治疗糖尿病的新的脂肪酸类似物的制作方法

专利名称：治疗糖尿病的新的脂肪酸类似物的制作方法
技术领域：
本发明涉及可用于治疗和/或预防糖尿病的新的脂肪酸类似物。另外，本发明涉及包含这些脂肪酸类似物的营养组合物。
本发明背景在加拿大和美国，目前认为糖尿病及其并发症是第三大死因，仅次于癌症和心血管疾病。
用改性的脂肪酸治疗代表了治疗这类疾病的一种新途径。
EP345,038和PCT/NO95/00195描述了非β可氧化的脂肪酸类似物的应用。
现已发现这些脂肪酸类似物具有较广泛的应用。
而且，我们现在已合成了有效治疗糖尿病的新的脂肪酸类似物并描述了其特征。
在用该脂肪酸类似物的喂养实验中，结果表明这些化合物可降低脂肪组织的质量和体重，因此它们是治疗肥胖和超重的有效药物。
而且，我们还证实了脂肪酸类似物是有效的抗糖尿病化合物、对葡萄糖和胰岛素的水平具有很强的作用。
我们还证实了该化合物对再狭窄具有较好的作用，并且具有较好的抗氧化特性。
在加拿大和美国，目前认为糖尿病及其并发症是第三大死因，仅次于癌症和心血管疾病。虽然可通过胰岛素治疗来控制糖尿病的急性和常见的致命症状，但长期的并发症预期缩短了三分之一的寿命。与非糖尿病正常人的发病率相比，糖尿病患者的失明率增加了25倍、肾疾病增加了17倍、坏疽增加了5倍、心脏病增加了2倍。
糖尿病有两种主要形式。一种是Ⅰ型糖尿病，也叫做胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，另一种是Ⅱ型糖尿病，也叫做非胰岛素依赖性糖尿病(NIDDM)。大多数IDDM患者具有共同的病理表现胰岛素产生的胰β细胞几乎全部消失，导致高血糖。
积累的重要证据表明大多数IDDM是多年经常蔓延的无症状期间β细胞进行性破坏的结果。通过检测循环的岛细胞自身抗体和胰岛素自身抗体可识别糖尿病前期。
需要一种无毒且无副作用、并可抑制临床IDDM和NIDDM的化合物。
Ⅰ型糖尿病重度糖尿病，通常成年前突然发生，特征是血浆咦岛素水平低下、烦渴、多尿、食欲增加、体重减轻和发作性酮酸中毒；也指IDDM。
Ⅱ型糖尿病轻度糖尿病的常见形式，常见逐渐性发作，多见于成人，特征是血浆胰岛素的绝对水平正常至升高，它相对于血浆葡萄糖水平相对地低，也指NIDDM。
Ⅰ和Ⅱ型糖尿病的病因学分类一致，分别被认为是《原发性》糖尿病。
继发性糖尿病包括胰腺性糖尿病、胰腺外糖尿病/内分泌性糖尿病或药物诱导的糖尿病。而且，将糖尿病的一些类型分类为特殊形式。它们包括脂肪萎缩性糖尿病、肌弛缓性糖尿病和由胰岛素受体紊乱所引起的糖尿病。
考虑到我们社会中糖尿病非常流行，和上面所述的与其相关的严重后果，任何可有效治疗和预防这种疾病的治疗药物都对其健康具有很大的益处。在该领域需要一种可降低糖尿病患者血液中的葡萄糖浓度而没有明显的副作用的药物。
因此本发明的一个目的是提供一种用于降低血葡萄糖而治疗糖尿病的治疗方法。
本发明的另一个目的是提供一种用于降低血胰岛素浓度以增强剩余胰岛素的作用的治疗方法。
作用机制对天然脂肪酸进行少量改性，即用硫、硒或氧取代脂肪酸主链中的一个或多个碳。由式Ⅰ所定义的化合物具有独特的生物组合作用的特性。
对十四烷基硫代乙酸(TTA)进行了最彻底的研究，我们已证实了它们在各种试验动物中的一些有益作用。
这些研究表明TTA具有与天然脂肪酸非常相似的特性，主要区别在于TTA不通过线粒体β氧化系统氧化。但是，已证实本发明化合物的存在可增加其它(非取代的脂肪酸)的β氧化。
对大鼠施用TTA近12周可使单不饱和脂肪酸(主要为油酸)的肝浓度和血浆浓度增加一倍，而多不饱和脂肪酸(主要为亚油酸和DHA)减少了。因此，本发明化合物可使各种组织中的脂类组合物改性。还证实了本发明化合物可改变脂肪含量，并预期本发明化合物也能改变脂肪分布。
在治疗期间，给大鼠、小鼠、兔和狗之类的动物饲以中等剂量的TTA使血浆胆固醇和三甘油酯的水平都降低。我们还证实了TSA具有同样的效果，并且已证实在位置5或7用硫取代的本发明化合物可增加β氧化，由此预期这些脂肪酸类似物也可降低三甘油酯和胆固醇的血浆水平。TTA和TSA在这一点的效果远远强于诸如EPA的多不饱和脂肪酸。
如上所述，3-硫代脂肪酸的一个重要作用机制是显著增加线粒体的脂肪酸氧化作用，该氧化作用可减少酯化脂肪酸的利用度。三甘油酯和胆固醇的合成减少了、且来源于肝的VLDL的分泌降低了(10)。这具有减少LDL产生的作用。所有这些作用似乎至少部分通过过氧化物酶体增殖体活化受体(PPAR)、参与脂质代谢调节的普遍存在的转录因子来调节。我们证实了TTA是PPAR*的有效配体、调节脂肪酸和二十烷类的分解代谢的转录因子和PPAR*的效果较差的配体，PPAR*参与调节脂肪细胞分化。
