专利名称：用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物的制作方法
技术领域：
本发明涉及动物细胞药物，更具体地说，涉及一种用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物。
疼痛是一种常见的可由多种病因引起的给病人带来极大痛苦的症状。现有的镇痛药物，如吗啡类，虽可在短时间内产生止痛效果，但反复用药后易产生抗药性及成瘾性。由于肾上腺髓质嗜铬细胞可分泌出某些与镇痛作用有关的物质，如甲啡肽、亮啡肽及单胺类物质等，如果将该嗜铬细胞植入人或动物的脊髓蛛网膜下，就可以象一个天然的“微型生物泵”那样，长期恒定地分泌出镇痛物质，而且不会产生抗药性及成瘾性。故在本世纪八十年代初，美国和瑞士的两个研究组尝试用同种(人、鼠)的肾上腺髓质组织和嗜铬细胞(chromaffin cell)移植入脊髓蛛网膜下内治疗疼痛，取得了满意的效果。但由于人类的肾上腺髓质组织和嗜铬细胞来源稀少，故在九十年代美国的研究组尝试用异种的牛肾上腺髓质嗜铬细胞(以下简称BCC)植入癌症病人的脊髓蛛网膜下以治疗癌痛。为了克服免疫排斥反应，他们采用长度为5cm、直径1mm的聚丙烯酰胺中空纤维管包裹BCC。由于中空纤维管壁膜孔只允许小分子的物质通过，所以BCC的分泌物可缓慢而且均匀地扩散出纤维管，发挥止痛作用，而宿主体内的大分子免疫球蛋白不能穿透管壁膜孔，因此使细胞能较长时间(一年左右)在宿主体内存活并不断地分泌止痛物质，从而对疼痛患者产生治疗作用。但是，中空纤维管的体积较大，一方面，由于其管内死腔大，因此影响了营养物和代谢物的扩散，使得管内细胞不易长期存活；另一方面，大体积的纤维管植入脊髓蛛网膜下易对脊髓神经产生刺激和压迫，从而产生许多对人体不利的副作用；此外，由于中空纤维管的体积大，植入脊髓蛛网膜下时必须采用外科手术的方法植入，给病人带来一定的损伤。同时，用脱乙酰几丁质、聚丙烯酰胺及羧甲基纤维素钠等材料(美国等使用)制作的中空纤维管的生物相容性较差，容易引起宿主体的组织反应。另一方面，采用藻酸钠-聚赖氨酸-藻酸钠制作的三层结构膜微胶囊(以下简称APA微胶囊)，其体积小(直径为200-1000um)、生物相容性高，利于微囊在动物体内长时间完好存在和囊内细胞较长期存活。实验已证明，APA微胶囊的囊膜可截割大于11万Kd(道尔顿)的分子，使免疫球蛋白和免疫活性细胞不能穿过该膜而进入囊内破坏其中的动物细胞，因而具有较好的免疫保护作用。实验亦显示出APA微胶囊具有较好的生物相容性，在小、大动物体内可较长时间(约1年半)完好存在。在胰岛、肝细胞、甲状旁腺和基因重组人生长激素分泌细胞移植治疗疾病模型动物的研究中，已证明具有保护异种移植物免受宿主免疫系统破坏的作用。但是，迄今为止，国内外尚未发现采用APA微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞作为药物用于治疗疼痛的报道。
本发明的目的是要提供一种生物相容性高、作用时间长、毒副作用小、操作简便的适用于治疗疼痛的APA微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物。
本发明人针对上述现有技术的状况进行了深入研究，结果发现，采用下述技术方案即可达到上述目的，从而完成了本发明。
本发明的技术方案如下
1、用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，其特征在于，该细胞药物按下列步骤制成(1)将牛肾上腺髓质嗜铬细胞与一种浓度为10-20g/L的藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每升悬浮液中含0.1-1×1010个细胞；(2)利用喷雾装置将步骤(1)获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.1-1×108个细胞，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得含牛肾上腺髓质嗜铬细胞的藻酸钙珠沉淀；(3)将步骤(2)获