苦瓜中的口服活性成分,其活性肽,及它们治疗糖尿病的用途的制作方法

专利名称：苦瓜中的口服活性成分,其活性肽,及它们治疗糖尿病的用途的制作方法
技术领域：
本发明领域是糖尿病。
背景技术：
非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM或II型糖尿病)是居美国第四位导致死亡的原因，在全世界有5-7％的人口受它的困扰，并且在西方国家中它的影响日渐严重。患糖尿病时，或者身体不能产生足够的胰岛素，或者产生的胰岛素无效，导致血液中葡萄糖水平升高，这种疾病医学上称为高血糖症。尽管任何年龄的人都有可能患糖尿病，但多数糖尿病患者的年龄超过45岁。此病似乎有家族性，并且体重超标的个体发病的危险率增加。
糖尿病是一种慢性病，无法根治并且伴发其它几种疾患。它是导致25-74岁年龄段人失明的主要原因。10％的糖尿病患者并发肾病。糖尿病是导致非创伤性下肢切除最常见的原因。糖尿病患者腿切除的危险率增加30倍。糖尿病患者并发心脏疾病的危险率增加2-4倍，并且中风的可能性增加5倍。
导致糖尿病的原因还不清楚，遗传因素和环境因素似乎均起作用。有两种糖尿病胰岛素依赖性(I型)和非胰岛素依赖性(II型)。I型糖尿病是自身免疫疾病，常发生于儿童和青年。导致I型糖尿病的自身抗原还不知道，患者的存活依赖每日静脉注射胰岛素。
II型糖尿病是由于机体不能产生足够量的胰岛素或者虽然能产生胰岛素但是不能恰当地使用从而导致的新陈代谢疾病，它被认为是最常见的糖尿病类型。尽管知道缺乏胰岛素的分泌和对胰岛素的抗性是导致II型糖尿病的主要原因，但是其中的精确的遗传因素目前还不清楚。糖尿病患者通常有下列一种或几种缺陷。它们是胰脏产生的胰岛素过少；肝脏分泌的葡萄糖过量；骨骼肌利用葡萄糖功能障碍；葡萄糖转运蛋白(Glut-1，Glut-2)功能障碍；胰岛素受体失敏和多糖代谢分解功能障碍。
目前临床除了静脉注射胰岛素外还应用四类口服降血糖药。简述如下

上表清楚地表明目前可用于治疗糖尿病的每种药物都有一定的缺陷。因此人们一直有兴趣鉴定和研制用于治疗糖尿病的新药。
苦瓜是一种果实可作为蔬菜的热带植物。一些研究小组已经报道了苦瓜在哺乳动物模型(Shibib等，生物化学杂志，292，267-270(1993)；Ali等，植物医学，59408-412(1993)；Akhtar等，植物医学，42205-212(1981))和人体(Leatherdale等，英国医学杂志，2821823-1824(1981)；Aslam等，Lancet，I.607(1979))中的降血糖活性。但是其中的降血糖成分及作用机理还不清楚。
从苦瓜中分离出一种具有类胰岛素活性的11kDal肽的报道见于Khanna等，“植物来源的多肤P的降血糖活性”，美国药学会第20届年会，Purdue University，West Lafayette，1979年7月29日-8月3日；Baldwa等，Upsala J.Med.Sci.(1977)8239-41和美国专利第3945988号。在所有这些报道中，这种类胰岛素多肽都不是口服给药，即是静脉注射或皮下注射。
最近的一篇报道指出，苦瓜的乙醇粗提取物能够通过刺激肝脏中的糖原合成而部分地降低血浆中葡萄糖水平，而不象是作为刺激胰岛素分泌的药物(Sarkar等，药学研究(Pharmacol.Res.)，33，1-4(1996))。
发明概述提供了一种苦瓜的水溶性组分(MC6)和它的制备方法及在治疗高血糖症中的用途。MC6的特征是在SDS-PAGE凝胶电泳上以单一条带形式泳动，分子量小于10kDal，小于重组胰岛素。它含三种肽，无高分子量蛋白质污染。同时提供的还有MC6的一种特定肽成分，标为MC6.1，还提供了MC6.1的肽衍生物MC6.2和MC6.3，它们的长度小于MC6.1，表现出降血糖活性，可以口服给药来治疗多种高血糖症。