肥胖症是非胰岛素依赖型糖尿病(NIDDM)的通常特征，是其病情发展的危险因素。NIDDM通常与高血压、血脂异常、血浆游离脂肪酸水平升高和日益增加的心血管疾病风险有关。NIDDM患者的特征是抵抗胰岛素对外周组织摄取的葡萄糖的作用和异常调节的胰岛素分泌。
我们已经证实TTA可降低高胰岛素血症，并显著增强胰岛素对葡萄糖利用的作用。TTA也可阻止食物诱导的胰岛素抵抗性。相对于现有公知的抗糖尿病药物glitazone,TTA不会重新增加体重。
这些作用至少可部分通过肝脏日益增加的脂肪酸流入和增强的脂肪酸氧化作用得到解释。该数据因而表明了TTA在体内脂质和葡萄糖动态平衡中的作用。
如本发明化合物的实验部分清楚显示的，它抑制给予高脂肪或者高蔗糖食物的动物体重和脂肪组织质量的增长。这使得本发明的化合物非常适于作用于肥胖治疗的药剂和/或营养剂，即该化合物可用作减轻体重或减少脂肪组织重量的减肥剂。
而且，通过减少血液中葡萄糖的浓度，本发明的化合物可用作一种抗糖尿病药物。我们也发现本发明的化合物可减少高胰岛素血症动物的血浆胰岛素的浓度。对于对胰岛素具有低敏感性的动物来说，本发明的化合物已经显示出可增强内源性胰岛素的作用。
术语《代谢综合症》用于描述多代谢综合症，尤其是高胰岛素血症、胰岛素耐受症、肥胖、葡萄糖不耐受症、2型糖尿病、血脂异常或高血压。
以上介绍的本发明的化合物对上述所有的病症都显示出积极的效果，即通过调节葡萄糖和脂质动态平衡，因此，预计本发明的化合物是用于调节上述代谢疾病(有时称之为综合征X)的适合药剂。
本发明的详细描述本发明公开了非细胞毒素浓度的改性脂肪酸类似物可用于治疗和预防肥胖、高血压和脂肪肝。
本发明涉及具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂用于制备治疗和/或预防糖尿病的药物组合物的应用-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
尤其是，本发明涉及具有通式Ⅰ的化合物的应用，其中糖尿病是Ⅰ型糖尿病。
本发明的优选实施方案涉及具有通式Ⅰ的化合物的应用，其中糖尿病是Ⅱ型糖尿病。
还有一个实施方案涉及糖尿病的类型，它选自继发性糖尿病，例如胰腺性糖尿病、胰腺外糖尿病/内分泌性糖尿病或药物诱导的糖尿病；或者糖尿病的特殊形式，例如脂肪萎缩性糖尿病、肌弛缓性糖尿病或由胰岛素受体紊乱所引起的糖尿病。
本发明的一种实施方案是其中m≥13的式Ⅰ化合物的应用。
本发明目前的优选实施方案包括式Ⅰ，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，Xi=5-25为CH2。
十四烷基硫代乙酸(TTA)和十四烷基硒代乙酸(TSA)，即Xi=3是硫和硒，分别是目前优选的化合物。
本发明另一方面还涉及式Ⅰ化合物用于制备治疗和/或预防叫做《代谢综症》的多代谢综合症的药物组合物的应用，尤其是高胰岛素血症、胰岛素耐受症、肥胖、葡萄糖不耐症、2型糖尿病、血脂异常或高血压。
本发明另一方面涉及治疗或预防糖尿病的方法，所述的方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的步骤-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-R代表氢或C1-C4烷基，一条件是至少Xi之一不是CH2。
按照上述方法，优选的实施方案如下-所述的动物是人。
-所述的动物是农用动物，例如鹑鸡类的鸟、牛、绵羊、公山羊或猪哺乳动物。
-所述的动物是家畜或观赏动物，例如狗或猫。
该治疗包括对需要这种治疗的患者施用有效治疗浓度的药物，它可以在给药期间动物的血液中大体上持续保持该有效浓度。
而且，本发明涉及到一种预防和/或治疗糖尿病的药物组合物。优选地，该药物组合物包括脂肪酸类似物和药学上可接受的载体或赋形剂的混合物。
本发明也涉及治疗和/或预防高血糖症、高胰岛素血症或胰岛素敏感性降低的方法，该方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)的脂肪酸类似物的步骤。
本发明还涉及包括一定量具有通式(Ⅰ)的脂肪酸类似物的营养组合物，它可有效地减少或防止人或非人动物的血葡萄糖浓度的增加。
