专利名称：呼吸合胞病毒的吸附(g)蛋白衍生的肽的制作方法
相关申请本申请要求1997年9月19日美国临时申请60/059,684与1998年5月8日美国临时申请60/084,863的权利，以上两申请的内容在此作为参考。
RSV含两种主要的外包膜糖蛋白，融合(F)蛋白与吸附(G)蛋白，它们对病毒的感染性具有重要意义，因此当然地成为设计RSV亚单位疫苗所针对的目标。已知，基于F蛋白的疫苗所产生的RSV中和抗体会因包含G蛋白而显著增加(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。但是，在试图理解FI-RSV诱导病情加重的分子基础时已经发现，天然RSV吸附(G)蛋白足以引发非典型性肺炎，其特征是肺嗜酸粒细胞增多伴TH2细胞因子白介素-5(IL-5)产生水平升高(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。实际上，体内去除IL-5显著降低了G蛋白免疫后被RSV攻击的小鼠支气管肺泡的灌洗液细胞中的嗜酸粒细胞应答。对G蛋白的应答被认为是将G蛋白特异性CD4+T细胞系转移到幼稚受体小鼠内而由T细胞介导的，造成在随后受攻击时发生非典型性肺炎(Alwan等，J.Exp.Med.17981-89(1994))。
体内去除CD4+细胞使接种了肽19结合物的小鼠不发生肺嗜酸粒细胞增多，而去除CD8+特异性细胞则几乎没有作用(图8)。以上信息表明，在对活RSV攻击的应答中，RSV G蛋白的肽19与CD4+T细胞介导的肺嗜酸粒细胞增多有关联，说明是肽19特异性CD4+T细胞引起了肺嗜酸粒细胞增多。在对43名人供血者的外周血细胞的分析中，6人对RSV G蛋白有应答，3人对肽19有应答(图7)。该信息提示，肽19可能参与了支气管炎、特异反应和哮喘的发病过程，这些疾病有时会在血清阴性婴儿受RSV感染后见到(Welliver和Welliver，Pediatrics inReview 14134-139(1993))。
所以，本发明涉及改变了的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。在一个具体的实施例中，被加重的病情是非典型性肺炎，具体是肺嗜酸粒细胞增多。在实施例之一中，所述的改变位于RSV G蛋白的氨基酸184-198区域内。另一实施例中，改变的结果是，与野生型G蛋白相比，改变后的G蛋白或多肽抑制IL-5分泌的引发。
本发明还涉及编码被改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改变的蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。实施例之一中，所述改变位于RSV G蛋白的氨基酸184-198区域内。
本发明还包括包含所述核酸分子与调控序列操作性连接的DNA结构。一具体实施例中，本发明涉及一种嵌合DNA结构，它包含(a)编码被改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改变的蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情；(b)编码完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的核酸分子；和(c)与F蛋白和改变的G蛋白操作性连接的调控序列。
本发明还涉及包含本发明DNA结构的重组宿主细胞，以及生产改变的RSVG蛋白或多肽的方法，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，所述的方法包括将本发明的重组宿主细胞维持在适合表达改变的G蛋白或多肽的条件下。
本发明还涉及生产包含改变后RSV G蛋白或多肽，以及完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的嵌合多肽的方法，所述改变的RSV G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
本发明还涉及改变的G蛋白或多肽，或表达所述蛋白或多肽的重组宿主细胞的用途，即用于制药，例如疫苗。
本发明还进一步涉及包含生理学上认可的介质与改变的RSV G蛋白或多肽的免疫原性组合物，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。一具体实施例中，与包含野生型G蛋白的免疫原性组合物相比，上述免疫原性组合物抑制IL-5分泌的引发。实施例之一中，所述的改变位于RSV G蛋白的氨基酸184-198区域内。免疫原性组合物还可以包含完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分。
本发明还涉及包含免疫有效量改变的RSV G蛋白或多肽的疫苗组合物，所述的蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。实施例之一中，所述的改变位于RSV G蛋白的氨基酸184-198区域内。疫苗组合物还可以包含完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分。具体实施例中，疫苗组合物还包含佐剂。
本发明还进一步涉及在脊椎动物接种并随后感染RSV后抑制病情加重的方法，包括给予改变的RSV G蛋白或多肽，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
本发明还涉及包含生理学上认可的载体和有效量编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的疫苗，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。实施例之一中，所述疫苗还包含转染促进剂。
本发明还涉及在脊椎动物体内诱导免疫应答的方法，包括给所述脊椎动物以诱导免疫应答有效量的编码改变的RSV G蛋白或多肽的DNA，可以同时给予转染促进剂，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
本发明还涉及对脊椎动物进行抗RSV免疫的方法，包括给予脊椎动物包含免疫有效量的改变的RSV G蛋白或多肽的组合物，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
本发明还涉及对脊椎动物进行抗RSV免疫的方法，包括给予脊椎动物包含免疫有效量的编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的组合物，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，可在加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物后提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
实施例之一中，组合物还包含免疫有效量的完整RSV F蛋白或其免疫原性部分，或免疫有效量的编码完整RSV F蛋白或其免疫原性部分的核酸分子。另一实施例中，脊椎动物是RSV血清阴性的人。
图2是合成肽列表(SEQ ID NO.1-31)，对应于RSV G蛋白的重叠区。GenosysBiotechnologies Inc.(The Woodlands，TX)合成了一系列重叠肽。这些肽跨RSV A2G蛋白的氨基酸48(对应于G蛋白的第二翻译起始密码子)至294区域。用质谱法测定肽的纯度。将冷冻干燥的肽溶解在无菌水中，浓度为2mg/ml，保存于-20℃。
图3是反映用G蛋白衍生肽刺激G蛋白初次免疫后BALB/c小鼠脾细胞的柱状图。在第0和4周，给BALB/c小鼠接种1μgG蛋白和StimulonTMQS-21佐剂。二次接种两周后，取5只小鼠分离出脾细胞，汇集后在抗原存在下培养4天。给予50μg/ml的每种合成肽。给予0.5和2.5μg/ml的天然G蛋白。伴刀豆球蛋白A(Con A)刺激脾细胞得到的平均cpm为94,746+8005。作为对照，只用介质(Med)或CRM197(CRM)刺激培养物。给出的数据是一式三格的平均值(±SD)。该实验代表着5次独立的实验，每次都显示质量上相似的结果。