附图简述

图1A显示了苦瓜的各种水溶性成分在SDS-20％-PAGE凝胶电泳中的结果；图1B显示纯化过的MC6制备物；图1C显示了MC6的HPLC分析结果。
图2A图示了未纯化的苦瓜含水提取物和对照组在一段时间内对SD大鼠血糖水平的作用；图2B图示了口服给药的MC6在一段时间内对SD大鼠血糖水平的作用。
图3A-B图示了MC6对SZC诱导患糖尿病的大鼠血糖水平的作用。
图4图示了口服给药的MC6不使血清中胰岛素的水平升高。
图5图示了口服给药的MC6与静脉注射的重组胰岛素有着相同的降血糖效果。
图6(a)-(b)显示了MC6.1在4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶上的SDS-PAGE分析结果(分别用考马斯亮兰和银染染色)。
图7图示了用C18 RP-HPLC柱纯化MC6.1的结果。
图8(a)-(b)显示了MC6.1的等电点分析结果。
图9显示了MC6.1的核磁共振分析结果。
图10图示了MC6.1对血糖水平的作用。
图11图示了MC6.1、MC6.2和MC6.3在正常大鼠口服葡萄糖耐受实验中的降血糖活性。
图12图示了MC6.2对糖尿病大鼠的降血糖作用。
图13图示了MC6.2对非肥胖型糖尿病大鼠的降血糖作用。
具体实施方案的详述本发明提供了苦瓜的一种水溶性成分MC6，MC6的一种活性肽成分MC6.1以及MC6.1的肽衍生物MC6.2和MC.3，它们的制备方法及在治疗高血糖症中的用途。MC6的特征是它含三种肽，在SDS-PAGE凝胶电泳上以单一条带形式一起泳动，分子量10kDal，比重组胰岛素小。MC6和MC6.1表现出降血糖活性并且具有口服活性。在对本发明后面的叙述中，将对MC6和MC6.1的特性，以及它的制备方法及在治疗高血糖症中的用途，尤其是在治疗人糖尿病患者中的用途作具体描述。
MC6.2和MC6.3分别是MC.1这种18氨基酸肽的11氨基酸和7氨基酸肽衍生物。
在进一步叙述本发明之前，应当说明，本发明并不仅限于下面叙述的实施特例，因为实施特例可以有一些变化但仍然在下面所附的权利要求范围内。还需要说明的是在此用到的术语只是为了描述实施特例，并非为了限制。所以本发明的范围以所附的权利要求书为准。
应当说明的是在本实施特例和权利要求书中，除非上下文清楚指明，单数形式“一个(种)”，“这个(种)”均有其复数对应形式。除非指明，所有的科学和技术术语都具有本发明所属领域普通技术人员的理解相同的含义。
本发明中的MC6是植物品种苦瓜中的一种水溶性成分或提取物。尽管MC6可以从苦瓜的一种或多种组织或组成中得到，包括叶、茎、根、果实、种子及其它组织，甚至整株苦瓜，但MC6通常从苦瓜果实、尤其是已与种子分离的未成熟果实中得到。
MC6的特征是在SDS-20％PAGE凝胶电泳上呈单一条带，该单一条带分子量小于10kDal(SDS-20％PAGE凝胶的电场强度100V)。MC6比重组胰岛素小，因此应小于约6kDal。MC6的进一步特征在于，经过C8或C18进行反相高效液相色谱(HPLC)柱层析，MC6洗脱为三个峰。在此条件下，第一峰在11.33分钟时流出，第二峰在25.35分钟时流出，第三峰在34.67分钟时流出。
本发明中的MC6是不包含高分子量污染物(如蛋白质)的制剂，在本申请中高分子量污染物指分子量大于约50kDal的分子。通常MC6中不包含分子量大于10kDal的任何污染物。
MC6对哺乳动物有降血糖活性。降血糖活性是指哺乳动物经MC6处理后血糖的水平下降，并且血糖水平下降的量与处理哺乳动物的MC6的量成比例。口服给药和静脉内给药均有降血糖的活性，也就是说MC6具有口服活性或口服生物可获得性，即它在经过哺乳动物胃肠道时不失去活性。