本发明也涉及式ⅠCH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的新的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂；-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。


图1表示TTA对给予高脂肪饮食的大鼠的重量增加的影响；图2表示TTA对给予高蔗糖饮食的大鼠的重量增加的影响；图3表示TTA治疗抑制高脂肪饮食诱导的高胰岛素血症；图4表示TTA治疗抑制高脂肪饮食诱导的胰岛素耐受性；图5表示TTA治疗减少5周龄Zucker(fa/fa)大鼠的血液胰岛素和葡萄糖浓度；图6表示TTA治法减少4月龄Zucker(fa/fa)大鼠的血液胰岛素和葡萄糖浓度(图5B)；图7表示相对于血浆葡萄糖，TTA治疗产生的血浆胰岛素降低；
图8表示TTA疗法促进线粒体β-氧化。
本发明化合物的给药方法作为一种药剂，本发明化合物可以通过任何适合方法直接对动物给药，包括肠道外、鼻内、口服或通过皮肤吸收的方法。可以将它们局部给药或系统给药。每种试剂的特殊给药途径有赖于例如动物的医疗史。
肠道外给药的例子包括皮下、肌内、静脉内、动脉内和腹膜内给药。
通常认为，每剂量肠道外给药的每化合物的总药学有效量优选按患者体重计为约5 mg/kg/天-1000mg/kg/天，尽管如上所述，这将产生许多治疗的自行处理权。对于TTA，认为100-500mg/kg/天的剂量为优选，对于TSA，剂量可以是10-100mg/kg/天。
如果连续给药，典型的是本发明化合物每次通过1-4次注射/天或连续皮下注射皮下输注给药，例如使用微型泵。也可采用静脉内袋溶液。选择适当剂量时的关键因素是所得到的结果，这可通过总体重或脂肪与无脂肪量的比例的减少、或通过其它衡量有关对照或预防肥胖或预防肥胖相关疾病的标准来确定，这些是医师认为适当的。
对于肠道外给药，在一种实施方案中，本发明化合物通常是按以下配制即将每个组分按所需的纯度、可注射的单位剂型(溶液、悬浮液或乳剂)与药学上可接受的载体混合，即该载体在其所使用的剂量和浓度时对接受者是无毒的、且与制剂的其它成分是相容的。
一般来说，通过将本发明化合物分别与液体载体或粉碎的固体载体或这两者均匀并紧密地结合来制备这些制剂。然后，如需要，将产品制成所需的制剂。载体优选肠道外载体，更优选是与接受者的血液等渗的溶液。这些载体的例子包括水、盐水、林格式溶液和右旋糖溶液。诸如固定油和油酸乙酯之类的非水载体、以及脂质体也可用于本发明。
该载体可适当含有少量添加剂，例如增加等渗性和化学稳定性的物质。这些物质在其所使用的剂量和浓度时对接受者是无毒的，其包括缓冲剂，例如磷酸盐、柠檬酸盐、琥珀酸盐、乙酸和其它有机酸或其盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；免疫球蛋白；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其它碳水化合物，其包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂，例如EDTA；糖醇，例如甘露糖醇或山梨糖醇；抗衡离子，例如钠；和/或非离子表面活性剂，例如聚山梨酯，泊洛沙姆或PEG。
对于口服药物组合物，可以使用诸如水、明胶、树胶、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、滑石、油、聚二醇、矿脂之类的载体物质。这种药物制剂可以是单位剂型，且可另外包含其它有治疗价值的物质或常见药物佐剂，例如防腐剂、稳定剂、乳化剂、缓冲剂等等。这些药物制剂可以是常规的液体形式例如片剂、胶囊、糖锭剂、安瓿剂等，可以是常规剂型，例如干安瓿剂和栓剂等。
采用本发明化合物的这种治疗可以不限制饮食或配合饮食限制，例如限定每天的食物或卡路里摄取，这些是个别患者所需要的。
另外，本发明化合物可适当与其它对抗或预防肥胖的疗法结合进行给药。
参考下面的实施例可以更全面地理解本发明。但是，不应认为是对本实验部分方法肥胖的Zucker(fa/fa)大鼠这里研究用的肥胖的Zucker(fa/fa)大鼠在U 465 INSERM动物实验室饲养，其最初的一对是由Harriet G.Bird实验室(Stow,MA,USA)提供。除另有说明，在连续的白昼-黑夜循环(早上7:00至晚上7:00光照)于21±1℃供养动物，并且食物和水可自由进食。每笼三只大鼠。每天记录增加的重量。