图4A和4B是显示培养物上清液中肽诱导细胞因子(IFN-γ和IL-5)分析的柱状图。和图3一样，将接种了天然G蛋白和StimulonTMQS-21佐剂的BALB/c小鼠脾细胞与肽抗原一起培养。4天后，从一式三格中取100μl上清液汇合，然后用抗原捕捉ELISA分析IFN-γ(图4A)和IL-5(图4B)。给出的数据是两次细胞因子分析的平均OD490。
图5是肽19在BALB/c小鼠内特异性诱导肺嗜酸粒细胞增多的柱状图。接种了G蛋白或19-KLH的小鼠与接受PBS或KLH的对照小鼠相比，有明显的差异(*)。给出的数据代表了结果相似的三次实验。
图6是鉴定肽19内促进嗜酸粒细胞增多应答的T细胞表位的柱状图。在第0和4周，给BALB/c小鼠(5只一组)肌内接种纯化天然RSV G蛋白1μg与20μgStimulonTMQS-21佐剂；250μg肽19-KLH；250μg肽22-KLH；250μg突变肽19-1-KLH或250μg突变肽19-2-KLH，或鼻内接种含106pfu的50μl活RSV。二次接种2周后，用活RSV攻击小鼠，7天后，定量分析BAL中的肺嗜酸粒细胞增多。给出的数据是BAL中嗜酸粒细胞的平均百分比(±标准偏差)。
图7是人PBMC对G蛋白衍生肽的增殖性应答柱状图。43名供血者中6人的PBMC对RSV G蛋白有应答，在合成肽19和22存在下培养这些PBMC进行增殖试验。各肽的浓度位50μg/ml。纯化G蛋白的浓度为3μg/ml。PHA刺激全部供血者PBMC的结果在22,945至55,619cpm之间。还单独以介质培养PBMC，并计算刺激指数。给出的是一式三份培养物得出的平均刺激指数。
图8是显示CD4 T细胞介导由RSV G蛋白和肽19-KHL诱导的嗜酸粒细胞增多应答的表格。在第0和4周，给BALB/c小鼠(5只一组)肌内接种纯化天然RSV G蛋白1μg与20μg StimulonTMQS-21佐剂；250μg含18μg肽19的KLH和StimulonTMQS-21佐剂，或鼻内接种含106pfu的50μl活RSV。为了去除T细胞亚型，在末次免疫后14天和20天后，腹腔内给予所示的单克隆抗体(或作为对照的大鼠Ig)，剂量分别为每鼠750μg和250μg。末次接种后21天，用活RSV攻击小鼠，7天后定量分析BAL中的嗜酸粒细胞。用抗CD4和抗CD8荧光抗体进行FACS分析。给出的数据是嗜酸粒细胞占BAL的平均百分比(±标准偏差)，和作为脾淋巴细胞总数的函数的CD4细胞比CD8细胞的百分比。与同样接种，接受大鼠Ig的对照小鼠相比，差异明显(**)。
详细说明RSV G蛋白显著加强F蛋白保护BALB/c小鼠抵抗攻击的能力(表)。这提示应将G蛋白加入RSV的亚单位疫苗。然而，G蛋白引发的肺嗜酸粒细胞增多持久而广泛，使其不适合用作疫苗。在对接种小鼠受攻击后进入BAL的白细胞进行的动力学定量分析中可以看出，在接种G蛋白的小鼠中，最大的细胞浸润(1.42×106个细胞)发生在第7天(
图1)。在接种G蛋白后10天的应答过程中，始终观察到嗜酸粒细胞，在第7天达到最大值，占白细胞总数的65％(图1B)。
本发明还涉及合成RSV G蛋白衍生的蛋白和/或多肽，它们不会在随后受RSV感染时刺激肺嗜酸粒细胞增多。具体地说，在此所述的工作涉及制备包含改变的G蛋白或多肽的组合物和方法，所述的蛋白或多肽可作为免疫原用于疫苗制剂，包括多价疫苗，并可用于主动免疫。这一策略包括改变G蛋白序列特定区域内的一个或多个氨基酸，形成衍生自RSV G蛋白，具有免疫原性但不会引发非典型性肺炎(例如肺嗜酸粒细胞增多)或任何形式RSV疾病加重的蛋白或多肽。
野生型(天然)RSV G蛋白的核苷酸和氨基酸序列在本领域是已知的(Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 924075-4079(1985)；Satake等，Nucl.Acids.Res.13(21)7795-7810(1985))。在此，“改变”或类似的表达表示不同于野生型序列的氨基酸序列，以及编码的氨基酸序列不同于野生型氨基酸序列的核苷酸序列。所述的改变包括一个或多个核苷酸或氨基酸的插入，缺失和/或取代。
例如，改变可以是一个或多个核苷酸的插入或缺失，造成移码突变；至少一个核苷酸改变，造成一个或多个所编码氨基酸改变；至少一个核苷酸改变，形成一个提前终止密码子；数个核苷酸缺失，造成核苷酸所编码的一个或多个氨基酸缺失；插入一个或多个核苷酸，造成基因编码序列中断；整个或部分基因复制；整个或部分基因转座；整个或部分基因重排。一个基因中可能存在一个以上上述突变。这样的序列改变造成基因所编码的G蛋白内的改变。例如，如果是移码突变，移码可能造成所编码的氨基酸内的改变，和/或形成一个提前终止密码子，产生截短的蛋白。
例如，所述改变最好保留天然G蛋白的三维构形。而且，可用本领域的已知技术鉴定出G蛋白功能尤其是免疫原性的必需氨基酸。具体地说，可用的方法包括保守氨基酸鉴定，定点诱变和丙氨酸扫描诱变(例如，Cunningham和Wells，Science 2441081-1085(1989))，结晶和核磁共振。可测试用这些方法产生的改变多肽的特定生物活性，包括免疫原性，降低肺嗜酸粒细胞增多的能力和抗原性。
具体地说，进行合适的氨基酸改变可以根据以下几个标准，包括疏水性、碱性或酸性特征、电荷、极性、大小、有否官能团(例如，-SH或糖基化位点)，和芳香性。根据以上特性，将各种氨基酸分类，对本领域技术人员来说是显而易见的；其他合适的氨基酸改变还可参见Bowie等(Sience 2471306-1310(1990))。
例如，参照氨基酸184-198区域，所述改变的形式可以是184-198区域(氨基酸序列AICKRIPNKKPGKKT；SEQ ID NO.19)内的保守性(例如，甘氨酸取代丙氨酸；缬氨酸取代异亮氨酸；天冬酰胺取代谷胺酰胺)定点诱变，这保留了G蛋白该区域在保护性免疫应答中的作用，但缺失或改变了参与刺激肺嗜酸粒细胞增多的表位(即，生物学等价体)。改变的形式还可以是非保守性突变(例如赖氨酸取代苏氨酸；丙氨酸取代脯氨酸)，降低或消除不良的嗜酸粒细胞增多刺激。改变的形式还可以是整个184-198区域或其部分的缺失，而继续应用RSV G蛋白的其余部分。为了获得最佳的翻译和/或免疫原性，可用接头区取代缺失，保留剩余G蛋白或多肽的空间特征。可用各种标准诱变剂或诱变方法进行改变，例如涉及噬菌体(例如M13)的定点诱变或用涉及合成寡核苷酸的聚合酶链反应(PCR)的技术。
所以，本发明涉及编码改变的RSV G蛋白或其部分的核苷酸序列，所述改变的G蛋白或其部分保留了免疫原性。在此，“改变的G蛋白”表示保留了免疫原性的G蛋白或其部分，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在随后受到RSV攻击时诱导疾病加重(例如非典型性肺炎，例如肺嗜酸粒细胞增多)。在一具体实施例中，改变的G蛋白具有氨基酸184-198区域内的改变。
虽然本发明就RSVG蛋白的氨基酸184-198区域进行了具体的描述，但在此描述的用于鉴定182-198区域方法也可以用于野生型G蛋白的其他区域，以鉴定出可改变的其他区域。例如，可分析位于在此所研究的氨基酸区域(48至198)上游(向氨基端)或下游(向羧基端)的区域，鉴定可进行有益改变的其他区域。或者，可用不同的重叠肽重新分析氨基酸48-294区域，鉴定可进行有益改变的其他区域。
本发明的核酸分子可以是例如mRNA的RNA或例如cDNA和基因组DNA的DNA。DNA分子可以是双链或单链的；单链RNA或DNA可以是编码链、有义链或非编码链、反义链。较好的是，核酸分子包含至少约14个核苷酸，至少约50个更好，至少约200个则还要好。所述的核苷酸序列可以只是编码改变的G蛋白氨基酸序列的至少一个片段；或者，核苷酸序列可包含改变的G蛋白氨基酸的至少一段的编码序列以及诸如内含子和3’和5’非编码序列(例如，包括调控序列)等非编码序列。此外，核苷酸序列可与标记序列融合，例如与协助多肽分离或纯化的多肽的编码序列融合。这类序列包括但不限于谷胱甘肽-S-转移酶(GST)和流感血凝素A标记肽的编码序列。