MC6可利用任何一种能从苦瓜组织中分离MC6的简便方法制备。一种能从苦瓜组织中得到MC6的方法是首先在一种溶剂(如磷酸盐缓冲液(PBS)、水或者其它溶剂)中利用搅拌器或其它浸渍方法将组织浸渍得到组织的粗悬物。然后将所得悬浮液中的颗粒物与液相分离并去掉，这一步可以通过离心来实现，常用转速在10,000-16,000rpm之间，再将上清用孔径在0.5-0.10μ范围内的滤膜过滤，常用0.45-0.22μ的滤膜，可在真空下过滤。再将得到的过滤液依次通过30kDal和10kDal的截留膜，得到包含MC6的初始苦瓜组织水溶性组分，在本领域中已知这类膜，代表性的膜包括Amicon分子量截留膜等。得到的水溶性组分可马上使用或者进一步处理以便后面使用，这种进一步处理可包括脱水如冷冻干燥等。得到的水溶性成分也可以在有防腐剂如苯甲酸钠等的存在下，在1-5℃，常在2-4℃的条件下，以液态形式保存。
MC6.1是MC6中的一种特殊肽成分，它在SDS-PAGE凝胶电泳(4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶电泳)上呈现单一条带，通过SDS-PAGE凝胶电泳判断其分子量小于2.5kDal。MC6.1的等电点是8.2。它有18个氨基酸，序列如下K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G(SEQ ID NO01)MC6.1在哺乳动物中有降血糖的活性。本发明中的MC6.1是从其天然环境中分离出来的MC6.1，如存在于MC中的，是分离或纯化形式的，等。
同时还提供了有降血糖活性的MC6.1肽类似物或模拟物。MC6.1的肽类似物或模拟物将包含至少8个氨基酸，通常不少于约12个氨基酸，最常见的是至少约18个但少于约40个氨基酸(通常少于30个)作为活性基元序列。其中某一种11氨基酸的MC6.1肽衍生物MC6.2有如下的序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A(SEQ ID NO02)另一个7氨基酸的衍生物有如下的序列K-T-N-M-K-H-M(SEQ ID NO03)可以理解，在本该序列中最多可以有三个置换或缺失，但变化的氨基酸的个数不能超过活性基元内氨基酸总数的约20％，通常不超过约10％。优选的是本领域内熟知的保守性置换，包括大的疏水组内的置换异亮氨酸、亮氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸；丝氨酸和苏氨酸间；甘氨酸和丙氨酸间；天冬酰氨和谷氨酰氨间；天冬氨酸和谷氨酸间；赖氨酸、精氨酸和组氨酸间。
除了从其天然来源纯化得到，MC6.1及其肽类似物或模拟物如MC6.2和MC6.3也可以用传统技术制备，如合成(例如使用Beckman 990型多肽合成仪或其它商业合成仪)。肽也可以用重组的方法直接制备(Sambrook等，分子克隆实验室手册，CSHL出版社，冷泉港，纽约，1989)或产生融合蛋白质，例如与作为特定结合对成员之一的蛋白质融合的蛋白质，然后通过亲和物将融合蛋白质纯化出来，再经过蛋白水解切割，通常在事先设计好的位点切割，以获得目的蛋白质。(例如Driscoll等，1993，分子生物学杂志，232342-350)。
寡肽(即MC6.1、MC6.1的类似物或模拟物)可以被延伸以便提供方便的连接位点，如半胱氨酸或赖氨酸，以增加稳定性、与特异受体结合、提供定点作用、简便纯化、改变物理性状(如溶解度、带电性等)和稳定构型等。寡肽可以借助连接基团或半胱氨酸介导的共价连接(二硫键)或肽键而连接在侧翼的非野生型区域上，形成融合蛋白质。寡肽也可以借助多种双功能试剂如顺丁烯二酰亚胺苯甲酸、甲基二巯基乙酸、巯基苯甲酸、S-吡啶基二巯基丙酸等连接。寡肽还可以连接到氨基酸链N端或C端的单个氨基酸上，也可以内部连接。例如，本发明肽可以共价连接到一个免疫原蛋白质上，如匙孔蝛血蓝蛋白、卵清蛋白等，以协助产生针对本发明寡肽的抗体。
