专利名称：通过基因治疗炎性细胞的自我调节的细胞凋亡的制作方法
技术领域：
本发明涉及通过向细胞中引入在这些细胞中诱导细胞凋亡(程序性细胞死亡或非坏死细胞死亡)的基因在炎性细胞中治疗性诱导细胞凋亡。细胞凋亡诱导基因(有时在本文称为AIG)是由TNFα启动子(TNFp)或其它在炎症中激活的诱导基因驱动的。在一个实施方案中，在那些能够产生TNFα的细胞中选择性诱导细胞凋亡。使用传统基因治疗技术，可将TNFp-AIG或其它嵌合基因方便地引入体内。在嵌合基因在TNFp-AIG的实施方案中，它有利地只在那样产生炎性细胞因子，TNFα的细胞中表达。此外，由于TNFp-AIG嵌合基因含有TNFα启动子元件，它亦能螯合诱导性的，TNFp-选择性转录因子。这种螯合导致内源产生的TNFα减少。本发明特别涉及TNFp-AIG和类似基因构建体，含嵌合基因的细胞，在使用嵌合基因转染的细胞中诱导细胞凋亡的方法，含嵌合基因的药物组合物，在产生TNFα的细胞种群中体外选择不产生TNFα的体细胞变体的方法及类似的确认能够抑制TNFα产生的显性阴性/显性抑制基因的方法以及使用嵌合基因的治疗方法。
本发明的背景在许多炎性条件下，炎性细胞的大量聚集和积累使细胞因子诸如白介素-1(IL-1)，IL-10，粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)和TNFα过量产生(Brennan F.m.et al.，英国医学公报(British Medical Bulletin)1995，51/2，386-384)。在发炎组织中细胞因子的正调节和或相反调节可能直接或间接造成慢性炎性疾病的恶化。例如，类风湿性关节炎(RA)中最显著的病理学表现于炎症局部部位(即滑液关节)。因而，很可能RA病人滑液关节中产生的细胞因子在疾病过程中起重要作用。在这些细胞因子中，相信IL-1和TNFα造成RA特征的软骨破坏和骨侵蚀(Dayer J.M.et al.，J.Exp.Med.，1985，162，1208-1215；Gowen M.et al.，Nature，1983，306，378-380)。在滑液关节中IL-1和TNFα的过量存在已显示加快啮齿动物中胶原诱导的关节炎的发展(Brennan F.M.et al.，Clin，Expt.Immunol.，1994.97/1，1-3)。在滑液组织中过量的TNFα和IL-1是通过软骨-关节翳接头处多种细胞类型产生的，包括巨噬细胞谱系，类巨噬细胞滑液细胞，激活的T细胞以及可能有类成纤维细胞滑液细胞(Chu C.Q.et al.，Arthritis & Rheumatism，1991，34，1125-1132；Deleuran B.W.，et al.，Arthritis & Rheumatism，1992，35，1170-1178)。
除了上述炎性效应，TNFα还在多种炎症前事件中起着普遍和关键的作用，诸如在单核细胞中诱导IL-1活性。实际上，抗TNFα中和抗体已显示能降低整体的IL-1产生(Portillo，et al.，Immunol.，1989，66，170-175；Brennan F.M.，et al.，British Medical Bulletin 1995，51/2，368-384)。因而，阻碍炎性细胞因子TNFα效用的另一个好处在于降低同等破坏性的炎症前媒介IL-1的产生。此外，人们熟知TNFα是其它炎症相关基因的一种转录激活剂。例如，TNFα的存在刺激其它细胞因子(诸如GM-CSF)和细胞表面受体的产生，包括人类白细胞抗原(HLA)II类抗原和粘附分子(Alvaro-GarciaJ.M.，et al.，J.Exp.Med.，1989，146，865-875)，导致连续募集激活的T细胞和嗜中性细胞，引起滑液炎症和增生并最终加重对软骨和骨的破坏(Allen J.B.，J.Exp.Med.，1990，171，231)。
对炎性疾病的常规治疗典型地是直接治疗症状性炎症。这种治疗只能暂时减轻而不能显著减缓疾病发展。相反，以炎性过程中诱导的TNFα和其它因子为靶的治疗看来更有希望。例如，在胶原诱导的关节炎动物模型中，抗TNFα抗体和可溶的TNFα受体-IgG嵌合体能有效降低爪肿胀，关节累及和软骨和骨的破坏(Williams R.O.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.，1992，89，9784-9788)。使用人源化抗TNF-α抗体和TNFα受体-IgG嵌合分子的人体实验产生显著效果(Elliott M.J.，et al.，Arthritis and Rheumatism，1993，36，1681-1690；Elliott M.J.，et al.，Lancet，343，1105-1110)。虽然用这些TNFα抗性剂的治疗看来很好忍受，但亦产生抗重组蛋白的抗体。因而，这些治疗可能不适于长期治疗并且不能获得真正的疾病减轻。为了实际缓和疾病进展，必须使用TNFα特异疗法连续把TNFα作为目标。用这些生物学药剂进行这种治疗方法是不实际的并且难以长期施用。
在一种替代治疗选择中，发炎滑膜可使用外科(Herold N.and SchroderH.A.，Act a Orthop Scand.，1995，66，252-254；Ogilvie-Harris D.J.and WeislederL.，Arthroscory，1995，11，91-95)，化学(Cruz-Esteban C.and Wilke W.S.，Bailliere′s Clinical Rheumatol.，1995，9，787-8017或放射引起的滑膜切除术(Cruz-Esteban C.and Wilke W.S.，Bailliere′s Clinical Rheumatol.，1995，9，787-801)切除。关节镜外科滑膜切除术后的结果是好的，显示从手术前状况到手术后状况的改善。非外科滑膜切除术是使用不同化学药剂例如锇酸，诸如氮芥和塞替派的烷化剂，甲氨蝶呤等进行的。不幸的是，非外科滑膜切除术(包括化学和射线引起的)程序上复杂，只提供短时减轻并且滑液增生只有不规则减少。此外，多数非外科替代物是潜在的致畸形药。另外，在非外科滑膜切除术中对患病组织的化学损伤以及外科引发的组织损伤，其本身常造成炎症反应。最后，必须知道这些方法有通常与常规药物治疗和侵害性外科手术相联系的危险和副作用，包括费用和住院及康复的不便。
因此，仍旧存在对治疗通常的炎性疾病以及特别是RA的有效治疗手段的需要。
本发明的总结通过提供一种新的治疗方法，本发明克服了与以前治疗炎性疾病的疗法相关的缺点。依据本发明的一个实施方案，在产生TNFα的炎性细胞中选择性诱导细胞凋亡，引起这些细胞的破坏而没有相关的炎性反应。
本发明的一个目的是提供一种治疗方法，包括向哺乳动物的炎性细胞，或在炎症部位的细胞中引入包含自我调节的细胞凋亡诱导基因(AIG)的步骤。AIG是由诸如TNFα启动子(TNFp；参看
图1和2)的启动子及优选地一个启动子增强子驱动。因而，它在所有且只有能产生TNFα的细胞中表达。
本发明的另一个目的是提供TNFp-AIG及类似嵌合基因构建体，制造它们的过程，使用它们的方法，以及含有它们的制剂。
本发明的又一个目的是提供一种在用TNFp-AIG嵌合基因转染的细胞中诱导细胞凋亡的方法，一种在种群中体外选择不产生TNFα体细胞变体的方法，一种鉴定能够负责不产生TNFα的种群的产生的显性/阴性基因的方法以及一种鉴定能够负责调节TNFα产生的产品的方法(图10)。
这些和其它目的将能基于下面对本发明的详细公开由本技术领域普通技术人员容易地理解。
附图的简单描述图1是本发明TNFp-AIG嵌合基因的图示。细胞凋亡诱导基因(AIG)可以是任何，但不限于所列基因，即Caspasesl到10，粒酶B，Fasligand等。
图2用图形描述了使用本发明的TNFp-AIG嵌合基因进行基因治疗的结果。
图3总结了用于利用萤光素酶基因(Luc)表达作为报告系统鉴定TNFα启动子的诱导顺式元件的缺失构建体。
图4(a和b)提供了使用图3所述的构建体获得结果的总结。在两个不同的产生TNFα的细胞系，即Jurkat(图4a)和THP-1(图4b)中评价了构建体的瞬时表达。每图中的直方图代表通过在不同实验中使用诸如PMA(图4a)或LPS(图4b)的激活剂测量诱导性的刺激指数。每图中的叠置线表示4到6个实验的平均诱导性。
图5是使用TNFα启动子和原域删除的AIG(使用的AIG是Caspase和Caspase 4/5)的选择的天然元件制备TNFpAIG的流程图。
图6(a，b和c)提供了所做的观察嵌合TNFpAIGs表达的代表性实验的结果总结。使用细胞死亡酶联免疫吸附测定(CDE测定)评价了瞬时转染的Jurkat细胞(图6a和6b)和THP-1(图6c)细胞中的细胞凋亡。在三张图中，具稀疏点(sparse dot)的直方图代表转染对照，即细胞用不含DNA的转染剂处理。具密集点(dense dot)的直方图代表驱动的萤光素酶基因表达的TNFp元件；实心(solid)直方图代表驱动的AIG.1或AIG.2的表达的相同的TNFp。实心直方图上括号内的数值代表富集因子(TNFp AIG诱导的细胞凋亡对TNFpLuc对照载体的比率)。
图7(a和b)图示了本发明的TNFp-AIG嵌合基因，含有随后驱动AIG表达的多拷贝的TNFα启动子诱导顺式元件(图7a)。图示TNFpAIG嵌合基因，含有多拷贝的TNFα启动子诱导顺式元件，驱动AIG的表达，在其下游是TNFα基因的3′未翻译区(TNF3′UTR)(图7b)。TNFα基因的3′UTR与TNFα的诱导表达的调节有关系(Han，J.，et al.，J.Immunolgy，1991，146，1843-1843，Crawford，E.K.，et al.，J.Biol，Chem.，1997，272，21 120-21137，及图9)。
图8(a和b)是制备TNFα超启动子-AIG嵌合构建体方案的流程表。
图9显示了两个实验结果的总结，表明TNF3′UTR对萤光素酶报告基因诱导表达的调节作用。在成纤维细胞系中进行了瞬时转染。加点的直方图代表缺少TNF3′UTR时TNFpLuc的诱导性，实心直方图代表TNF3′UTR存在时TNFpLuc的诱导性。在Jurkat细胞中获得类似的结果。
图10图示从产生TNFα的细胞种群中选择不产生TNFα的体细胞变体并鉴定负责抑制TNFα产生的显性阴性抑制基因。
本发明的详细描述本发明基于这样的事实，在特定炎性疾病中的炎性细胞的细胞凋亡是治疗上有益的。本发明特别涉及通过基因治疗的自我调节细胞凋亡。概括地说，在本发明实践中，至少含有一个附着到至少一个功能拷贝的最小启动子上的启动子增强子(该启动子是在炎性细胞或在炎症部位细胞中激活的基因或基因组合)的嵌合基因结合到至少一个拷贝的细胞凋亡诱导基因(AIG)，这样由启动子驱动细胞凋亡诱导基因的表达，从而将炎性细胞作为靶。在炎症中激活的诱导基因的启动子举例包括，但不限于，细胞因子，白介素及其受体，细胞粘附分子及其配体，趋化因子及其受体，促炎酶，及其类似物。依据本发明的嵌合基因以直接，远侧，或邻近结合及其组合包含增强子，启动子，和AIG元件。如上提及并将在下面详细讨论，在一些实施方案中，为了最大效率使用了多拷贝的增强子，启动子，和/或AIG。
