抗cd的制作方法

专利名称：抗cd的制作方法
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本发明涉及抗CD20单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断的药物中的应用。具体地，本发明的重链和轻链可变区基因来自抗CD20单克隆抗体HI47。
B淋巴细胞瘤是一种常见的血液系统疾病，其发病率约为2／10000，按此估计，我国每年约有两万多病例。目前对B淋巴细胞瘤的治疗方法主要有化疗，放疗和生物辅助治疗三种疗法，生物治疗作为辅助疗法主要用于化疗替代、联合应用治疗、微量残留肿瘤细胞的杀伤和早期潜在转移灶的治疗，提高病人的愈后质量。CD20是B淋巴细胞表面膜蛋白，CD20与Ca2+离于在B淋巴细胞跨膜运输密切相关，CD20对B淋巴细胞的分化和增殖起调节作用(BubienJK，Zhou LJ，Bell PD，et a1J．Cell Biol．1993，121(5)1121-1132；Golay JT，Clark EA，Beverley PC，et alJ Immuno1．1985；1353795)。CD20作为治疗B淋巴细胞瘤靶点有如下优点首先，CD20只在前-B淋巴细胞，未成熟B淋巴细胞，成熟B淋巴细胞，激活B淋巴细胞表达，而在其他组织以及多能B淋巴干细胞，浆细胞不表达(Stashenko PNadler LM，Hardv R，et al．J．Immun，1980；1251678-1685；Nadler LM，Karsmeyer SJ，Anderson KC，et alClin．Invest．1984；74332-340；Stashenko PNadler LM，Hardy R，et al．Proc．Natl．Acad．Sci．USA 1981；783848-3852；Rosenthal P，Rimm IJ，Umiel T，et al．J．Immunol．1983；131232-237)。其次，CD20和抗CD20抗体结合后不发生内吞作用，因而细胞表面CD20数量并不因为抗体的结合而减少(Liu AY，Robinson RJr，Murvay ED，et al．J．Immunol．1987；1393521)。第三，CD20比较暴露，不为其它表面分子所掩盖，因而容易接近(Einleld DA，Brown JP，Vakebtube MA，et al．EMBOJ．1988；7711)。第四，在人体血清中无游离的CD20存在(EinleldDA，Brown JP，Valentine MA，et al．EMBOJ．1988；7711)。
抗CD20单克隆抗体的研究已有十多年的历史，早在80年代抗CD20抗体IF5、B1已用于临床实验，但收效甚微，直至1997年才取得突破性的进展。是年美国FDA批准抗CD20嵌合抗体Rituxan应用于B淋巴细胞瘤的临床治疗，疗效显著，毒副作用小(Magic bulletsat lastFinally-approval of a monoclonal antibody for the treatment ofcancer．Cancer Biotherapy & Radio pharmaceuticals 1997；14(4)223-225)。不同的抗CD20抗体和CD20结合后引起的效应不同，有的可使B淋巴细胞从G0期进入G1期，引起B淋巴细胞的活化；有的抑制B淋巴细胞的活化。抗CD20抗体主要是通过抗体依赖性细胞毒作用(ADDC)、补体依赖性细胞毒作用(CDDC)以及抗体和B淋巴细胞的结合等三种机制杀伤B淋巴细胞瘤。
HI47(IgG3)是中国医学科学院血液学研究所于1990研制成功的抗CD20鼠源性单克隆抗体，第四届国际人类白细胞分化抗原会议将HI47命名为CD20+X，HI47的组织反应性和IF5、B1略有不同(杨希峰、沈德诚、金宇光等，HI47一种抗成熟B细胞单克隆抗体制备、鉴定及其生物学特性研究；上海免疫学杂志，199010(2)65-68)。HI47能抑制SAC诱导的B淋巴细胞DNA、RNA的合成，而对Anti-IgM和PMA引起B细胞活化及细胞系的增殖无明显作用，HI47使SAC激活的B细胞HI抗原表达明显减少，但对PMA激活细胞HI抗原表达没有明显影响(杨希峰、沈德诚、陈障等，HI47(CD20)单克隆抗体对B细胞活化增殖的影响；中国免疫学杂志，19917(1)21-24)。这与Tedder等报道的相反(Tedder TF et al．Eur J Immunol．1986；16881)，这些结果预示HI47的作用位点与B1的作用位点不同。HI47的抑制活性是抗体的特异性作用。
人体对鼠源性抗体的免疫反应(HAMA反应)是鼠源性抗体应用于临床治疗的主要障碍，且鼠源性抗体不能介导人的ADDC、CDDC反应。抗体的人源化和嵌合抗体的构建可大大降低鼠源性抗体的免疫原性。
