专利名称：流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗的制作方法
“流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗研究”属国家95医学科技攻关专题(编号96-906-03-14)。由中国预防医学科学院病毒学研究所牵头，中国药品生物制品检定所和卫生部兰州生物制品研究所参加。本发明涉及的病毒株、Vero细胞生产库、生产工艺流程和质量控制标准及检定方法均由病毒学研究所独家完成。
流行性出血热(国际上统称肾综合征出血热)是危害我国人民最严重的自然疫源性传染病，由某些汉坦病毒(Hanta Virus)引起，我国主要是汉滩病毒(Hantaan Virus，即上述的野鼠型或称Ⅰ型)和汉城病毒(Seoul Virus，即上述的家鼠型或称Ⅱ型)，安全有效的疫苗是减少发病率，控制爆发流行的关键之举。虽然我国已有三种动物原代细胞和乳鼠脑纯化灭活疫苗，并取得良好的近期防病效果，但是由于要建立大量正常的动物种群，不仅费时费力，质量也难以保证，而且由于原有疫苗每剂量的抗原含量有限，全程免疫后的抗体反应水平及阳转率偏低，长期的防病效果有待考验。随着改革开放后我国人民文化、生活水平的提高，必须要有更安全、更有效的高质量疫苗，以满足日益增长的防病需要。
通过四年来的努力，从病毒株的选育和培养适应，Vero细胞库的建立、生产工艺及质量标准的制定和实施等，已经连续研制出了三批上述纯化疫苗，完成了全部临床前的实验研究，各项结果指标均符合WHO和我国有关疫苗的质量标准。
一个安全有效的疫苗的关键是要有好的疫苗毒株、合适的细胞培养系统、稳定易行的生产工艺流程和一套严格完整的质量控制标准及方法。1．毒株的选育及在Vero细胞上的传代适应出血热病毒是优劣不等的群体，在Vero细胞上利用终末稀释或空斑筛选及乳小白鼠脑中交替传代的方法，可以获得繁殖力强(即病毒毒力滴度高)，抗原性和免疫原性好的疫苗候选株。我们用地鼠肾细胞传代12次的疫苗株病毒L99，再经Vero细胞连续3代，终末稀释5代，再经乳鼠脑3代及Vero细胞2代的病毒作为疫苗种子病毒，再连续2～4代作为Ⅱ型疫苗生产用毒种。另外用84Fli毒株Vero细胞传代连续3代，终末稀释5代，再在乳鼠脑3代及Vero细胞2代作为疫苗种子病毒，再连续2～4代作为Ⅰ型疫苗生产用毒种。种子病毒的滴度始终保持在107TCID50/ml以上。其他毒株包括R22、A9、PS-6、FT-14、H5和C4等采用上述类似的方法，均可达到上述目的[说明书附
图1．我国流行性出血热病毒流行株L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84-Fli、H5、C4等在Vero细胞上的传代适应(图中滴度为IFAT测定结果)传代适应条件1、原始滴度；2、在Vero细胞连传三代；3、用终末稀释法连续传5代，可以较好地提高病毒毒力滴度；4、回传乳鼠，即腹腔接种，收取乳鼠脑，鼠脑悬液毒方滴度可达8.0LogTCID50/ml；5、再在Vero细胞上适应传代，毒力一般均达7.0LogTCID50/ml以上，再传至4～6代，可用于疫苗的试制。]为了保证使用毒株的正确性，进一步用特异引物作RT-PCR扩增分型{说明书附图2．在Vero细胞传代适应的L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株为，用型特异引物进行RT-PCR，以进一步确定它们的基因型。表明L99和R22毒株为Ⅱ型，而A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5及C4毒株为Ⅰ型。