“核苷酸序列”包括化学合成或重组得到的核苷酸序列。这样，本发明包括载体包含的重组DNA。而且，核苷酸序列包括异源宿主细胞内的重组DNA，以及溶液中部分纯化或完全纯化的DNA。本发明的核苷酸序列还包括本发明DNA分子的体内和体外RNA转录产物。上述核酸序列可用于例如制造所编码的改变的G蛋白。
本发明还包括本发明核苷酸序列的各种变体，例如编码改变的G蛋白某些部分、其类似物或衍生物的核苷酸序列，只要所述的部分、类似物或衍生物包含改变的G蛋白。这类变异可以是核苷酸未改变部分的天然变异，例如等位变异，或是非天然变异，例如由各种诱变剂和诱变方法诱导的变异。需要的变异包括但不限于一个或多个核苷酸的增加、缺失和取代，造成保守性或非保守性氨基酸改变，包括氨基酸增加和缺失。
本发明还涉及上述核酸分子的片段。“片段”一词包括本文所述核苷酸序列的一部分，长度为至少14个连续核苷酸至至少50个连续核苷酸，条件是所述片段编码改变的G多肽；这样的片段可用作引物。特别好的引物和探针选择性地与本文编码改变的G蛋白的核酸分子杂交。例如，可用编码本文改变的G蛋白的抗原性部分的片段。
本发明还涉及在中等，更好的是高度严谨杂交条件(例如选择性杂交条件)下与本发明核苷酸序列杂交的核苷酸序列。合适的严谨性条件是本领域技术人员已知的，或者，可以参见标准教科书，例如Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley & Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6。
所以，本发明涉及与本发明改变的核苷酸序列基本相同的核苷酸序列；特别好的是与本发明核苷酸序列一致性至少为90％，更好的是一致性至少95％的核苷酸序列。此时，特别好的是所编码多肽的免疫原性与本发明改变的G蛋白基本相同的核苷酸序列。
本发明还涉及改变的RSV G蛋白或多肽。改变的G蛋白或多肽是这样的RSVG蛋白或其部分，它保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在脊椎动物随后受到RSV感染时引起疾病加重(例如，非典型性肺炎，例如肺嗜酸粒细胞增多)。在一具体实施例中，改变的G蛋白在氨基酸184-198区域内至少有一处改变。本发明改变的G蛋白可以是部分或完全纯化的(例如纯化至均一)，和/或基本没有其它蛋白。
改变的G蛋白或多肽还可以是融合蛋白，包含与其它组分融合的改变的G蛋白氨基酸序列的全部或部分。其它组分，例如放射性同位素和抗原性尾端，可选用来协助多肽的分离或纯化，或延长多肽的半衰期；例如，六组氨酸尾端允许采用简便的镍层析来纯化。或者，改变的G蛋白或多肽还可以是这样的融合蛋白，所含的全部或部分改变的G蛋白氨基酸序列与完整或部分RSV F蛋白氨基酸序列融合(Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci(USA)817683-7687(1984)；美国专利5,639,853；5,723,130)。
本发明还包括这样的改变的G蛋白和多肽，除了在接受改变的G蛋白或多肽的脊椎动物中不引起疾病加重所必需的改变之外，它还包含其它氨基酸改变。例如，本发明包括的氨基酸改变有，不会改变由于给予改变蛋白所致的疾病的特征的保守性氨基酸改变。本发明还包括与本发明改变的G蛋白或多肽的一致性至少约40％的多肽。但是，一致性更低的多肽也可以使用，尤其是，如果它们在蛋白的一个或多个特定结构域表现出高(例如至少40％)一致性时。例如，本发明包括免疫功能和受体结合活性等特定活性的必需结构域具有高度一致性的改变的多肽。本发明的多肽可以化学合成或重组得到。
为了确定两条多肽序列一致性百分比，可排列序列一获取最佳比较结果(例如，可在第一氨基酸序列内引入空隙)。然后比较对应氨基酸位置的氨基酸残基。当第一序列内某位置在第二序列对应位置被相同氨基酸残基占据时，则两分子在该位置是一致的。两序列的一致性百分比与序列间相同位置的数量有关(即，一致性％＝相同位置数/总位数×100)。
可通过数学计算确定两序列的一致性百分比。用于比较两序列的一个较好的非限定性数学算法实例是Karlin等的算法，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873-5877(1993)。该算法被用在NBLAST和XBLAST程序中，分值＝50，字长＝3，以获得与本发明多肽或蛋白分子具有所需一致性的氨基酸序列。为了进行加入空隙的排列以便比较，可用空隙BLAST，Altschul等，Nucleic Acids Res，253389-3402(1997)。在使用BLAST和空隙BLAST程序时，可使用相应程序(例如NBLAST和XBLAST)的默认参数。参见http//www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法另一个优选非限定性实例是Myers等的算法，CABIOS(1989)。该算法被用于ALIGN程序(2.0版)，该程序是GCG序列排列软件包的一部分。在使用ALIGN程序比较氨基酸序列时，可使用长度为12和4的空隙补偿。可用类似以上所述有或没有空隙的技术测定两序列的一致性百分比。在计算一致性百分比时，只计数精确匹配的数量。
本发明还提供表达载体，例如核酸结构，它含有编码改变的G蛋白或多肽的核酸序列，该序列与至少一段调控序列操作性连接。许多这类载体是可以买到的，其它合适的载体可由熟练技术人员方便地制得。“操作性连接”指核苷酸序列与调控序列的连接方式使得核酸序列能被表达；这包括直接物理连接和通过接头或中介序列连接。调控序列是本领域的已知技术，被选来产生改变的G蛋白或多肽。所以，“调控序列”包括启动子，增强子和其它表达调控元件，参见Goeddel，Gene Expression TechnologyMethods in Enzymology 185，Academic Press，SanDiego，CA(1990)。例如，可以使用天然调控序列或宿主细胞本身的调控序列。应该知道，可根据以下因素来设计表达载体，例如欲转化宿主细胞的选择，和/或欲表达蛋白的类型。
例如，可如此产生本发明改变的G蛋白或多肽将核酸分子或其部分连接到适合在原核细胞和/或真核细胞内表达的载体内(参见Broach等，ExperimentalManipulation of Gene Expression，编辑M.Inouye(Academic Press，1983)p.83；Molecular CloningA Laboratory Mannual，第2版，编辑Sambrook等(Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)第16和17章)。通常，表达结构含有一个或多个选择标记，包括但不限于编码二氢叶酸还原酶的基因和产生新霉素、四环素、氨卞青霉素、氯霉素、卡那霉素和链霉素抗性的基因。
表达结构可包含调控序列，它与编码改变的G蛋白或多肽的核酸分子操作性连接，还可以直接或通过聚核苷酸接头与编码完整或部分RSV F蛋白的核酸分子连接。上述表达结构的表达将产生包含改变的G蛋白或多肽与完整或部分F蛋白或多肽的嵌合体；如果结构中使用了聚核苷酸接头，F多肽和改变的G多肽将通过一个或多个氨基酸连接。制备和表达F/G嵌合体的一般方法可参见例如美国专利5,194,595(Wathen)，其中的说明内容在此作为参考。
本发明还提供了用所述载体转染的原核和真核宿主细胞。例如，可用本发明载体转染的细胞包括但不限于细菌细胞，例如大肠杆菌(例如大肠杆菌K12株)，链霉菌，假单胞菌，粘质沙雷氏菌和鼠伤寒沙门氏菌；昆虫细胞(杆状病毒)，包括嗜露覃菌；真菌细胞，例如酵母；植物细胞和动物细胞，例如胸腺细胞，中国仓鼠卵巢细胞(CHO)，HEp-2细胞，Vero细胞和COS细胞。
