专利名称：一种抗不育症和提高生育力的药剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及局部麻醉药在制备用于抗不育症或用于提高生育力的药剂方面的应用。它还涉及一种药物组合物，该药物组合物包括药物上有效剂量的局部麻醉药和药物上可接受的赋形剂。它还涉及一种用所述药物组合物提高妇女生育力的方法。
不育症或低生育力会是为该病苦恼的人们的一个难题。对不生育妇女的常规疗法是IVF(体外授精)治疗。该IVF疗法的基础如下刺激排卵每天激素注射，超声检查和血样。
恢复卵母细胞用局部麻醉法经阴道进行超声波引导的卵巢穿刺。
精子的预备游上，游下，精子选择或者选择具有最好的前进活动性的最佳精子群体的其它方法。
体外授精在细胞培养箱中将卵母细胞和选定的精子群体培养。直接显微镜检查细胞分裂和选择最有活力的胚细胞。
胚胎转移将2～3个活力最强的胚细胞置于子宫腔内进行有希望的子宫内膜中植入。
IVF疗法是一种昂贵的方法，对于一些夫妇来说，它会引发复杂的心理副作用。试图怀孕的该技术性的人工方法对于经历该疗法的夫妇来说具有不利作用，该疗法会不利地影响夫妻关系。在整个该烦琐的治疗之后，只有25～30％的怀孕率，其余那些未获成功的夫妻其关系遭到破坏并且仍无孩子。IVF治疗的费用是每个月经周期约20000～25000SEK。
虽然以前进行了一些研究，但子宫内膜异位期间不育症的原因尚未弄清，也不清楚治疗后缺乏改善的生育率的原因。尤其是还不清楚不存在骨盆粘连时轻度子宫内膜异位与低生育力之间的关系(Mahmood，TA，Templeton A.轻度子宫内膜异位的病理生理学文献综述。人类生殖(Human Reproduction)1990；5765～784)。
已在带有子宫内膜的腹膜植入物的患者腹膜液(PF)中发现了白细胞数增多，并认为是一种发作的不生育炎症(Haney AF，Muscato JJ，Weinberg JB不育症患者中的腹膜液细胞群。生育与不孕(FertilSteril)1981，35696～698；Edelstam GAB.Lundkvist OE，Venge P，Laurent TC生殖器炎症过程中腹膜液内的透明质(hyaluronan)和髓过氧化物酶。炎症(Inflammation)1994，1813～21)。数目增加的白细胞含有活体内接触过抗原的巨噬细胞，该巨噬细胞分泌巨噬细胞衍生的生长因子(MDGF)，这可以解释子宫内膜组织的增殖(Halme J，White C，Kauma S，Estes J，Haskill S。子宫内膜异位患者的腹膜巨噬细胞体外释放生长因子活性。临床内分泌学和代谢杂志(J Clin Endocrin andMetabolism)，1988；661044～49)。得自巨噬细胞的其它分泌产物，生长因子例如TNF和干扰素，表现出配子毒性并且还可能对生育过程产生不利影响(Halme J子宫内膜异位相关性不育症中腹膜炎的作用。AnnN Y Acad Sci 1991；622266～74)。
无细胞的腹膜液也对生殖力降低有重要作用，因为已证实它显著降低输卵管伞获取卵子的能力(Suginami H，Yano K，Watanbe K，Matsnura S子宫内膜异位腹膜液中存在的抑制输卵管伞捕获卵子的因素。生育与不孕1986；461140～1146)。已在患有子宫内膜异位和未解释的不育症的患者腹膜液中分别发现了精子前进速度的降低(Makarand K，Oak M，Chantler EN，Vaughan Williams CA，Elstein M.对患有子宫内膜异位和未解释的不育症的不育妇女腹膜液中精子存活率的研究。临床生殖和生育力(Clinical reproduction and fertility)1985；3297～303)。甚至更有趣的是，在与得自患子宫内膜异位的患者的腹膜液进行24小时体外培养过程中发现了精子吞噬作用的增大(Muscato JJ，Haney AF，Weinberg JB，人腹膜巨噬细胞对精子的吞噬作用子宫内膜异位中一个可能的不育原因。美国妇产科学杂志(Am J ObstetGynecol)1982；144503～510)。然而，在该具体研究中存在数个不同的精子供体，所以不能排除包括的免疫因素。
