专利名称：一种预防或治疗雌激素依赖性疾病及失调的方法
技术领域：
总体上，本发明涉及的是雌激素依赖性疾病及失调的治疗，具体地，涉及的是一种用抗雌激素治疗雌激素依赖性癌症，特别是乳腺癌的方法。
背景人类雌激素受体(ER)是转录因子核受体超级家族的一个成员(Evans，科学240889-895(1988))。当没有激素时，它存在于靶细胞的细胞核中，不具转录活性。当与配体结合时，ER产生构象变化，从而启动了一系列的事件，最终导致它与靶基因中特定的调控区域相结合(O′Malley等人，激素研究471-26(1991))。随后的转录受到细胞及结合有DNA的受体的启动子构成的影响(Tora等人，细胞59477-487(1989)；Tasset等人，细胞621177-1187(1990)；McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。生理性的、ER-激动剂，雌二醇，正是以这种方式在生殖、骨骼及心血管系统中发挥它的生物活性(Clark及Peck编写的雌性类固醇受体和功能，内分泌学专著，Springer-Verlag，纽约(1979)；Chow等人，临床研究杂志8974-78(1992)；Eaker等人，循环881999-2009(1993))。
除了具有上述活性以外，雌激素在大部分的ER-阳性乳腺癌细胞中还具有促分裂素的功能。因此，用抗雌激素，即对雌激素作用具拮抗作用的合成化合物的治疗方案，在临床上可以有效地终止或延缓疾病的发展(Jordan及Murphy，内分泌综述11578-610(1990)；Parker，乳腺癌研究治疗26131-137(1993))。这些合成ER调控剂的出现以及对它们作用机制随后的解析为ER作用提供了有用的理解。
在这一方面被研究得最多的化合物是三苯氧胺(Jordan及Murphy，内分泌综述11578-610(1990)).这一化合物在大部分ER阳性的乳腺瘤中具有拮抗剂的功能，但在骨及心血管系统中却具有反常的激动剂活性，而且在子宫中也具有部分激动剂活性(Kedar等人，柳叶刀3431318-1321(1994)；Love等，新英格兰医学杂志326852-856(1992)；Love等人，Ann.Intern.Med.115860-864(1991))。因此，ER-tamoxifen复合物的激动剂/拮抗剂活性是受到细胞环境影响的。这一重要的观察显然与沿用已久的模型是矛盾的，后者认为，ER仅以具活性或不具活性的状态存在于细胞中(Clark及Peck编写的雌性固醇受体和功能，内分泌学专著，Springer-Verlag，NeW York(1979))。取而代之的，这一观察显示，通过同一受体起作用的不同的配体可以在不同的细胞中发挥不同的生物学功能。这一选择性机制的定义有可能可以推进对如tamoxifen抗性等过程的理解，这些过程存在于大部分含有ER的乳腺癌中，这一疾病与ER信号传导的失常是有关联的(Tonetti及Jordan，抗癌药物6498-507(1995))。
使用体外方法，已经确定了tamoxifen细胞选择性激动剂/拮抗剂活性的可能机制(Tora等人，细胞59477-487(1989)；Tasset等人。细胞621177-1187(1990)；McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。重要的是，已表明tamoxifen诱导ER内部发生构象变化，这一变化与经由雌二醇诱导的是截然不同的(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Beekman等人，分子内分泌学71266-1274(1993))。另外，ER中转录所需序列的确定表明了这些特定的配体-受体复合物是如何被细胞转录机器分别识别的。具体地，已示明ER含有两个激活结构域，AF-1(激活功能-1)以及AF-2，这两者使其能与转录装置相互作用。这两个AF对ER整体效力的相对贡献随着细胞的不同而不同(Tora等人，细胞59477-487(1989)；McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。已确定雌二醇既是AF-1，又是AF-2的激动剂。在一给定的细胞环境中，不管哪一个AF处于主导地位，雌二醇都能表现其最大的活性。另一方面，tamoxifen是一种AF-2的拮抗剂，它抑制在需要AF-2或者AF-2为处于主导地位的激活物的细胞中ER的活性(Tora等人，细胞59477-487(1989)；McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。相反地，当细胞仅需AF-1时，tamoxifen充当激动剂(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。随后，根据这些ER调控剂相对的AF-1/AF-2活性把其分为机制各不相同的四组，即完全的激动剂(如雌二醇)；两类各不相同的部分激动剂，分别由tamoxifen及raloxifene代表；以及纯粹的拮抗剂，其代表成员是ICI 182，780(McDonnell等人，分子内分泌学9649-669(1995)；Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。这些结果为所观察到的一些ER调控剂生物学活性的区别提供了机制上的解释，并表明ER在不同组织中的操作机制是不同的。有趣的是，在这些体外系统中由ER调控剂，如雌激素及tamoxifen，所表现出来的激动剂活性反映了它们在整个动物的生殖道中的活性。然而，这一相互关系并没有延伸到骨。在骨中，具有不同程度AF-1/AF-2激动剂活性的雌二醇、tamoxifen及raloxifene都有效地保护经卵巢切除的大鼠模型的骨不致损失。因此，除了类固醇类的纯粹的抗雌激素(即ICI 182，780)以外，所有已知类别的ER调控剂在人类以及相关动物模型中对骨损失都有保护作用，而它们在其它组织中则具有不同程度的雌激素活性(Chow等人，临床研究杂志8974-78(1992)；Love等人，新英格兰医学杂志326852-856(1992)；Draper等人，健康绝经期妇女的骨和脂质代谢的生化标记。于C.Christiansen及B.Biis编辑的Proceedings 1993。骨质疏松和交感建立会议第四次国际论坛，Handelstrykkeriet，Aalborg；Wagner等人，美国国家科学院院报938739-8744(1996)；Black等人，临床研究杂志9363-69(1994))。
本发明的概述本发明是以对ER调控剂的鉴定为基础的，上述ER调控剂在机制上与诸如tamoxifen的调控剂是截然不同的。这些调控剂已被应用于各种不同的雌激素依赖性疾病及失调症，包括乳腺癌的治疗。这些调控剂在对tamoxifen重新具有抗性或者在治疗中产生抗性的乳腺癌的治疗中具有特别的重要性。
本发明的目标及优点将在下列的描述中一目了然。
附图的简要描述