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的聚赖氨酸溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；(4)将步骤(3)获得的沉淀物加入到一种浓度为1.0-2.0g/L的藻酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；(5)将步骤(4)获得的沉淀物加入到一种浓度为40-70mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞沉淀物；(6)将步骤(5)获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养并作为治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物保存。
2、如第1项所述的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，其中所述的牛肾上腺髓质嗜铬细胞优选具有80％以上的纯度。
3、如第1项所述的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，在其步骤(2)中优选是将步骤(1)获得的悬浮液以180-500μm直径的微滴状态分散。
在使用时，只要将本发明APA微囊化BCC(2-9×106个细胞)注入患疼痛的病人(例如癌痛病人)的脊髓蛛网膜下，即可在4-24小时内产生镇痛作用，而且一次注射可以维持镇痛作用9个月以上。
下面对本发明的技术方案进行较详细的解释。
在上述的几项技术方案中，第1项为必要解释特征，而第2、3项属于优选的技术特征。
在本发明中所述的牛肾上腺髓质嗜铬细胞(BCC)是指在牛肾上腺髓质中能被含铬染料染色的细胞，它可分泌单胺类、脑啡肽类(包括甲啡肽.亮啡肽)及神经营养因子等物质，这些物质具有镇痛作用。
BCC的获得与纯化方法不属于本发明的范围而是属于常规技术。例如，可以使用胶原酶(Collagenase)与牛的肾上腺作用，使其中胶原组织分解，然后配合机械方法将牛肾上腺组织分离成单个细胞，接着使用170目(88μm)网孔的筛网过滤，牛肾上腺髓质细胞(含嗜铬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和血细胞)穿过滤网，将网下液离心，弃去上清液，即获得了上述各种牛肾上腺髓质细胞的沉淀物，其中，嗜铬细胞约占细胞总数的50-60％，内皮细胞和成纤维细胞二者共约占细胞总数的40-50％，由于血细胞的形态很小，因此通常都不将其计算在总细胞内。应予指出，由于BCC在牛肾上腺髓质细胞总数中约占50-60％，因此即使不进行纯化也能应用于本发明中。但是为了提高治疗效果，优选将其纯化至BCC约占细胞总数的80％以上。作为BCC的纯化方法，例如可以采用常规的贴壁纯化法，其原理是根据不同种类的细胞具有不同程度的贴壁倾向来进行分离。例如对于含有嗜铬细胞、内皮细胞、成纤维细胞和血细胞的混合液来说，在培养瓶中在数小时内，大部分成纤维细胞贴壁，而大部分嗜铬细胞、内皮细胞和血细胞不贴壁，因此换瓶时可除去大部分成纤维细胞。又因血细胞不贴壁生长，故可以通过培养较长时间(例如24-48小时)，待嗜铬细胞及内皮细胞贴壁后再次换瓶即可除去大部分血细胞。如此经过两次换瓶即可使BCC的纯度达到细胞总数(血细胞除外)的80％以上。
关于细胞的计数方法，可以采用常规的染色后显微镜下观察计数的方法。例如可以采用胎盘蓝染色法(Trypanblue stain)，见于“组织培养溶剂和试剂”(Tissue CultureMedia and Reagents)，第1566页。
在属于本发明的必要技术特征的6个操作步骤中，各个步骤所用的溶液量可以根据限定的细胞数目来掌握。例如，在上述本发明技术方案1的步骤(1)所获得的悬浮液中每升含有0.1-1×1010个细胞，而在步骤(2)的混合液中每升含有0.1-1×108个细胞，也就是步骤(1)的悬浮液中的细胞浓度相当于步骤(2)的混合液中细胞浓度的约100倍，因此，如果从步骤(1)的悬浮液中取出1ml，则在步骤(2)中最好将其分散到100ml的氯化钙溶液中。余此类推。