因此，本发明的一个目的在于提供一种抗CD20单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的嵌合抗CD20抗体及其Fab片段，能降低鼠源性抗CD20抗体的免疫原性。
本发明的另一个目的在于抗CD20嵌合抗体及其Fab片段在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断的药物中的应用。
根据本发明的一个方面，本发明涉及一种抗CD20单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因，其中，所述的重链可变区基因全长为366bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示。所述的轻链可变区基因全长为318bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ IDNO4所示。
我们采用噬菌体抗体展示技术，成功地克隆到抗CD20单克隆抗体HI47的轻重链可变区基因，并将得到的抗CD20单克隆抗体轻重链可变区基因克隆到Fab表达载体中，构建嵌合抗CD20抗体的Fab片段，降低了鼠源性抗CD20抗体的免疫原性。并能在大肠杆菌中进行高效分泌性表达，分泌性表达抗体能提高抗CD20基因工程抗体的产量，降低生产成本，利于工业化生产。Fab片段和全抗体相比具有以下优点首先，Fab较全抗体分子量小，且穿透力比较强，其次，Fab可在大肠杆菌中表达，利于工业化生产，生产成本低。
以下参照附图及实施例详细描述本发明。其中

图1示出抗CD20嵌合抗体Fab片段的构建。
图2示出抗CD20嵌合抗体Fab片段分离纯化产物的SDS-PAGE分析结果，其中泳道1为非还原条件下的纯化前的产物，泳道2为非还原条件下的纯化后的产物，泳道3为还原条件下的纯化前的产物，泳道4为还原条件下的纯化后的产物。
图3示出抗CD20嵌合抗体Fab片段与HI47单克隆抗体竞争性免疫荧光抑制实验FACS测定结果。
实施例1抗CD20单克隆抗体HI47轻链可变区和重链可变区基因的克隆应用RT-PCR方法从抗CD20抗体杂交瘤细胞株HI47(杨希峰等，上海免疫学杂志，第10卷第2期，1990年)中克隆抗CD20抗体轻重链可变区基因。具体操作如下抗CD20抗体轻重链可变区基因克隆RT-PCR扩增抗CD20抗体轻重链可变区基因1)总RNA提取采取异硫氰酸胍一步法(Chomczynski P，SacchiN，Anal．Biochem．1987，162156)。简言之，将107个抗CD20单克隆抗体杂交瘤HI47细胞，依次加入溶液D(储备液(50ml)异硫氰酸胍23．8g，0．75mol／L柠檬酸钠(PH 7．0)2．2ml，10％十二烷基氨酸钠3．3ml，加双蒸水至溶液体积为50ml；溶液D10ml储备液中加入72μl 2-巯基乙醇)，3M NaAc，苯酚，氯仿异戊醇混匀，冰浴10分钟后离心，上清加入等体积异丙醇，-20℃放置1小时，离心，取沉淀溶于溶液D中，再加入等体积的异丙醇，-20℃放置1小时，离心，弃上清，用70％乙醇洗沉淀，用DEPC处理过的ddH2O溶解沉淀。
2)逆转录取2μg总RNA置于0．5ml Eppendorf管中，依次加入600ng随机引物、4×dNTP各10nmol、RNasin 20μl，于65℃水浴5-10分钟，然后加入200U的M-MLV逆转录酶，37℃水浴放置1小时，转移至70℃水浴放置10分钟。
3)PCR扩增抗CD20单克隆抗体轻重链可变区基因轻链可变区基因PCR扩增反应体系(100μl)逆转录产物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR缓冲液10μl，Taq DNA聚合酶 2U，购于Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统的轻链扩增引物1、2各2μl，加水至终体积100μl。反应条件为95℃预变性5分钟后，再进行30循环的PCR扩增(94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟)，最后于72℃延伸10分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(100μl)逆转录产物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR缓冲液10μl，Taq DNA聚合酶2U，购于Pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统的重链扩增引物1、2各2μl，加水至终体积100μl。反应条件为95℃预变性5分钟后，再进行30循环的PCR扩增(94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟)，最后于72℃延伸10分钟。