图1A及1B。GW 5638的机制与已知类别的ER调控剂的是截然不同的。把融合到萤火虫荧光素酶报告基因的人类C3启动子(-1807至+58)与一含有(图1A)野生型人类雌激素受体(ERwt)或(图1B)其AF-2功能被破坏的突变型ER(ER-TAF1)一起转染到HepG2细胞中，并检测随着ER调控剂浓度如图所示的不断提高其转录激活的情况。通过共转染一含有β-半乳糖酶的表达质粒来对转染的效率和细胞数进行标准化。通过把光单位除以β-半乳糖酶在酶学化验中所测得的活性来对转染反应进行标准化。进行三次重复转染。所示数据是在类似条件下进行的多次实验的代表值。
图2A-2C。分别具有雌二醇的激动剂活性、tamoxifen的部分激动剂活性以及ICI 182，780的逆向激动剂活性的GW 5638及GW7604。图2A。GW 5638或GW 7604对10-8M 17-β-雌二醇激动剂活性或10-8M tamoxifen所体现的部分激动剂活性的抑制作用在用ERwt进行转染的HepG2细胞中得到评估。图2B。GW 5638或GW 7604对10-8M 17-β-雌二醇激动剂活性或10-8M 4-OH tamoxifen所体现的部分激动剂活性的抑制作用，在用ER-TAFI进行转染的HepG2细胞中得到评估(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。图2C。当用所标示浓度在HepG2细胞中进行测定时，GW 5638及GW7604都可以抑制ICI 182,780(ICI)对C3启动子产生的明显的逆向ER激动剂的活性。通过把光单位除以β-半乳糖酶在酶学试验中所测得的活性来对转染反应进行标准化。所示的是三次重复转染的代表性化验结果。误差条线代表的是平均值的标准误差(SEM)。
图3A及3B。GW 5638保护经卵巢切除的大鼠的骨损失。用双波长X射线吸收仪测量了GW 5638对腰部脊椎(L1-L4)骨无机盐密度(bone mineral density，BMD)的影响。用Dunnet氏检测法确定了卵巢切除(ovariectomized，OVX)大鼠及经治疗大鼠的BMD差异的显著性(*p≤0.005)。图中标示了经过拟手术(shamoperated，Sham)(有阴影的条线)及经过卵巢切除(空心条线)的动物的骨无机盐密度的范围。图3B。用定量计算段层造影术(quantitativecomputerized tomography，QCT)测量了GW 5638对OVX大鼠胫骨近端干骺端的BMD的影响。用Turkey-Kramer检测法确定了OVX大鼠及经治疗大鼠(用“*”号表示)的BMD差异的显著性(p≤0.05)。
图4。GW 5638抑制了由卵巢切除术诱导的血清胆固醇的提高。从如标示用雌二醇或GW 5638进行治疗的90天龄的经卵巢切除的各组大鼠提取血液进行血清胆固醇的测量。如图所示，每一点代表OVX对照(n＝7)，雌二醇(n＝7)以及GW 5638(n＝7)的血清胆固醇平均值(±SEM)。“*”号所标示的是与OVX对照有显著区别的组别。图中标示了OVX动物血清胆固醇的范围(空心条框)。
图5。GW 5638在未成熟的大鼠子宫中并不具ER激动剂活性。给21天龄的多组大鼠分别口服单一的赋形药、单一药剂形式的GW 5638或tamoxifen、或者GW 5638或tamoxifen与雌二醇相结合。所示数据代表的是平均值(±SEM)。图中标示了对经雌二醇治疗(有阴影的条框)及经拟手术(空心条框)动物的测量范围。
图6。GW 5638对经卵巢切除的大鼠的子宫湿重的影响。分别用单一的赋形药、雌二醇或GW 5638对经拟手术或卵巢切除的90天龄大鼠治疗28天。所示结果代表的是每组7只大鼠子宫湿重的平均值(±SEM)。图中标示了对经拟手术(有阴影的条框)及经OVX(空心条框)的动物的测量范围。
图7A-7F。GW 5638对经卵巢切除大鼠的子宫组织学上的影响。所示的分别是(图7A)经拟手术，(图7B)经卵巢切除，(图7C)经卵巢切除及雌二醇治疗，或经卵巢切除及(图7D)1μg/kg，(图7E)3μg/kg或(图7F)10μg/kg GW 5638治疗的90天龄大鼠子宫的组织学比较结果(低放大倍数)。
图8A-8D。GW 5638对经卵巢切除的小鼠子宫组织学上的影响。所示的分别是(图8A)经拟手术，(图8B)经卵巢切除，(图8C)经卵巢切除及雌二醇治疗，或者(图8D)经卵巢切除及10μg/kg GW 5638治疗的90天龄小鼠子宫的比较组织学结果。所拍照片放大倍数为150×，随后把其放大到600×。
图9。抗雌激素治疗对种植于裸鼠MCF-7乳腺癌肿瘤的影响。天数0表示治疗的第一天。肿瘤接种2周后的统计分析表明，每一治疗组与对照组相比都有显著影响(ANOVA，p＜0.5)，而两个最大剂量的GW 5638与tomoxifen之间并没有显著区别。
图10。剂量反应研究。
图11。LCC2研究。
图12。GW 7604在MCF-7乳腺癌细胞中充当抗雌激素。
图13A及13BER的特异性突变对抗雌激素药理学影响的分析揭示了作用机制上另外的复杂性。图13A。ERwt。图13B。ER-TAFI。
图14A及14B各种不同的抗雌激素对ERα(图14A)及ERβ(图14B)转录活性的抑制能力的比较分析。
图15A-15C经激动剂或拮抗剂治疗之后ER在靶细胞中进行表达的Western免疫印迹分析。图15A。MCF-7细胞。图15B。Ishikawa细胞。图15C。经pRST7ER转染的Ishikawa细胞。
图16A及16B经激动剂或拮抗剂短时间治疗(图16A 1小时，图16B 4小时)之后，ER在MCF-7细胞中内源性表达的Western免疫印迹分析。
图17A及17B经激动剂或拮抗剂短时间治疗(图17A 1小时，图17B 4小时)之后，ER在Ishikawa细胞中内源性表达的Western免疫印迹分析。
图18A-18C经激动剂或拮抗剂短时间治疗以后。ER在Ishikawa细胞整个细胞(图18A)、细胞核(图18B)以及细胞质(图18C)中内源性表达的Western免疫印迹分析。
图19A-19C对经E2激活的MCF-7细胞增殖的影响。图19A，ICI 182,780，图19B，GW 7604，图19C，4-OH tamoxifen。
本发明的详细描述本发明涉及的是具有组织特异ER激动剂活性的选择性雌激素受体调控剂。本发明的调控剂在骨及心血管系统中充当激动剂，但在子宫中则无此活性。这些调控剂在机制上与例如tamoxifen是截然不同的并可被用于治疗肿瘤，如乳腺肿瘤，特别是ER阳性乳腺肿瘤，这些肿瘤的特征在于对各种不同的雌激素受体调控剂，包括tamoxifen，重新产生了或获得了抗性。这些调控剂在机制上也与raloxifene，droloxifene，idoxifene及ICI 182,780截然不同。
本发明优选的调控剂是三苯乙烯衍生物，更优选的是如USP 5,681,835中所定义的公式I化合物、GW 5638及其衍生物，如GW7604，是最优选的。这些化合物可以根据USP 5,681,835中以及Willson等人(医学化学杂志371550(1994))所描述的方法进行制备。这些调控剂可以与阳离子，包括碱金属，如钠及钾，或碱土金属，如钙或锰，形成药理学上可被接受的盐。