Wistar大鼠重280-358雄性Wistar查尔斯河大鼠购自AnLab有限公司(布拉格，捷克共和国)，置于铁丝网笼中，控制房间的温度(21±1℃)和光照(早上7:00至晚上7:00光照)。它们都能自由进食和饮水。每笼三只大鼠。每天记录增加的重量和食物摄取量。
动物饲养实验中采用的饮食(按重量％给予)标准饮食以购自Velaz，布拉格，捷克共和国的标准实验室大鼠食物ST1饲养大鼠。
高蔗糖饮食(HS)50.3％蔗糖、4.8％明胶、3.2％干草、2.3％维它命和矿物、8.7％酵母、8.7％奶粉、12.3％酪蛋白、9％牛脂、1％葵花油。
HS+TTA即溶解在牛脂中的HS+O.3％TTA。
HS+鱼油(FO)以10％Triomar代替牛脂和葵花油，Triomar购自Pronova Biocare，挪威，它含有33.4％EPA,3.1％DPA和20.2％DHA。
高脂肪(HF)1.9％明胶、5.7％麦麸、7.7％维它命和矿物、25.4％玉米淀粉、25.7％酪蛋白、26.8％牛脂和7.1％葵花油。
HF+TTA即溶解在牛脂中的HF+0.4％TTA。
HF+FO以10％Triomar代替10％牛脂。
静脉内葡萄糖耐受试验5小时禁食后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉雄性Zucker(fa/fa)大鼠(5周龄)。在隐静脉中注射葡萄糖(0.55g/kg)，葡萄糖注入后0、5、10、15、20和30分钟时从尾静脉收集血样至有肝素的试管中。将样本置于冰上、离心并且将血浆贮存在-20℃直到分析。
高胰岛素血症的正常血糖控制(clamp)给予它们各自食物21天后(参见上述)，通过注射甲苯噻嗪盐酸盐(Rometar SPOFA，布拉格，捷克共和国；10mg/ml)和氯胺酮盐酸盐(Narkamon SPOFA，布拉格，捷克共和国；75mg/ml)麻醉大鼠，并且如Koopmans等人描述的(Koopmans,S.J.，等，Biochim Biophys Acta,1115,2130-2138 1992.)以长期的(chronic)颈动脉和颈静脉导管注入。按照Kraegen等人的方案实施(Kraegen,E.W.等人，Am J Physiol,248,E353-E362 1983)，控制研究前的手术后，插入导管的大鼠允许恢复2天。如此，手术后第三天，给意识未受限制的大鼠连续灌输剂量为6.4mU/kg/分钟的猪胰岛素(Actrapid,Novo Nordisk，丹麦)，以达到血浆胰岛素水平在生理学范围之上。通过30％w/v葡萄糖溶液(Leciva，布拉格，捷克共和国)的可调灌输，动脉的血糖浓度控制在基础禁食水平。每隔15分钟从葡萄糖灌输起始收集用于确定血浆葡萄糖和胰岛素浓度的血液样本。90分钟后，断开大鼠的灌输，立即处死，收集血液并分离血浆，解剖肝脏和附睾脂肪组织垫并称重。
血浆参数的测量采用酶法测量葡萄糖(GLU,Boehringer Mannheim，德国)，游离脂肪酸(NEFA,C ACS-ACOD试剂盒；Wako Chemicals,Dalton,USA)和b-羟基丁酸盐(310-A试剂盒；Sigma Diagnostics Inc.,St.Louis,USA)浓度。通过Zucker大鼠标准的大鼠胰岛素的放射性免疫测定(CIS国际生物公司，Gif sur Yvette，法国)确定胰岛素浓度。对于Wistar查尔斯河大鼠，借助于Beckman葡萄糖分析仪(Fullerton,CA,USA)测定血浆葡萄糖浓度。采用Linco研究公司(St.Charles,MO,USA)的放射免疫分析试剂盒测定血浆胰岛素水平。通过法国bioM*rieux,Marcy-l’Etoile的酶法检测磷脂。通过美国no.SA4-0324L90 Technicon法，检测三酰基甘油，通过美国no.SA4-0305L90 Technicon法检测胆固醇。
核后和线粒体片段的制备和酶活性的检测将从单个的老龄的Zucker大鼠新鲜分离的肝脏以冰冷的蔗糖缓冲液(0.25M蔗糖，10mM HEPES(pH7.4)和2mM EDTA)均质化。采用按照DeDuve等人的制备差示离心法(DeDuve,C.，等，《生物化学杂志》，60,604-6171955.)制备核后和线粒体片段。改性、纯度和收率如早期所述(Garras，A.,等，Biochim.Biophs.Acta.1255,154-160 1995)。如早期描述的(willumsen,N.，等，《脂类研究杂志》，34,13-22 1993)，采用[1-14C]-棕榈酰-辅酶A和[1-14C]-棕榈酰-L-肉毒碱(放射化学中心，Amersham,英国)作为底物，检测核后和富含线粒体片段的酸溶物。如Bremer描述的(Bremer,J.,Biochim.Biophys.Acta,665,628-631 1981.)，检测主要在核后和线粒体片段中的肉毒碱棕榈酰转移酶-Ⅰ和-Ⅱ活性，按照Clinkenbeard等人的方法(Clinkenbeard,K.D.，等，《生物化学杂志》,250,3108-3116 1975.)，检测3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶。