在步骤(2)中形成藻酸钙珠的作用是为了在步骤(5)中获得含牛肾上腺髓质嗜铬细胞的微囊创造条件。在步骤(5)中，柠檬酸钠的钠离子将藻酸钙珠中的钙离子置换之后便形成了具有许多小孔隙的微囊。在这些微囊中含有许多BCC，而在BCC的周围又包裹着藻酸钠。
对藻酸钙珠的形成方法没有特殊限定，只要是能将含有BCC的藻酸钠悬浮液以足够微小的液滴分散于氯化钙溶液中既可。该藻酸钠悬浮液微滴的直径通常应在150-1000μm的范围内，优选在180-500μm的范围内。如果微滴直径在1000μm以上，则最后获得的微囊过大，在注射入人或动物的机体时容易引起破裂，因此不好。通常使用的液滴分散方法有针头注射法、喷雾法等，优选是喷雾法，最优选的是利用加拿大多伦多大学制造的静电微囊发生器(见《酶学方法》“微囊化胰岛细胞一种生物内分泌胰”SUN,A.M.Micro-encapsulation of pancreatic islet cell:a bio-artificial endocrine pancreas.In:Methods inEnzymology，第137卷，第575-580页，1988年)进行的喷雾的方法。
上面对本发明的技术方案进行了较详细的解释，本领域的技术人员在阅读了上文及下文所附的实施例之后将能很容易地理解本发明。
与本领域的现有同类技术相比，本发明具有如下的积极效果通过动物实验证实，使用本发明的APA微囊化动物细胞药物(微囊直径150-1000μm)将含有0.2-1×105个BCC细胞的微囊注入正常大鼠脊髓蛛网膜下，可使大鼠的热痛阈值(用传统的抬脚试验和甩尾试验检测大鼠对急性伤害性热刺激的反应)明显升高(较注药前提高80％-110％)，作用时间超过9个月。通过对癌痛病人的治疗证实，将微囊化BCC(2-9×106个细胞)注入癌痛病人脊髓蛛网膜下，可在4-24小时内产生镇痛作用，其中绝大多数病人不再需要使用其他止痛药物。病人的疼痛评分值(按国际通用的VAS评分法由2名医生进行评分)明显下降，精神和食欲好转，治疗效果已持续超过120天，而且无明显的副作用。这一事实表明，本发明的APA微囊化BCC的植入可产生明显的镇痛作用，而APA微囊可保护移植物(即BCC)免受宿主体免疫系统的破坏，使得微囊化BCC可在异种动物体内较长期的存活和持久地发挥镇痛作用。
与现有技术相比，本发明具有下列特点1、按本发明制作的APA微囊体积小(直径180-500um)，因而至少具有3个优点，即(1)利于营养物和代谢物的扩散，使囊内细胞易于较长期的存活；(2)不需以手术的方法将中空纤维管植入，仅需以简单的腰穿方法即可将微囊注入脊髓蛛网膜下腔内，对组织损伤小；(3)在脊髓蛛网膜下腔内不易对脊髓神经产生刺激和压迫的副作用；2、与其它材料的免疫隔离膜相比，APA微囊具有很好的生物相容性；3、大量实验已证实，本发明的APA微囊具有很好的免疫保护作用；4、BCC在宿主体内可持续地(3个月以上)分泌镇痛物质，产生持续的镇痛作用，克服了临床用药产生的波动性止痛效果；5、微囊化BCC可在宿主体内较长期地发挥镇痛作用，避免了反复使用镇痛药物而产生的抗药性、成瘾性等副作用；6、与采用人肾上腺髓质嗜铬细胞相比，牛肾上腺髓质嗜铬细胞可大批量获得；
7、可采用低温技术保存微囊化BCC，便于长距离运输和批量供应。
概括地说，本发明具有治疗疼痛的效果明显、作用时间长、使用安全、操作简便、质量稳定、可大批量生产、生产周期短等特点。在临床应用中具有广阔的使用前景。
下面举出实施例、实验例和应用例来进一步解释本发明，但本发明不受这些具体例的限定。
实施例1BCC的分离与纯化1、从屠宰场取到12个新鲜的牛肾上腺(在室温下的缺血时间不超过1小时)，在冷藏条件下迅速运回实验室备用。
2、从肾上腺的静脉注入浓度为1g/L的胶原酶Ⅰ(collagenase Ⅰ)溶液，每个肾上腺注入胶原酶Ⅰ溶液5ml，然后在37℃下放置30分钟，以便让胶原酶与牛肾上腺细胞周围的胶质充分反应。
3、沿肾上腺纵轴切开皮质，分离出髓质并将其剪碎。
4、向全部已剪碎的髓质组织中加入60ml浓度为1g/L的胶原酶Ⅰ溶液，再放置30分钟。
5、用一个网孔为170目(88μm)的钢网过滤，收集网下液。
6、将网下液离心分离，弃去上清液，获得含牛肾上腺髓质细胞(包括BCC、内皮细胞、成纤维细胞和血细胞)的沉淀物。