本发明是一种用于妇女授精的IVF疗法的替代方法。已通过体外研究发现了利多卡因可减小精子吞噬作用。认为利多卡因的该效果是由于通过阻止Na+渗透性的增大和通过可能干扰细胞膜中ATP而引起细胞膜的稳定化。该疗法的费用将大约是IVF疗法的10％，例如每个月经周期2500SEK。不存在可引起心理副作用的技术授精过程。该疗法可对患有子宫内膜异位和/或轻度机械原因的不育症的患者试用。可在等候IVF时实施该疗法并且不会影响后续IVF疗法的成功可能性。
迄今，文献中未报道过用利多卡因治疗不育症。但已知利多卡因的其它药学效果。例如，在EP 507 160中，它公开了一种应用于皮肤、含利多卡因的外用制剂，该制剂包括置于支持体上的药物保持层。该制剂应该用于治疗带状疱疹神经痛和带状疱疹后神经痛。
附图中应用的“endometr”表示子宫内膜异位，“end-prob”表示可能的子宫内膜异位。
图1是显示培养的每天的自由精子数的示意图与细胞介质(cellmedium)(A，对照)，与细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与腹膜液和利多卡因(D)。
图2是显示培养的每天的前进性游动的精子数的示意图与细胞介质(A，对照)，与细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与腹膜液和细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与膜腹液和利多卡因(D)。
图3是显示培养的每天的非前进但游动的精子数的示意图与细胞介质(A，对照)，与细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与腹膜液和利多卡因(D)。
图4是显示培养的每天的活着但静止的精子数的示意图与细胞介质(A，对照)，与细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与腹膜液和利多卡因(D)。
图5是显示培养的每天的死精子数的示意图与细胞介质(A，对照)，与细胞介质和利多卡因(B)，与腹膜液(C，对照)以及与腹膜液和利多卡因(D)。
参考图1～6，局部麻醉药在制备用于抗不育症或用于提高生育力的药剂方面的应用。所述局部麻醉药可选自具有局部麻醉效果的任何物质。这类物质的实例有布比卡因(1-丁基-N-(2，6-二甲基苯基)-2-哌啶甲酰胺)、利多卡因(2-(二乙氨基)-N-(2，6-二甲基苯基)乙酰胺)、甲哌卡因(N-(2，6-二甲基苯基)-1-甲基-2-哌啶甲酰胺)、丙胺卡因(N-(2-甲基苯基)-2-(丙氨基)丙酰胺)和罗哌卡因((S)-N-(2，6-二甲基苯基)-1-丙基-2-哌啶甲酰胺)。也可应用其它局部麻醉药。优选应用利多卡因。
本发明的另一特征是一种药物组合物，它包括药物上有效浓度的局部麻醉药与药物上可接受的赋形剂。所述浓度是一个对妇女不育症有效果的浓度或是一种提高妇女生育力的浓度。剂量和浓度可由医师确定。有效物质的浓度至少是5μg/ml。可应用1～20ml中100～2000μg，优选约118μg。施用的剂量至少是100μg，尤其约1000μg。所述组合物优选通过输卵管灌气法优选在腹膜腔内施用。所述局部麻醉药如前面定义。
可将所述活性成分与赋形剂混合，该赋形剂是药物上可接受的并与所述活性成分相容，其用量适用于本文描述的疗法。此外，如果需要的话，所述组合物可含少量辅助物质，例如润湿剂或乳化剂，pH缓冲剂等，它们增强所述活性成分的效果。
本发明的药物组合物可包括其中所含组分的药物上可接受的盐。药物上可接受的盐包括酸加合盐，即与无机酸(例如盐酸或磷酸)形成的盐，或者与有机酸(例如乙酸、酒石酸和扁桃酸)形成的盐。
生理上耐受的载体是本技术中熟知的。液态载体的实例有无菌水溶液，该水溶液除了活性成分和水外不含其它物质，或者含缓冲剂(例如生理pH值的磷酸钠)、生理盐水或这二者，例如磷酸盐缓冲的盐水。此外，水性载体可含一种以上缓冲剂盐，以及例如氯化钠和氯化钾这类盐，葡萄糖，丙二醇，聚乙二醇和其它溶质。