本发明的调控剂可被用于治疗及/或预防各种不同的失调或症状，如雌激素激活型癌症，包括子宫癌，卵巢癌，结肠癌及乳腺癌，心血管疾病(男性及女性)，骨质疏松症及关节炎。本发明调控剂对其(治疗或预防)有用的其它疾病或症状有前列腺癌、不育(如充当排卵的诱导剂)、与更年期相关联的血管运动性症状(如“潮热(hot flashes)”)，阴道炎、良性增生性失调，包括子宫内膜异位以及子宫纤维瘤、II型糖尿病、黄斑变性、尿失禁以及阿尔茨海默病(认知功能)。另外，本发明化合物还可被用作女性的避孕药。
由下列实施例可以清楚地看出，GW 5638及其衍生物都是在机制上独一无二的调控剂。由于这些药剂不具有营养子宫的活性，所以它们充当第一线治疗以及雌激素激活型癌症，特别是乳腺癌的化学预防剂比tamoxifen优越。这些药剂对ER不具经典的活性因而预计不会诱导出程度与目前的化合物的相同的抗性。另外，这些药剂可被用于治疗那些对其它雌激素受体调控剂，包括tamoxifen、idoxifene、raloxifene及ICI182,780，反应差的患者，以及那些开始时对这些调控剂反应良好但随后失效的患者。由于本发明药剂在机制上具有独特性，它们的应用被期望不会导致有害的副作用，如深静脉血栓。
由于本发明调控剂具有独特的作用机制，所以它们也被期待可被用作治疗用“鸡尾酒合剂”，特别是用于乳腺癌治疗的“鸡尾酒合剂”的一个成分，据此，本发明的调控剂可以与另一抗雌激素、视黄酸配体或视黄酸受体、抗黄体酮(如RU 486)、抗雌激素(如casdex或flutamide)、维生素D(或其代谢物)、法呢基转移酶抑制剂、PPARα或γ激动剂或MAP激酶抑制剂结合使用。
如上所述，本发明包括把本发明的调控剂用于预防以及用于治疗已存在的疾病及症状。所需调控剂的数量因症状(疾病/失调)、患者年龄及病症的不同而不同，并最终由负责的医生(当系治疗牲畜时由兽医)判断。然而，一般治疗成年人所用的剂量典型地介于每天0.001mg/kg至大约100mg/kg之间。所需的剂量可以方便地一次施用，或者也可以分次间隔适当时间施用，如一天两次、三次、四次或更多次。
本发明还包括包含上述调控剂或其在医药上可被接受的盐，以及一种或多种在医药上可被接受的载体以及，可选地，其它的治疗用及/或预防用成分，包括如上所述的那些组合物。
本发明的制剂可以以标准的方式施用以治疗所标示的疾病/失调，如可以口服、非肠道施用、舌下施用、穿过真皮施用、通过直肠施用、通过吸入施用或者通过口腔施用。当通过口腔施用时，组合物的形式(如单位剂量的形式)可以是以传统的方式配制而成的片剂或锭剂的形式。例如，口服用的片剂或胶囊可以含有传统的赋形剂如结合剂、填充剂、润滑剂、分解剂以及润湿剂。片剂可以根据本工艺所公知的方法裹上覆层。
或者，本发明的调控剂也可被结合到口服液制剂，如水状或油状悬浮液、溶液、乳状液、糖浆或酏剂之中。另外，含有这些调控剂的制剂可以被制成干制品，用于在使用前与水或其它合适的赋形剂进行组合。这类液体制剂可以含有传统的添加剂，如悬浮剂、乳化剂、防腐剂以及非水性赋形物。
这类制剂也可以被配制为栓剂，如含有传统的栓剂主料如可可脂或其它的甘油脂。吸入用的组合物可以被典型地配制成溶液、悬浮液或乳状液的形式，它们可以被以干粉的形式施用，或者用传统的推进剂如二氯二氟甲烷或三氯一氟甲烷以气溶胶的形式施用。典型的穿过真皮施用的制剂包含有一传统的液状或非液状赋形剂，如乳剂、软膏、洗液或糊剂或是采取药膏、药片或药膜的形式。
另外，本发明的组合物可以被配制用于通过注射或连续输注进行非肠道施用。注射用的制剂可以采取悬浮液、溶液、或置于油状或水状赋形物中的乳状液的形式，而且可以含有处方剂如悬浮剂，稳定剂及/或分散剂。或者，活性成分也可以是粉末状的，以便在使用前与合适的赋形剂(如无菌无热源的水)组合。
本发明的组合物也可以被配制成贮存型制剂。这种长效剂型可以通过埋植(如皮下埋植或肌肉埋植)或通过肌肉注射进行施用。相应地，本发明的调控剂可用合适的聚合或疏水性材料(如用可被接受的油制备成乳状液)、离子交换树脂，或者可以是例如保守可溶的衍生物或保守可溶的盐形成制剂。
GW 5638及GW 7604作为缺乏经典的激动剂活性的药剂而得以鉴定表明“激活”ER(即导致ER从热休克蛋白中被释放出来)而且不引起ER降解的化合物可被用于骨质疏松症的治疗。GW 5638及GW7604无法把导致骨质疏松以及保护心脏的活性分割开来这一发现表明，任何一种与ER结合并具有(致骨质疏松或保护心脏)任一活性的化合物必具有其他的活性。
本发明某些特定的方面在下列的非限制性的实施例中得到了更详细的描述。
实施例下列实验细节被随后具体的实施例所参照。生化试剂DNA及修饰酶购自Boehringer Mannheim(印第安纳波利斯，IN)，New England Biolabs(贝沃利，MA)或Promega Corp.(麦迪逊，WI)。普通的实验室试剂及17β-雌二醇(E2)购自Sigma(SL路易斯，MO)。ICI 182,780是由Zeneca Pharmaceuticals，Macclesfield，英国赠送的。Raloxifene是由Pfizer Pharmaceuticals，Groton，CT赠送的。4-OH Tamoxifene是由LigandPharmaceuticals(圣迭哥，CA)赠送的。GW 5638及GW 7604是参照已发表的方法(Wilson等人，医学化学杂志371550-1552(1994))制备的。抗体H222在Abbott Laboratories有售。细胞培养及共转染测定把HepG2细胞保存在加有10％胎牛血清(FCS)(生命技术公司，Grand Island，NY)的Modified Zagles Medium(MEM)(生命技术公司)中。转染24小时前把细胞接种到24孔平板(涂覆有明胶)上。用Lipofectin(生命技术公司)把DNA导入到细胞中。简而言之，使用了3μg的总DNA进行三次重复转染。进行标准转染时，每个三次重复转染使用500ng的pCMV-β-Gal(标准化载体)，1500ng报告基因(可变)以及1000ng受体(pRST7-hER(Dana等人，分子内分泌学81193-1207(1994))。用Lipofectin给细胞温育3小时，然后把该介质除去，用PBS清洗细胞，再用稀释于含有10％除碳CS(Cyclone Inc.)的无酚红介质的合适的激素对细胞进行诱导。用激素给细胞温育48小时，然后把细胞裂解并据前法(Norris等人，生物化学杂志27022777-22782(1995))化验荧光素酶及β-半乳糖酶的活性。未成熟大鼠的营养子宫测定21天龄雌性Sprague-Dawley大鼠(30-35克)购自Harlan或Taconic实验室。把它们随机地分为5个治疗组并记录每一治疗组的平均体重。在治疗的每一天都对体重进行记录。把GW 5638或tamoxifen制备于100％ETOH中(制备成10×贮存液)并把其贮存于-70℃，直至取用。