另外，本发明寡肽也可以与其它蛋白质或肽结合起来表达，成为该链的内部或N端或C端一部分。还可以进行一些表达后的修饰，例如设计合适的编码序列，就可以进行法呢基化、异戊二烯基化，使本发明肽能够在一端结合脂类基团，并且能够插入到脂膜如脂质体中。
本发明寡肽可以被聚乙二醇化，其中聚乙烯氧基能够增加其在血流中的半衰期。本发明寡肽还可以与其它蛋白质组合，如与免疫球蛋白同种型的Fc组合，以促进补体结合，或者同蓖麻蛋白、相思豆毒素、白喉毒素等毒素尤其是它们的A链组合。本发明寡肽可以与抗体连接以执行定向作用。连接技术，参见如美国专利第3817837，3853914，3850752、3905654，4156081，4069105，和4043989号；均引入本文作为参考文献。
本发明中的MC6、MC6.1、MC6.2(及其类似物和模拟物)可用于治疗以血糖水平较高为特征的疾病，如高血糖疾病，例如糖尿病(包括I型和II型)和其它高血糖相关的疾病如肥胖症、肾胆固醇升高相关的疾病等。“治疗”意味着给予MC6、MC6.1、MC6.2、MC6.3(及其类似物和模拟物)，以至少降低高血糖疾病宿主的血糖水平。在应用MC6和本发明寡肽对高血糖疾病的治疗中，宿主接受的MC6或寡肽的量足以使其血糖水平降低到容许的范围(容许的范围是指宿主正常血糖的平均值的±10％，一般±8％，通常在±5％)。
本发明中可以对多种宿主进行处理，以降低其血糖水平，它们有哺乳动物，包括家畜、珍贵或稀少的动物、宠物如狗和猫，以及人。
最令人感兴趣的是治疗人类高血糖疾病，如糖尿病(包括I型和II型)的方法，其中将MC6、MC6.1、MC6.2、MC6.3及其类似物和模拟物给予高血糖疾病患者，以至少使其血糖水平下降，其中血糖水平下降到人正常血糖范围附近。尽管活性药物可以通过上述任何一种方便的途径给予人体，但最令人感兴趣的是口服给予活性药物。
为了用组分MC6或者肽MC6.1、MC6.2和/或MC6.3进行治疗，活性化合物可以通过任何一种方便的途径给予患高血糖疾病的宿主，如静脉注射、皮内注射、肌肉内注射、皮下注射和口服等等，其中口服途径给药是最令人感兴趣的。给予宿主的剂量必须根据给药途径确定，一般对体重70千克的人给药约50-500毫克(通常在100-200毫克之间)。在用MC6治疗高血糖疾病患者时，活性成分或化合物的给药量一般是约50-500毫克/70kg人体重，通常是100-200毫克/70kg人体重。
按照本发明，在应用此活性成分或化合物时，它们可以与生理学上可接受的载体结合，形成药物组合物。与活性成分或化合物可以结合形成药物组合物的生理学上可接受载体的性质必须由该药物组合物预定的给药途径决定，可列举的载体包括水，例如注射用无菌水、盐水等。最令人感兴趣的是造用于口服给药的生理学上可接受载体。在本领域中熟知这类载体，包括水，如去离子水；盐溶液，如磷酸盐缓冲液，片状或胶囊状的冻干粉，这类形式可以包括填充剂、结合剂等。药物组合物中存在活性成分的量由其给药方式决定，可由本领域技术人员经验性地确定。