所述组合物还可包括透明质，它是一种粘稠的物质，例如呈凝胶形式。透明质给出活性物质的缓慢释放，它是优选的，因为在排卵和按本发明治疗后长达24小时可能会发生受孕。另一优点在于，透明质对精子有刺激作用(Zimmerman ER，Drobnis E，Robertson KR，NakajimaST，Kim H用精子选择系统与洗涤技术配制精液。生育与不孕1994；61269～275)。
通常不认为不育症是一种病。本发明还包括用本发明的药物组合物治疗妇女不育症的方法，其特征在于，所述药物组合物是通过输卵管灌气法被插入的。
本发明尤其涉及抗不育症或提高生育力的美容方法或非治疗性方法，其中a)诊断排卵，b)当按步骤a)预期到排卵时给出用局部麻醉药的治疗。
该治疗优选通过输卵管灌气法实施。步骤优选如下自发排卵在正常月经周期中初步治疗。只刺激停止排卵的患者，并用氯米芬(Clomifen)(片剂)初步治疗，氯米芬容易制备且不贵。排卵后需要一个血样以证实在受治疗的周期中已排卵。
LH(黄体生成素)检验通过自己在家里检查尿样诊断排卵前24～36小时LH急变。
输卵管灌气法当LH检验是阳性时给予输卵管灌气法治疗，即在正常的妇科检查中例如用10ml的100μg/ml利多卡因的生理NaCl或林格溶液治疗。将不需麻醉。
授精无人工处理。在被给予输卵管灌气法治疗后夫妇将在家里通过正常的性交方式尝试并达到怀孕。
不存在对精子存活的不利效果这一发现证实了精子未受利多卡因的影响，这也已在其它研究中被证实(Bennett SJ，Bolton V，Parsons J.利多卡因对人精子活动性的效果。辅助的生殖和遗传学杂志(J AssistedReprod.& Genetics)1992；9271～3)。对卵母细胞似乎也是这样，因为已测得高含量的利多卡因但没有任何有关授精或胚胎发育的问题(Bailey-Pridham DD，Cook CL，Reshef E，Hurst HE，Drury K，Yussman MA。在经阴道的卵母细胞恢复过程中卵泡液利多卡因含量。生育与不孕1990；53171～173)。最高含量是118μg/ml，它表明在体外培养中给出的剂量即1000μg利多卡因应该可稀释到例如在10ml等渗液中100μg/ml而被应用。该浓度现将被用于在排卵前24小时进行的输卵管灌气法之后临床研究怀孕结果以提高精子存活率。
利多卡因已被应用多年但没有任何关于怀孕期间不利效果的报道，在动物研究中也已得到证实(Ramazzotto J，Curro FA，Paterson JA，Tanner P，Coleman M。在怀孕的大鼠中利多卡因的毒理鉴定。牙研究杂志(J Dent Res)1985；641214～1218)，所以利多卡因应可被用于治疗子宫内膜异位患者的不育症。
本发明通过如下实施例而被阐述。除非另外定义，应用的所有技术术语和科学术语都与本领域普通技术人员通常理解的具有相同意义。除非另外说明，本文应用的技术是本领域普通技术人员已知的技术。本文提到的文献并入作参考。
实施例1-子宫内膜异位妇女的PF(腹膜液)中精子吞噬作用的减小。
进行该研究以进一步分析白细胞对子宫内膜异位期间降低的生育力的作用，还探寻潜在的疗法。为了排除免疫影响，只有一名精子损献者参与了该实验。将配制的精子样品与得自健康妇女和患子宫内膜异位的妇女的未离心腹膜液一起培养，以评定精子吞噬作用对子宫内膜异位期间降低的生殖力的重要性。当存在或不存在局部麻醉药时，每天计数培养物中成活的精子数达五天，添加局部麻醉药是为了探寻降低腹膜白细胞群活性的方法。材料和方法患者妇女将患者分成三个不同的组。对照材料(n＝9，平均年龄＝38.5岁)包括进行腹腔镜检绝育的妇女或具有不明白的腹痛的妇女。对比例具有被认为与解剖学上正常子宫和输卵管一样正常的腹腔镜检发现物。
研究组是这样的妇女通过腹腔镜检查发现了不育症的病因或者腹痛的病因并且诊断为子宫内膜异位(n＝11，平均年龄＝34.5岁)。该组中，对8名患者是用腹腔镜检诊断的，对3名患者的诊断是既往病历的可能子宫内膜异位但她们尚未发展在腹腔镜检查时可见到的任何子宫内膜异位性植入物。