用药当天，把药物稀释在0.5％甲基纤维素中，于25℃其2％稀释液的粘度为400厘泊(centipoise)(Sigma，St.Louis，MO)。强饲法的口服剂量是以每公斤体重施用10ml总体积为基础的。把雌二醇(Sigma，St.Louis，MO)制备于芝麻油中并用一玻璃匀浆机进行混合(制成溶液或悬浮液)，把其等量分装后置于-70℃冷冻，直至取用。皮下用药的剂量是以每公斤体重施用总共2ml为基础的。给大鼠强饲(GW 5638)或注射(雌二醇)3天。在第4天用CO2窒息法处死大鼠，记录其体重并把其子宫切除、吸干并称重。数据用子宫重量/体重表示。骨无机盐密度的研究动物的制备。把90天龄的Spragne-Dawley大鼠用异荧烷进行麻醉(诱导时用4％，保持时用2％)，对其施行卵巢切除(OVX)或拟手术(Sham operation，SO)并把其随机分组(n＝7)，通过强饲法于术后第1至第28天给其口服单一的赋形药、制备于0.5％甲基纤维素中的雌二醇或GW 5638。用CO2把动物无痛处死并记录其体重，切除其子宫并记录其子宫的重量。把其子宫，阴道及乳腺组织固定于10％中性缓冲的福尔马林中。从每一子宫角的中点处取样用于组织学处理。把组织样品包埋于石蜡中，用苏木素及曙红进行染色并用显微镜进行评估。把其腰椎及左右两根胫骨切开。测量其总血固醇(Roche生物医学实验室)。
双能量X射线吸收学(DEXA)分析。DEXA分析所用的是一Hologic QDR-2000骨密度仪及一区域性高分辨率软件包。把扫描长度、宽度、行距及点分辨率的缺省值分别设定为2、0.75、0.01及0.005英寸。每天用羟基磷灰石脊骨平台对密度仪进行校准。把切开后的胫骨放入一1cm深的水浴中，使胫骨及腓骨取水平位置。进行体内扫描时，用异荧烷对大鼠进行麻醉并把其置于仰卧的位置，使其脊骨与密度仪台面的长轴平行。把扫描脚用带子捆在与桌面长轴平行的位置，对胫骨进行扫描，直至其与股骨的连接处。用亚区域性软件(swb-regionalsoftware)对胫骨中感兴趣区域(region of interest，ROI)进行分析，把焦点放在从离生长盘3mm处开始的2mm宽的区域。
周边定量计算段层造影(peripheral quantitative computedtomography，pQCT)分析。CT扫描是在一PQCT(XCT-960A，Norland)上进行的。对4至5毫米的截面进行扫描时所用的三维象素尺寸E为0.148mm，步长为0.5mm。用Contmode，2/peelmode，5/cortmode分析了一远离生长板的3-5mm的截面。测量了全骨、小梁骨以及皮层骨的无机盐密度。把切开后的胫骨放入一1cm深的水浴中，使胫骨及腓骨取水平位置以确保可垂直对骨进行扫描。用异荧烷对大鼠施行麻醉并把其腿进行定位以便从监视图上可以对股-胫连接及胫-腓连接进行定位并把其当作CT扫描的位标。
实施例1新颖的ER调控剂的鉴定一系列的体外检测已得以发展，它们允许把ER调控剂分为四个机制截然不同的组别(Tzukerman等人，分子内分泌学821-30(1994))。具体地，对肝HepG2细胞的化验方法进行重建。测定时，化合物对雌激素应答性补体3(C3)启动子转录活性的调控能力是在有野生型ER(ERwt)或受体突变体，即ER-TAF1(此种突变体的AF-2功能已损坏)，存在时进行评估的。使用这些测定就可能获得已知的ER调控剂的“指纹”(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。虽然这些测定并不确切地反映ER在体内时的环境，但这些化验中的化合物的表现却足以把它们分为几个组，每个组在体内都发挥着独一无二的功能。
合成了一系列由三苯乙烯衍生的ER配体(Willson等人，医学化学杂志371550-1552(1994))。对这些化合物进行体内初步分析表明这些化合物在骨及子宫中的相对活性是不同的，这反映了它们的机制可能有所区别(Wilson等人，医学化学杂志371550-1552(1994))。接着，在HepG2细胞中的ERwt盲法测定这些化合物对C3启动子的活性，结果除了两种化合物以外，所有其它化合物的机制都可以与tamoxifen的区分开来。然而有两种化合物，即GW 5638及GW7604，在这一系统中表现出与其它ER配体足够不同的特征，这保证了进一步的研究。有趣的是，除了GW 7604是GW 5638的4-羟基化形式以外，这些化合物在结构上是一致的(表1)。体外竞争性放射配体结合测定结果显示，这些化合物都与ER有高亲和力的相互作用。具体地，GW 5638及GW 7604的Ki值分别为50.4nM(+/-5.4)以及15.5nM(+/-1.4)。在同一条件下，17-β-雌二醇的Ki值为6.3nM(+/-0.4)。虽然GW 5638的新陈代谢还未被研究，但它在体内很可能是被转变为亲和力更强的化合物GW 7604，这种方式与tamoxifen被转变成亲和力更强的代谢物4-OH tamoxifen是相同的(Jordan等人，内分泌学杂志75305-316(1977))。图1A所示的是这些化合物的激动剂活性与已确定的四组ER配体每一组的代表之间的比较。在这一测定中，当对C3启动子进行测定时，tamoxifen充当ER的部分激动剂，其效力是雌二醇的45％。当用同种方法进行分析时，raloxifene及纯粹的拮抗剂ICI 182,780都不表现激动剂的活性，而是抑制了C3启动子的基本转录活性。最近，已经确定C3启动子的基本活性虽然不是配体依赖性的，但却是ER依赖性的(Norris等人，分子内分泌学101605-1616(1996))。由于raloxifene及ICI 182,780都抑制配体依赖性及非配体依赖性的ER激活，所以它们在这一环境中充当了“逆向激动剂”。然而，GW 5638及其推断性代谢物GW 7604对这一启动子并不具有任何激动剂或拮抗剂的活性，显示出在以前没有被认识到的“指纹”。可以得出结论在一tamoxifen表现出部分激动剂活性的环境中，tamoxifen的类似物GW 5638及GW 7604不具功能活性。
虽然raloxifene及ICI182,780对ERwt的作用是类似的，但是它们的机制却截然不同(McDonnecl等人，分子内分泌学9659-669(1995)；Dauvois等人，美国国家科学院院报894037-4041(1992)；Dauvois等人，细胞科学杂志1061377-1388(1993))。当用一ER的突变体(ER-TAF1，此突变体的AF-2激活序列已被除去)进行测定时，raloxifene的性质类似于tamoxifen，其激动剂活性为雌二醇的40％(图1B)。在这一化验中，ICI 182,780，GW 5638以及GW 7604不具功能活性。这些数据表明，GW 5638(以及GW7604)发挥功能的方式与先前定义的与ER混合的激动剂及拮抗剂类别是截然不同的(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。