为了更完整的理解此处描述的发明，陈述出下面的详细描述，仅为说明的目的强调嵌合基因包含至少一个TNFα启动子增强子，结合到至少一个功能拷贝的最小TNFα启动子并进一步结合到至少一个拷贝的AIG。虽然随后的实施例亦使用了这种类型的构建，熟练技术人员将会知道此处描述的基本构建体可以改动以提供其它实施方案，将本发明的产物，流程，方法和组合物与其它包括诸如上面列出类型的表现出可用于靶定感染部位细胞的类似功能的在炎症中激活的诱导基因的启动子共同使用。
例如，在本发明嵌合基因构建中可用作启动子的细胞因子和白介素包括，但不限于，TNF-α，TNFβ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-9，GM-CSF，干扰素γ，及其类似物，以及其功能片段和混合物。细胞粘着分子及其配体包括，但不限于，选择蛋白，整联蛋白，和免疫球蛋白超家族成员诸如胞间粘着分子-1(ICAM-1)，血管细胞粘着分子(V-CAM)及类似物，以及其功能性片段和变体及混合物。趋化因子及其受体包括，但不限于，C-X-C和C-C家族成员诸如巨噬细胞炎性蛋白-1α(MIP-1α)，MIP-1β，巨噬细胞趋化蛋白1-4(MCP1-4)，趋化因子RANTES(RANTES)，Mig，嗜中性白细胞活化蛋白2(NAP2)，IP10，Groα-β及类似物，以及功能性片段和变体及其混合物。促炎酶包括，但不限于COX-2，iNOS，磷脂酶，蛋白酶(包括基质金属蛋白酶)，及其类似物以及功能性片段及其混合物。
为了使下面关于本发明的实施例TNFp-AIG嵌合基因的讨论更清楚，说明下列序列序列1是对应于发表的(Takashiba S.et al.，Gene，1993，131，307-308)全长参考人TNFα启动子序列的核苷酸序列。此处使用的核苷酸序数是指此序列的编号。
序列2是本发明使用基因的天然TNFα启动子序列(从转录起始位点，TSS的-1077核苷酸)。序列1和序列2中的TNFp序列只有少数不同。已经报道了TNFα启动子核苷酸序列的这些差别(Takashiba S.，et al.，Gene，1993，131，307-308)。
序列3是天然最小TNFα启动子序列(核苷酸-120通过-TSS，它至少包括一个增强子元件(K1位点；参看Pauli.，U.，Crit.Rev.in Eucaryotic GeneExpression，1994，4，323-344；Rhoades K.L.，et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，22102-22107；and Takashiba S.，et al.，Gene，131，307-108)。
序列4是嵌合基因TNFp120AIG.1(含有-120TNFp，驱动前域(prodomain)缺失的CPP32基因变体的表达(Caspase3，发表于Tewari M.et al.，Cell，199581(5)，801-809，变体为V239A)。
序列5是嵌合基因TNFp706AIG.1(含有-706TNFp，驱动前域(prodomain)缺失的CPP32基因的表达)。
序列6是TNFp1005 AIG.1(含有-1005TNFp，驱动的前域缺失的CPP32基因的表达)。
序列7是嵌合基因TNFp120 AIG.2(含有-120TNFp，驱动前域缺失的Ty/x基因的表达。(Ty(Caspase5)和Tx(Caspase4)基因的序列发表于参考文献Faucheu，C.，et al.，Eur，J Biochem.，236，207-213，1996；Faucheu，C.，et al.，EMBOJ.，14，1914-1922，1995)。
序列8是嵌合基因TNFp706 AIG.2(含有-706TNFp，驱动前域缺失的Ty/x基因的表达)。
序列9是TNFp1005 AIG.1(含有-1005TNFp，驱动前域缺失的Ty/x基因的表达)。
序列10是TNFα启动子的增强子区域1(ER1)，包含核苷酸-1005至-905)。
序列11是TNFα启动子的增强子区域2(ER2)，包含核苷酸-706至-517。
序列12是附加的多克隆位点(MCS)，遗传工程操作到-120pGL3构建体的-120最小TNFα启动子的上游。
序列13是TNFα基因的3′未翻译区域(3′UTR)(Nedwin，G.E.，et al.，Nucleic Acid Research，1985，13，6361-6373)。
用于制备依据本发明的嵌合基因构建体的TNFα启动子的元件是从能够诱导由TNFα启动子驱动的治疗基因的表达的元件中选择的。这些启动子元件此处将称为TNFα启动子的“诱导顺式元件”，“顺式诱导元件”或“增强子元件”。
增强子元件可物理连接到最小启动子序列，或通过一个可能有或没有特异限制性位点的接头序列与最小启动子分离。因此，如上面所总结，增强子元件可直接，远端的，邻近的或其任何组合结合到本发明嵌合基因。这些典型地构建到启动子的上游。TNFα增强子元件的例子陈述于序列10和序列11；可使用其功能性片段或变体及组合。依据本发明的一些优选基因构建体包括那些具有多拷贝增强子元件即2或多个拷贝的构建体。一些实施方案有大约2至25，更少的2至10以及甚至更少的2至5个拷贝。
术语“TNF启动子”，“TNFα启动子”和“TNFp”此处可互换使用。除非另有注明，这些术语指相应于接合了一个或多个上游增强子元件的天然TNFα最小启动子序列的完整核苷酸序列(天然存在的即天然的或在实验室中遗传工程产生的)。例子包括，但不限于，序列1，序列2，和序列3，及它们中任一个的功能性片段，变体和混合物。这些TNFα序列的许多功能性片段和变体及此处描述的其它序列与它们的天然和遗传工程相应物具有至少大约80％，在有些情况下超过90％的序列同源性，但这些为熟练技术人员熟知并详细说明于此处引用的文献中。
可将任何细胞凋亡诱导基因用于嵌合基因和此处描述的方法中。用于本发明嵌合治疗基因的细胞凋亡诱导基因可以与产生TNFα的炎性细胞(如果这些细胞天然含有细胞凋亡基因)的天然序列中细胞凋亡诱导基因类型相同或不同。优选的AIGs包括，但不限于，细胞凋亡诱导蛋白酶的ICE/CED3家族成员(诸如Caspase-1(ICE)，hICE，ICE-LAP45，Mch2α)，Caspase-2(ICH1)，Caspase-3(CPP32，Yama，Apopain)，Caspase-4(TX，ICH2，ICErel II)，Caspase-4(ICE rel III，IY)，Caspase-6(Mch-2)，Caspase-7(Mch-3，ICE-LAP3，CMH-1)，Caspase-8(MACH，FLICE，Mch-5)，Caspase-9(ICE-LAp6，Mch6)和Caspase-10(Mch4))，粒酶家族成员(诸如粒酶A和粒酶B)，Fas配体(FasL)，以及它们的功能性片段，变体和混合物。一些实施方案使用Caspase3，Caspase4，Caspase5，粒酶B，及其功能性片段，变体和混合物。除了FasL之外，这些基因在转染后过量表达时，在转染细胞中诱导细胞凋亡(Miura M.el al.，Cell，1993，75，653-660；Chinnayan A.M.et al.，Cell，1995，81，505-512；Los，et al.，Nature，1995，375，81；Muzio，et al.，Cell，1996，85，817-827)。
在FasL情况下，只在表达Fas的细胞中诱导细胞凋亡(自分泌或旁分泌方式)。因而，TNFp-FasL嵌合基因构建体提供了第二个水平的选择性。TNFp-FasL嵌合基因的另一个优点在于选择性的以那些滑膜中疾病产生的不表达TNFα(因而不能驱动细胞凋亡诱导基因的表达)但在表面表达Fas的细胞为靶。在这种情况下，FasL将由能够产生TNFα的细胞诸如激活的巨噬细胞和T细胞表达。然后这些细胞能在表达Fas的细胞中诸如危险的激活T细胞和表达Fas的滑膜细胞中诱导细胞凋亡。
本发明提供了一种新的治疗方法，包括向哺乳动物细胞中引入含有由TNFα启动子(TNFp)驱动的细胞凋亡诱导基因(AIG)的嵌合基因的步骤。本发明嵌合基因的例子陈述于序列4，5，6，7，8和9；亦可使用它们的功能性片段或变体。因为不想受理论约束，作为由TNFp控制的结果，AIG只在那些产生炎性细胞因子，TNFα的细胞中表达。因而，任何表达TNFα的细胞是自我破坏的，而不表达TNF-α的细胞不受影响。有利的是，本方法能靶向任何产生TNFα的细胞(诸如激活的巨噬细胞，激活的T细胞及类巨噬细胞以及可能的类成纤维细胞滑膜细胞)而不论其细胞类型。实际上，靶向的产生TNFα的细胞可以是在其天然未改变形式时正常携带或表达或正常不携带或不表达细胞凋亡基因的细胞。因此，使用本发明的嵌合基因和方法，TNFα的细胞来源可通过高选择方式破坏。
使用本发明的TNFp-AIG嵌合基因的另一个优点是TNFp螯合内源TNFp所需的转录因子，从而导致内源TNFα产生的降低。在一个优选实施例中，TNFp大量存在于治疗的靶细胞。这可通过将多拷贝转染基因引入到细胞中完成。另外，依据本发明的TNFp-AIG嵌合基因可包含多拷贝的TNFα启动子的诱导顺式元件。如上面提及，多拷贝的TNFp“诱导增强子元件”存在于本发明的一些TNFp-AIG嵌合基因实施例中。通过包括TNFp构建体的多拷贝诱导顺式元件，通过外源引入的序列螯合了转染细胞产生TNFα所需的转录因子。这种优选嵌合TNFp-AIG构建体特征为，与本发明只含有连接到TNFp的单个增强子元件的嵌合基因相比在竞争TNFp特异转录因子时有增强的效能。这种方法构建的“诱导超启动子”能够(1)更有效竞争TNFα特异诱导转录因子以及(2)由于多个增强元件而以增强方式驱动细胞凋亡诱导基因的表达。
例如，已经显示在类风湿性关节炎病人，滑膜切除术，即去除了滑膜组织中临床有益。与常规和外科滑膜切除方法不同，此处描述的以细胞为靶的治疗方法只以产生TNFα的细胞为靶。因而，有益的是，TNFp-AIG嵌合基因的引入和表达，及随后细胞凋亡的诱导不会诱导炎性反应。相应地，本发明的方法相对为选择性的并导致最少的组织损伤并且减轻炎症。
此处描述的产品和方法同样可用于治疗其它炎性疾病。这些炎性疾病包括，但不限于，多发性硬化，急性热病性多神经炎，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，银屑病，移植体抗宿主病(graft versus host disease)，红斑狼疮，胰岛素依赖性糖尿病，银屑样关节炎(psoriatic arthritis)，结节病，过敏性肺炎，类风湿性脊椎炎及相关脊椎关节病，赖特综合征和全身性硬皮病。这样，本发明包括通过向细胞引入本发明的至少一个嵌合基因在病人炎性细胞或炎症部位细胞诱导细胞凋亡治疗病人炎性疾病的方法。这一点典型地通过制备至少含有一个本发明嵌合基因和典型的药物学可接受载体的药物组合物，以及使用标准方法向病人施用这种组合物来完成。在一些实施方案中，药物组合物是使用局部的，静脉的，腹膜内的，及类似方法直接传送到炎症部位。进一步的方法在下面讨论。