7、用台盘蓝染色法进行计数，获得的细胞总数(血细胞除外)为5.8×107，细胞存活率为90％。
8、将细胞转移入2个培养瓶中，每瓶加入DMEM(Dulbeco’sModified Eagle Medium)培养液(其中还含有青霉素100单位/ml、链霉素100μg/ml、小牛血清10体积％)20ml，置于一台温度为37℃，含5体积％CO2孵箱内培养，5小时后换瓶，继续培养，使BCC绝大部分贴于瓶壁上，待用。
通常至少需要培养24小时以上，在用于制备微囊化动物细胞药物时，只需将培养瓶中的溶液去除，用常规胰酶消化法将BCC从培养瓶中收集下来即可作进一步的处理。
应予说明，实施例1的方法属于常规技术，它对本发明不起任何限定作用。
实施例2微囊化动物细胞药物的制备1、使用按实施例1的方法获得的BCC，离心分离，获得BCC的沉淀物，用生理盐水洗涤并稀释至1ml，将其移至离心管内。
2、用台盘蓝染色法计数，所获得细胞总数为3×106个细胞，其中BCC的纯度为82％。
3、向其中加入1ml浓度为15g/L的藻酸钠溶液，用搅拌法将其制成悬浮液。
4、用静电微囊发生器(electrostatic dropletgenerator，加拿大多伦多大学制造)将悬浮液喷入到100ml浓度为100mmol/L的氯化钙溶液中，在10分钟后获得了一种直径在180-500μm范围内的含细胞的藻酸钙珠沉淀，待沉淀完全后除去上清液。
5、将藻酸钙珠加入到50ml浓度为0.5g/L的聚赖氨酸溶液中，混合均匀，在室温下放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
6、将步骤5获得的沉淀物加入到60ml浓度为1.5g/L的藻酸钠溶液中，混合均匀，在室温下放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液。
7、将步骤6获得的沉淀物加入到60ml浓度为55mmol/L的柠檬酸钠溶液中，在室温下放置10分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得含BCC的微囊化动物细胞沉淀物。
8、用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤沉淀物，然后将此沉淀物转移入实施例1的步骤8所述的DMEM培养液中培养，作为注射用微囊化BCC药物待用。
实验例1微囊化BCC对大鼠痛阈的影响1、使用10只Wister品系大鼠作为实验对象，每只大鼠的重量为300±30g。
2、使实施例2中获得的微囊化BCC悬浮液沉淀，用浓度为9g/L的氯化钠溶液洗涤3次，获得含微囊化BCC的氯化钠悬浮液。将此悬浮液注射入该10只大鼠的脊髓蛛网膜下，注射量为每只大鼠1×105BCC/20μl氯化钠溶液，结果表明，所有被注射微囊化BCC的大鼠的热痛阈值(用国际通用的抬脚试验和甩尾试验检测大鼠对急性伤害性热刺激的反应)明显升高(较注药前提高80％-110％)，作用时间超过9个月。
实验例2微囊化BCC应用于治疗癌痛病人将APA微囊化BCC(约7×106细胞)悬浮于5毫升浓度为9g/L的氯化钠溶液中，以常规的腰椎穿刺方法注入必须长期使用止痛药物的癌痛病人的脊髓蛛网膜下。共选取10名癌痛病人进行注射前后的疼痛评分(VAS法)，结果表明，其中9名病人在移植(即注射微囊化BCC)后的疼痛评分(VAS法)由6～10级下降到0～2级；在该9名病人中的4名用药的当天即开始停止使用止痛药物，其他的5名病人在次日或第3日开始停止使用止痛药物。在未用任何免疫抑制剂的条件下，其中1名病人的镇痛作用时间已超过120天，另6名病人的镇痛作用也已超过70天。9名病人在此期间精神愉快，食欲增加。在总共10例病人中只有1例在植入后仍须使用止痛药物，但用量减少了50％。对所有10例病人均未观察到明显的毒副作用。