用编码接头(GGGGS)3的寡核苷酸序列连接所获得的轻重链可变区基因，连接的轻重链基因经酶切后组装到单链抗体表达载体pCANTAB 5E相应的酶切位点中。采用电穿孔法将组装好的单链抗体(ScFv)表达载体转化大肠杆菌菌株TG1(本发明人所在实验室保存)，建立一个重组噬菌体抗体库。用ELISA法对抗体库筛选，获得几株分泌抗CD20单链抗体的克隆株。经核酸测序，免疫球蛋白(IgG)一级结构中特征氨基酸同源分析，证明我们克隆的基因是目的基因。实施例2抗CD20嵌合抗体Fab片段的构建以生物活性最好的抗CD20单链抗体克隆为模板来进行Fab片段的组装，其组装过程简要说明如下(见图1)用PCR法从抗CD20单链抗体(ScFv)表达载体扩增重链可变区(VH)、轻链可变区(VL)基因，用琼脂糖电泳分离纯化VH、VL基因。分别以MluI+ApaI、Mlul+StyI消化后分别重组到pYZH、pYZL载体(pYZH载体含有人免疫球蛋白γ1链CH1，为本发明人所在实验室构建，pYZL载体含有人免疫球蛋白K链CL，为本发明人所在实验室构建)相应的内切酶位点中，用所得的重组子pYZHcd20、pYZLcd20转化大肠杆菌16C9菌株(本发明人所在实验室保存)，扩增培养后提取pYZHcd20、pYZLcd20，分别以MluI+NheI、SpeI+SphI消化pYZLcd20、pYZHcd20，琼脂糖电泳分离纯化含VL、VH基因的相应DNA片段，将这两个片段和经MluI+SphI消化Fab表达载体pYZF(本发明人所在实验室构建)所得的载体片段连接成抗CD20嵌合抗体Fab片段表达载体pYZFcd20。实施例3抗CD20嵌合抗体Fab片段在大肠杆菌中可溶性表达及分析将实施例2获得的载体pYZFcd20转化大肠杆菌16C9菌株，挑取单菌落接种5ml含氨苄青霉素50μg／ml的2×YT培养基(蛋白胨16g／L，酵母膏10g／L，氯化钠5g／L，pH7．4)，37℃，200rpm，振荡培养6小时。6000rpm离心10分钟收集菌体，将菌体重新悬浮于20ml含氨苄青霉素50μg／ml的AP5培养基(每升培养基含酪素酸水解物11g，酵母膏0．6g，MgSO40．19g，葡萄糖1．5g，NH4Cl 1．07g，KCl3．73g，NaCl 1．2g，1M三乙醇胺pH 7．4 120ml)，30℃，250rpm，振荡培养20小时。6000rpm，4℃，离心10分钟收集菌体，将菌体于-20℃冻存1小时，化冻后加1ml细菌周质腔蛋白提取液(三羟甲基氨基甲烷25mM，乙二胺四乙酸1mM，苯甲基磺酰氟0．1mM，蔗糖20％(W／V)，氯化钠200mM，pH7．5)，混匀，于4℃轻摇1小时，尔后4℃，12000rpm，离心20分钟，取上清，用ProteinG柱(GIBCO BRL)分离纯化Fab片段。SDS-PAGE分析
按分子克隆实验操作指南(J．Sambrook，E．F．Fritsch，T．Maniatis等编著，金冬雁等译)881页上的方法配制12％的SDS聚丙烯酰胺凝胶。将上述经ProteinG柱分离纯化的Fab片段样品与样品缓冲液混合，100℃水浴3分钟。按次序上样，安排已知分子量的标准物。电泳开始时电压为8v／cm，染料进入分离胶后，将电压增加到15v／cm继续电泳直到染料抵达分离胶底部，断开电源。取下凝胶，用至少5倍体积的染色液(将25g考马斯亮蓝溶解于90ml甲醇∶水(1∶1)和10ml冰醋酸溶液中制成的溶液)浸泡凝胶，置脱色摇床上室温缓慢旋转3-4小时。换掉染色液，用脱色液(7％乙酸、5％甲醇溶液)浸泡凝胶，缓慢摇动4-8小时，其间换3-4次脱色液，直到满意为止，将脱色后的凝胶照相。Fab分离纯化产物SDS-PAGE分析见图2，从图2可见在非还原条件下(2道)Fab的分子量约为48kDa，与预期的分子量相同，而在还原条件下(4道)，轻重链之间的二硫键断裂，轻重链分开，因此在48kDa处的电泳带消失。表明处于48kDa处为Fab产物。实施例4竞争性免疫荧光抑制实验将1×106daudi细胞(CD20+，CD3-，本发明人所在实验室保存)悬于30μl浓度为60μg／ml的HI47单克隆抗体溶液，在4℃下孵育1小时。2000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，PBS洗细胞3次，将细胞重悬于30μl浓度为40μg／ml的实施例3所述Protein G纯化的Fab的溶液，4℃放置1小时，2000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，PBS洗细胞3次，将细胞重悬于30μl按校价稀释好的羊抗鼠IgG-FITC的溶液，4℃放置1小时，2000rpm，4℃离心10分钟，弃上清，PBS洗细胞3次，FACS测定。同时以抗CD3鼠源性抗体为阴性对照，以抗CD20的HI47鼠源性单克隆抗体为阳性对照，同样进行FACS测定。