除了治疗的指示，可将依据本发明的基因和细胞用于多种有用的筛选和选择方法。在一个这种方法中，能将TNFp-AIG嵌合基因引入产生TNFα的细胞种群从产生TNFα的细胞种群中体外选择出不产生TNFα的体细胞变体。产生TNFα的细胞会发生细胞凋亡。不产生TNFα的细胞将会存活。选择具有存活表型的那些细胞变体是一种确认不产生TNF-α细胞的简单方法。这种选择方案可用于确定与TNF-α启动子调节活性相反的基因的表达，从而降低TNF-α的产生。这种基因特征为其它系统中的显性失活(DN)/显性抑制基因(Behrends S.，et al.，J.Biol，Chem，1995，270，21109-21113；Zhang S.，et al.，J.Biol，Chem.，1995，270，23934-23936；Watowich S.S.，et al。Mol.Cell Biol.，1994，1416，3535-3549)。
在进一步体外方法中，可使用依据本发明的TNFp-AIG嵌合基因鉴定负责不产生TNFα细胞种群起源的显性失活基因。依据本发明，将一个依据本发明的TNFp-AIG嵌合基因引入产生TNFα的细胞。阻碍显性失活基因的存在，这些细胞会在活化时发生细胞凋亡。因此，可以推论存活的变体含有能下调TNFα产生的显性失活基因。可通过产生cDNA文库并转染细胞系(例Jurkat和THP-1)容易地确认显性失活基因。这些细胞是诱导TNFp-AIG嵌合基因或TNFp-萤光素酶基因的稳定转染体。体外激活后选择TNFp-AIG转染细胞的存活表型；存活表型指示DN基因的作用。在用TNFp-萤光素酶基因转染的细胞中，萤光素酶活性的降低指示DN基因的作用。使用这种方案确定的显性失活基因本身可用于将来的治疗药剂。这类基因可作为降低TNFα产生的基因治疗的候选。
用于基因转移的方法可分为两大类1.直接方法使用合适的载体作为治疗基因的载体将治疗基因原位转导进入靶细胞例如滑膜细胞。将含有治疗基因的载体直接注射到损伤区域(例如关节炎关节)。2.间接方法治疗基因来自体内转染到诸如滑膜细胞的靶细胞。在此方法中，从关节中除去滑膜，体外分离和培养滑膜细胞。用治疗基因转染体外培养的细胞，并将遗传改变的滑膜细胞移植回滑膜。
对于体内转移，评价了多种载体在基因传送中的效率(Nita，et al.，Arthritis & Rheumatism，1996，3915，820-828)。在用于基因治疗的载体中，从反转录病毒衍生的载体目前发展的最好。它们能将遗传物质插入宿主基因组并产生稳定转染体。这些载体虽然不能感染不分裂细胞，由于它们插入到宿主基因组，不能排除插入诱变的可能性。与此相反，从腺病毒衍生的载体感染分裂及不分裂的细胞并游离型传送DNA。基于腺病毒的载体的缺点是这些载体在感染的细胞中继续产生病毒蛋白使它们潜在是抗原的。第三种基于病毒的载体来源于单纯疱疹病毒(HSV)，亦能够感染分裂着及未分裂着的细胞。
在非病毒载体系统中，评价了阳离子脂质体和裸质粒DNA。虽然诸如肌肉和皮肤的特定类型细胞吸收，保持和表达裸质粒DNA，脂质体处于发展的最前沿阶段。
颗粒介导的基因传送系统亦是可能的(Rakhmilevich，et al.，PNAS，1996，93，6291)并且是一种有希望的方法。
下面的“体内”基因传递方案可用于传送本发明的嵌合基因(1)Nita等，Arthritis and Rheumatism，1996，39，820-823兔子体内实验将各载体关节内注射到1膝关节。对于病毒载体，每膝中注射悬浮于0.5毫升平衡盐溶液中的108至109颗粒。
每膝中注射1毫升平衡盐溶液中的脂质体-DNA复合物(200纳摩尔DC-Chol与20微克DNA/毫升复合)。(2)分子医学方法基因治疗方法(Methods in Molecular MedicineGeneTherapy Protocds)，Paul Robbins编，1997，Barr等，205-212页基于腺病毒的载体传递到肝细胞100克(g)动物中大鼠肝细胞1×1011噬斑形成单位(PFU)。
在狗中(12-17公斤(kg))，用大约1.5×1011PFU/kg灌注门静脉，每宿主DNA二倍体拷贝给出1腺病毒基因组拷贝在兔中(2-4kg)，1.5×1013病毒颗粒(大约1.5×1011PFU)给出100％肝细胞转导；4×1012病毒颗粒给出50-75％转导。Yang N-S等，281-296金颗粒介导的基因传递哺乳动物皮肤组织的转染-0.1，0.5，1.0和2.5微克(μg)DNA/毫克(mg)颗粒给出与转基因表达水平的线性关系。Nabel等，297-305在人体中脂质体介导的基因传递方案115nmol DC-Chol/Dope脂质体与1μgDNA混合于0.7ml。
取上述混合液0.2ml注射到病人黑素瘤结。对于导管传递，将0.6ml溶液传递到动脉中。
方案2将15nmol DMRIE/Dope脂质体与5μg DNA混合于1.0ml。
对于直接肿瘤内注射，DNA浓度范围从3μg与4.5nM DMRIE/Dope混合至300μg与450nM DMRIE/Dope混合。(3)Roessler等，369-374基因转移到滑膜使用了剂量范围109-1012含治疗基因/关节的腺病毒颗粒。然而，对任何特定实验系列最适剂量需要经验来确定，并且依赖于使用的重组腺病毒基因组主链的特征以及表达的转基因。
对于间接方法，已很好建立了多种方法，包括使用基于阳离子脂质或阳离子聚合物的转染及电穿孔。
任何上面的参考技术均可加以改变以适应那些本技术领域普通技术人员的具体需要。这种改进完全在普通操作者拥有的技术水平内而不需要过度的实验。这些明显的改变在本发明范围内。
实施例为了更完整的理解本发明，陈述了下列实施例。这些实施例是为了说明本发明的一些优选实施例，而不应解释为任何意义上对本发明范围的限制。
实施例1产生TNFp-AIG构建体为了在单或多拷贝的相同区域或不同区域构建由TNF启动子的增强子顺式元件驱动的嵌合AIG，进行了负责报告基因的最优化诱导表达的感兴趣区域的鉴定。
选择TNF-α启动子元件用于构建嵌合基因。使用包含TNFα启动子多种缺失构建体的引物(图3)通过聚合酶链式反应(PCR)扩增了TNF-α启动子区域。使用由其它研究者在多种其它细胞系统中确定的区域作为参照(Rhoades，et al.，J.Biol.Chem.，1992，267，22102-22107；Leitman，et al.，Mol.Cell Biol.，1992，12，1352-1356；Pauli U.，Crit.Reviews Eukaryotic GeneExpression，1994，4，323-344)。然后将PCR扩增基因克隆到商业存在的无启动子载体中报告基因诸如萤光素酶的上游。在多种细胞系诸如Jurkat(T类成淋巴细胞(T lymphoblastoid))，U973(骨髓单核细胞(myelomonocytic))，THP-1(单核细胞(monocytic))，成纤维细胞和体外培养的人滑膜细胞中检测这些构建体的组成型和诱导表达。负责报告基因诱导表达的区域主要基于使用两种产生TNFα的细胞系，即Jurkat(用PMA激活后)和THP-1(用LPS激活后)(图4a和b)获得的结果得到确认。通过使用已良好建立的方法和商品试剂例如DEAE葡聚糖和Superfect瞬时转染这些细胞。然后将负责报告基因诱导表达的TNFα启动子的顺式元件用于构建TNFp-AIG嵌合基因。
构建TNFp-AIG嵌合基因。在此处描述的细胞凋亡诱导基因中，下列基因是优选的i)半胱氨酸蛋白酶-CPP32(亦称为Yama，apopain或Caspase3)以及ii)半胱氨酸蛋白酶-Tx/Ty(Caspase4/Caspase5)AIGs用作“前域缺失的”截短物以潜在地增加Caspase的自催化。这对无活Caspase到活性形式的转换是必要的。
使用相应于密码子29-36和271-278(278是终止密码子)的引物扩增了前域缺失的CPP32。截短形式的CPP32此处称为“α CPP32”或“AIG.1”。
为了PCR扩增前域缺失的Ty，合成了相应于Ty基因中序列的引物。目前发现的所有Caspases具有与Caspase家族其它成员的同源性。相应于密码子359-365(密码子365是终止密码子)的3′引物与Tx基因中的密码子372-378(密码子378是终止密码子)具有100％序列同源性。然而，相应于Ty基因中密码子81-87的5′引物与Tx基因中的相应区域(Tx密码子94-100)并不100％同源。Ty基因中87位残基(丙氨酸)与Tx基因中100位残基(甘氨酸)不同。由于Tx转录物明显丰富，从使用激活的人周围血淋巴细胞制备的cDNA产生的PCR扩增产物包含Tx的序列。因此，使用相应于Ty中序列的合成寡核苷酸引物产生的截短形式的AIG，虽然侧翼为引物的Ty序列，实际上与Tx中的序列一样。除了一个密码子之外，使用的引物的Ty序列亦与Tx序列一样。因此本发明使用的基因与残基甘氨酸(G)100变为丙氨酸(A)的截短Tx基因一致。这个基因此处称为“ΔTy/x”或“AIG.2”。
AIG.1和AIG.2通过替代萤光素酶报告基因插入到TNFα启动子删除构建体(-120，-706和-1005)中TNFα启动子下游(图5)。刺激瞬时感染的Jurkat和THP-1细胞后检测了这些构建体对细胞凋亡的诱导(图6a，b和c)。
构建TNFα超启动子-AIG嵌合基因。用PCR扩增了含有负责如上所述(图4a和4b)报告基因诱导表达的元件的两个主要优选区域，即TNFα启动子的ER1(-1005至-905)(序列10)和ER2(-706至-517)(序列11)，并以单拷贝或多拷贝连接到最小天然启动子(-120通过TSS，序列3)的上游。TNFα启动子的另两个区域(-234至-120)和(-234和-65)亦分别确认为是可能的增强子区域3(ER3)和增强子区域4(ER4)，它们可使用下面所述的策略用于嵌合构建体。超启动子包含多个(2-10)含有诱导启动子元件的上述区域的盒(图7)。这是通过使用限制性位点插到每引物5′端的合成引物路经PCR扩增感兴趣区域获得的。这些独特限制性位点侧翼在扩增的感兴趣基因产物。优选地，将PCR扩增的AIG克隆到TNF-(超启动子下游，代替为天然TNFα启动子所述的原始构建体(图5)中的萤光素酶报告基因。
