO:4的多肽或其保守替换的变体。
3．权利要求1或2中的多肽，其中多肽是转录时和/或转录后修饰的。
4．包含编码具有根据权利要求1和2的氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
5．包含编码具有SEQ ID NO:4氨基酸序列的多肽的核苷酸序列的核酸分子。
6．根据权利要求4和5的为cDNA的核酸分子。
7．根据权利要求4和5的为基因组DNA序列的核酸分子。
8．权利要求5的核酸分子，它是包含核苷酸序列SEQ ID NO:1的cDNA分子。
9．从牛初乳乳清中制备具有序列SEQ ID NO:4的多肽或其转录时和/或转录后修饰形式的方法，包括从乳清中分离该多肽。
10．权利要求9的方法，其中分离多肽包括蛋白质从澄清的牛初乳乳清中盐析出来。
11．权利要求10的方法，其中多肽的进一步分离包括阴离子交换层析。
12．权利要求11的方法，其中多肽的进一步分离包括筛柱层析。
13．权利要求12的方法，其中多肽的进一步分离包括羟基磷灰石柱层析。
14．激活B细胞的方法，利用具有氨基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:6的多肽，或保持该多肽生物活性的该多肽的片断；或保持该多肽生物活性的该多肽的变体；或该多肽保守替换的变体；或具有该多肽生物活性的其片断或变体的偶联物。
15．权利要求14的方法，其中多肽SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的类似物来自该多肽的氨基酸替换、缺失或添加，条件是该多肽的三维构象得以保存。
16．权利要求15的方法，其中多肽是SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的保守替换变体。
17．权利要求14、15或16的方法，其中多肽是转录时和/或转录后修饰的。
18．通过施用根据权利要求14、15、16或17的多肽在需要B细胞激活的哺乳动物中激活B细胞的方法。
19．权利要求18的方法，其中哺乳动物是人受试者。
20．权利要求19的方法，其中人是婴儿。
21．权利要求18的方法，其中需要这种激活的哺乳动物具有CD40阴性或CD40缺陷的B细胞。
22．权利要求21的方法，其中哺乳动物是人受试者。
23．权利要求22的方法，其中人是婴儿。
24．权利要求18的方法，其中哺乳动物患T细胞免疫缺陷，或过敏。
25．权利要求24的方法，其中哺乳动物具有CD40L阴性或CD40L缺陷的T细胞。
26．权利要求25的方法，其中哺乳动物是人受试者。
27．权利要求26的方法，其中人是婴儿。
28．诱导B细胞增殖和分化成免疫球蛋白高分泌细胞的方法，采用具有氨基酸序列SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:5或SEQ IDNO:6的多肽，或保持该多肽生物活性的该多肽的片断；或保持该多肽生物活性的该多肽的变体；保守替换的该多肽变体；或具有该多肽生物活性的片断或变体的偶联物。
29．权利要求28的方法，其中多肽SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的类似物来自该多肽的氨基酸替换、缺失或添加，条件是该多肽的三维构象得以保存。
30．权利要求28的方法，其中多肽是SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5或SEQ ID NO:6的保守替换变体。
31．权利要求28、29或30的方法，其中多肽是转录时和/或转录后修饰的。
32．通过施用根据权利要求28、29、30或31的多肽在需要B细胞激活的哺乳动物中诱导B细胞增殖和分化的方法。
33．权利要求32的方法，其中哺乳动物是人受试者。
34．权利要求31的方法，其中人是婴儿。
35．一种制备具有氨基酸序列SEQ ID NO:4的纯蛋白或其转录时和/或转录后修饰形式包括保守替换变体的方法，包括(ⅰ)培养原核或真核宿主细胞，它们能够在培养条件下表达所述蛋白或转录时和/或转录后修饰形式的所述蛋白；(ⅱ)表达所述蛋白或转录时和/或转录后修饰形式的所述蛋白；以及(ⅲ)从培养物中回收所述蛋白。
36．权利要求14、15、16或17的多肽在制备在需要B细胞激活的哺乳动物中激活B细胞的药物中的用途。
37．制备婴儿饮食配方的方法，其中包括将权利要求14、15、16或17的多肽加入到饮食配方中。
38．制备疫苗的方法，它包括将权利要求14、15、16或17的多肽加入到疫苗配方中。
39．权利要求38的方法，包括将抗原和权利要求14、15、16或17的多肽偶联入疫苗配方中的步骤。
40．权利要求38的方法，进一步包括将抗原和权利要求14、15、16或17的多肽混合入疫苗配方中的步骤。
41．接种病人的方法，包括对病人施用抗原和权利要求14、15、16或17的多肽。
42．权利要求41的方法，其中抗原和权利要求14、15、16或17的多肽在单一步骤中使用。
43．权利要求41的方法，其中抗原和权利要求14、15、16或17的多肽在不同步骤中使用。
44．接种制剂的试剂盒，包括预定量的抗原和预定量的权利要求14、15、16或17的多肽。
45．对需要以下抗体的哺乳动物的施用方法，所述抗体针对具有氨基酸序列SEQ ID NO:5的多肽或保留该多肽生物活性的该多肽的片断；或保留该多肽生物活性的该多肽的变体；该多肽的保守替换体；它能够结合该多肽，其片断或变体，因而降低或抑制人B细胞的活性，否则B细胞因为高血清水平的具有SEQ ID NO:5氨基酸序列的多肽或其功能性衍生物而是高度活化的。
46．权利要求45的方法，其中哺乳动物是人受试者。
47．富集分泌所需抗原特异性的单克隆抗体的哺乳动物B细胞的方法，其包括根据权利要求14、15、16或17在亚最适量与抗体针对的抗原一起协同激活该B细胞。
48．根据权利要求47的方法，其中哺乳动物B细胞是人源的。
49．根据权利要求47的方法，其中哺乳动物B细胞是小鼠的。
全文摘要
从牛初乳乳清中纯化出一种新蛋白质并鉴定了已分离的编码该蛋白质的核苷酸序列。该分离的牛蛋白被称为牛泌乳相关的亲免疫(Bo－LAIT)蛋白。Bo－LAIT蛋白的人对应蛋白，Hu－LAIT，也进行了描述。激活B细胞的方法，尤其是在需要该激活的哺乳动物，如人，中通过施用LAIT蛋白激活B细胞的方法被描述。LAIT蛋白可加入到婴儿饮食配方中。正是通过这种饮食配方喂养婴儿，LAIT蛋白可施用于婴儿。LAIT蛋白可以掺入作为接种的成分。LAIT蛋白可以施用于患T细胞免疫缺陷的病人，例如，病人T细胞的细胞表面低表达或完全缺乏gp39(CD40L)的特定T细胞的机能障碍。也描述了包括LAIT蛋白在内的用于激活需要该激活的哺乳动物中B细胞的药物的制备。可以使用天然或重组的LAIT蛋白。
文档编号A61K38/00GK1238010SQ97199840
公开日1999年12月8日 申请日期1997年11月18日 优先权日1996年11月18日
发明者M·H·朱利叶斯, D·菲利普, K·阿利扎德-希阿威 申请人:韦尔斯利医院基金会