男子精子损献者是具有正常生育力的健康的38岁男子，在每次精子采样之前的节欲期为2～3天。精子样品是通过上游技术(swim uptechnique)选择最佳群体而配制的(Russel LD，Rogers BJ。应用上升技术改善人精子群体的质量和授精可能性。男科学杂志(J Androl)1987；825)。在腹腔镜检查下采集的腹膜液样品在患者被麻醉后，取血样供以后分析透明质，它在PF中可被用作发作炎症的标记从而排除PID(骨盆炎性疾病)。在器械安全地处于腹腔内的腹腔镜检查开始时，应用抽吸器通过特氟隆导管(直径1.7mm，Optinova，Godby，芬兰)抽吸直肠子宫陷凹中所有可得到的腹膜液并在特氟隆瓶(Nalgene，Brochester，NY，美国)内与10IU肝素/ml混合(Olive DL，Weinberg JB，Haney AF.腹膜巨噬细胞和不育症细胞数和骨盆病理学之间的联系。生育与不孕1985；44772～777)并即刻加以注意。通过在电子天平上称量测定腹膜液量。特氟隆是采集PF的精选的材料，是因为它对哺乳动物细胞的低粘着性(Grinnell F，Milam M，Srere PA。对细胞粘着的研究。生物化学与生物物理学文献(ArchBiochem Biophys)1972；153193～198)。将肝素用作抗凝剂以防止白细胞聚集(Makarand等，1985)。以前应用柠檬酸盐(Edelstam等，1994)，它在精子培养中对精子生存力有不利影响。所有样品都是获得患者许可后抽取的，取样方法得到瑞典Uppsala大学医学院的伦理委员会的认可。精子和腹膜液的培养将特氟隆小管用于在潮湿的细胞培养箱内按如下进行的所有培养中a)细胞介质(1ml)，精子(1ml细胞介质中106个)和0.1ml NaCl。
b)细胞介质(1ml)，精子(1ml细胞介质中106个)和0.1ml利多卡因10mg/ml(Xylocain，ASTRA)。
c)精子(1ml细胞介质中106个)，腹膜液(1ml)和0.1ml NaCl。
d)精子(1ml细胞介质中106个)，0.1ml利多卡因(10mg/ml)和腹膜液(1ml)。
Earls细胞介质(Sigma)含0.35％BSA(牛血清白蛋白)。离心残余量的腹膜液并将上清液冷冻(-20℃)供后续的透明质分析(Edelstam等，1994)。在五天中每天分析这些小管，对所有A～D培养物计数如下，直到100个精子
未与白细胞粘着的自由精子数前进性游动的精子数非前进性游动的精子数静止但活着的精子数死精子数还应用锥虫蓝每天记录存活的腹膜白细胞的百分数。结果主要发现是，当与腹膜液和利多卡因一起培养时，小管内有统计上显著少的被吞噬的精子(p＜0.02)。观察到被捕集在大的白细胞聚集体中的精子，并且一些精子显然遭受吞噬，于是减少了自由活动的精子数。存在和不存在子宫内膜异位时的精子存活率培养两天后，与子宫内膜异位的组相比，含正常组腹膜液的培养物中存在统计上显著更多的自由精子(Kruskal Wallis p＜0.014)。存在和不存在利多卡因时的精子存活率在24或48小时后，未发现对精子存活的不利影响，并且在含利多卡因或不含利多卡因的精子培养物之间没有统计上明显的差异。应用Wilcoxon的p值分别示于表I和II中。
存在和不存在PF(腹膜液)和利多卡因时的精子存活率，未考虑诊断与单独的精子培养物相比，不存在腹膜液时前进活动性降低得更快(图2)。子宫内膜异位组中，存在和不存在PF和利多卡因时的精子存活率存在腹膜液和利多卡因时明显有更多的自由精子，尤其是子宫内膜异位组中培养两天之后。图1和表II。
在两个诊断组内，含利多卡因的培养物中随时间推移死精子更多。图5，表II。
腹膜液中的透明质浓度未表现发作的炎性过程的指征，即证实所有患者是健康的。
表1当比较与利多卡因一起培养或未与利多卡因一起培养时，培养物中记录的不同参数的P值。24小时培养时间后的数据。
a)不含利多卡因的培养物内更多前进性游动的精子。
b)利多卡因组中更多的死精子。
表II.当比较与利多卡因一起培养或未与利多卡因一起培养时，培养物中记录的不同参数的P值。48小时培养后的数据。