RNA分析按照以前所述(Vaagenes,H.，等，《生化药理学》(Biochem.Pharmacol.),56,1571-1582 1998.)进行RNA提取(Chomczynski,P.，等，《分析生化》(Anal.Biochem.),162,156-159 1987.)、尼龙滤器上的RNA的Northern印迹法分析和狭线印迹分析，以及固定RNA的杂化作用。下列cDNA片段用作探针CPT-Ⅰ,(Esser,V.等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),268,5817-5822,1993),CPT-Ⅱ(Woeltje,K.F.,等，《生物化学杂志》(J.Biol.Chem.),265,10720-10725 1990.),3-羟基-3-甲基戊二酰基-辅酶A合酶(Ayte,J.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,87,3874-3878 1990.)，和激素敏感脂酶(Holm,C.，等，Biochim.Biophys.Acta,1006,193-197 1989.)。预计相关的RNA表达的水平与对相应的28S rRNA水平杂交的放射活性探针的数量相同。
结果实施例1．化合物的制备和表征a)新化合物的合成根据有关具有下列改性的3-取代类似物(见下文)的一般描述来合成具有不定位的杂原子的脂肪酸烷基-卤被链烷酸(Alcanoic)-卤取代，HS-CHCOOR被烷基-SH取代。
对下列脂肪酸类似物进行制备和表征

按如下所述纯化产物。纯度＞95％。通过质谱测定法验证其结构。
b)3-取代的脂肪酸类似物的合成根据下列常用方法可制备本发明所用的其中取代基Xi=3是硫原子或硒原子的化合物X为硫原子本发明的硫取代化合物可以根据下面所示的常规方法制备 按照EP-345,038所述制备硫化合物，即十四烷基硫代乙酸(TTA)(CH3-(CH2)13-S-CH2-COOH)。
X为硒原子本发明的硒取代化合物可以根据下面所示的常规方法制备1．烷基-卤+KSeCN烷基-SeCN…2．烷基-SeCN+BH4-烷基-Se-3．烷基-Se-+O2烷基-Se-Se-烷基此化合物可通过从乙醇或甲醇的仔细结晶而纯化。 5．烷基-Se-+卤-CH2-COOH烷基-SeCH2-COOH可以通过从乙醚和己烷的结晶来纯化最终化合物，例如当烷基是十四烷基，CH3-(CH2)13-Se-CH2-COOH(十四烷基硒代乙酸(TSA))。可以通过NMR、IR和分子量测定来全面表述该成品的特性。
在欧洲专利号345,038和国际专利申请号WO97/03663中描述了这些硫和硒化合物以及其中式Ⅰ的X为氧(O)、硫的一氧化物(SO)和二氧化物(SO2)的化合物的合成和分离方法。
实施例2TTA的毒性研究根据GLP原则由英国Corning Hazleton(欧洲)进行了狗的28天毒性研究。口服给予剂量达500mg/kg/天的TTA通常完全能忍受。在给予高剂量的动物中，一些脂类相关参数降低了。这与TTA的药理活性一致。
500mg/kg/天的剂量也使体重减轻了。50或500mg/天/kg的剂量没有出现毒性。
英国Covance有限实验室进行了诱变活性试验。结论是TTA和TSA没有诱导鼠沙门氏杆菌和大肠杆菌的菌株突变。而且，当在小鼠淋巴瘤细胞和L5178Y中试验时，TTA没有致突变。
在鼠沙门氏杆菌和大肠杆菌中试验的化合物的浓度为3-1000mg/平板(TTA)和2-5000mg/平板(TSA)。在小鼠淋巴瘤细胞、L5178Y中，浓度为2,5-50mg/ml。
在这些试验中没有发现TTA和TSA产生致突变。在培养的中国仓鼠卵巢细胞中对TSA和TTA进行了染色体畸变试验，试验剂量(12-140mg/ml)没有诱导畸变。
因此本发明化合物在这方面作为药物化合物具有潜在作用。