下面概述了构建TNFα超启动子和提供用于有效定向插入的特定限制性位点(在TNF-α启动子和研究的AIG选择元件中没有这些限制性位点)的接头序列的方案并描述于图8方案1步骤1将TNF-α最小启动子(-120至TSS)插入到pGL3基本(不含启动子(promoterless))萤光素酶载体(Promega)将用于构建嵌合基因TNFp-AIG的pGL3基本载体的元件陈列于下。_KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.BgIII.HindIII.[荧光素酶].XbaI_使用含有XhoI和BgIII.HindIII位点的引物PCR扩增最小启动子，从而XhoI在扩增产物5′端而BgIII.HindIII位点在扩增引物3′末端。使用这些相同限制性位点，将片端插入到pGL3基本载体的多接头中。这一构建体称为“构建体A1”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI.SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤2使用含有多个限制性位点的引物PCR扩增了增强子片段(ER1或ER2)。产生的片段如下将在5′末端有限制性位点KpnI.AatII.BssHII并在3′末端有限制性位点NsiI.Spel.MluI5′KpnI.AatII.BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI3′。使用KpnI和MluI限制性位点将片段插入到步骤1中产生的“构建件A1”中。此构建体称为“构建体B1”，如下_KpnI.AatII.BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI.NheI.SmaI.XhoI(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤3使用含有限制性位点AatII和BssHII的引物扩增了TNFα增强子片段(ER1或ER2)，产生了如下PCR产物5′AatII.(ER 1或ER2).BssHII3′。使用这些相同限制性位点将此片段克隆到“构建体B1”中。此构建体称为“构建体C1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.SpeI.MluI.NheISmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤4使用含有限制性位点NSiI和SpeI的引物扩增了TNFα增强了片段(ER1或ER2)，产生的PCR产物如下5′NsiI.(ER1或ER2).SpeI3′。使用这些相同限制性位点将此片段克隆到“构建体C1”。此构建体称为“构建体D1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.(ER1或ER2).SpeI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤5使用含有BgIII和XbaI限制性位点的引物PCR扩增了AIG.1或AIG.2(优选但不限于AIG.1和AIG.2；可使用列出的任何AIG)编码区域，产生如下片段5′BgIII.(AIG.1或AIG.2).XbaI3′。使用这些相同的限制性位点将此片段插入到“构建体D1”。产生的构建体称为“构建体E1”，如下_KpnI.AatII.(ER1或ER2)，BssHII.(ER1或ER2).NsiI.(ER1或ER2).SpeI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).[AIG.1或AIG.2].XbaI_可替代的方案2如下方案2步骤1如方案1产生“构建体A1”，如下KpnI.SacI.MluI.NheI SmaI.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI步骤2插入另外MCS。
利用商业途径合成了提供_Nhel.SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI_的两互补寡核苷酸(5′磷酸化的)。将这些寡核苷酸退火然后克隆到“构建体A1”的NheI和XhoI位点。产生的构建体称为“构建体B2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤3使用在5′末端含限制性位点SpeI.PvuII及在3′端含限制性位点XhoI的引物扩增了TNF-α增强了片段(ER1或ER2)，产生的PCR产物如下5′SpeI.PvuII.(ER1或ER2).XhoI3′。使用SpeI和XhoI限制性位点将此片段克隆到“构建体B2”。此构建体称为“构建体C2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.PvuII.(ER1或ER2)XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI_步骤4使用在5′末端含有限制性位点AvrII.SpeI及在3′末端含限制性位点PvuII的引物扩增了TVFα增强子片段(ER1或ER2)，产生的PCR产物如下5′AvrII.SpeI.(ER1或ER2).PvuII3′。使用AvuII和PvuII限制性位点将此片段克隆到“构建体C2”。此构建体称为“构建体D2”，如下_KpnI.SacI.MluI.NheI SacII.EcorV.AfIII.AatII.AvrII.SpeI.(ER1或ER2)PvuII.(ER1或ER2)XhoI.(-120至TSS BgIII).HindIII.[荧光素酶].XbaI这样，使用这种策略可将至少7个拷贝的增强子区域(ER1，ER2或ER3，单独或组合)，每次一个，通过利用一个在前一个上游的限制性位点在选择的增强子区域的PCR扩增中加上去。
当加上期望数目拷贝的增强子区域后，如方案1步骤5中所述将AIG插入到超启动子的下游。
通过上面提及的细胞系的瞬时转染测定了嵌合TNFp-AIG基因的诱导表达。通过检测转染细胞的细胞凋亡，使用商品抗体在Westem印迹中鉴定AIG表达的蛋白以及使用商品化的，良好证明了的特定合成四肽底物鉴定蛋白酶活性，测量了TNFp-AIG基因的表达。
通过瞬时转染相同的细胞测定了嵌合TNFp-AIG基因的诱导表达。转染细胞的FasL的细胞表面表达使用抗-FasL抗体结合经间接免疫荧光和测定Fas阳性细胞的细胞凋亡诱导进行了定量。
TNFp-驱动的报告基因表达的调节。TNFα基因3′非翻译区在调节TNFα生物合成调节中起重要作用。它与正常非活性状态的TNFα基因的翻译表达有关。重要的是，当产生TNFα的细胞由外界刺激活化时，这些元素使脱阻抑发生(Han.J.，et al.，J.Immunology，1991，146，1843-1848；Crawford，F.K.，et al.，J.Biol.Chem.，1996，271，2238 3-22390)。
制造的遗传构建体，将完整的3′非翻译区(序列13)插入到由缺失片段即TNFα启动子的-120，-706和-1005驱动的萤光素酶基因下游。这些构建体的瞬时表达的结果总结于图9。
实施例2检测方案体外方法萤光素酶检测使用商品化试剂(Promega)确定萤光素酶活性。AIG.1和AIG.2基因表达a)使用抗-CPP32抗体及抗PRAP抗体进行了转染细胞裂解物的Western印迹测定。抗-PRAP抗体检测水解的和未水解的作为CPP32酶反应的PRAP产物。b)CPP32酶检测此检测测定CPP32的酶反应及比色或产荧光底物的断裂。此检测中使用商品化试剂盒(Clonotech，Pharmingen)。c)转染细胞的细胞凋亡通过碘化丙锭染核(Krishan，A.，J.Cell Biol.，66，1994，188-193)及商品化细胞死亡酶联免疫吸附测定(Cell Death Elisa)试剂盒(Boehringer Mannheim)检测了由AIG.1和AIG.2引起的转染细胞的细胞凋亡。动物模型IL-1诱导关节炎的兔模型(Pettipher E.R.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.，1986，83，8749-8753)将IL-1注射到新西兰白兔的膝关节。IL-1的关节内注射造成白细胞剂量依赖性浸润入关节腔以及从关节软骨丧失蛋白聚糖。
抗原诱导的关节炎关节内注射抗原(卵清蛋白)到膝关节诱导白细胞聚集和软骨降解，非常类似于人的类风湿性关节炎。注射后的关节肿胀保持14天。
严重联合免疫缺陷病(Scid)鼠-人滑膜细胞模型(Houri J.M.，et al.Current Opinions in Rheumatol.，1995，7，201-205；Sack U.，et al.，J.Autoimmunity，1995，9，51-58；Geiler T.，et al.，Arthritis & Rheumatism，1994，37，1664-1671)这些是最近开发的关节炎模型，其中将来自RA病人的新鲜滑膜组织与正常人软骨一起移植到scid鼠皮下，肾被膜下(Geiler T.et al.，Arthritis & Rheumatism，1994，37，1664-1671)，或膝关节中(Sack U.，et al.，J.Autoimmunity，1995，9，51-58)。移植物的生长具类似关节炎特征，包括形成高细胞密度的关节翳组织，骨和软骨侵蚀，产生多核巨大细胞，以及滑膜成纤维细胞对软骨的侵蚀。
间接方法用治疗基因体外转染滑膜细胞并移植回兔中。通过注射IL-1在这些兔中诱导关节炎并评价激活后治疗基因的表达。嵌合基因的激活诱导的表达在移植细胞中诱导细胞调亡。
直接方法嵌合基因的关节内注射。可以使用上述的所有基因传递方法，包括裸质粒DNA，阳离子脂质体介导的传递。为了使用基于病毒载体的传递，将嵌合基因克隆到合适的载体。然后通过删除这些载体中的真核启动子修饰载体。然后关节内注射插入到适当载体的治疗基因，以评价治疗和预防功效。
实施例3选择不产生TNF-α的体细胞变体用TNFp-AIG嵌合基因体外稳定转染细胞(THP-1，Jurkat)。在几轮的刺激后，在表达TNFp-AIG基因的细胞中诱导细胞凋亡，然后收集存活的细胞。构建了这些细胞的cDNA文库，用于功能性克隆(LegerskiR and PetersonC.，Nature，1992，359，70-73；Jaattela M.，et al.，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
实施例4显性失活(DN)基因的鉴定和表征用TNFp-AIG稳定转染的THP-1和Jurkat细胞进行重复循环的刺激以激活TNFp-AIG的表达。不表达负调节基因的细胞发生细胞凋亡，而表达显性失活基因的细胞存活。在这些存活细胞中，DN基因产物与TNFα启动子反式作用，从而抑制其激活以转录AIG，最终导致存活表型。使用这些细胞中的聚腺苷酸化mRNA构建了cDNA文库。通过如描述其它基因的功能性克隆确认了将TNFp-AIG-转染的THP-1或Jurkat细胞从细胞凋亡中拯救的DN基因(Legerski R.and Peterson C.，Nature，1992，359，70-73；Jaattela，M.，al.，Oncogene，1995，10，2297-2305)。
上面的描述是为了教会本技术领域普通技术人员怎样实践本发明，而不是意图详细描述熟练技术人员读了描述后很明显的那些显然的改进和变化。然而，我们打算由下面的权利要求定义，在本发明范围内包括这些明显的改进和变化。权利要求意图覆盖权利要求的组合物和任何顺序的步骤，除非文中特别指出的反面，它们能有效满足它们意图的目标。
此处引用的文章明显以参考文献完整并入本发明。
序列表(1)一般资料(i)申请人Revati J.Tatake，Steven D.Marlin和Randall W.Barton(ii)发明名称通过基因治疗炎性细胞的自我调节的细胞凋亡(iii)序列数目13(iv)通讯地址(A)地址Boehringer Ingelheim Corporation(B)街道900 Ridgebury Road，P.O.Box 368(C)城市Ridgefield(D)州Connecticut(E)国家United States of America(F)邮编06877-0368(v)计算机可读形式(A)媒介类型3.5″1.44Mb软盘(B)计算机IBM PC(C)操作系统MS DOS(D)软件word程序(vi)现在申请数据(A)申请号待指定(B)填表日期同此(D)分类(vii)先前申请数据(A)申请号60/038,266(B)填表日期97年2月28日(viii)律师资料(A)名字Robert P.Raymond(B)登记号25089(C)参考/档案号9/121PCT(ix)通讯资料(A)电话203-789-4865(B)电传203-791-6183(2)系列资料1(i)序列特征(A)长度1178(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词参照人TNFα启动子(x)发表资料(A)作者Takashiba，S.，et al.