这样，编码本发明改变的G蛋白或多肽的核苷酸序列可用来通过微生物或真核细胞加工产生重组蛋白。将聚核苷酸序列连接到例如表达载体等基因结构内，转化或转染到真核(酵母，禽类，昆虫，植物或哺乳动物)或原核(细菌)宿主细胞内是用于产生其它常见蛋白的标准方法。病毒载体包括但不限于腺病毒和委内瑞拉马脑炎载体。此外，目前用牛痘病毒(VV)在哺乳动物细胞系中或传递到动物模型中表达各种RSV蛋白(Olmstead等，PNAS 837462-7466(1986)；Wertz等，J.Virol.634767-4776(1989))。与此类似，可用改变的RSV G蛋白的cDNA插入VV内胸腺嘧啶激酶基因形成的类似结构来合成改变的G蛋白或多肽。例如，可用Ball(Proc.Nalt，Acad.Sci.USA 83246-250(1986))或Olmstead等(Proc.Nalt，Acad.Sci.USA 837462-7466(1986))说明的方法从牛痘病毒载体表达改变的G蛋白或F蛋白/改变的G蛋白嵌合体。通过微生物方法或组织培养技术，可用类似的方法或其修改法制备本发明的重组蛋白。所以，本发明涉及用重组技术产生改变的G蛋白或多肽。
除体外产生本发明改变的G蛋白或多肽的上述宿主细胞之外，许多系统适合体内表达或传递改变的G蛋白和多肽。这些系统应用减毒病原例如细菌或病毒作为传递因子。这些减毒活病原中插入了异源核酸节段，节段的核酸序列编码所需的本发明改变的G蛋白或多肽。用这些系统，所需的改变的G蛋白或多肽是由减毒活细菌或病毒在脊椎动物体内表达的。
减毒活病原的例子包括但不限于减毒活细菌，例如美国专利4,837,151所述的沙门氏菌，它特别适合经口传递；和美国专利5,643,576所述的减毒活委内瑞拉马脑炎病毒，它特别适合鼻内或吸入传递。
可用多种方法从重组细胞培养物中分离或纯化(例如，纯化至均一)本发明的蛋白或多肽。这包括但不限于阴离子或阳离子交换层析，乙醇沉淀，亲合性层析和高效液相层析(HPLC)。使用的具体方法取决于多肽的性质和宿主细胞的选择；合适的方法对本领域熟练技术人员来说是显而易见的。
本发明还涉及结合改变的G蛋白或多肽的抗体。例如，多克隆抗体和单克隆抗体，包括非人的和人抗体，人源化抗体，嵌合抗体和它们的抗原结合性片段(Current Protocols in Immunology，John Wiley & Sons，N.Y.(1994)；EP申请173,494(Morrison)；国际专利申请WO86/01533(Neuberger)和美国专利5,225,539(Winters))，它们结合本发明改变的G蛋白。哺乳动物，例如小鼠、大鼠、仓鼠或家兔可用免疫原形式的改变的G蛋白进行免疫。使蛋白或肽具有免疫原性的技术包括与载体偶联或本领域已知的其他技术。蛋白或多肽可与佐剂一同给予。免疫进程可通过检测血浆或血清内抗体效价来监测。可以免疫原作为抗原用标准ELISA或其它免疫试验检测抗体水平。
免疫后，可获取抗肽的抗血清，并根据需要从中分离出多克隆抗体。也可以用本领域熟知的标准技术制备单克隆抗体(Kohler和Milstein，Nature 256495-497(1975)；Kozbar等，Immunology Today 472(1983)；和Cole等，MonoclonalAntibodies and CancerTherapy，Alan R.Liss，Inc.，pp.77-96(1985))。“抗体”在此包括抗体片段，例如Fab和F(ab)2。本文所述的抗体可通过本领域已知的方法用来抑制本文所述改变的G蛋白的活性，尤其是在体外或细胞提取物中。“抑制”在此指任何程度量或质上的减少，包括完全丧失。此外，可以使用连有标记例如放射性标记的抗体检测来自例如组织样品或细胞培养物的细胞内有否表达的蛋白，以及在免疫吸附方法例如ELISA中用于分离改变的G蛋白或多肽。可分析的组织样品包括人组织，例如已分化和未分化的细胞。例如肺、骨髓、胸腺、肾、肝、脑、胰、成纤维细胞和上皮细胞。
本发明还包括包含改变的G蛋白或多肽的药物组合物。例如，可将本发明改变的G蛋白或多肽或其前药与生理学上认可的介质一起配制成药物组合物(例如免疫原性组合物)。具体的生理学上认可的介质包括但不限于水、盐缓冲液、多元醇(例如甘油、丙二醇、液态聚乙二醇)和葡萄糖溶液。选定介质中活性成分的最佳浓度可凭经验根据熟知的方法来确定，这取决于最终所需的药剂。将外源肽引导到处理部位的方法包括但不限于透皮、肌内、腹腔内、静脉、皮下、经口和鼻内。其它合适的引入方法包括基因治疗、可重复加载(rechargeable)或可生物降解的装置、气雾剂和缓释聚合物装置。改变的G蛋白可与其它免疫原偶联后给予，其它免疫原包括完整或部分RSV F蛋白；改变的G蛋白或多肽可与其它免疫原分开、先后或同时给予。例如，改变的G蛋白或多肽可与完整或部分RSV F蛋白形成混合物一同给予。
改变的G蛋白或多肽(或混合物、其融合蛋白或嵌合体)可作为抗原用来在脊椎动物(例如哺乳动物宿主)中激发对抗原的免疫应答。例如，抗原可以是完整的改变的G蛋白或其免疫原性部分，或是改变的G蛋白或多肽与完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分的嵌合体。本文涉及包含改变的G蛋白或多肽的组合物，这包括包含改变的G蛋白或多肽以及完整或部分RSV F蛋白的组合物。
本发明的方法包括给予脊椎动物免疫有效量的疫苗组合物，所述的疫苗组合物包含改变的G蛋白或多肽与各种合适的佐剂所成的混合物。在此，“佐剂”指各种足以加强或改善对疫苗抗原的免疫应答的物质。在此，“免疫有效量”的疫苗组合物指适合激发免疫应答的剂量，具体剂量取决于待治疗脊椎动物的年龄、体重和医疗状况。熟练技术人员很容易确定合适的剂量。疫苗组合物可以包含在药学上或生理学上认可的载体中给予，所述载体例如生理盐水或多元醇例如甘油或丙二醇。
合适的佐剂包括植物油或其乳液，表面活性剂，例如十六烷基胺、氨基酸十八烷酯、十八烷基胺、溶血卵磷脂、溴二甲基二十八烷基铵、N，N-二十八烷基-N’-N’-二(2-羟基乙基-丙二胺)、甲氧基十六烷基甘油和复合多元醇；聚胺，例如吡喃，硫酸葡聚糖，聚IC，聚羧乙烯；肽，例如胞壁酰二肽，二甲基甘氨酸，tuftsin；免疫刺激复合物；乳油；矿物凝胶；铝化合物，例如氢氧化铝和磷酸铝；MPLTM(3-O-脱酰基单磷酸酯A，RIBI ImmunoChem Research Inc.，Hamilton，MT)；霍乱毒素的脱毒突变体和大肠杆菌热不稳定性毒素；裸DNA CpG基序；和StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)。本发明改变的G蛋白或多肽还可以加入脂质体或ISCOMS(免疫刺激复合物)，并可使用其它活性成分。本发明的抗原还可以与淋巴因子联合给予，所述淋巴因子包括但不限于IL-2，IL-3，IL-12，IL-15，IFN-γ和GM-CSF。
本发明的组合物和疫苗可通过各种途径给予人或动物，包括肠胃外，动脉内，皮内，透皮(例如用缓释聚和物)，肌内，腹腔内，静脉内，皮下，经口和鼻内。疫苗中所用改变的G蛋白的量取决于给予途径和脊椎动物对象的生理特征。本领域熟练技术人员应该能够调整和操纵所用剂量范围和传统载体抗原，以适合本发明的疫苗。本发明的疫苗是用来治疗未成年或成年脊椎动物的，尤其是人。
为了减弱或加强免疫应答，可将本发明改变的G蛋白或多肽与载体分子偶联。合适的载体蛋白包括细菌毒素，即，可安全给予哺乳动物且作为载体具有免疫效应的细菌毒素。例如百日咳，白喉，和破伤风类毒素和无毒突变蛋白(交叉反应性物质(CRM))，例如白喉类毒素的无毒变体，CRM197。包含至少一个T细胞表位的天然毒素或类毒素的片段也可作为抗原的载体。制备抗原与载体分子偶联物的方法是本领域熟知的，可参见例如Wong，Chemistry of ProteinConjugation(CRC Press Inc.，Ann Arbor，MI(1991))；Bernatowicz和Matsueda，Analytical Biochemistry 15595-102(1986)；Frisch等，Bioconjugate Chem.7180-186(1996)；和Boeckler等，J.Immunological Methods 1911-10(1996)。
此外，如果整个肽19区(氨基酸184-198)缺失，可在缺失区插其它生物(包括但不限于3型副流感病毒)的抗原的一个或多个表位，以形成二价疫苗。