[用上述毒株感染的Vero细胞提取全RNA，先用共用引物合成cDNA第一链，再用Ⅰ和Ⅱ型分型引物进行扩增。共用引物为P1CCGGATCCTAGTAGTAGACACCGC(+)；Ⅰ型引物为P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P3TGTTAACCGGAATCG(-)；Ⅱ型引物为P8GATGAAAAGCTGTTTGAT(+),P4GCCCTGAAACTGG(-)]}。2．在合适的Vero细胞上生产疫苗原液，半成品和成品的检定内容及方法以中国药品生物制品检定所引入早代Vero细胞种(130代左右)，每3～4天传一代，至第135代建立生产用种子细胞库，传至140～145代可以获得足够量的细胞用于生产。
对疫苗原液，半成品及成品检定，采用如下方法(1)疫苗原液无菌试验，无细菌、真菌及支原体污染；病毒毒力测定，达到6.5～7.0LogTCID50/ml；免疫荧光(IFAT)+++以上；感染细胞中的外源因子检查阴性。
(2)半成品的检定浓缩和纯化灭活样品，分别测定蛋白含量，以确定纯品中蛋白及其他杂质的去除率；纯品中残余牛血清蛋白的含量应＜50ng/ml(检定所试剂盒)细胞DNA含量应＜100pg/针(分子克隆技术)；安全试验(在E6或Vero细胞上盲传3代，IFAT检测阴性)；β-丙内酯残留量(疫苗研制过程中可完全水解去除)。
(3)疫苗成品的全面检定无菌试验(需增菌检定)；毒性试验(用3周小白鼠)；热原试验(用2kg重大白兔)；效力试验(0,7天免疫2kg重大白兔，28天后测中和抗体，四只兔子中必须有三只抗体≥1∶20以上)；Al(OH)3含量＜0.7mg/ml；硫柳汞含量＜0.01(g/ml)；总蛋白含量＜4mg/针；外观(白色、微混浊)；pH值(6.5～7.8)。
上述各项检定，均符合规程要求的指标，以保证疫苗的安全和有效性。3、通过上述疫苗的试制，形成一套易行而又稳定的生产工艺流程经全面检定合格的Vero细胞悬液分别接种经严格检定的Ⅰ、Ⅱ型生产用毒种，分装至转瓶中培养，2～3天成片后，用Hanks液喷淋，加含0.2％人白蛋白的199维持液，而后每3～4天收获一次，经无菌试验和毒力测定合格，合并。合并的原液10000r/m连续流离心，超滤浓缩，硫酸鱼精蛋白沉淀，7000r/m 30分钟离心，吸去上清，柱层析(BPG)纯化，灭活，半成品检定合格，稀释除菌，加入白蛋白、硫柳汞及Al(OH)3，分装后进行成品全面检定[说明书附图3流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗生产工艺流程。(所谓多价，即包括不同型的流行性出血热病毒，至少含有Ⅰ和Ⅱ型病毒两种)]4、上述生产工艺流程图(即生产过程)中，我们作了如下改进(1)病毒生产Ⅰ、Ⅱ型种子病毒分别与细胞混种的方法，缩短了生产周期及污染率；(2)一定间隔的充分的喷淋，以尽可能去除残存牛血清；(3)增加了疫苗原液连续流离心，去除更多的细胞杂质；(4)纯化时，改变了洗脱液的pH值，提高了Al(OH)3对病毒抗原的吸附度，有可能提高其免疫原性；(5)病毒样品纯化后再进行β-丙内酯灭活，可减少污染及可能的抗原损失；(6)单价疫苗单独进行浓缩和纯化，然后按抗原量稀释，配制成单价苗，而后适量合并成多价纯化疫苗，这样有更多调配抗原含量的余地。