(C)期刊基因(Gene)(D)卷131(E)页307-308(xi)序列描述序列1GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA50GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC100TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG150GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG AGTATCGGGG ACCCCCCCTT200AACGAAGACA GGGCCATGTA GAGGGCCCCA GGGAGTGAAA GAGCCTCCAG250GACCTCCAGG TATGGAATAC AGGGGACGTT TAAGAAGATA TGGCCACACA300CTGGGGCCCT GAGAAGTGAG AGCTTCATGA AAAAAATCAG GGACCCCAGA350GTTCCTTGGA AGCCAAGACT GAAACCAGCA TTATGAGTCT CCGGGTCAGA400ATGAAAGAAG AAGGCCTGCC CCAGTGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT450TCACTCCCCG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT500TCCTGAGGCC TCAAGCTGCC ACCAAGCCCC CAGCTCCTTC TCCCCGCAGA550CCCAAACACA GGCCTCAGGA CTCAACACAG CTTTTCCCTC CAACCCCGTT600TTCTCTCCCT CAAGGACTCA GCTTTCTGAA GCCCCTCCCA GTTCTAGTTC650TATCTTTTTC CTGCATCCTG TCTGGAAGTT AGAAGGAAAC AGACCACAGA700CCTGGTCCCC AAAAGAAATG GAGGCAATAG GTTTTGAGGG GCATGGGGAC750GGGGTTCAGC CTCCAGGGTC CTACACACAA ATCAGTCAGT GGCCCAGAAG800ACCCCCCTCG GAATCGGAGC AGGGAGGATG GGGAGTGTGA GGGGTATCCT850TGATGCTTGT GTGTCCCCAA CTTTCCAAAT NCCCGCCCCC GCGATGGAGA900AGAAACCGAG ACAGAAGGTG CAGCGCCCAC TACCGCTTCC TCCAGATGAG950CTTATGGGTT TCTCCACCAA GGAAGTTTTC CGCTGGTTGA ATGATTCTTT 1000CCCCGCCCTC CTCTCGCCCC AGGGACATAT AAAGGCAGTT GTTGGCACAC 1050CCAGCCAGCA GACGCTCCCT CAGCAAGGAC AGCAGAGGAC CAGCTAAGAG 1100GGAGAGAAGC AACTGCAGAC CCCCCCTGAA AACAACCCTC AGACGCCACA 1150TCCCCTGACA AGCTGCCAGG CAGGTTCT 1178(3)系列资料2(i)序列特征(A)长度1069(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词人TNFα启动子基因(x)发表资料(A)作者Takashiba，S.，等(C)期刊Gene(D)卷131(E)页307-308(xi)序列描述序列2GAGGCCGCCA GACTGCTGCA GGGGAAGCAA AGGAGAAGCT GAGAAGATGA 50AGGAAAAGTC AGGGTCTGGA GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT 100ATGGCCACAT GTAGCGGCTC TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG 150AGATGTGACC ACAGCAATGG GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATGGAAGTCG 200AGTATGGGGA CCCCCCCTTA ACGAAGACAG GGCCATGTAG AGGGCCCCAG 250GGAGTGAAAG AGCCTCCAGG ACCTCCAGGT ATGGAATACA GGGGACGTTT 300AAGAAGATAT GGCCACACAC TGGGGCCCTG AGAAGTGAGA GCTTCATGAA 350AAAAATCAGG GACCCCAGAG TTCCTTGGAA GCCAAGACTG AAACCAGCAT 400TATGAGTCTC CGGGTCAGAA TGAAAGAAGA AGGCCTGCCC CAGTGGGGTC 450TGTGAATTCC CGGGGGTGAT TTCACTCCCC GGGGCTGTCC CAGGCTTGTC 500CCTGCTACCC CCACCCAGCC TTTCCTGAGG CCTCAAGCCT GCCACCAAGC 550CCCCAGCTCC TTCTCCCCGC AGGGACCCAA ACACAGGCCT CAGGACTCAA 600CACAGCTTTT CCCTCCAACC CCGTTTTCTC TCCCTCAAGG ACTCAGCTTT 650CTGAAGCCCC TCCCAGTTCT AGTTCTATCT TTTTCCTGCA TCCTGTCTGG 700AAGTTAGAAG GAAACAGACC ACAGACCTGG TCCCCAAAAG AAATGGAGGC 750AATAGGTTTT GAGGGGCATG GGGACGGGGT TCAGCCTCCA GGGTCCTACA 800CACAAATCAG TCAGTGGCCC AGAAGACCCC CCTCGGAATC GGAGCAGGGA 850GGATGGGGAG TGTGAGGGGT ATCCTTGATG CTTGTGTGTC CCCAACTTTC 900CAAATCCCCG CCCCCGCGAT GGAGAAGAAA CCGAGACAGA AGGTGCAGGG 950CCCACTACCG CTTCCTCCAG ATGAGCTCAT GGGTTTCTCC ACCAAGGAAG1000TTTTCCGCTG GTTGAATGAT TCTTTCCCCG CCCTCCTCTC GCCCCAGGGA1050CATATAAAGG CAGTTGTTGG CACACCCAGC CAGCAGACGC TCCCTC1096(4)系列资料3(i)序列特征
(A)长度139(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词天然最小TNFα启动子(xi)序列描述序列3CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100AGGCAGTTGT ATGGCACACC CGCCAGCAGA CGCTCCCTC 139(5)系列资料4(i)序列特征(A)长度904(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp120 AIG.1(D)其它资料残基1至139含启动子序列；残基140至151，接头序列，及剩余残基含AIG.1序列。
(xi)序列描述序列4CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA 100AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA CGCTCCCTCA GCAGATCCAC 150CATGTCTGGA ATATCCCTGG ACAACAGTTA TAAAATGGAT TATCCTGAGA 200TGGGTTTATG TATAATAATT AATAATAAGA ATTTTCATAA AAGCACTGGA 250ATGACATCTC GGTCTGGTAC AGATGTCGAT GCAGCAAACC TCAGGGAAAC 300ATTCAGAAAC TTGAAATATG AAGTCAGGAA TAAAAATGAT CTTACACGTG 350AAGAAATTGT GGAATTGATG CGTGATGTTT CTAAAGAAGA TCACAGCAAA 400AGGAGCAGTT TTGTTTGTGT GCTTCTGAGC CATGGTGAAG AAGGAATAAT 450TTTTGGAACA AATGGACCTG TTGACCTGAA AAAAATAACA AACTTTTTCA 500GAGGGGATCG TTGTAGAAGT CTAACTGGAA AACCCAAACT TTTCATTATT 550CAGGCCTGCC GTGGTACAGA ACTGGACTGT GGCATTGAGA CAGACAGTGG 600TGTTGATGAT GACATGGCGT GTCATAAAAT ACCAGTGGAG GCCGACTTCT 650TGTATGCATA CTCCACAGCA CCTGGTTATT ATTCTTGGCG AAATTCAAAG 700GATGGCTCCT GGTTCATCCA GTCGCTTTGT GCCATGCTGA AACAGTATGC 750CGACAAGCTT GAATTTATGC ACATTCTTAC CCGGGCTAAC CGAAAGGTGG 800CAACAGAATT TGAGTCCTTT TCCTTTGACG CTACTTTTCA TGCAAAGAAA 850CAGATTCCAT GTATTGTTTC CATGCTCACA AAAGAACTCT ATTTTTATCA 900CTAA 9~(6)系列资料5(i)序列特征(A)长度1490(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp 706 AIG.1(D)其它资料残基1至724含启动子序列；残基725至736，接头序列，及剩余残基含AIG.1序列。