实施例3．在肥胖动物中TTA产生的降脂作用实验开始时将重100g的雄性肥胖Zucker fa/fa大鼠成对地置于金属丝笼中，室内保持12小时白昼一黑夜循环和20±3℃恒温。在实验开始之前，动物在这些条件下至少要适应一周。
将按照先前描述所制备的TTA(十四烷基硫代乙酸)，和棕榈酸(对照)，悬浮在0.5(w/v)羧甲基纤维素(CMC)中。两组都采用六只动物。TTA(十四烷基硫代乙酸)和棕榈酸给药剂量为300mg/天/kg体重，经胃插管(管饲法)给药10天，每天1次。在实验结束之前大鼠禁食2小时。收集血液和器官。如方法部分所述的，采用自动分析仪测定血浆中的脂质浓度。表1报告了所得结果。
表1TTA对肥胖Zucker fa/fa大鼠的脂质水平的作用

结果清楚地显示TTA降低了血浆中甘油三脂、胆固醇和磷酯的水平。
实施例4正常动物(Wistar大鼠)中TTA和TSA产生的降脂作用实验开始时将重180-200g的雄性Wistar大鼠分别置于金属丝笼中，室内保持12小时的白昼-黑夜循环和20±3℃恒温。在实验开始之前，动物在这些条件下至少要适应一周。
将TTA、TSA和二十碳五烯酸(EPA)悬浮在0.5％(w/v)羧甲基纤维素(CMC)中。每个治疗采用六只动物，同时给予大鼠0.5％CMC溶液作为对照。在施用试验化合物后，大鼠禁食12小时并以卤乙烷麻醉。将EPA和脂肪酸衍生物经胃插管(管饲法)给药7天，一天一次。通过心脏穿刺收集血样，如方法部分总结的，确定血浆中的脂质浓度。结果如表2所示表2TTA、TSA和EPA对大鼠血浆脂质水平的作用

表2显示TTA对大鼠血液内的脂质具有良好的降低作用。显然要达到与TSA获得的血浆脂质浓度下降相同的效果，需要100倍剂量的EPA。此外，本发明取代的脂肪酸化合物比纯的EPA和鱼油在降低血浆脂质上更有效。因此，它们可有效地用作医用化合物。
实施例5TTA对高脂肪饮食饲养的Wistar查尔斯河大鼠的影响以三种不同的饮食(参见方法)随意饲养雄性Wistar查尔斯河大鼠(280-360g)3周。之后，斩首处死，解剖肝脏和附睾脂肪组织垫并称重。
给Wistar大鼠食用高脂肪食物，从而提高了附睾和腹膜后的脂肪垫重量。TTA治疗抑制了脂肪组织质量的增长，并且该作用与食物的消耗无关，这点是相同的(高脂肪15.1±1.1对比高脂肪+TTA14.8±1.3g/鼠/天)。
表3三周期间，添加和不添加TTA的高脂肪饮食对高脂肪饮食饲养的Wistar查尔斯河大鼠的体重增长、肝脏重量和脂肪组织重量的影响。

数值以平均值±SEM表示。
实施例6TTA降低正常大鼠总体重随机选择2组6只雄性Wistar大鼠，研究它们在12周期间重量的增长。实验开始测量每只Wistar大鼠的体重。在12周的实验期间，所有两组动物分别食用同样数量的食物(营养物)。两组中的一组动物口服给予含有TTA的药物。其它一组是对照组(CMC)。12周后再测量大鼠的体重。
表4给出的结果显示口服给药TTA导致显著的重量损失。
表4TTA对12周治疗后的雄性Wistar大鼠体重的影响

实施例7TTA对高脂肪饮食饲养的Wistar查尔斯可大鼠的影响图1表示经3周后体重增长(g)/食用食物总量(g)的累积值。通过每天平均增长的体重除以当天食用的食物平均数量，计算该数值。饮食的缩写和说明参见方法部分。
方法部分给出了食物组合物。
实施例8TTA对高蔗糖饮食饲养的Wistar查尔斯河大鼠的影响图2表示经3周体重增长(g)/食用食物总量(g)的累积值。通过每天平均增长的体重除以当天食用的食物平均数量，计算该数值。饮食的缩写和说明参见方法部分。
方法部分给出了食物组合物。
实施例9TTA对肥胖动物的体重增长、肝脏和脂肪组织重量的影响还试验了TTA对肝脏和脂肪组织重量的影响。结果如表5所示。
按300/kg/天给5周龄的雄性Zucker(fa/fa)大鼠食用悬浮于0.5％CMC中的TTA。对照动物仅给予CMC。治疗11天后，脱颈椎处死大鼠，解剖肝脏和附睾脂肪组织垫并称重。数值是对照组6只动物和实验组6只动物的平均值±SD。表5TTA对幼龄肥胖Zucker(fa/fa)大鼠的体重增长、肝脏和脂肪组织重量的影响。

实施例10．
TTA引起狗的体重减轻实验期间将3只雄性狗(4-6月龄)单独放置。每天早上定量给药后，提供每个动物400g的SQC食物A，在下午清除任何残留食物。该药物以胶囊形式口服给药28天，一天一次。
表6以500mg TTA/kg/天治疗4周的雄性狗的平均体重