治疗中，MC6.2和/或MC6.3及其寡肽类似物或模拟物可以口服给药、局部给药或者不经过胃肠道给药，如在一些特殊的部位注射，例如皮下注射、腹膜内注射、静脉注射、鼻内注射以及经皮注射等。口服给药的剂型包括以上提到的适合于MC6使用的那些。注射用剂型中包括生理学上可接受的介质，如水、盐溶液、磷酸盐缓冲液、含水乙醇、含水乙二醇等。可利用的水溶性防腐剂包括亚硫酸氢钠、硫代硫酸钠、抗坏血酸盐、洁尔灭、氯代丁醇、硫柳汞、硼酸苯汞、对羟基苯甲酸酯类、苄基醇和苯乙醇。这些药剂分别可以占到重量的约0.001-5％，优选0.01-2％。适于使用的水溶性缓冲剂包括碱或碱土碳酸盐、磷酸盐、碳酸氢盐、柠檬酸盐、硼酸盐、醋酸盐、琥珀酸盐等，如磷酸钠、柠檬酸钠、硼酸钠、醋酸钠、碳酸氢钠、碳酸钠。添加剂如羧甲基纤维素可作为载体使用，用量为重量的约0.01-5％。剂型可以根据目的不同，用于调整受体活性的具体方式、拟用治疗等而不同。剂型可包括贴剂、胶囊、脂质体、缓释包装、丸剂或者为了连续给药而制成灌注液。具体剂量可根据本领域的常规方法经验性确定。参见如Harrison’s，《内科学原理》，11版，Braunwald等编，McGraw Hill Book Co.，Mew York，1987。
通常地，活性成分或肽，其类似物或模拟物的治疗有效剂量的范围约在0.005-10毫克每千克宿主体重，更普遍的约在0.01-1毫克每千克宿主体重。这样的剂量将足以取得期望的降血糖活性。给药的频率可以是每天给药(通常不超过每天一次或每天多次)，甚至长达一周一次，这要根据所给药物的水平来确定。所给的寡肽量通常根据此肽的半衰期来调整，当肽有延长的半衰期或者以长效制剂的形式给药时，它的剂量就可以取此范围的下限部分，例如，将含有颗粒的缓释组合物引入可延期维持肽的基质(如胶原基质)中，在相当长的时间里利用泵将肽以基本比较连续的速度注入体内，诸如此类。Heeler，受控药物送递中的可生物降解性聚合物，《治疗性药物载体系统CRC评述》，第1卷，CRC出版社，Boca Raton，FL，1987，第39-90页中描述了受控药物送递的胶囊化。DiColo(1992)生物材料，13850-856中描述了由疏水性聚合物控制的药物释放。
下面的例子作为例举而不是为了限制。例1A. 分离和纯化苦瓜提取物中的活性成分新鲜未成熟的苦瓜果实洗净，擦干，去掉种子。果浆在磷酸盐缓冲液或去离子水中混匀。悬浮物于12,000xg离心，然后在真空下通过0.22μ的无菌滤膜(得自Whatman)过滤。澄清上清再依次通过30kDal、10kDal和3kDal的截留膜(得自Amicon filtration)。用SDS-20％-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析经过0.45μ(第一步)、0.22μ(第二步)和10kDal(第三步)的截留膜而流出的组分，结果显示在图1A中。第三步纯化后组分显示为小于人类胰岛素的单一条带。从凝胶电泳分析可以明显看出，纯化后组分不包含各种高分子量的蛋白质条带。纯化了几批克级水平的10K截留组分标为MC6，见图1B。得到的纯化组分被冻干，以获得去除游离水的MC6。
对100-500毫克的冻干MC6经过高效液相色谱(HPLC)(利用C8或C18柱，用TFA/乙腈线性梯度进行的反相HPLC)分析，结果见图1C。HPLC分析结果显示有保留时间分别为17.35、25.35和34.67分钟的三个主峰，说明MC6包含三种肽。B.MC6的降血糖活性将纯化后组分的降血糖活性与起始的粗提物制剂比较。SD大鼠(平均体重200克，得自Charles River，MA)饥饿3小时后，从尾静脉取血，以测量基础血糖水平。每只大鼠口服给予5毫升粗提物或1毫升纯化后的于磷酸盐缓冲液中的MC6组分(在A部分中制备)(500克)。对照动物接受同体积的磷酸盐缓冲液。用硫戊巴比妥(suritol)麻醉大鼠(腹膜内注射)(0.08μg/ml/kg，萘心安(1.7μg/min/kg))。将导管插入每只大鼠的颈静脉，灌注溶在5mM氯化钾和140mM氯化钠溶液中的葡萄糖(18mg/min/kg体重)3小时。在30、60、90、150、180分钟时从颈动脉取血。血糖水平用Kadish等(临床化学(1968)，14116)叙述的量热测定法测定。