对这些初步结果的一个可能(虽然不太可能)的解释是化合物被代谢了(或者被以某种形式阻止与受体结合)，这样就解释了它们为什么在测定中不具活性。这一观点是通过对GW 5638及GW 7604对雌二醇及tamoxifen分别对ERwt及ER-TAF1表现出的激动剂活性的抑制能力，以及对ICI 182,780的逆向激动剂活性的取消作用进行评估来进行论述的。如图2A所示，当用HepG2细胞中的C3启动子进行测定时，雌二醇对ERwt表现出完全的激动剂活性，而tamoxifen则对ERwt表现出部分激动剂的活性。重要的是，tamoxifen或雌二醇所表现出来的激动剂活性都被GW 7604及GW 5638所抑制。因此，这些化合物以一种与tamoxifen截然不同的方式充当受体的拮抗剂的作用。用ER-TAF1取代ERwt进行了类似的分析(图2B)。如被期望的一样，GW 5638及GW 7604都能够抑制由雌二醇及tamoxifen诱导的ER-TAF1的转录活性。有趣的是，raloxifene对ER-TAF1有部分激动剂活性(图1B)，这一活性可被GW 5638及GW 7604所抑制。总而言之，这些数据表明GW 5638及其推断性的体内代谢物，GW 7604，是在机制上独一无二的ER调控剂，它们在体外不具有激动剂的活性，但它们可以抑制雌二醇，tamoxifen及raloxifene的激动剂活性。虽然这些化合物在一些测定中的特性与纯粹拮抗剂类的配体类似，但是由于它们并不具有逆向激动剂活性(图1A)，所以它们与雌二醇类拮抗剂，如ICI 182,780，是截然不同的。
为了确证GW 5638及GW 7604的机制与ICI 182,780是截然不同的，测量了这些化合物对由ICI 182,780所表现出来的逆向激动剂活性的取消能力。图2C示出了这一分析的结果。具体地，据观察，当加入ICI182,780时，人类C3启动子的基本活性被抑制10倍，而当同时加入GW7604时，该活性被完全取消，当同时加入GW 5638时，该活性被部分取消。
对所观察到的机制上的差别的一个可能的解释是GW 5638及GW7604与ER相互作用并抑制它与DNA相互作用的能力。这一解释是通过用一经过修饰的ER(ER-VP 16)来报告配体结合后ER在细胞中的核定位及其DNA结合状态来进行论述的。这一经过修饰的蛋白质一旦与雌激素应答元件(ERE)相互作用，不管与其结合的配体的性质如何，它都会激活转录作用，除此之外，它的性质与ER的完全相似(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。使用这一试剂，发现所有类型的ER配体，包括ICI 182,780、GW 5638及GW 7604，都可以便利ER与靶DNA的有效相互作用(McDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。
因此，GW 5638及GW 7604在体内与ER相互作用并表现出与其它已知调控剂截然不同的药理学特征。因此，这提示GW 5638及GW7604独一无二的特性在DNA结合之后的某些步骤是明显的。由于这些化合物具有这些独一无二的特性，所以就进行了整个动物研究，以检验它们在骨骼、心血管及生殖系统中的活性。
实施例2防止大鼠中由卵巢切除所诱导的骨损失现在已有强有力的证据表明tamoxifen及raloxifene在更年期骨质疏松症的临床前模型中都可以防止骨损失(Love等人，新英格兰医学杂志326852-856(1992)；Love等人，Ann.Intern.Med.115860-864(1991)；Black等人，临床研究杂志9363-69(1994))。然而，这些化合物在骨中的作用机制仍未被确定。虽然临床前大鼠模型的数据提示纯粹拮抗剂ICI 182,780在骨组织中并不是一种激动剂(Gallagher等人，内分泌学1332787-2791(1993))，但接受纯粹拮抗剂ICI 182,780治疗的患者的骨的命运如何在目前仍不清楚。这就引出一种假说，即tamoxifen及raloxifene的部分激动剂活性是骨保护所必需的(Love等人，新英格兰医学杂志326852-856(1992)；Black等人，临床研究杂志9363-69(1994))。先前的工作表明tamoxifen及raloxifene在一些细胞及启动子环境中都具有同样有效的激动剂的功能，这些工作支持了上述的假说(MeDonnell等人，分子内分泌学9659-669(1995))。然而，GW 5638提供了论述这一观点的新的工具。对这一在任何体外化验中都不具有经典的激动剂活性的化合物对经卵巢切除的大鼠骨损失的抑制能力进行化验。具体地，在给90天龄的经卵巢切除的大鼠口服17β-雌二醇或剂量逐增的GW 563828天之后，化验大鼠腰部脊椎及胫骨的骨无机盐密度(BMD)。示于图3A中的结果表明，与经拟手术的对照动物相比较，经卵巢切除(OVX)的动物在28天内其腰部脊椎发生了显著的骨损失，而用雌二醇治疗的OVX大鼠的BMD得到保持。GW 5638显著地表现出剂量依赖性的骨保护活性，当其浓度为3μmol/kg(1mg/kg)时与雌二醇一样有效。这一剂量与对同一模型进行骨保护所需的tamoxifen剂量是相似的(Love等人，新英格兰医学杂志326852-856(1992)；Black等人，临床研究杂志9363-69(1994)；Yang等人，内分泌学1372075-2084(1996))。所观察到的骨保护活性并不局限于腰部脊椎，因为当对胫骨的BMD进行评估时也获得了类似的结果(图3B)。具体地，使用同一实验方法，结果显示GW 5638对保持全骨质量是有效的，对小梁隔室的效果非常显著。这是很有趣的，因为雌激素已早被示明对这一隔室骨的更新有调控作用(Gallagher等人，内分泌学1332787-2791(1993))。总而言之，这些数据表明GW 5638作为一种缺乏经典的ER激动剂活性的化合物，当被在体外化验时，在骨中充当一有效的ER激动剂。
已发明在骨中充当ER激动剂的化合物，如雌二醇，tamoxifen及raloxifene，也可以抑制与卵巢切除相关联的血清胆固醇的增加(Love等人，Ann.Intern.Med.115860-864(1991)；Black等人，临床研究杂志9363-69(1994))。这一观察引出一个建议，即ER发挥其活性的机制在骨及心血管系统中是非常类似的。虽然还未清楚所观察到的血清胆固醇水平的抑制是否足以解释为什么接受雌激素替代治疗的更年期妇女死于心血管疾病的几率降低，但这却被接受为雌激素在心血管系统中起作用的一个标记。为了论述这一观点，对用雌二醇或GW5638治疗28天的经卵巢切除的大鼠的全血清胆固醇水平进行了测定。示于图4中的结果显示，即使在被测试的最低浓度，GW 5638降低血清胆固醇水平的效率与雌二醇一样。