具体应用例(1)张贵贵，男，42岁，非何杰金氏淋巴瘤。用本药前需用口服止痛药美施康定60mg/日，在注射微囊化BCC 7×106个细胞4小时后停用止痛药，VAS疼痛评分由8级下降到0级，效果现已持续超过120天。(2)刘风英，女，45岁，何杰金氏淋巴瘤。用本药前需用口服止痛药芬必得300mg/日，在注射微囊化BCC 7.5×106个细胞18小时后停用止痛药，VAS疼痛评分由6级下降到0级，效果现已持续超过90天。(3)赵建华，女，47岁，乳腺癌骨转移。用本药前需用口服止痛药美施康定60mg/日和芬必得300mg/日，在注射微囊化BCC 7×106个细胞24小时后减为仅用芬必得150mg/日，3日后完全停用止痛药，VAS疼痛评分由10级下降到1级，效果现已持续超过80天。(4)丁顺香，女，56岁，肺癌骨转移。用本药前需口服止痛药美施康定60mg/日，在注射微囊化BCC 7×106个细胞24小时后减为美施康定30mg/日，6日后完全停用止痛药，VAS疼痛评分由10级下降到2级，效果现已持续超过80天。(5)李香芝，女，60岁，多发性骨肿瘤。用本药前需用肌肉注射止痛药吗啡20mg/日，在注射微囊化BCC 7×106个细胞24小时后减为吗啡10mg/日，3日后完全停用止痛药，VAS疼痛评分由10级下降到1级，效果现已持续超过60天。
权利要求
1.用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，其特征在于，该细胞药物按下列步骤制成(1)将牛肾上腺髓质嗜铬细胞与一种浓度为10-20g/L的藻酸钠溶液混合，制成悬浮液，使每升悬浮液中含0.1-1×1010个细胞；(2)利用喷雾装置将步骤(1)获得的悬浮液以150-1000μm直径的微滴状态分散于一种浓度为80-120mmol/L的氯化钙或乳酸钙溶液中，两种液体的比例为保证每升混合液含0.1-1×108个细胞，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得含牛肾上腺髓质嗜铬细胞的藻酸钙珠沉淀；(3)将步骤(2)获得的沉淀物加入到一种浓度为0.3-0.7g/L的聚赖氨酸溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；(4)将步骤(3)获得的沉淀物加入到一种浓度为1.0-2.0g/L的藻酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置3-15分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得沉淀物；(5)将步骤(4)获得的沉淀物加入到一种浓度为40-70mmol/L的柠檬酸钠溶液中，二者的比例为保证每升液体含0.2-2×108个细胞，混合均匀，放置5-20分钟，待沉淀完全后除去上清液，获得微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞沉淀物；(6)将步骤(5)获得的沉淀物加入到一种浓度为9g/L的氯化钠溶液清洗，最后将沉淀物转移入细胞培养液中培养并作为治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物保存。
2.如权利要求1所述的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，其特征在于，其中所述的牛肾上腺髓质嗜铬细胞具有80％以上的纯度。
3.如权利要求1所述的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞药物，其特征在于，在其步骤(2)中将步骤(1)获得的悬浮液以180-500μm直径的微滴状态分散。
全文摘要
用于治疗疼痛的微囊化牛肾上腺髓质嗜铬细胞(简称BCC)药物,其制法是:1.将BCC悬浮于藻酸钠溶液中;2.将该悬浮液分散于氯化钙溶液中以形成藻酸钙珠沉淀;3.将该沉淀与聚赖氨酸溶液混合以包裹聚赖氨酸膜并沉淀;4.将该沉淀与藻酸钠溶液混合以包裹藻酸钠膜;5.用柠檬酸钠置换出沉淀物中的钙离子以微囊化BCC;6.将微囊化BCC转移入培养液中,待用。该细胞药物能在人体内长期地分泌镇痛物质,植入一次可以止痛数个月以上。
文档编号A61K9/50GK1235027SQ9910905
公开日1999年11月17日 申请日期1999年6月16日 优先权日1999年6月16日
发明者薛毅珑, 何立敏, 黎立, 王振福, 张莉, 李新建 申请人:薛毅珑, 何立敏