(xi)序列描述序列5TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT150TTCCTGAGGC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG200GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC250GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG300TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC350AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG400GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG450AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT500CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG550AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT600GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC650TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA700CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC750CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA800TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT850GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA900ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT950TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT 1000TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1050ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1100GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1150ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1200GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1250CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1300ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT TGCTGAAACA GTATGCCGAC AAGCTTGAAT 1350TTATGCACAT TCTTACCCGG GCTAACCGAA AGGTGGCAAC AGAATTTGAG 1400TCCTTTTCCT TTGACGCTAC TTTTCATGCA AAGAAACAGA TTCCATGTAT 1450TGTTTCCATG CTCACAAAAG AACTCTATTT TTATCACTAA1490(7)系列资料6(i)序列特征(A)长度1789(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp1005 AIG.1(D)其它资料残基1至1023含启动子序列；残基1024至1036，接头序列，及剩余残基含AIG.1序列。
(xi)序列描述序列6GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT 100AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC 150GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC 200CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG 250GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT 300CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG 350AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT 400CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT 450TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG 500GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC 550GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG 600TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC 650AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG 700GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG 750AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 800CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 850AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 900GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 950TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA1000CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGT CTGGAATATC1050CCTGGACAAC AGTTATAAAA TGGATTATCC TGAGATGGGT TTATGTATAA1100TAATTAATAA TAAGAATTTT CATAAAAGCA CTGGAATGAC ATCTCGGTCT1150GGTACAGATG TCGATGCAGC AAACCTCAGG GAAACATTCA GAAACTTGAA1200ATATGAAGTC AGGAATAAAA ATGATCTTAC ACGTGAAGAA ATTGTGGAAT1250TGATGCGTGA TGTTTCTAAA GAAGATCACA GCAAAAGGAG CAGTTTTGTT1300TGTGTGCTTC TGAGCCATGG TGAAGAAGGA ATAATTTTTG GAACAAATGG 1350ACCTGTTGAC CTGAAAAAAA TAACAAACTT TTTCAGAGGG GATCGTTGTA 1400GAAGTCTAAC TGGAAAACCC AAACTTTTCA TTATTCAGGC CTGCCGTGGT 1450ACAGAACTGG ACTGTGGCAT TGAGACAGAC AGTGGTGTTG ATGATGACAT 1500GGCGTGTCAT AAAATACCAG TGGAGGCCGA CTTCTTGTAT GCATACTCCA 1550CAGCACCTGG TTATTATTCT TGGCGAAATT CAAAGGATGG CTCCTGGTTC 1600ATCCAGTCGC TTTGTGCCAT GCTGAAACAG TATGCCGACA AGCTTGAATT 1650TATGCACATT CTTACCCGGG CTAACCGAAA GGTGGCAACA GAATTTGAGT 1700CCTTTTCCTT TGACGCTACT TTTCATGCAA AGAAACAGAT TCCATGTATT 1750GTTTCCATGC TCACAAAAGA ACTCTATTTT TATCACTAA 1789(8)系列资料7(i)序列特征(A)长度1008(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp120 AIG.2(D)其它资料残基1至138含启动子序列；残基139至150，接头序列，及剩余残基含AIG.2序列(xi)序列描述序列7CCGCTTCCTC CAGATGAGCT CATGGGTTTC TCCACCAAGG AAGTTTTCCG 50CTGGTTGAAT GATTCTTTCC CCGCCCTCCT CTCGCCCCAG GGACATATAA100AGGCAGTTGT TGGCACACCC AGCCAGCAGA GCTCCCTCAG CAGATCCACC150ATGGCTGGAC CACCTGAGTC AGCAGAATCT ACAGATGCCC TCAAGCTTTG200TCCTCATGAA GAATTCCTGA GACTATGTAA AGAAAGAGCT GAAGAGATCT250ACCCAATAAA GGAGAGAAAC AACCGCACAC GCCTGGCTCT CATCATATGC300AATACAGAGT TTGACCATCT GCCTCCGAGG AATGGAGCTG ACTTTGACAT350CACAGGGATG AAGGAGCTAC TTGAGGGTCT GGACTATAGT GTAGATGTAG400AAGAGAATCT GACAGCCAGG GATATGGAGT CAGCGCTGAG GGCATTTGCT450ACCAGACCAG AGCACAAGTC CTCTGACAGC ACATTCTTGG TACTCATGTC500TCATGGCATC CTGGAGGGAA TCTGCGGAAC TGTGCATGAT GAGAAAAAAC550CAGATGTGCT GCTTTATGAC ACCATCTTCC AGATATTCAA CAACCGCAAC600TGCCTCAGTC TGAAGGACAA ACCCAAGGTC ATCATTGTCC AGGCCTGCAG650AGGTGCAAAC CGTGGGGAAC TGTGGGTCAG AGACTCTCCA GCATCCTTGG700AAGTGGCCTC TTCACAGTCA TCTGAGAACC TGGAGGAAGA TGCTGTTTAC750AAGACCCACG TGGAGAAGGA CTTCATTGCT TTCTGCTCTT CAACGCCACA800CAACGTGTCC TGGAGAGACA GCACAATGGG CTCTATCTTC ATCACACAAC850TCATCACATG CTTCCAGAAA TATTCTTGGT GCTGCCACCT