本发明还涉及包含编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子和生理学上认可的载体的疫苗，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时提供保护，而不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。这样的疫苗在此称为核酸疫苗或DNA疫苗，可用于脊椎动物的基因免疫。
“基因免疫”在此指给脊椎动物特别是人接种抗病原特别是RSV的核酸疫苗，由此保护脊椎动物抵抗RSV。本文中的“核酸疫苗”或“DNA疫苗”是一种核酸结构，它包含编码多肽抗原，特别是本文所述改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子。所述的核酸结构还可以包含转录启动元件，增强元件，剪接信号，终止和聚腺甘酸化信号，以及其它核酸序列。
“抗RSV保护”在此指在脊椎动物中形成免疫应答，该免疫应答是保护性(部分或完全)的，能够抵抗RSV所致疾病的发生。受到抗RSV疾病保护的脊椎动物会感染RSV，但感染程度比没有免疫的动物低；也可能感染RSV，但不表现出疾病症状；或者可能感染RSV，但表现出的疾病症状比没有免疫的动物少。或者，受到抗RSV疾病保护的脊椎动物即使接触病毒也完全不受RSV感染。然而，无论如何，核酸疫苗不会在脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
核酸疫苗可用标准方法来制备。例如，可用已知方法将编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸(例如DNA)插入表达载体，形成核酸疫苗(参见，Maniatis等，Molecular Cloning，A Laboratory Mannual，2nd版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress(1989))。
用标准方法给脊椎动物接种核酸疫苗(即给予核酸疫苗)。给脊椎动物接种可通过皮下，静脉，腹腔内，透皮，肌内，局部，口服，直肠，鼻内，颊，阴道，吸入喷雾剂，或植入制剂储存体，其中包含常规无毒、生理学上认可的运载体或载体。或者，可用粒子加速仪(“基因枪”)给脊椎动物接种核酸疫苗。给予的形式(例如胶囊、片剂、溶液，乳液)部分取决于给予的途径。例如，就黏膜给予而言，可使用滴鼻液，吸入剂或栓剂。
核酸疫苗可与各种合适的佐剂联合给予。佐剂需足量给予，该量足以增强对核酸疫苗的应答。佐剂可在接种核酸疫苗之前给予(例如之前1天以上)；在接种核酸疫苗的同时给予(例如将佐剂与核酸疫苗混合，然后将混合物给予脊椎动物)；或在接种核酸疫苗后给予(例如之后1天以上)。佐剂还可以多次给予(例如，接种核酸疫苗前和接种核酸疫苗后)。在此，“联合”包括各种时间段，包括本文具体指明的时间和本文具体指明的时间段的组合，在此期间可给予佐剂以加强对核酸疫苗的免疫应答(例如，针对核酸疫苗所编码的抗原的抗体效价升高，或针对RSV的抗体效价升高)。佐剂与核酸疫苗可在大致相同的部位给予脊椎动物；例如，佐剂与核酸疫苗都在脊椎动物肢体上某标记部位给予。
在一具体实施例中，核酸结构与一转染促进剂共同给予。一优选实施例中，转染促进剂是二辛烷基甘氨酰精胺(DOGS)(PCT公开WO96/21356)。另一实施例中，转染促进剂是bupivicaine(美国专利5,593,972)。
本发明还提供了在脊椎动物体内诱导免疫应答的方法，包括给予脊椎动物诱导免疫应答有效量的本文所述免疫原性组合物，疫苗或核酸疫苗。一具体实施例中，所述的脊椎动物是血清阴性脊椎动物，例如血清阴性的人。本发明还提供免疫脊椎动物(例如RSV血清阴性的人)以抵抗RSV的方法，包括给予脊椎动物包含免疫有效量改变的RSVG蛋白或多肽的组合物，所述蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。或者，组合物包含编码免疫有效量改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。本发明还涉及免疫接种脊椎动物的方法，包括给予脊椎动物本文所述的疫苗或核酸疫苗。
总之，本文数据显示，再度刺激时，肽19(AICKRIPNKKPGKKT)(SEQ IDNO.19)刺激CD4+T细胞扩增，引起与嗜酸粒细胞诱导和募集相关的细胞因子IL-5的分泌，由此引发肺嗜酸粒细胞增多(Coffman等，Science 245308-310(1989))。
不想局限于理论，在此提出一个免疫引发模型，其中，一个或多个肽19内的Th细胞表位控制着随后的免疫应答的性质，导致向Th2表型的深度倾斜(skewing)。先前，改变肽序列已经证明T细胞受体(TCR)-MHC相互反应中的肽组分能够调整Th1和Th2表型之间免疫应答的性质(Pfieffer等，J.Exp.Med.1811569-1574(1995)；Murray等，Eur.J.Immunol.242337-2344(1994))。但是，仍有可能，肽19所含的15个氨基酸包含一个以上T细胞表位，各有不同的激发Th1或Th2应答的能力。支持这一假设的是，对肽19的序列分析显示，它具有3个潜在T细胞表位，都受限于MHC II类的I-Ed，它们相邻排列在关键的1，4，6和9位锚着残基处(分别是I，K或R，I和K)(肽19的氨基酸187，189和192)(Rammensee等，Immunogenetics 41178-228(1995))。根据通过生物化学分离MHC-结合肽或通过肽结合试验得到的已知配体，以上推定序列都符合II类结合(Rammensee等，Immunogenetics 41178-228(1995))。将肽19(AICKRIPNKKPGKKT)(SEQ ID NO.19)突变成能破坏这些潜在T细胞表位的MHC-结合锚着区的序列((AICGRGPNGKPGKKT)(突变体1；SEQ ID NO.32)或(AGCGRGPGGKPGKGT)(突变体2；SEQ ID NO.33)，则该肽完全丧失了使小鼠易发肺嗜酸粒细胞增多的能力(图6)。
本发明的数据确定了包含G蛋白氨基酸184-198的肽与肺嗜酸粒细胞增多易感性之间的关联。这样，对血清阴性群体来说，该结果赞成构建G蛋白氨基酸184-198区域内基因被改变的RSV疫苗。该疫苗不会使受体易发非典型性肺炎，但保留了抵抗RSV随后攻击的保护能力。HLA型与对肽19反应性的关联为该氨基酸序列在支气管炎，特异性反应或哮喘这些在血清阴性婴儿感染RSV后时有所见的疾病发作期的作用提供了更深刻的理解(Welliver和Welliver，Pediatrics inReview 14134-139(1993))。这样，对血清阴性群体来说，最好的RSV疫苗策略应包含这样的组分，它们不会引发免疫致病性结果，但可获得平衡的免疫应答，从而激发保护性的CD4+和CD8+细胞类型。图4A和4B中的数据确认了一系列激发IFN-γ分泌并具有以上作用的肽(即，肽10，14，16和18)。与此类似，该数据提示了一系列能够激发PBMC增殖并足以在没有肽19序列存在下提供抗RSV攻击保护的肽(例如，对供血者100来说，是肽2，4，9，15和29)。
以下实施例用于说明本发明而非限定本发明的范围。本文引用的参考文献的内容均在此作为参考。