实施例11．TTA疗法抑制HF饮食引起的正常大鼠的高胰岛素血症将重280-360g的大鼠分成3组(n=6)，并且以三种不同的饮食饲养标准鼠食，高脂肪饮食(HF)和添加TTA的HF。分别给予饮食21天，在头天晚上禁食后从尾静脉收集血液。数值以平均值±SEM表示。通过ANOVA分析结果，不同的字母表示统计学上的显著性(p＜0.05)。
图3显示TTA疗法抑制高脂肪饮食引起的Wistar查尔斯河大鼠的高胰岛素血症。
实施例12TTA治疗抑制HF饮食引起的正常大鼠的胰岛素耐受性将重330±20g的大鼠分成3组(n=9)，并且食用三种不同的食物标准鼠食、高脂肪饮食(HF)和添加TTA的HF。分别给予食物21天后，如材料和方法部分所述的，在意识清醒的动物中进行90分钟的高胰岛素血症的血糖正常控制。从血糖变得稳定的控制期间，即，控制开始后45-90分钟检测葡萄糖灌输速度(GIR)，数值以平均值±SEM表示。
制定一项高胰岛素血症的血糖正常控制方案，以试验摄取TTA饮食是否会提高喂养高脂肪引起的大鼠胰岛素功能的损伤。90分钟的高胰岛素血症的血糖正常控制产生稳定水平的血浆葡萄糖和血浆胰岛素，研究的三组均无区别。相对于标准饮食喂养的Wistar大鼠，HF组中外源性葡萄糖输注速率(GIR)有显著的下降以维持血糖正常(图4)。有趣的是，如完全正常的GIR所证明的，添加TTA的HF饮食抑制了这些大鼠的胰岛素耐受性的发展。这显示了TTA对体内胰岛素功能的有益作用。
图4显示TTA疗法抑制高脂肪饮食引起的Wistar查尔斯河大鼠的胰岛素耐受性。
实施例13TTA对肥胖动物的血浆胰岛素和葡萄糖水平的作用5周龄Zucker(fa/fa)大鼠如图5所示，TTA疗法减少了近40％血浆胰岛素浓度，同时血糖浓度大约降低15％。
用口服管饲法对大鼠(n=6)施用剂量为300mg/kg/天的悬浮在O.5％CMC中的TTA。治疗11天后，脱颈椎处死大鼠。如方法部分所示，收集血液、并测量胰岛素和葡萄糖的水平。数值为平均值±S.D。
按照Zucker,L.M.等所述(Sparks,J.D.等，《代谢》(Metabolism)，47,1315-1324 1998.)，这些幼龄动物并没有发生高血糖症。
4月龄肥胖Zucker(fa/fa)大鼠图6表示TTA对4月龄Zucker(fa/fa)大鼠、即已发生高血糖症的大鼠的血液胰岛素和葡萄糖水平的作用(Sparks,J.D.等，《代谢》(Metabolism),47,1315-1324 1998.)。
给大鼠食用含(n=5)或不含(n=6)0.15％TTA的标准饮食。治疗21天后，收集血液，并测量胰岛素和葡萄糖的水平。数值为平均值±S.D。
实施例15相对于葡萄糖，TTA治疗降低血浆胰岛素为了研究TTA治疗是否引起胰岛素对葡萄糖利用的作用增强，进行了静脉内葡萄糖耐受试验(IVGTT)。5周龄Zucker(fa/fa)大鼠中，相对于葡萄糖，TTA疗法导致显著的低血浆胰岛素(图7A)。IVGTT葡萄糖曲线是正常的，且在TTA治疗组和对照组大鼠之间比较起来是类似的(图7B)。
实施例16TTA对线粒体β-氧化作用的影响给肥胖Zucker(fa/fa)大鼠食用含(n=5)或不含(n=6)0.15％TTA的标准饮食。治疗21天后，脱颈椎处死大鼠并摘除肝脏。从个体肝脏中分离线粒体片段。采用[1-14C]-棕榈酰-辅酶A和[1-14C]-棕榈酰-L-肉毒碱作底物测定脂肪酸氧化速率，在线粒体片段中测定(A)CPT-Ⅰ(B)和CPT-Ⅱ(C)。进行RNA纯化和杂交实验。通过放射自显影图的光密度分析(densiometric)扫描测定有关的mRNA水平，不同的mRNA水平恢复正常至相应的28s rRNA，对照组的平均值设为1。分别用棕榈酰-辅酶A和棕榈酰-L-肉毒碱作为底物，对照组肥胖动物的酸溶性产品的形成是1.3±0.7和5.3±2.2nmol/g肝脏/分钟。对照组大鼠的CPT-Ⅰ活性是22±4.9nmol/g肝脏/分钟，对照组大鼠CPT-Ⅱ活性是270±115nmol/g肝脏/分钟。数值表示为平均值±S.D。
TTA给药提高酮体的血浆浓度，引起FFA/酮体比率显著下降(表7)。这些数据显示4月龄肥胖Zucker(fa/fa)大鼠的TTA治疗，促进了肝脏的线粒体β-氧化作用和生酮作用。的确，以棕榈酰-辅酶A和棕榈酰-L-肉毒碱作为底物(图8A)测量时，对肥胖Zucker(fa/fa)大鼠的TTA治疗增加了超过7倍的肝脏脂肪酸氧化作用。这种β-氧化作用的诱导伴随着CPT-Ⅰ(图8B)和CPT-Ⅱ(图8C)mRNA活性和水平的提高。
此外，生酮作用中的限速酶的活性也提高了(表7)。