结果显示在图2A中。结果显示接受粗提物的动物在各个检测点的血糖水平均有显著下降，60分钟时效果就已经很好(相对差别几乎达100％)。在平行实验中，如图2B所示，1毫升在磷酸盐缓冲液中的MC6纯化水溶液组分(500克)口服给药，其效果与粗提物的效果类似，暗示分离后的MC6多肽混合物是粗提物中的主要活性成分。C.MC6的预防和治疗效果进行下面一系列实验，以验证纯化组分在动物模型上对糖尿病的预防和治疗效果。用链脲霉素(40mg/千克体重)(得自Sigma Chem.，MO)诱导雄性SD大鼠(每只200-225克)发生糖尿病。在预防模型中，动物从第0天开始，每天口服接受1毫升(500克)纯化过的MC6组分。在治疗模型中，动物从第5天开始发病后口服接受1毫升(500克)纯化过的MC6组分。在15天内每天观察血糖的水平。如图3A和3B所示，纯化后的MC6组分有很好的预防和治疗效果(第10天时p＜0.001)。
MC6对链脲霉素诱导的糖尿病的良好预防效果很好地支持了它对于治疗I型自身免疫糖尿病的适用性。D.MC6对血清中胰岛素水平的作用在C部分叙述的实验中，在不同的天数测量血清中胰岛素的水平，以观察在降血糖过程中MC6在调节全身性胰岛素中起的作用。血清中胰岛素水平的定量测定采用的是放免方法(LINKO实验)(如Hales & Randle，生物化学杂志(1963)88137所述)。图4显示了口服给药并不提高血清中胰岛素的水平，说明此组分的作用并不是通过胰脏分泌胰岛素来实现。图4中，糖尿病是链脲霉素诱导的。未处理组只接受磷酸盐缓冲液，SZC组接受40毫克每千克的链脲霉素；预防组从第一天开始口服MC6；治疗组从第5天开始接受MC6。胰岛素用常规的放免法测定。数据显示的是三个平行测定的平均值。E.口服给药MC6与系统注射胰岛素有相同的疗效在接下去的实验中，将SD大鼠口服纯化过的MC6(500克)与静脉注射胰岛素(150mU)的结果进行比较。动物被分成四组，饥饿3小时。第一组只接受磷酸盐缓冲液，第二组在灌注葡萄糖前60分钟口服MC6；第三组在颈静脉灌注葡萄糖后60分钟静脉注射150mU重组胰岛素(Humalin-R，Novo-Nordisk)；第四组在颈静脉灌注葡萄糖后60分钟接受溶于1毫升磷酸盐缓冲液的纯化过的MC6(500克)(静脉注射)。所有组中葡萄糖均以18毫克/分钟/千克灌注。在不同的时间间隔从颈动脉取血，用量热术定量测定血糖的水平。
结果见图5。结果显示，在120分钟内，口服MC6有着与静脉注射重组胰岛素相似的效果。而且系统注射此组分和重组胰岛素有着相同的降血糖曲线。说明纯化组分经口服和系统给药均有活性。F.MC6.1的特性对MC6.1进一步在4-20％tris-甘氨酸梯度凝胶上进行SDS-PAGE分析，用考马斯亮兰或银染显示分开的条带。结果见图6a和6b。G.进一步纯化MC6.1MC6.1用C18反相高效液相色谱进一步纯化和分析(梯度0.1％TFA缓冲液A；60％乙腈于0.1％TFA中)，结果见图7。H.MC6.1的等电点对MC6.1进行等电点分析，结果为8.2。见图8a和8b。I.MC6.1的核磁共振分析对MC6.1进行质子核磁共振分析，结果见图9。J.MC6.1的降血糖活性MC6.1降血糖活性的检测类似于上面例B。使用体重平均为220克的SD雄性大鼠。给大鼠口服50微克MC6.1(500μl)。对照组接受PBS。结果见图10。显示MC6.1口服后有降血糖活性。例2图11显示MC6.1和它的衍生物MC6.2、MC6.3在正常大鼠口服葡萄糖耐受实验中的降血糖活性。实验中这三种多肽与载体处理组相比均有效地降低了血糖的水平。