实施例材料与方法小鼠雌性BALB/c(H-2d)小鼠，7-9周龄，购自Taconic Farms，Inc.(Germantown，NY)。所有小鼠都笼养在American Association for Accreditation of LaboratoryAnimal Care设计的设备中。疫苗抗原的制备与使用用RSV A2毒株感染HEp2-细胞(ATCC CCL23)，离心澄清培养物上清液去除细胞碎片，制得病毒粒子。由培养在Vero细胞(ATCC CCL81)中的RSV A2毒株纯化RSV F和G蛋白。根据现有记载(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))，用G蛋白特异性单克隆抗体L7(杂交瘤，ATCC HB10233)，通过免疫亲合层析分离G蛋白。经ELISA和SDS-PAGE测定，所得的G蛋白纯度＞95％。免疫时，每只小鼠在第0和4周肌内接种含1μg纯化G蛋白和20μg佐剂StimulonTMQS-21(Aquila Biopharmaceuticals，Inc.，Framingham，MA)的0.1ml PBS，除非另作说明。以离子交换层析纯化F蛋白，用3μg F蛋白，以100μg氢氧化铝(Al(OH)3)为佐剂进行接种。在RSV接种和攻击中，给予50μl含1-2×106噬斑形成单位(pfu)的感染性RSV A2。用等体积HEp-2细胞裂解液进行模拟接种。肽抗原的制备与使用由Genosys Biotechnologies，Inc.(The Woodlands，TX)合成一系列对应于RSVG蛋白重叠区的合成肽(图2)。所得的肽系列涵盖RSV A2 G蛋白的氨基酸48-294(Wertz等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 824075-4079(1985))。这些肽经质谱测定的纯度高于90％。将冻干肽在无菌水中溶解成2mg/ml，保存于-20℃。用50μg/ml肽体外刺激人外周血单核细胞(PBMC)或用G蛋白初次免疫过小鼠的脾细胞。
用Imject活化偶联试剂盒(Pierce Chemical，Rockford，IL)将选定的肽与马来酰亚胺活化的匙孔血蓝蛋白(KLH)偶联。由于偶联机制的基础是KLH内马来酰亚胺基团与肽内SH基团间的化学反应，所以在肽22的羧基末端添加一个半胱氨酸。用Elliman’试剂(Pierce Chemical)测定肽内巯基的减少来定量检测各种肽的偶联程度。以上反应中的偶联程度(通常每mg KLH结合50-80μg肽)优于过去肽与KLH通过该技术(Tsao等，Anal.Biochemistry 197137-142(1991))的偶联。为了研究各种肽对嗜酸粒细胞增多的诱导，在第0和4周，用250μg与KLH结合的各种肽，以20μg StimulonTMQS-21为佐剂，加入0.1PBS中肌内免疫各小鼠。二次接种2周后，通过肌内给予50μl含1-2×106pfu感染性RSV A2进行攻击(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))。7天后，通过颈椎脱臼处死小鼠，进行支气管灌洗(BAL)。测定感染性RSV的效价系列稀释RSV感染的小鼠的肺匀浆上清液，用于感染HEp-2细胞单层。温育2小时后，吸出接种物，每测试格覆盖以含1％Sephadex G-75的培养基。继续温育3天后，去除凝胶覆盖，测试格用80％乙醇固定。用RSV G蛋白的单克隆抗体和与辣根过氧化酶偶联的山羊抗小鼠第二mAb鉴定RSV噬斑。加入底物，0.05％4-氯萘酚/0.09％过氧化氢的磷酸盐缓冲液(PBS)溶液，进行显色。计数RSV噬斑形成单位(pfu)，将效价表示为pfu/g肺组织。
用含纯化自RSV A2毒株的天然融合(F)和/或吸附(G)蛋白的多种疫苗之一肌内注射初次免疫BALB/c小鼠。3组小鼠分别用3,000，300或30ng F蛋白/剂次进行初次免疫。另3组小鼠用1,000，100或10ng G蛋白/剂次初次免疫。再有3组小鼠用含3000+1000，300+100或30+10ng F与G蛋白的组合疫苗初次免疫。全部疫苗均以氢氧化铝(AlOH，100μg/剂次)为佐剂。对照鼠RSV A2毒株感染，或肌内注射PBS/AlOH。初次免疫后4周，用RSVA2毒株攻击全部小鼠。4天后，处死小鼠，测定肺组织中感染性病毒的数量(表)。
表小鼠肺内RSV效价的测定抗原(ng) GMT RSVaF(3000)+G(1000)＜1.6±0.2F(300)+G(100) ＜2.1±0.7F(30)+G(10)＜2.8±0.9bF(3000)＜2.1±0.5F(300) ＜2.5±0.1F(30) 4.1±0.8G(1000)3.5±0.5G(100) 4.7±0.2G(10) 4.7±0.2PBS5.1±0.2RSV＜1.6±0.1a.GMT是RSV/g肺组织的几何平均效价(log10)±1标准偏差。GMT RSV是在鼻内攻击4天后测定的。
b.接种纯F(30)，纯G(10)或PBS的组，P＜0.05。支气管肺泡灌洗进行支气管肺泡灌洗(BAL)用含1ml冰冷却的12mM盐酸利多卡因的RPMI溶液灌注气管，然后抽出，重复至少5次(Hancock等，Vaccine 13391-400(1995))。然后离心BAL悬浮液沉淀出细胞。用0.2％的台盼蓝PBS溶液染色分成等份的细胞，测定白细胞数量。接着，离心细胞，转移到玻片上，用Diff-Quik(DadeInternational Inc.，Miami，FL)固定并染色。通过分析每玻片至少400细胞计数各白细胞群。表示的结果为每组5只小鼠的平均百分比(±SD)。体内清除T细胞亚型在重组G蛋白柱(Pharmacia，Piscataway，NJ)上，从杂交瘤培养物上清液中纯化抗鼠CD4，GK1.5(ATCC TIB207)和抗鼠CD8，53-6.72(ATCC TIB105)的单克隆抗体(mAb)。作为对照，从Calbiochem(San Diego，CA)购得纯化的大鼠IgG。在末次免疫后的第14天和第20天，以每鼠750μg和250μg的剂量给予mAb。然后用活RSV攻击小鼠，7天后，通过分析BAL细胞测定肺嗜酸粒细胞的量。在FACScan(Becton Dickinson，Mountain View，CA)上进行流动细胞计数，评估清除的效果。用购自Pharmaingen(San Diego，CA)的PE抗小鼠CD4(L3T4)和FITC抗小鼠CD8(Ly-2)进行标准流动细胞计数。脾免疫细胞的体外扩增根据现有记载(Hancock等，J.Virol.707783-7791(1996))，用天然G蛋白与StimulonTMQS-21二次接种小鼠，2周后从5个一组的小鼠中分离出脾脏，制成单细胞悬液。用氯化铵裂解去除红细胞，用台盼蓝排除法测定所得脾细胞的量。在96格平底培养板上培养细胞，一式三份，浓度为每格2.5×105个细胞，培养基含RPMI1640，并补充以2mM谷胺酰胺；100U/ml青霉素和50μg/ml链霉素；5×10-4Mβ-巯基乙醇；10mM HEPES；1％正常小鼠血清(Biocell Labs，Inc.，RanchoDominguez，CA)。在培养基中加入50μg/ml肽抗原。作为对照，分别加入最终浓度为0.5μg/ml的纯化G蛋白，10μg/ml白喉类毒素交叉反应性蛋白(CRM197)和1μg/ml伴刀豆蛋白A(ConA)。37℃，5％CO2培养4天后，用1μCi3H-胸腺嘧啶脉冲处理18小时。然后收获细胞，用液相闪烁计数法测定掺入DNA的3H-胸腺嘧啶。
收集正常成年供血者肝素化人血液，通过Ficoll-Hypaque(Pharmacia，Piscataway，NJ)离心分离。细胞与上述肽培养在含10％AB-血清(Biocell)的PRMI1460中。作为对照，细胞在培养基中与CRM197(30μg/ml)，PHA(5μg/ml)一起培养，或单独培养。细胞因子试验汇合一式三格的上清液，用抗原-捕捉ELISA检测IFN-γ和IL-5。简而言之，最大吸附(maxisorb)板(Nunc)上涂以含捕捉IFN-γ的R4-6A2(3μg/ml)或捕捉IL-5的TRFK.5(2.5μg/ml)单克隆抗体的碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.6)50μl。用含5％FBS和10％奶粉(wt/vol)的Tris缓冲液封闭非特异性结合位点。将培养物上清液加到测试格中，一式两份，室温培养2小时。用生物素化的抗体XMG1.2(IFN-γ)(1μg/ml)和TRFK.4(IL-5)(2μg/ml)检测结合的细胞因子。细胞因子试验中使用的4种单克隆抗体都来自Pharmacia(San Diego，CA)。用链霉亲合素-碱性磷酸酶以及含NADP，黄递酶，醇脱氢酶和INT紫的底物系统测定细胞因子的量。