实施例3GW 5638是一种具有子宫保护功能的ER调控剂为了扩展对GW 5638组织特异性的检验，对这一化合物的营养子宫活性进行了综合分析。在初始的实验系列中，对GW 5638及tamoxifen在21天龄的未成熟大鼠的子宫中的活性进行了比较。在这一化验中，把子宫湿重当成在这一组织中的ER激动剂活性的一个度量(图5)。当作为单一药剂被口服时，GW 5638与对照相比并不显示出任何显著的活性。值得特别注意的是，这一化合物在这一化验中，当剂量为10μm/kg/d时(这一剂量是骨保护所需剂量的3倍)，不具有活性(图3)。相反，tamoxifen在剂量小至0.1μmol/kg/d时仍表现出营养子宫活性。对这些研究进行扩展以示明GW 5638，而不是tamoxifen，可以抑制雌二醇在这些大鼠中的激动剂活性，从而确证了在该测定条件，该化合物在这一组织中是一纯粹的拮抗剂。
在第二系列的实验中，用GW 5638或雌二醇对90天龄的经卵巢切除(OVX)大鼠进行28天的治疗，然后营养子宫活性进行评估。显示图6A中的结果显示，在剂量高达骨保护所需量的三倍时，GW 5638的营养子宫活性仍是微乎其微。然而，重要的是，经过GW 5638治疗的OVX大鼠的体重与经拟手术的大鼠的体重并没有显著区别。OVX大鼠的子宫湿重有非常小的不依赖于剂量的增加。这与别人已报导的经raloxifene治疗的大鼠的情形是相似的，在该种情形中，活性是因为水被抑制的程度增加了而造成的(Kedar等人，柳叶刀3431318-1321(1994)；Love等人，Ann.Intern.Med.115860-864(1991)；Black等人，临床医学杂志9363-69(1994))。
除了测量大鼠的子宫湿重外，还对取自那些动物的子宫进行组织学检查(图7A-7F(低放大倍数)以及图8A-8D(高放大倍数))。在这一分析中，经GW 5638治疗的大鼠的子宫上皮细胞表现出与剂量相关的营养不良症状，而基质(stroma)则在胞间结缔组织及基质中有边界性的增加。在GW 5638的最大剂量(比骨保护所需的高3倍)，所观察到的表皮营养不良症状与经雌二醇治疗的大鼠的子宫中的相当，而基质反应及嗜曙红细胞浸润则比在经雌二醇治疗的大鼠中所观察到的少(比较图8C及8D)。总之，这些数据表明GW 5638在子宫中具有边界ER激动剂的活性，而在骨中则具有ER激动剂的活性。因此，GW5638是一种独特的ER调控剂，它以组织选择性的方式表现其ER激动剂及拮抗剂活性。
实施例4抗雌激素治疗对接种于裸鼠中的乳腺癌肿瘤的影响这一研究是用来源于MCF-7乳腺癌细胞系的肿瘤细胞进行的。这一细胞系是雌激素及黄体酮受体阳性的，它依赖于激素并对抗激素敏感。把肿瘤细胞接种在经卵巢切除的麻醉的BALB/c Urd nunu小鼠的肋腹处。经小鼠补充缓释的雌激素药丸。如下所示，每天给小鼠进行皮下注射第一组对照(玉米油)第二组0.3mg GW 5638第三组0.6mg GW 5638第四组1.0mg GW 5638第五组1.0mg tamoxifen用卡钳测量肿瘤的两个尺寸，其中肿瘤面积＝1/2×w/2×π。结果示于图9中。
实施例5剂量反应研究这一研究的目的是对GW 5638及tamoxifen抑制在裸鼠中的MCF-7乳腺癌肿瘤生长的最大有效剂量进行比较。
给10只OVX供体小鼠注射五百万个MCF-7细胞。把所得的肿瘤移植到受体小鼠中。给所有的小鼠都施用缓释的雌二醇药丸。
当实验用鼠的肿瘤已经可以测量时，开始按下列所示每日皮下注射0.1ml的药剂第一组对照(玉米油)第二组0.3mg GW 5638第三组0.6mg GW 5638第四组1.0mg GW 5638第五组1.0mg tamoxifen每日用卡钳测量肿瘤并如下计数肿瘤面积面积＝1/2×w/2×π八周后对各组的肿瘤生长情况进行比较。与对照相比较，所有治疗组的肿瘤生长都受到抑制(具统计显著性)。GW 5638的前两个大剂量(0.6mg及1.0mg)与1.0mg的tamoxifen的效果是无法区分的(如图10所示)。
实施例6LCC2研究MCF-7/LCC2是一种(来源于癌症中心)细胞系，它虽对雌激素敏感，但对其却不具依赖性，而且它对tamoxifen具抗性。这一实验是用以确定相对于对照及经tamoxifen治疗的肿瘤而言，GW 5638对这一细胞系于裸鼠中生长的阻滞能力。
准备40只用以接受细胞的OVX小鼠并进行如下分组第一组对照第二组雌激素药丸第三组1.0mg tamoxifen第四组1.0mg 化合物GW 5638对照组小鼠不施用任何处理，第三及第四组每三天注射用玉米油制备的0.1mg的药剂。肿瘤每三天用卡钳测量一次，并如下计算其面积面积＝1/2×w/2×π八周后对各组的肿瘤生长情况进行比较。与所期望的相反的是，肿瘤对雌激素并没有反应。另外，虽然肿瘤被预测对tamoxifen具抗性，但它实际上却对tamoxifen敏感。Tamoxifen和GW 5638可以同样有效地抑制肿瘤的生长(看图11)。
实施例7GW 7604在MCF-7乳腺癌细胞中充当抗雌激素作用用0.9μg/ml人类ER表达载体，2μg/ml C3-Luc报告质粒以及0.1μg/ml pRSV-β-半乳糖酶表达载体(充当转染效率的内部对照)对人类乳腺癌MCF-7细胞进行瞬时共转染。转染时，把细胞在有17-β-雌二醇以及如标示的浓度逐渐升高的各种拮抗剂存在的情况下温育48小时，然后测定经转染细胞的荧光素酶及β-半乳糖酶的活性。把每一点的荧光素酶(×104U)除以β-半乳糖酶活性[(A415×105)/分钟]以计算标准化的荧光素酶活性。参照图12，本实验中的每个数据点代表的是在所给定的条件下经过三次重复确定的转染活性的平均值。每一激素浓度偏差的平均常数都小于10％。
实施例8对ER特异性突变对抗雌激素的药理学特征的影响的分析揭露了另外的机制的复杂性用0.9μg/ml的表达人类ER(pRST7ER)(看图13A)或ER突变体(ER-TAF1)(看图13B，该突变体的AF-2活性已被除去)的载体以及2μg/ml的融合到荧光素酶基因上的雌激素应答性补体3(C3)启动子，以及0.1μg/ml pRSV-β-半乳糖酶表达载体(充当转染效率的内部对照)对人类肝细胞癌HepG2细胞进行瞬时转染。转染时，把细胞在仅有溶剂或者如所标示的浓度逐渐升高的雌二醇或抗雌激素存在的情况下温育48小时，然后测定经转染细胞的荧光素酶及β-半乳糖酶的活性。本实验中的每个数据点代表的是在所给定的条件下经过三重确定的转染活性的平均值。每一激素浓度偏差的平均常数都小于10％。示于图13A及图13B的数据显示大部分已知的抗雌激素对突变的雌激素受体具有激动剂活性。GW 7604对到目前为目已经检验的任何ER突变体都不具激动剂活性，这一事实表明这一化合物对用tamoxifen难以治疗的乳腺肿瘤的治疗是有用的。
实施例9对各种不同的抗雌激素对ERα及ERβ转染活性的抑制能力的比较分析用ERα表达载体(看图14A)或ERβ表达载体(看图14B)以及一雌激素应答性的ERE-TK-荧光素酶报告构建体(construct)一起对HeLa细胞进行转染。然后，对不同浓度的激动剂对由雌二醇(10-9)激活的转染的抑制能力进行评估。示于图14A及14B中的结果显示除了idoxifene以外，所有的抗雌激素对ERα都具有相当的活性，而对于ERβ，raloxifene及idoxifene都不具有强有力的拮抗剂活性。另外，这些数据显示GW 7604对人类雌激素受体的两种类型都具有强有力的全能拮抗剂活性。