MC6.2(11个氨基酸的肽)的降血糖活性在糖尿病大鼠上进一步验证。给平均体重在200克的SD大鼠以40毫克每千克体重的量注射链脲霉素。如图12所示，以100微克/只大鼠(0.5毫克/千克体重)的剂量给糖尿病大鼠(平均血糖330mg/dl)口服MC6.2后，其血糖水平比对照组显著下降。
在非肥胖型糖尿病(NOD)小鼠上实验MC6.2(11个氨基酸的肽)的降血糖活性。如图13所示，NOD小鼠每天口服MC6.2，对其血糖水平的影响比载体处理组动物更为显著。
这些结果证明，MC6.1的N端7-11个氨基酸残基对于降低血糖水平比较重要，可用于开发用于治疗人类糖尿病的药物中。
以上的结果和讨论明确说明，本发明提供了一种可用于治疗高血糖疾病，尤其是糖尿病的新的苦瓜提取物和特殊肽药物。因为本发明中的活性物不导致体内产生的胰岛素量升高，因此它提供了另外一种调节血糖水平的机制。此外，由于MC6和肽MC6.1、MC6.2、MC6.3有口服活性，它们比传统上用于糖尿病治疗的胰岛素产品更具优势，因为传统药物必须通过更具侵害性且更为不便的方式给药，如静脉注射。
本详述中引用的论文和专利申请在此处引用作为参考，就象每一单独的论文和专利申请被分别引用作为参考。任一篇引用的文献仅仅因为其公开早于此申请，并不应该解释为因为有前人发明而承认本发明不能早于这些文献。
尽管为了清楚理解的目的，本发明通过图和例子进行了一些详细的描述。但是很明显，对于本领域普通技术人员来说，根据本发明教导，可以在不脱离所附权利要求的精神和范围的前提下进行某些改变和调整。
序列表(1)一般资料(i)申请人Natpro，Inc(ii)发明题目苦瓜中的口服活性成分，其活性多肽，及它们治疗糖尿病的用途(iii)序列数3(iv)联系地址(A)收信人Fish & Richardson，P.C.
(B)街道2200 Sand Hill Road，Suite 100(C)城市Menlo Park(D)州名加利福利亚(E)国家美国(F)邮政编码(ZIP)94025(v)计算机可读形式(A)介质类型软盘(B)计算机IBM PC可兼容机(C)操作系统DOS(D)软件FastSEQ for Windows Version 2.0(vi)目前申请资料(A)申请号未知(B)提交日期1998年4月1日(C)分类(vii)以前申请资料(A)申请号08/850,855(B)提交日期1997年5月2日(A)申请号08/831,039(B)提交日期1997年4月1日(viii)代理/代理信息(A)姓名Suyat，Reginald J(B)登记号28，172(C)参考/备案号08948/006WO1(ix)通讯信息(A)电话650-322-5070(B)传真650-854-0875(C)电报(2)SEQ ID NO1的资料(i)序列特征(A)长度18个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO1Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala Ala Ala Gly Ala Val1 5 10 15Val Gly(2)SEQ ID NO2的资料(i)序列特征(A)长度11个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO2Lys Thr Asn Met Lys His Met Ala Gly Ala Ala1 5 10(2)SEQ ID NO3的资料(i)序列特征(A)长度7个氨基酸(B)类型氨基酸(C)链型单链(D)拓扑结构线性(xi)序列描述SEQ ID NO3Lys Thr Asn Met Lys His Met1 权利要求
1.水溶性组分MC6。
2.按照权利要求1的组分，其特征在于在SDS-20％-PAGE凝胶电泳中迁移为单一条带。