c)利多卡因中的更多d)利多卡因组内更多自由精子该研究包括了在五天培养过程中，利多卡因对精子存活率的影响以及对腹膜白细胞吞噬精子的作用。该研究只包括一名精子捐献者以避免不同的免疫组合，这些组合会成为实验中非受控因素。该研究还跟踪精子存活达5天之久，而以前的研究是在24小时期间内考察精子存活的。此外，不但计数了自由的未被吞噬的精子数，还计数了有多少表现为前进性游动或静止性游动的精子以及活着的、死的或自由的(即未与白细胞粘着的)精子数。
在该研究中，证实了以前的发现，即Muscato等1982描述的关于因精子吞噬作用引起子宫内膜异位患者的生育力降低。来自子宫内膜异位患者的腹膜巨噬细胞提高的吞噬能力也已用荧光珠证实了(SamejimaT，Masuzaki H，Ishimaru T，Yamabe T。子宫内膜异位中腹膜巨噬细胞的活性。亚洲大洋洲妇产科学杂志(Asia Oceania J Obstet Gynaecol)1989，15175～181)。
其它关于精子吞噬作用的研究未考虑粘附到一些其它材料上的白细胞损失这个问题(Grinnell等1972)。Makarand等1985应用玻璃容器贮存腹膜液。玻璃对白细胞的粘着力最高(Grinell等1972)因而已被用于分离巨噬细胞(Smedsroed B，Pertoft H。通过珀可离心和选择性粘着的方法从单个的大鼠肝高产率地制备纯的肝细胞和网状内皮细胞。白细胞生物学杂志(J Leukocyte Biol.)1985；38)。Muscato等1989选择了聚丙烯，就细胞粘着问题来说聚丙烯是比玻璃更好的替代材料，但没有特氟隆理想。
在含利多卡因的培养物中死精子随时间推移而更多这一发现势必被认为是在利多卡因存在下，精子吞噬作用减小的结果，因为在含有或不含利多卡因的单独的精子培养物中，未发现对精子的不利影响。这肯定也可解释在利多卡因培养物中非前进性游动的精子增多这一发现(图3)。不存在腹膜液时前进活动性的降低可能指示PF(腹膜液)含有精子保持其功能所需要的物质。
如在引言中提及的那样，输卵管伞不断地被腹膜液润湿，该作用在子宫内膜异位患者的情况下减小卵子获取能力(Suginami等，1986)。如该研究和以前的研究中阐明的子宫内膜异位患者腹膜液中的白细胞吞噬精子的能力更强(Muscato等，1982)。所以患子宫内膜异位的妇女可能具有促使她们的生育力降低的两个因素。该研究还指示了有可能应用利多卡因的效果以便降低精子的吞噬作用。
总之，该研究证实了在利多卡因存在下精子吞噬作用的降低。必须继续研究该现象，即在排卵前(LH急变时间)应用盐水或利多卡因/盐水溶液的输卵管灌气法的随机临床试验进行研究。
虽然按优选的组合物和实施方案描述了本发明，但应懂得可对其作一定的替换和更改而不会偏离所附权利要求书的实质和范围。
权利要求
1.局部麻醉药在制备用于抗不育症或用于提高生育力的药剂方面的应用。
2.权利要求1的应用，其特征在于，所述局部麻醉药选自下组药物布比卡因、利多卡因、甲哌卡因、丙胺卡因和罗哌卡因。
3.一种药物组合物，它包括药物上有效浓度的局部麻醉药和药物上可接受的赋形剂。
4.权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述药物上有效浓度至少是5μg/ml。
5.权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述局部麻醉药选自下组药物布比卡因、利多卡因、甲哌卡因，丙胺卡因和罗哌卡因。
6.权利要求3的药物组合物，其特征在于，所述药物上可接受的赋形剂包括生理NaCl或林格溶液。
7.权利要求3～6任一项的药物组合物，其特征在于，它包括透明质。
8.用权利要求3的药物组合物提高妇女生育力的方法，其特征在于，所述药物组合物优选通过输卵管灌气法被插入腹膜腔。
全文摘要
本发明涉及局部麻醉药在制备用于抗不育症或用于提高生育力的药剂方面的应用。它还涉及一种药物组合物,该药物组合物包括药物上有效剂量的局部麻醉药和药物上可接受的赋形剂。它还涉及一种用所述药物组合物提高妇女生育力的方法。
文档编号A61K31/167GK1248915SQ98802557
公开日2000年3月29日 申请日期1998年2月9日 优先权日1997年2月15日
发明者格雷塔·埃德尔斯塔姆 申请人:埃德尔斯塔姆公司, 格雷塔·埃德尔斯塔姆