AGAGGAAGTA900TTTCGGAAGG TACAGCAATC ATTTGAAACT CCAAGGGCCA AAGCTCAAAT950GCCCACCATA GAACGACTGT CCATGACAAG ATATTTCTAC CTCTTTCCTG 1000GCAATTGA 1008(9)系列资料8(i)序列特征(A)长度1587(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp706 AIG.2(D)其它资料残基1至724含有启动子序列；残基725至736，接头序列，及剩余残基含AIG.2序列(xi)序列描述序列8TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT 100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT 150TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT TCTCCCCGCA 200GGGACCCAAA CACAGGCCTC AGGACTCAAC ACAGCTTTTC CCTCCAACCC 250CGTTTTCTCT CCCTCAAGGA CTCAGCTTTC TGAAGCCCCT CCCAGTTCTA 300GTTCTATCTT TTTCCTGCAT CCTGTCTGGA AGTTAGAAGG AAACAGACCA 350CAGACCTGGT CCCCAAAAGA AATGGAGGCA ATAGGTTTTG AGGGGCATGG 400GGACGGGGTT CAGCCTCCAG GGTCCTACAC ACAAATCAGT CAGTGGCCCA 450AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT 500CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG 550AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT 600GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC 650TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 700CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 750TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 800TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 850AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 900CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT GACATCACAG GATGAAGGAG 950TACTTGAGGG TCTGGACTAT GTGTAGATGT GAAGAGAATC GACAGCCAGG1000ATATGGAGTC AGCGCTGAGG GCATTTGCTA CCAGACCAGA GCACAAGTCC1050TCTGACAGCA CATTCTTGGT ACTCATGTCT CATGGCATCC TGGAGGGAAT1100CTGCGGAACT GTGCATGATG AGAAAAAACC AGATGTGCTG CTTTATGACA1150CCATCTTCCA GATATTCAAC AACCGCAACT GCCTCAGTCT GAAGGACAAA1200CCCAAGGTCA TCATTGTCCA GGCCTGCAGA GGTGCAAACC GTGGGGAACT1250GTGGGTCAGA GACTCTCCAG CATCCTTGGA AGTGGCCTCT TCACAGTCAT1300CTGAGAACCT GGAGGAAGAT GCTGTTTACA AGACCCACGT GGAGAAGGAC1350TTCATTGCTT TCTGCTCTTC AACGCCACAC AACGTGTCCT GGAGAGACAG1400CACAATGGGC TCTATCTTCA TCACACAACT CATCACATGC TTCCAGAAAT1450ATTCTTGGTG CTGCCACCTA GAGGAAGTAT TTCGGAAGGT ACAGCAATCA1500TTTGAAACTC CAAGGGCCAA AGCTCAAATG CCCACCATAG AACGACTGTC1550CATGACAAGA TATTTCTACC TCTTTCCTGG CAATTGA 1587(10)系列资料9(i)序列特征(A)长度1894(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词嵌合基因TNFp1005 AIG.2(D)其它资料残基1至1024含启动子序列；残基1025至1036，接头序列，及剩余残基含AIG.2序列(xi)序列描述序列9GGCGGGGGTC AGGGAGCTCC TGGGAGATAT GGCCACATGT AGCGGCTCTG 50AGGAATGGGT TACAGGAGAC CTCTGGGGAG ATGTGACCAC AGCAATGGGT100AGGAGAATGT CCAGGGCTAT GGAAGTCGAG TATGGGGACC CCCCCTTAAC150GAAGACAGGG CCATGTAGAG GGCCCCAGGG AGTGAAAGAG CCTCCAGGAC200CTCCAGGTAT GGAATACAGG GGACGTTTAA GAAGATATGG CCACACACTG250GGGCCCTGAG AAGTGAGAGC TTCATGAAAA AAATCAGGGA CCCCAGAGTT300CCTTGGAAGC CAAGACTGAA ACCAGCATTA TGAGTCTCCG GGTCAGAATG350AAAGAAGAAG GCCTGCCCCA GTGGGGTCTG TGAATTCCCG GGGGTGATTT400CACTCCCCGG GGCTGTCCCA GGCTTGTCCC TGCTACCCCC ACCCAGCCTT450TCCTGAGGCC TCAAGCCTGC CACCAAGCCC CCAGCTCCTT CTCCCCGCAG500GGACCCAAAC ACAGGCCTCA GGACTCAACA CAGCTTTTCC CTCCAACCCC550GTTTTCTCTC CCTCAAGGAC TCAGCTTTCT GAAGCCCCTC CCAGTTCTAG600TTCTATCTTT TTCCTGCATC CTGTCTGGAA GTTAGAAGGA AACAGACCAC650AGACCTGGTC CCCAAAAGAA ATGGAGGCAA TAGGTTTTGA GGGGCATGGG700GACGGGGTTC AGCCTCCAGG GTCCTACACA CAAATCAGTC AGTGGCCCAG750AAGACCCCCC TCGGAATCGG AGCAGGGAGG ATGGGGAGTG TGAGGGGTAT800CCTTGATGCT TGTGTGTCCC CAACTTTCCA AATCCCCGCC CCCGCGATGG850AGAAGAAACC GAGACAGAAG GTGCAGGGCC CACTACCGCT TCCTCCAGAT900GAGCTCATGG GTTTCTCCAC CAAGGAAGTT TTCCGCTGGT TGAATGATTC950TTTCCCCGCC CTCCTCTCGC CCCAGGGACA TATAAAGGCA GTTGTTGGCA 1000CACCCAGCCA GCAGACGCTC CCTCAGCAGA TCCACCATGG CTGGACCACC 1050TGAGTCAGCA GAATCTACAG ATGCCCTCAA GCTTTGTCCT CATGAAGAAT 1100TCCTGAGACT ATGTAAAGAA AGAGCTGAAG AGATCTACCC AATAAAGGAG 1150AGAAACAACC GCACACGCCT GGCTCTCATC ATATGCAATA CAGAGTTTGA 1200CCATCTGCCT CCGAGGAATG GAGCTGACTT TGACATCACA GGGATGAAGG 1250AGCTACTTGA GGGTCTGGAC TATAGTGTAG ATGTAGAAGA GAATCTGACA 1300GCCAGGGATA TGGAGTCAGC GCTGAGGGCA TTTGCTACCA GACCAGAGCA 1350CAAGTCCTCT GACAGCACAT TCTTGGTACT CATGTCTCAT GGCATCCTGG 1400AGGGAATCTG CGGAACTGTG CATGATGAGA AAAAACCAGA TGTGCTGCTT 1450TATGACACCA TCTTCCAGAT ATTCAACAAC CGCAACTGCC TCAGTCTGAA 1500GGACAAACCC AAGGTCATCA TTGTCCAGGC CTGCAGAGGT GCAAACCGTG 1550GGGAACTGTG GGTCAGAGAC TCTCCAGCAT CCTTGGAAGT GGCCTCTTCA 1600CAGTCATCTG AGAACCTGGA GGAAGATGCT GTTTACAAGA CCCACGTGGA 1650GAAGGACTTC ATTGCTTTCT GCTCTTCAAC GCCACACAAC GTGTCCTGGA 1700GAGACAGCAC AATGGGCTCT ATCTTCATCA CACAACTCAT CACATGCTTC 1750CAGAAATATT CTTGGTGCTG CCACCTAGAG GAAGTATTTC GGAAGGTACA 1800GCAATCATTT GAAACTCCAA GGGCCAAAGC TCAAATGCCC ACCATAGAAC 1850GACTGTCCAT GACAAGATAT TTCTACCTCT TTCCTGGCAA TTGA1894(11)系列资料10(i)序列特征(A)长度123(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词TNFα启动子增强子区域1(ER1)(xi)序列描述序列10GGGGCGGGGG TCAGGGAGCT CCTGGGAGAT ATGGCCACAT GTAGCGGCTC 50TGAGGAATGG GTTACAGGAG ACCTCTGGGG AGATGTGACC ACAGCAATGG 100GTAGGAGAAT GTCCAGGGCT ATG 123(12)系列资料11(i)序列特征(A)长度190(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词TNFα启动子增强子区域2(ER2)(xi)序列描述序列11TCCTTGGAAG CCAAGACTGA AACCAGCATT ATGAGTCTCC GGGTCAGAAT 50GAAAGAAGAA GGCCTGCCCC AGTGGGGTCT GTGAATTCCC GGGGGTGATT100TCACTCCCCG GGGCTGTCCC AGGCTTGTCC CTGCTACCCC CACCCAGCCT150TTCCTGAGGC CTCAAGCCTG CCACCAAGCC CCCAGCTCCT 190(13)系列资料12(i)序列特征(A)长度223(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征(A)名字/关键词多克隆位点(D)其它资料遗传工程多克隆位点，遗传工程操作到-120pGL3构建体中最小TNFα启动子上游。