实施例10在用激动剂或拮抗剂进行治疗后对ER在靶细胞中的表达进行Western印迹分析把所选细胞系在所示的溶剂或10nM雌二醇或抗雌激素存在的下温育48小时。制备核提取物并用变性PAGE对样品进行分离，然后把样品转移到尼龙膜上，用ER特异性的单克隆抗体H222进行Western免疫印迹以评估经过这些处理以后ER的相对表达。图15A示出了MCF-7细胞内源性的核ER的含量(10μg/泳道)。图15B示出了Ishikawa细胞中内源性核ER的含量(100μg/泳道)。图15C与经0.9μg/ml ER(pRST7ER)瞬时转染的Ishikawa细胞有关，检测所用的核提取物为10μg/泳道。用免疫印迹光密度测定法对ER的水平进行量化。示于图15A-15C中的结果是在同一条件下进行的多次实验的代表实验。
实施例11在经过短期激动剂或拮抗剂处理以后对ER在MCF-7细胞中的内源性表达进行Western印迹分析在所示的溶剂或10nM雌二醇或抗雌激素存在的情况下，对人类乳腺癌MCF-7细胞进行1小时(图16A)或4小时(图16B)的诱导。制备核提取物并用变性PAGE对样品进行分离，然后把样品转移到尼龙膜上，用ER特异性的单克隆抗体H222进行Western印迹以评估经过这些处理以后ER的相对表达。用免疫印迹光密度测定法对ER的水平进行量化。示于图16A及16B中的结果是在同一条件下进行的多次实验的代表实验。
实施例12在经过短期激动剂或拮抗剂处理以后对ER在Ishikawa细胞(培养的子宫细胞)中的内源性表达进行Western印迹分析在所示的溶剂或10nM雌二醇或抗雌激素存在的情况下，对人类子宫内膜腺癌Ishikawa细胞进行1小时(图17A)或4小时(图17B)的温育。制备核提取物并用变性PAGE对样品进行分离，然后把样品转移到尼龙膜上，用ER特异性的单克隆抗体H222进行Western印迹以评估经过这些处理以后ER的相对表达。用免疫印迹光密度测定法对ER的水平进行量化。示于图17A及17B中的结果是在同一条件下进行的多次实验的代表实验。
实施例13在经过短期激动剂或拮抗剂处理以后对ER在Ishikawa细胞的全细胞、核以及细胞质中的内源性表达进行Western印迹分析在有溶剂或10nM雌二醇或抗雌激素存在的情况下，对人类子宫内膜腺癌Ishikawa细胞进行1小时的诱导。制备全细胞(图18A)，核(图18B)以及细胞质(图18C)提取物并用变性PAGE对样品进行分离，然后把样品转移到尼龙膜上，用ER特异性的单克隆抗体H222进行Western印迹以评估经过这些处理以后ER的相对表达。用免疫印迹光密度测定法对ER的水平进行量化。示于图18A-18C中的结果是在同一条件下进行的多次实验的代表实验。
实施例14GW 7604抑制由E2激活的MCF-7细胞的增殖目的确定GW 5638在体内对由雌激素激活的MCF-7乳腺癌细胞的增殖的抑制能力。
实验设计在24孔平板的每一孔中接种25,000～50,000个细胞。把细胞接种在无酚红的介质中。细胞附着后，用单一的抗雌激素或雌激素及抗雌激素对细胞进行激活。诱导时间根据实验介于12-48小时之间。
在每一孔中加入4λ(4μCi)胸腺嘧啶脱氧核苷，[甲基-3H]-。
在37℃温育2-4小时。
吸去培养基并用冰冷的PBS洗两次。
用冰冷的10％TCA(三氯乙酸)洗一次。
在每孔中加入2ml 10％TCA。
在4℃温育1-2小时。
用TCA洗一次。
加入1ml 0.2N的NaOH。
把每孔样品转移到含有2ml闪烁液的闪烁管中。
振荡并对[3H]进行计数。
结果将显示不同的化合物对MCF-7细胞由雌激素诱导的和基本细胞增殖的抑制能力(看图19A-19C)。
* * *上面所引用的所有文献作为参照被全部结合于本文中。
本工艺的熟练人士阅读本发明以后即可理解可以对本发明的形式和细节进行各种不同的改变而不致脱离本发明的真正范围。表1
权利要求
1.一种预防或治疗在哺乳动物中雌激素激活癌症的方法，包括给所述哺乳动物施用一种一定量的如下结构式I的化合物
其中R1是-(CH2)nCR5＝CR6R7，-(CH2)mC(X)NR8R9；或
R2及R3分别可以是H，-CH3，-OH，-OCH3，-OCH2CH3或-CH(CH3)2；R4是-CN，-NO2，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2-Y或-Y；R5及R6分别可以是H，-C1-4烷基，-C2-4链烯基，-C2-4链炔基，-X-C1-3烷基，-X-C2-4链烯基，-X-C2-4链炔基或-Y；R7是-CN，-C1-4烷基-OH，-C(O)NR10R11，-C(O)NR12R13，-C1-4烷基-NR10R11，-C(O)R12，-C(O)OR12，-C(O)NR12OR13，-C(O)NHC(O)R12、-C(O)NHCH2R12、-C(NH2)(NOR12)、-S(O)R12、-S(O)(O)(OR12)、-S(O)(O)(NHCO2R12)、PO3R12、-P(O)(NR12R13)(NR12R13)、-P(O)(NR12R13)(OR14)、-CONR12(CH2)qOCH3、-CONR12(CH2)qNR9R9噁二唑，被甲基替换；R8及R9分别可以是H、-C1-7烷基、-C3-7环烷基、-O-C1-7烷基、-C1-7烷基-Y或苯基；R10及R11分别可以是甲基或乙基或两者通过其氮原子相结合形成吗啉代基团；R12，R13及R14分别可以是H、-C1-12烷基、-C2-12链烯基、-C2-12链炔基、-O-C1-12烷基、-O-C2-12链烯基、-C3-7环烯基、-C3-7环烯基线性及环杂烷基、芳基、杂芳基或-Y；X是氧或硫；Y是卤素；n是整数0、1或2的其中之一；m是整数1或2；p是整数1至4的其中之一；以及q是整数1-12的其中之一，或者其在药理学上可被接受的盐，它们应足以实现上述的预防或治疗，其中上述的癌症对除上述的结构式I化合物以外的一种雌激素受体调控剂具抗性。
2.如权利要求1中所述的方法，其中所述的癌症是乳腺癌、子宫癌、卵巢癌或结肠癌。
3.如权利要求2中所述的方法，其中所述的癌症是乳腺癌。
4.如权利要求1中所述的方法，其中所述的癌症对tamoxifene，idoxifene，raloxifene或ICI 182，780具抗性。
5.如权利要求1中所述的方法，其中所述的癌症原初存在(denovo)对上述的雌激素受体调控剂具抗性。
6.如权利要求1中所述的方法，其中所述的对上述雌激素受体调控剂的抗性是获得性的。
7.如权利要求1中所述的方法，其中所述的化合物是GW 5638或GW 7604。
8.如权利要求1中所述的方法，进而包括给上述哺乳动物施用有效剂量的下列的至少一种化合物抗雌激素，视黄酸配体或视黄酸X受体(retinoxic X receptor)，抗黄体酮(antiprogestin)，抗雄激素(antiandrogen)，维生素D或其代谢物，法呢基转移酶的抑制剂，PPARα或γ激动剂以及MAP激酶的抑制剂。