以下的优先实施例对本发明或者实用新型作补充说明，但不意味着限制本发明的内容，在这些实施例中，为说明本发明，我们采用了自己分离的并在地鼠肾细胞生产的L99疫苗株，及第四军医大学唐都医院分离由我们在Vero细胞和乳小白鼠适应的84Fli毒株，分别在Vero细胞(从检定所引进)制备出原液苗，再经市售Millipore PELLICON 300K M.W.超滤浓缩器及Amersham Pharmacia Biotech公司Sepharose 4FF介质组装的BPG柱，作为原液疫苗浓缩及纯化的重要手段，对于纯品疫苗的质量控制除常规检测外，还进行一些特殊的检测。实施例1，为合适疫苗毒株的选育；实施例2，为原液疫苗的生产；实施例3，为原液疫苗的浓缩及纯化；实施例4，疫苗原液半成品及成品检定；实施例5，纯化样品的特殊检定。实例1．选育繁殖力强，抗原谱广，免疫原性及抗原性强的病毒株是疫苗成败的关键。
(1)选择了实验室收集和分离的多个病毒株或疫苗候选株，包括L99,R22,A9,FT-14,PS-6,H5,84Fli,C4等，在Vero细胞传代适应；(2)在Vero细胞采用终末稀释的方法传代；然后(3)回至乳小白鼠腹腔接种，收取乳鼠脑中病毒传代；最后(4)Vero细胞继续传代，达到相对较高的病毒滴度(如图1．)，同时对病毒的基因型(用RT-PCR技术)进行进一步确证(如图2．)。实例2．将液氮冻存的134代Vero细胞复苏和传代培养，至138代获得足够生产用量的细胞，消化成细胞悬液，与Ⅰ型或Ⅱ型病毒一定比例混合分种转瓶培养成牢固单层后，用缓冲液充分喷淋(有间隔)，加入0.2％人白蛋白199培养基(pH7.4～7.8)继续培养7～19天，每3～4大收液一次作无菌试验及毒力测定，无菌试验合格，毒力滴度大于6.50LogTCID50/ml，即为合格疫苗原液。实例3．疫苗原液的浓缩及纯化上述合格的疫苗原液合并，进行连续流离心机离心(10000r/m)，去除细胞碎片和杂质，然后用Millipore PELLICON 300K M.W.超滤浓缩至少50～100倍，再经装载有Sepharose 4FF介质的BPG柱(全套由瑞典Amersham Pharmacia生物技术公司生产)，紫外检测第一峰即为所需要的纯化病毒峰，按收集的液量，加入β-丙内酯(1∶4000)灭活，测定有关抗原蛋白含量及ELISA滴度，用PBS(pH7.2～7.4)稀释至合适量(比疫苗原液高4～8倍)，同时检测残余牛血清含量，Vero细胞DNA含量及安全试验(盲传3代)，必要时检测β-丙内酯残留量，稀释的样品中立即加入0.3～0.5％人白蛋白，0.5mg/ml的Al(OH)3及硫柳汞防腐剂等，此为纯化疫苗半成品。半成品的检定，实际是Ⅰ型和Ⅱ型疫苗的分别检定，内容如下所述。实例4．疫苗原液、疫苗半成品及成品的检定。
在病毒培养进程中，用免疫荧光检测来估计病毒在细胞中繁殖状况，一般IFAT在+++以上为好。收获的原液应做无菌试验及病毒毒力滴定。
半成品的检定半成品分两类，即在加入白蛋白，Al(OH)3和硫柳汞等以前及以后，以前包括蛋白含量、抗原活性(ELISA滴度)、β-丙内酯含量、残牛血清蛋白含量及Vero细胞DNA含量的测定，安全试验；以后做无菌试验。而对加入成分的含量测定都放在成品的检定中。
成品的检定成品是Ⅰ型半成品和Ⅱ型半成品(在加入人白蛋白等以后)适量合并，分装安瓶后的制品。需作全面检定，包括无菌试验，毒性试验，热原试验，效力试验及Al(OH)3，硫柳汞和总蛋白量等，另外还包括外观及pH值等理化检定。实例5．纯化样品的特殊检定下列检定，将不一定包括在以后的疫苗生产过程中纯化样品中病毒颗粒形态观察及病毒蛋白SDS-PAGE电泳，以此判定病毒的特异性及纯度。病毒形态由本所形态室用负染色进行[如说明书附图4纯化病毒样品中的病毒颗粒形态(负染色，30000×)]。电泳按本室常规操作进行[如说明书附图5、纯化病毒样品的SDS-GAGE电泳图1、纯化样品84Fli；2、纯化样品L99；3、蛋白Marker，由上至下分子量依次为97.4KD、66.2KD、42.7KD、31.0KD、14.4KD。]