3.按照权利要求2的组分，其中所说的单一条带分子量小于10kDal，并且比重组胰岛素更小。
4.按照权利要求1的组分，其中包括三种肽。
5.按照权利要求1的组分，其有降血糖活性，且口服给药具有活性。
6.水溶性组分MC6，其特征在于在SDS-20％-PAGE凝胶电泳中迁移为分子量小于10kDal的单一条带，其中包括三种肽，有降血糖活性，口服给药有活性。
7.包含存在于生理学上可接受载体内的MC6的药物组合物。
8.按照权利要求7的药物组合物，其中所说的生理学上可接受载体是一种能口服的载体。
9.按照权利要求8的药物组合物，其中所说的能口服的载体包括去离子水或磷酸盐缓冲液。
10.降低宿主血糖水平的方法，所述方法包括给该宿主施用MC6。
11.按照权利要求10的方法，其中所说的MC6存在于生理学上可接受载体内。
12.按照权利要求10的方法，其中所说的施用是口服或者静脉内注射给药。
13.按照权利要求10的方法，其中所说的宿主患有高血糖疾病。
14.按照权利要求13的方法，其中所说的高血糖疾病是糖尿病。
15.按照权利要求14的方法，其中所说的糖尿病是I型糖尿病。
16.按照权利要求14的方法，其中所说的糖尿病是II型糖尿病。
17.降低患有高血糖疾病的哺乳动物宿主内血糖水平的方法，所述方法包括给该宿主口服含有MC6的药物组合物。
18.按照权利要求17的方法，其中所说的哺乳动物宿主是人。
19.按照权利要求18的方法，其中所说的高血糖疾病是糖尿病。
20.按照权利要求19的方法，其中所说的糖尿病选自I型糖尿病和II型糖尿病。
21.降低因患糖尿病而有高血糖症的人体内血糖水平的方法，所述方法包括给该宿主口服含有MC6的药物组合物。
22.按照权利要求21的方法，其中所说的糖尿病选自I型糖尿病和II型糖尿病。
23.选自MC6.1、MC6.2、MC6.3及它们的类似物或模拟物的一种肽。
24.按照权利要求23的肽MC6.1，其具有氨基酸序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A-A-A-G-A-V-V-G (SEQ ID NO01).
25.按照权利要求23的肽MC6.2，其具有氨基酸序列K-T-N-M-K-H-M-A-G-A-A(SEQ ID NO02).
26.按照权利要求23的肽MC6.3，其具有氨基酸序列K-T-N-M-K-H-M(SEQ ID NO03).
27.含有于生理学上可接受载体内的肽MC6.1、MC6.2、MC6.3、它们的类似物或模拟物或者其混合物的药物组合物。
28.降低宿主血糖水平的方法，所述方法包括给该宿主施用权利要求27的药物组合物。
29.按照权利要求28的方法，其中的施用是口服或者静脉内注射给药。
30.按照权利要求28的方法，其中所说的宿主患有高血糖疾病。
31.按照权利要求30的方法，其中所说的高血糖疾病是糖尿病。
32.按照权利要求31的方法，其中所说的糖尿病是I型糖尿病或II型糖尿病。
全文摘要
提供了苦瓜的一种水溶性提取物称为MC6,它的制备方法及在治疗高血糖症中的使用方法。有活性的MC6的特征是在SDS－PAGE凝胶电泳上以单一条带形式迁移,分子量小于10kDal,包含三种肽。同时提供的还有MC6的肽成分,称为MC6.1,以及MC6.1的衍生物和模拟物。活性MC6、MC6.1、MC6.2、M6.3有降血糖作用,口服给药后也有这种活性。同时提供的还有利用这些活性药物治疗高血糖疾病的方法,尤其是糖尿病,其中优选口服给予这些活性药物。
文档编号A61K38/17GK1255044SQ98805001
公开日2000年5月31日 申请日期1998年4月1日 优先权日1997年4月1日
发明者B·纳格, S·麦迪彻拉, S·D·沙玛 申请人:卡里克斯治疗公司