加入0.3M硫酸令底物显色，在Dynatech(Chantilly，VA)ELISA读数仪上，于490nm处测定光密度(OD490)。为了确保线性，用重组IFN-γ(Genzyme，Cambridge，MA)和IL-5(Pharmacia，San Diego，CA)得出各细胞因子的标准曲线。给出的是每种抗原的平均OD490。肺嗜酸粒细胞增多的诱导在第0和4周，给7-9周龄的雌性BALB/c小鼠肌内接种含20μg StimulonTMQS-21佐剂；1μg纯化G蛋白，250μg KLH，250μg与肽19或22偶联的KLH；或游离肽19或22的0.1ml PBS。用购自Peirce Chemical，Rockford，IL的Imject活化偶联试剂盒(产品编号77111)将肽与马来酰亚胺活化KLH偶联。通常，每次偶联反应，将80-100μg肽与1mgKLH结合。这样，由于每鼠每次接种接受250μgKLH，这就相当于接种了20-25μg相关肽。二次接种2周后，用50μl 1-2×106PFU感染性RSV A2鼻内攻击。7天后，颈椎脱臼处死小鼠，进行支气管肺泡灌洗。离心细胞，转移到玻片上，用Diff-Quik(Dade Diagnostics)固定和染色。分析每片至少400细胞，计数与白细胞总数相关的嗜酸粒细胞的相对比例。表示的结果(图5)是每组5只小鼠的平均百分比(±SD)。统计学分析用JMP统计学软件(SAS Institute Inc.，Cary，NC)，用Tukey-Kramer HSD多重比较检验测定不同组之间的显著差异。结果本文描述了以上工作的结果，即天然G蛋白和一系列G蛋白氨基酸48至294上重叠肽(图2)所激发的免疫应答。氨基酸48对应于RSV G蛋白的第二翻译起始密码子。在第0和4周肌内(IM)接种天然G蛋白的BALB/c小鼠，在活RSV鼻内(IN)攻击后第7天，表现出最大的支气管肺泡灌洗(BAL)液中嗜酸粒细胞增多(占白细胞总量的65％)。相反，实验感染或初次免疫感染过的小鼠的BAL液中嗜酸粒细胞不到2％(图1B)。
接种G蛋白的BALB/c小鼠脾细胞的体外刺激试验显示，对包含G蛋白氨基酸184-198的肽发生的优势性增殖应答(图3)。增殖比背景水平高16倍，且大大超过用其它G蛋白衍生肽获得的增殖。此外，对肽19的应答强度与用纯化天然G蛋白所得的相当。所以，以上数据说明，RSV G蛋白激发BALB/c小鼠初次免疫脾细胞增殖的能力完全包含在蛋白质的184-198氨基酸节段内。
分析了培养物上清液与辅助T细胞亚型相关的细胞因子，最高水平的IFN-γ和IL-5出现在肽19刺激之后。而且，该水平与用天然G蛋白激发所得相当，或更高(图4A和4B)。以上数据说明，氨基酸184-198区域包含了BALB/c小鼠T细胞所识别的RSV G蛋白内的优势表位。
初步研究表明，接种G蛋白的BALB/c小鼠的BAL中，肺嗜酸粒细胞最高值出现在攻击后7天，为65±5.4％。为了证实肽19在激发小鼠肺嗜酸粒细胞增多中的直接作用，将肽19与肽22进行了比较。后一肽似乎只激发产生IFN-γ，而不激发产生IL-5(图4A和4B)。
为了确保足够的免疫原性，将肽与马来酰亚胺活化的KLH偶联。与只用佐剂接种的小鼠(2.5±2.0％)相比，用肽19-KLH(39.5±8.0％)或G蛋白(63±1.9％)初次免疫的小鼠，发生统计学意义上明显的肺嗜酸粒细胞增多(图5)。相反，肽22-KLH只引起背景水平的嗜酸粒细胞增多(4.9±3.3％)，尽管数据显示肽22具有免疫原性。末次接种后2周，接种肽19-KLH或肽22-KLH的小鼠抗RSV G蛋白IgG效价的几何平均值分别为1517和5611。所以，虽然对两种肽偶联物都产生体液免疫，但嗜酸粒细胞异常增多的诱导仅限于接种肽19的小鼠。用非偶联肽19或22接种都不激发可测得的体液免疫应答，产生的嗜酸粒细胞相对百分比(分别为6.5±5.2％和2.5±2.5％)与PBS/StimulonTMQS-21对照没有显著差异。
为了评估肽19作为致肺嗜酸粒细胞增多诱因，对在MHC II类结合位点的关键性1，4，6和9锚着区发生氨基酸取代的肽19突变体进行了评估。这些突变消除了致小鼠肺嗜酸粒细胞增多的能力(图6)。结合图5，以上数据表明，肽19的氨基酸序列与诱导小鼠受随后攻击时肺嗜酸粒细胞增多之间直接相关。
为了确定与肽19-KLH相关的嗜酸粒细胞增多是否是由CD4+细胞介导的，用针对CD4或CD8表面分子的mAb进行了一系列缺失试验。FACS分析是在攻击后7天，对接种小鼠脾脏的脾门淋巴细胞群进行的(图8)。
去除CD4+细胞，在接种G/StimulonTMQS-21或肽19-KLH/StimulonTMQS-21的小鼠内显著降低了BAL中的嗜酸粒细胞增多(图8)。具体地说，用抗CD4 mAb治疗分别将嗜酸粒细胞从67.2±8.5％和29.6±13.3％降至8.1±4.7％和0.75±0.6％。相应的抗CD8 mAb治疗对嗜酸粒细胞增多诱导作用甚微，接种G和肽19-KLH的小鼠的嗜酸粒细胞水平分别保持在63.8±6.4％和32.8±10.3％。如图8所示，用RSV试验性感染的小鼠的BAL中，只有0.7％嗜酸粒细胞。所以，以上数据说明，对接种了G蛋白或肽19的BALB/C小鼠受攻击时肺嗜酸粒细胞增多应答而言，CD4+细胞是必需的。
测试了一组供血者外周血单核细胞与纯化G蛋白的反应性，以鉴定最近已被感染的个体。接着，获取表现出对G蛋白增殖应答的6名供血者的细胞，在图2中合成肽存在下培养(图7)。发现供血者100对肽19有强烈的增殖应答(平均刺激指数，8.5)。此外，供血者9和20也对肽19有增殖应答，平均刺激指数均为3倍。等价性虽然，参照优选实施例对本发明进行了具体的说明与描述，本领域熟练技术人员知道，在形式和细节上可进行多种改变，这些都属于后文权利要求书的精神和范围内。
权利要求
1.一种改变的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
2.根据权利要求1所述的改变的G蛋白或多肽，所述加重的病情是非典型性肺炎。
3.根据权利要求2所述的改变的G蛋白或多肽，所述的非典型性肺炎是肺嗜酸粒细胞增多。
4.根据权利要求1所述的改变的G蛋白或多肽，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
5.根据权利要求1所述的改变的G蛋白或多肽，所述改变所在区域的氨基酸序列为丙氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸，或其生物等价体。
6.根据权利要求1所述的改变的G蛋白或多肽，所述的改变造成改变的G蛋白或多肽相对于野生型G蛋白抑制IL-5分泌的引发。
7.编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
8.根据权利要求7所述的核酸分子，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
9.根据权利要求7所述的核酸分子，所述改变所在区域的氨基酸序列为丙氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸，或其生物等价体。
10.一种核酸结构，包含与调控序列操作性连接的权利要求7所述的核酸分子。
11.一种嵌合核酸结构，包含a)编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情；b)编码完整或部分RSVF蛋白的核酸分子；和c)与a)和b)操作性连接的调控序列。
12.一种重组宿主细胞，包含权利要求10所述的核酸结构。
13.一种重组宿主细胞，包含权利要求11所述的核酸结构。
14.一种产生改变的RSV G蛋白或多肽的方法，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，该方法包括将权利要求12所述的重组宿主细胞维持在适合改变的G蛋白或多肽表达的条件下。
15.一种产生嵌合多肽的方法，嵌合多肽包含改变的RSV G蛋白或多肽与完整的RSV F蛋白或其免疫原性部分，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，该方法包括将权利要求13所述的重组宿主细胞维持在适合所编码嵌合蛋白表达的条件下。