权利要求
1．流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗，其特征在于(1)使用经Vero传代细胞长期传代适应的我国流行性出血热流行株-至少包括野鼠型(即Ⅰ型，如A9、PS-6、FT-4、84Fli、H5、C4)和家鼠型(即Ⅱ型，如L99、R22毒株)，它们的毒力滴度均达7.0Log/ml以上；具有较好的免疫原性及抗原性。(2)野鼠型(Ⅰ型)和家鼠型(Ⅱ型)毒株分别在Vero传代细胞(美国ATCC引进，中国药品生物制品检定所提供，生产疫苗时代次不超过150代)培养，多次收液，合并即为原液，原液经10000转/分连续流离心，PELLICON 300K超滤浓缩，Sepharose4 FF(BPG柱)纯化，β-丙内酯灭活，再经稀释除菌，半成品检定合格，加佐剂及多价配伍，成品检定合格而成纯化疫苗。半成品检定①无菌试验阴性，合格；②安全试验三代盲传(Vero-E6细胞)，IFAT检查阴性，合格；③残余牛血清蛋白含量＜50ng/ml，合格；④蛋白含量＜200ng/ml；⑤细胞DNA含量＜100pg/针。成品检定①无菌试验阴性，合格；②毒性试验阴性，合格；③硫柳汞含量＜0.01％(g/ml)合格；④氢氧化铝含量＜0.7％mg/ml合格；⑤pH6.5～7.8，合格；⑥过敏原测定阴性，合格；⑦热原测定阴性，合格；⑧效力试验每批疫苗免疫家兔4只，对Ⅰ、Ⅱ型病毒的中和抗体分别≥1∶20。(3)上述毒株的生产、检定已经形成一套系统、合理而稳定的生产工艺流程和质量控制标准，以保证产品(疫苗)的质量。(4)纯化疫苗应用于人体，具有更好的免疫效果及更好的安全性，将会得到使用者的欢迎。将会产生良好的社会效益和一定的经济价值。
2．根据权利要求1(1)使用经Vero细胞传代的上述我国流行性出血热病毒流行株(包括L99、R22、A9、PS-6、FT-14、84Fli、H5、C4等)，可被用于Vero传代细胞为基质的疫苗生产；
3．根据权利要求1(2)流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗在Vero传代细胞中的生产，其半成品和成品的全面系统检定内容及方法，可被用于Vero传代细胞纯化疫苗的质量控制；
4．根据权利要求1(3)流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗在Vero传代细胞中的生产，全面、系统、合理而又稳定的生产工艺流程及质控标准，可被利用作为Vero细胞纯化疫苗的流程及标准。
5．根据权利要求1(4)流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗，由于采用了高速连续流离心机离心，去除了更多的杂质，同时人为地控制了病毒蛋白和抗原含量，因而使本疫苗效价高，对人体的副反应更小，达到既有效又安全的目的。
全文摘要
流行性出血热传代细胞多价纯化疫苗是属生物技术领域“九五”国家医学技术攻关专题研究内容，包括我国流行性出血热病毒流行株在Vero传代细胞中的传代适应，毒株的选育，Vero细胞库的建立，病毒在Vero细胞中的培养、收获，超滤浓缩及纯化，稀释配制，分装，以及对疫苗原液、半成品及成品一系列的检测和检定，以保证疫苗的质量，使其既安全又有效，用于流行性出血热(肾综合征出血热)的免疫预防。
文档编号A61P31/00GK1237456SQ99109199
公开日1999年12月8日 申请日期1999年6月23日 优先权日1999年6月23日
发明者杭长寿, 李德新, 孙世华, 解燕乡, 霍子威, 张全福, 梁米芳 申请人:中国预防医学科学院病毒学研究所