抗CD20嵌合抗体Fab片段与HI47单克隆抗体竞争性抑制实验FACS测定结果见图3，当加入Fab时，阳性峰向左偏移，表明抗CD20嵌合抗体Fab片段能竞争性抑制HI47与CD20的结合，即Fab与CD20特异结合。
序列表SEQ ID NO1的信息序列长度366bp序列类型核酸分子类型cDNA序列描述SEQ ID NO11 CAGGTGAAGC TGCAGCAGTC AGGGGCTGAG CTGGTGAAGC CTGGGGCCTC AGTGAAGATG61 TCCTGCAAGG CTTCTGGCTA CACATTTATC AGTTACAATA TGCACTGGGT AAAGCAGACA121CCTGGACAGG GCCTGGAATG GATTGGAGGT ATTTATCCAG GAAATGGTGA TACTTCCTAC181AATCAGAAAT TCAAAGGCAA GGCCACATTG ACTGCAGACA AATCCTCCAG CGCAGCCTAC241ATGCAGCTCA GCAGCCTGAC ATCTGAGGAC TCTGCGGTCT ATTACTGTGC AAGATGGAAC301TATGGTAACT TCGGGGGGGG TACTATGGAC TACTGGGGCC AAGGGATCAC GGTCACCGTC361TCCTCASEQ ID NO2的信息序列长度318bp序列类型核酸分子类型cDNA序列描述SEQ ID NO21 GACATCGAGC TCACTCAGTC TCCAGCAATC CTGTCTGCAT CTCCAGGGGA GAAGGTCACA61 ATGACTTGCA GGGCCAGCTC AAGTGTAAGT TACATGCTCT GGTACCAGCA GAAGCCAGGA121TCCTCCCCCA AACCCTGGAT TTATGCCACA TCCCACCTGG CTTCTGGAGT CCCTACTCGC181TTCAGTGGCA GTGGGTCTGG GACCTCTTAC TCTCTCACAA TCAGCAGAGT GGAGGCTGAA241GATGCTGCCA CTTATTACTG CCAGCAGTGG ACTAGTAACC CACCCACGTT CGGTGCTGGG301ACCAAGCTGG AGCTGAAASEQ ID NO3的信息序列长度122个氨基酸残基序列类型氨基酸分子类型肽序列描述SEQ ID NO31 Q V K L Q Q S G A E L V K P G A S V K M S C K A S G Y T F I31 S Y N M H W V K Q T P G Q G L E W I G G I Y P G N G D T S Y61 N Q K F K G K A T L T A D K S S S A A Y M Q L S S L T S E D91 S A V Y Y C A R W N Y G N F G G G T M D Y W G Q G I T V T V121 S SSEQ ID NO4的信息序列长度108个氨基酸残基序列类型氨基酸分子类型肽序列描述SEQ ID NO41 D I E L T Q S P A I L S A S P G E K V T M T C R A S S S V S31Y M L W Y Q Q K P G S S P K P W I Y A T S H L A S G V P T R61F S G S G S G T S Y S L T I S R V E A E D A A T Y Y C Q Q W91T S N P P T F G A G T K L E L K R A
权利要求
1.一种抗CD20抗体的重链可变区基因，其具有SEQ ID NO1的序列。
2.由权利要求1的基因编码的多肽，其具有SEQ ID NO3的序列。
3.一种抗CD20抗体的轻链可变区基因，其具有SEQ ID NO2的序列。
4.由权利要求3的基因编码的多肽，其具有SEQ ID NO4的序列。
5.一种表达载体，其含有权利要求1的抗CD20抗体的重链可变区基因及权利要求3的抗CD20抗体的轻链可变区基因。
6.如权利要求5的表达载体，其为pYZFcd20。
7.如权利要求5或6的表达载体所表达的多肽。
8.权利要求7所述的多肽在制备用于B淋巴细胞瘤的治疗和诊断的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了抗CD
文档编号A61K39/395GK1292418SQ99121728
公开日2001年4月25日 申请日期1999年10月10日 优先权日1999年10月10日
发明者杨纯正, 朱祯平, 熊冬生, 许元富, 彭晖, 赖增祖, 邵晓枫, 范冬梅, 徐晨 申请人:中国医学科学院中国协和医科大学血液学研究所血液病医院