16.一种免疫原性组合物，包含生理学上认可的介质和改变的RSV G蛋白或多肽，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
17.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，该免疫原性组合物相对于野生型G蛋白造成IL-5分泌的引发被抑制。
18.根据权利要求16所述的免疫原性组合物，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
19.一种免疫原性组合物，包含生理学上认可的介质，完整或部分RSV F蛋白和改变的RSV G蛋白或多肽，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
20.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，它相对于野生型G蛋白造成IL-5分泌的引发被抑制。
21.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
22.根据权利要求19所述的免疫原性组合物，所述改变所在区域的氨基酸序列为丙氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸，或其生物等价体。
23.一种疫苗组合物，包含免疫有效量的改变的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
24.根据权利要求23所述的疫苗组合物，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
25.根据权利要求24所述的疫苗组合物，所述改变所在区域的氨基酸序列为丙氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸，或其生物等价体。
26.一种疫苗组合物，它包含免疫有效量的完整或部分RSV F蛋白，免疫有效量的改变的RSV G蛋白或多肽，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
27.根据权利要求26所述的疫苗组合物，所述的改变位于氨基酸184-198区域内。
28.根据权利要求27所述的疫苗组合物，所述改变所在区域的氨基酸序列为丙氨酸-异亮氨酸-半胱氨酸-赖氨酸-精氨酸-异亮氨酸-脯氨酸-天冬酰胺-赖氨酸-赖氨酸-脯氨酸-甘氨酸-赖氨酸-赖氨酸-苏氨酸，或其生物等价体。
29.根据权利要求23所述的疫苗组合物，它还包含佐剂。
30.根据权利要求26所述的疫苗组合物，它还包含佐剂。
31.权利要求1所述改变的G蛋白或多肽的用途，它被用于制造疫苗等药物。
32.一种疫苗，它包含生理学上认可的载体和有效量的编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
33.根据权利要求32所述的疫苗，它还包含转染促进剂。
34.一种诱导脊椎动物体内免疫应答的方法，包括给予所述脊椎动物诱导免疫应答有效量的编码改变的RSV G蛋白或多肽的DNA和转染促进剂，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
35.一种抑制脊椎动物接种后再度RSV时诱导病情加重的方法，包括给予改变的RSV G蛋白或多肽，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，可提供保护但不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
36.一种免疫脊椎动物抗RSV的方法，包括给予所述脊椎动物包含免疫有效量改变的RSV G蛋白或多肽的组合物，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
37.根据权利要求36所述的方法，所述的组合物还包含免疫有效量的完整或部分RSV F蛋白。
38.根据权利要求36所述的方法，所述的脊椎动物是RSV血清阴性的人。
39.一种免疫脊椎动物抗RSV的方法，包括给予所述脊椎动物包含免疫有效量编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸分子的组合物，所述改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情。
40.根据权利要求39所述的方法，所述的组合物还包含免疫有效量的编码完整或部分RSV F蛋白的核酸分子。
41.根据权利要求39所述的方法，所述的脊椎动物是RSV血清阴性的人。
42.一种疫苗组合物，它包含免疫有效量的减毒活病原体，病原体内插入有异源核酸节段，所述核酸节段是一段编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸序列，使得所述疫苗在给予脊椎动物后，改变的G蛋白或多肽得以表达并具有免疫原性，但不会在该脊椎动物随后感染RSV时诱导病情加重。
43.根据权利要求42所述的疫苗组合物，所述的减毒活病原体是减毒细菌。
44.根据权利要求43所述的疫苗组合物，所述的减毒活细菌是沙门氏菌。
45.根据权利要求42所述的疫苗组合物，所述的减毒活病原体是减毒病毒。
46.根据权利要求45所述的疫苗组合物，所述的减毒活病毒是减毒的委内瑞拉马脑膜炎病毒。
47.一种免疫脊椎动物抗RSV的方法，包括给予所述脊椎动物包含免疫有效量减毒活病原体的组合物，所述病原体内插入有异源核酸节段，所述核酸节段是一段编码改变的RSV G蛋白或多肽的核酸序列，使得所述疫苗在给予脊椎动物后，改变的G蛋白或多肽得以表达并具有免疫原性，但不在该脊椎动物随后感染RSV时诱导病情加重。
48.根据权利要求47所述的方法，所述的减毒活病原体是减毒细菌。
49.根据权利要求48所述的方法，所述的减毒活细菌是沙门氏菌。
50.根据权利要求47所述的方法，所述的减毒活病原体是减毒病毒。
51.根据权利要求50所述的方法，所述的减毒活病毒是减毒的委内瑞拉马脑膜炎病毒。
52.一种改变的RSV G蛋白或多肽，它保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列选自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
53.一种免疫原性组合物，它包含生理学上认可的介质和改变的RSV G蛋白或多肽，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列选自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
54.免疫原性组合物，它包含免疫有效量的改变的RSV G蛋白或多肽，所述的改变的G蛋白或多肽保留了免疫原性，当加入免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时，可提供保护，但不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情，所述蛋白或多肽的氨基酸序列选自SEQ IN NO32和SEQ IN NO33。
全文摘要
本发明公开了一种改变的RSV G蛋白或其部分,它保留了免疫原性,当加入到免疫原性组合物或疫苗并给予脊椎动物时,不会在该脊椎动物随后感染RSV时加重病情(例如非典型性肺炎,例如肺嗜酸粒细胞增多)。具体实施例中,所述改变的G蛋白包含位于氨基酸184－198区域内的改变。本发明还公开了包含改变的RSV G蛋白,还可以另含RSV F蛋白的免疫原性组合物和疫苗。
文档编号A61K48/00GK1322250SQ98810491
公开日2001年11月14日 申请日期1998年9月17日 优先权日1997年9月19日
发明者G·E·汉考克, P·W·特伯贝 申请人:美国氰胺公司