(xi)序列描述序列12GGTACCGAGC TCTTACGCGT GCTAGCCGCG GATATCTTAA GACGTCCTAG 50GACTAGTCAG CTGCTCGAGC CGCTTCCTCC AGATGAGCTC ATGGGTTTCT100CCACCAAGGA AGTTTTCCGC TGGTTGAATG ATTCTTTCCC CGCCCTCCTC150TCGCCCCAGG GACATATAAA GGCAGTTGTT GGCACACCCA GCCAGCAGAC200GCTCCCTCAG CAGATCTAAG CTT 223(14)系列资料13(i)序列特征(A)长度787(B)类型核酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(ii)分子类型(A)描述DNA(ix)特征
(A)名字/关键词TNFα(不翻译区域(xi)序列描述序列13TCTAGAGGAG GACGAACATC CAACCTTCCC AAACGCCTCC CCTGCCCCAA 50TCCCTTTATT ACCCCCTCCT TCAGACACCC TCAACCTCTT CTGGCTCAAA100AAGAGAATTG GGGGCTTAGG GTCGGAACCC AAGCTTAGAA CTTTAAGCAA150CAAGACCACC ACTTCGAAAC CTGGGATTCA GGAATGTGTG GCCTGCACAG200TGAAGTGCTG GCAACCACTA AGAATTCAAA CTGGGGCCTC CAGAACTCAC250TGGGGCCTAC AGCTTTGATC CCTGACATCT GGAATCTGGA GACCAGGGAG300CCTTTGGTTC TGGCCAGAAT GCTGCAGGAC TTGAGAAGAC CTCACCTAGA350AATTGACACA AGTGGACCTT AGGCCTTCCT CTCTCCAGAT GTTTCCAGAC400TTCCTTGAGA CACGGAGCCC AGCCCTCCCC ATGGAGCCAG CTCCCTCTAT450TTATGTTTGC ACTTGTGATT ATTTATTATT TATTTATTAT TTATTTATTT500ACAGATGAAT GTATTTATTT GGGAGACCGG GGTATCCTGG GGGACCCAAT550GTAGGAGCTG CCTTGGCTCA GACATGTTTT CCGTGAAAAC GGAGCTGAAC600AATAGGCTGT TCCCATGTAG CCCCCTGGCC TCTGTGCCTT CTTTTGATTA650TGTTTTTTAA AATATTTATC TGATTAAGTT GTCTAAACAA TGCTGATTTG700GTGACCAACT GTCACTCATT GCTGAGCCTC TGCTCCCCAG GGGAGTTGTG750TCTGTAATCG CCCTACTATT CAGTGGCGAG ATCTAGA 78权利要求
1.一种嵌合基因，含有至少一个连接到一个功能拷贝的最小TNFα启动子并进一步连接到至少一个拷贝的细胞凋亡诱导基因的TNFα启动子增强子，其中由TNFα启动子驱动细胞凋亡诱导基因的表达。
2.依据权利要求1的基因，其中增强子对启动子的连接和启动子对细胞凋亡诱导基因的连接是从包括直接连接，远端连接，邻近连接及其组合的组中选择的。
3.依据权利要求1的基因，包含2个或更多拷贝的TNFα启动子增强子。
4.依据权利要求1的基因，其中TNFα启动子增强子是序列10或序列11，或其功能性片段或变体。
5.依据权利要求1的基因，其中TNFα启动子选自含有序列1，序列2，序列3，及其功能性片段或变体的组中。
6.依据权利要求1的基因，其中细胞凋亡诱导基因选自含有caspase-1，caspase-2，caspase-3，caspase-4，caspase-5，caspase-6，caspase-7，caspase-8，caspase-9，caspase-10，粒酶A，粒酶B，Fas配体，及其任何的功能性片段，变体，和混合物的组中。
7.依据权利要求6的基因，其中细胞凋亡诱导基因选自含有caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B及其任何的功能性片段，变体，和混合物的组中。
8.依据权利要求1的基因，选自含有序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或变体的组中。
9.依据权利要求1的基因，选自含有序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或变体的组中，其中TNF α基因的3′UTR连接到细胞凋亡诱导基因的下游。
10.含有依据权利要求1基因的药物组合物。
11.含有依据权利要求9基因的药物组合物。
12.在病人中治疗炎性疾病的方法，包含通过向细胞中引入依据权利要求1的嵌合基因在病人炎性细胞或炎症部位细胞中诱导细胞凋亡的步骤。
13.依据权利要求12的方法，其中细胞凋亡的诱导在病人中不诱导炎性反应。
14.依据权利要求12的方法，其中炎性细胞是TNFα产生细胞。
15.依据权利要求12的方法，其中炎性疾病选自包括类风湿性关节炎，多发性硬化，急性热病性多神经炎，局限性回肠炎，溃疡性结肠炎，银屑病，移植物对抗宿主疾病，红斑狼疮，胰岛素依赖性糖尿病，银屑性关节炎，结节病，过敏性肺炎，类风湿性脊椎炎，赖特综合征，及全身性硬皮病的组中。
16.依据权利要求15的方法，其中炎性疾病是类风湿性关节炎。
17.一种嵌合基因，包含2至10盒的连续到至少一个拷贝的最小TNFα启动子的TNFα启动子增强子，及至少一个拷贝的选自包括caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B及其任何功能性片段，变体和混合物的组中的细胞凋亡诱导基因，其中由TNF启动子驱动细胞凋亡诱导基因的表达。
18.包含依据权利要求17的基因的药物组合物。
19.通过向细胞中引入依据权利要求17的嵌合基因在产生TNFα炎性细胞中诱导细胞凋亡的方法。
20.治疗病人炎性疾病的方法，包括通过向细胞中引入依据权利要求17的嵌合基因在炎性细胞或炎症部位细胞中诱导细胞凋亡，而不在病人中引起炎性反应。
21.构建包含至少一个连接到一个功能性拷贝的最小TNFα启动子并进一步连接到至少一个拷贝的细胞凋亡诱导基因的TNFα启动子增强子的嵌合基因的过程，其中由TNFα启动子驱动细胞凋亡诱导基因的表达，包含步骤(a)使用含有TNFα启动子的缺失构建体的引物通过聚合酶链式反应扩增TNFα启动子；(b)将步骤(a)中获得的PCR扩增的基因克隆到报告基因上游；(c)在至少一种产生TNFα的细胞系中测定步骤(b)中获得的构建体的组成型和诱导表达；(d)选择负责报告基因在细胞系中表达的TNFα启动子；并或者(e)PCR扩增增强报告基因表达的TNFα启动子区域以获得增强子并连接至少一个拷贝的增强子到启动子上游；或者(f)通过用细胞凋亡诱导基因缺失构建体代替报告基因将至少一个拷贝的前域缺失的细胞凋亡诱导基因插入TNFα启动子下游以得到嵌合基因或(g)PCR扩增TNFα-3′UTR并连接到报告基因下游，或这些步骤的任何组合。
22.依据权利要求21的方法，其中将2或更多拷贝的增强子插入到启动子上游。
23.依据权利要求21的方法，其中报告基因是萤光素酶。
24.依据权利要求21的方法，其中的增强子含序列10或序列11。
25.依据权利要求21的方法，其中前域缺失的细胞凋亡诱导基因选自包括caspase3，caspase4，caspase5，粒酶B，及其功能性片段和变体的组中。
27.依据权利要求21的方法，产生选自含序列4，序列5，序列6，序列7，序列8，序列9及其功能性片段或变体的组中的基因。
28.依据权利要求21的方法，其中用于检测构建体的细胞系选自包括T类成淋巴细胞，骨髓单核细胞，单核细胞，成纤维细胞，和培养的人滑膜细胞。
29.一种嵌合基因包括(a)至少一个连接到一个功能拷贝的最小启动子的启动子增强子，条件是启动子是在炎性细胞或炎症部位细胞中激活的基因或基因组合，以及(b)进一步连接到至少一个拷贝的细胞凋亡诱导基因，其中由该启动子驱动细胞凋亡诱导基因的表达，并且启动子选自包括细胞因子，白细胞介素及其受体，细胞粘附分子及其配体，趋化因子及其受体，促炎酶，及其混合物的组中。
31.依据权利要求29的基因，其中启动子选自包括TNFβ，IL-1α，IL-1β，IL-2，IL-6，IL-8，GM-CSF，干扰素γ，其功能性片段和变体，以及其任何混合物的组中。
32.依据权利要求29的基因，其中启动子选自含有选择蛋白，整联蛋白，ICAM-1，V-CAM，其功能片段和变体，和其任何混合物。
33.依据权利要求29的基因，其中启动子选自含有MIP-1α，MIP-1β，MCP1-4，RANTES，Mig，NAP2，IP10，Groα-γ，其功能性片段和变体，以及其任何混合物的组中。
34.依据权利要求29的基因，其中启动子选自包括COX-2，iNOS，磷脂酶，蛋白酶，其功能性片段和变体，以及其任何混合物的组中。
35.依据权利要求29的基因，其中增强了对启动子的连接和启动子对细胞凋亡诱导基因的连接选自包括直接连接，远端连接，邻近连接，及其组合的组中。
全文摘要
本发明涉及通过向细胞中引入含有在炎症中由活性的诱导基因的启动于驱动的细胞凋亡诱导基因(AIG)和炎症细胞靶向的启动子增强子的嵌合基因,在活性炎症细胞或炎症部位细胞中治疗性诱导细胞凋亡。在一个实施方案中,嵌合基因含有至少一个与最小肿瘤坏死因子α(TNFα)启动子功能拷贝结合的TNFα启动子增强子并进一步与至少一个拷贝的细胞凋亡诱导基因结合,其中基因的表达是由TNFα启动于驱动的。结合可以是直接的,在远侧的,邻近的或其组合。细胞凋亡诱导基因的例子包括caspase 3,caspase 4,caspase 5,粒酶B等。TNFp－AIG嵌合基因只在产生炎性细胞因子,TNFα的细胞中表达是有利的。此外,TNFp－AIG嵌合基因亦螫合诱导TNFp转录因子,从而降低内源TNFα的产生。本发明亦涉及制造和使用自我调节细胞凋亡嵌合基因及含有它们用于治疗炎症疾病的药物组合物。
文档编号A61K48/00GK1249688SQ98802960
公开日2000年4月5日 申请日期1998年2月27日 优先权日1997年2月28日
发明者雷瓦蒂·J·塔塔克, 史蒂文·D·马林, 兰德尔·W·巴顿 申请人:贝林格尔·英格海姆药物公司