9.如权利要求1中所述的方法，其中所述的方法是一种治疗方法。
10.一种预防或治疗哺乳动物良性增生性失调症的方法，包括给上述哺乳动物施用结构式I化合物
其中R1是-(CH2)nCR5＝CR6R7，-(CH2)mC(X)NR8R9；或
R2及R3分别可以是H，CH3，-OH，-OCH3，-OCH2CH3或-CH(CH3)2；R4是-CN，-NO2，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2-Y或-Y；R5及R6分别可以是H，-C1-4烷基，-C2-4链烯基，-C2-4链炔基，-X-C1-3烷基，-X-C2-4链烯基，-X-C2-4链炔基或-Y；R7是-CN，-C1-4烷基-OH，-C(O)NR10R11，-C(O)NR12R13，-C1-4烷基-NR10R11，-C(O)R12，-C(O)OR12，-C(O)NR12OR13，-C(O)NHC(O)R12、-C(O)NHCH2R12、-C(NH2)(NOR12)、-S(O)R12、-S(O)(O)(OR12)、-S(O)(O)(NHCO2R12)、PO3R12、-P(O)(NR12R13)(NR12R13)、-P(O)(NR12R13)(OR14)、-CONR12(CH2)qOCH3、-CONR12(CH2)qNR9R9噁二唑，被甲基替代；R8及R9分别可以是H、-C1-7烷基、-C3-7环烷基、-O-C1-7烷基、-C1-7烷基-Y或苯基；R10及R11分别可以是甲基或乙基或两者通过其氮原子相结合形成吗啉代基团；R12，R13及R14分别可以是H、 -C1-12烷基、-C2-12链烯基、-C2-12链炔基、-O-C1-12烷基、-O-C2-12链烯基、-C3-7环烯基、-C3-7环烯基线性及环杂烷基、芳基、杂芳基或-Y；X是氧或硫；Y是卤素；n是整数0、1或2的其中之一；m是整数1或2；p是整数1至4的其中之一；以及q是整数1-12的其中之一，或者其在药理学上可被接受的盐，它们应足以实现上述的预防或治疗。
11.如权利要求10中所述的方法，其中所述的失调症是子宫内膜异位或子宫纤维瘤。
12.如权利要求10中所述的方法，其中所述的方法是一种治疗方法。
13.如权利要求10中所述的方法，其中所述的化合物是GW 5638或GW 7604。
14.一种预防或治疗哺乳动物阿尔茨海默病、黄斑变性、尿失禁或II型糖尿病的方法，包括给上述哺乳动物施用结构式I化合物
其中R1是-(CH2)nCR5＝CR6R7，-(CH2)mC(X)NR8R9；或
R2及R3分别可以是H，CH3，-OH，-OCH3，-OCH2CH3或-CH(CH3)2；R4是-CN，-NO2，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2-Y或-Y；R5及R6分别可以是H，-C1-4烷基，-C2-4链烯基，-C2-4链炔基，-X-C1-3烷基，-X-C2-4链烯基，-X-C2-4链炔基或-Y；R7是-CN，-C1-4烷基-OH，-C(O)NR10R11，-C(O)NR12R13，-C1-4烷基-NR10R11，-C(O)R12，-C(O)OR12，-C(O)NR12OR13，-C(O)NHC(O)R12、-C(O)NHCH2R12、-C(NH2)(NOR12)、-S(O)R12、-S(O)(O)(OR12)、-S(O)(O)(NHCO2R12)、PO3R12、-P(O)(NR12R13)(NR12R13)、-P(O)(NR12R13)(OR14)、-CONR12(CH2)qOCH3、-CONR12(CH2)qNR9R9噁二唑，被甲基取代；R8及R9分别可以是H、-C1-7烷基、-C3-7环烷基、-O-C1-7烷基、-C1-7烷基-Y或苯基；R10及R11分别可以是甲基或乙基或两者通过其氮原子相结合形成吗啉代基团；R12，R13及R14分别可以是H、-C1-12烷基、-C2-12链烯基、-C2-12链炔基、-O-C1-12烷基、-O-C2-12链烯基、-C3-7环烯基、-C3-7环烯基线性及环杂烷基、芳基、杂芳基或-Y；X是氧或硫；Y是卤素；n是整数0、1或2的其中之一；m是整数1或2；p是整数1至4的其中之一；以及q是整数1-12的其中之一，或者其在药理学上可被接受的盐，它们的剂量应足以实现上述的预防。
15.如权利要求14中所述的方法，其中所述的方法是一种治疗方法。
16.如权利要求14中所述的方法，其中所述的化合物是GW 5638或GW 7604。
17.一种防止雌性哺乳动物怀孕的方法，包括给上述哺乳动物施用结构式I化合物
其中R1是-(CH2)nCR5＝CR6R7，-(CH2)mC(X)NR8R9；或
R2及R3分别可以是H，-CH3，-OH，-OCH3，-OCH2CH3或-CH(CH3)2；R4是-CN，-NO2，-CH3，-CH2CH3，-CH2CH2-Y或-Y；R5及R6分别可以是H，-C1-4烷基，-C2-4链烯基，-C2-4链炔基，-X-C1-3烷基，-X-C2-4链烯基，-X-C2-4链炔基或-Y；R7是-CN，-C1-4烷基-OH，-C(O)NR10R11，-C(O)NR12R13，-C1-4烷基-NR10R11，-C(O)R12，-C(O)OR12，-C(O)NR12OR13，-C(O)NHC(O)R12、-C(O)NHCH2R12、-C(NH2)(NOR12)、-S(O)R12、-S(O)(O)(OR12)、-S(O)(O)(NHCO2R12)、PO3R12、-P(O)(NR12R13)(NR12R13)、-P(O)(NR12R13)(OR14)、-CONR12(CH2)qOCH3、-CONR12(CH2)qNR9R9噁二唑，被甲基取代；R8及R9分别可以是H、-C1-7烷基、-C3-7环烷基、-O-C1-7烷基、-C1-7烷基-Y或苯基；R10及R11分别可以是甲基或乙基或两者通过其氮原子相结合形成吗啉代基团；R12，R13及R14分别可以是H、-C1-12烷基、-C2-12链烯基、-C2-12链炔基、-O-C1-12烷基、-O-C2-12链烯基、-C3-7环烯基、-C3-7环烯基线性及环杂烷基、芳基、杂芳基或-Y；X是氧或硫；Y是卤素；n是整数0、1或2的其中之一；m是整数1或2；p是整数1至4的其中之一；以及q是整数1-12的其中之一，或者其在药理学上可被接受的盐，它们的剂量应足以实现上述的预防。
18.如权利要求17中所述的方法，其中所述的化合物为GW 5638或GW 7604。
全文摘要
总体上,本发明涉及的是雌激素依赖性疾病及失调的治疗,具体地,涉及的是一种用抗雌激素治疗雌激素依赖性癌症,特别是乳腺癌的方法。
文档编号A61K31/565GK1275911SQ98810214
公开日2000年12月6日 申请日期1998年8月14日 优先权日1997年8月15日
发明者D·P·麦东尼尔, J·诺里斯, C·康诺尔, A·维雅拉特尼 申请人:杜克大学