表7TTA对老龄肥胖Zucker大鼠血浆游离脂肪酸(FFA)和酮体(4-羟基丁酸盐)浓度的影响。

对照和实验组的数据均是六只动物的平均值±SD。测定血浆中游离脂肪酸(FFA)和酮体(4-羟基丁酸盐)，并且测定由21周龄雄性肥胖Zucker(fa/fa)大鼠肝脏制备的线粒体片段中的3-羟基-3-甲基戊二酰(HMG)，这些大鼠食用15天的标准饮食(对照)，或者食用含有0.15％TTA的标准饮食。
实施例17TTA对肝脏三酰甘油水平的作用由TTA引起的显著增加的线粒体脂肪酸氧化作用将减少脂肪酸的酯化利用度。因而，减少了三酰甘油和胆固醇的合成，且减少了肝脏的VLDL分泌。这反应在肝脏的三酰甘油水平降低，血浆中的三酰甘油降少，以及脂肪组质量的减少。基本的和总的lypolysis并没有变化(数据未显示)，血浆游离脂肪酸和酮体的比率下降(数据未显示)。这表明，增加了来自外周组织的脂肪酸至肝脏氧化的流量。
甚至增长的肝脏三酰甘油水平也可以通过TTA减少。食用脂肪酸氧化作用抑制剂的大鼠会提高导致脂肪肝的肝脏三酰甘油水平。十四烷基-4-硫代丙酸(TTP)是一种4位上具有硫原子的脂肪酸类似物。由于线粒体抑制因子形成，这种类似物抑制脂肪酸的β-氧化作用。用这种类似物饲养的大鼠可产生肥胖。然而，如果给大鼠喂食TTA和TTP的混合物，则可以避免脂肪肝的形成(表8)。这证明了TTA可用于肝脏三酰甘油水平升高的疾病的治疗。
雄性Wistar大鼠可自由获取水和鼠平衡饮食。给它们食用悬浮在0.5％CMC中的棕榈酸或脂肪酸类似物6天。在一些实验中，在同时给予6天TTA和TTP之前，单独食用3天TTA或TTP。实验末，前天晚上大鼠禁食，处死，摘除肝脏并均质化。在匀浆中测定三酰甘油。
表8以棕榈酸和脂肪酸类似物治疗6天的大鼠的肝脏三酰甘油水平(TTA150mg/kg/天－TTP300mg/kg/天)

实施例18硫原子自脂肪酸的羧酸基团进一步移动至预定位置，这样合成了脂肪酸类似物。当硫原子取代于奇数位(5,7,9等)的碳链时，这些类似物被部分β-氧化。β-氧化每次从脂肪酸的羧基端去掉两个C原子，这些类似物从而可β-氧化直到硫原子转至3-位。因而可以认为这些类似物具有类似于TTA的生物效应。实验已经显示，与碳链奇数位为硫原子相关的脂肪酸类似物均会提高线粒体的β-氧化作用(表9)。
如实施例16，采用[1-14C]-棕榈酰-L-肉毒碱作为底物，测定线粒体的β-氧化。
表9不同脂肪酸类似物对大鼠肝脏内线粒体β-氧化作用的影响

实施例19实验开始时，将重100g的雄性肥胖Zucker fa/fa大鼠成对地置于金属丝笼中，室内保持12小时白昼-黑夜循环和20±3℃恒温。在实验开始之前，动物在这些条件下至少要适应一周。
将TTA和棕榈酸(对照)悬浮于0.5％(w/v)羧甲基纤维素(CMC)中，其给药剂量为300mg/天/kg体重，经胃插管(管饲法)给药10天，每天1次。在实验结束之前大鼠禁食2小时。收集血液和器官。从肝脏和血浆中提取总的脂质。用Carlo Erba 2900气相色谱分离之前，蒸发、皂化和酯化该脂质。
表10化合物Ⅰ(十四烷基硫代乙酸)对肥胖Zucker fa/fa大鼠的脂肪酸组合物的作用

表10表示TTA口服给药能提高肝脏和血浆中油酸的水平。另外TTA的δ-9-去饱和产物累积在血浆和肝脏中。
权利要求
1．具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂用于制备治疗和/或预防糖尿病的药物组合物的应用-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xj相互无关、选白O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
2．根据权利要求1的应用，其中糖尿病为Ⅰ型糖尿病。
3．根据权利要求1的应用，其中糖尿病为Ⅱ型糖尿病。
4．根据权利要求1的应用，其中糖尿病是选自下组的一种形式继发性糖尿病，例如胰腺性糖尿病、胰腺外糖尿病/内分泌性糖尿病或药物诱导的糖尿病，或者糖尿病的特殊形式，例如脂肪萎缩性糖尿病、肌弛缓性糖尿病或由胰岛素受体紊乱所引起的糖尿病。
5．根据权利要求1的应用，其中m≥13。
6．根据权利要求1的应用，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，且其中Xi=5-25为CH2。
7．根据权利要求6的应用，其中Xi=3是硫。
8．根据权利要求6的应用，其中Xi=3是硒。
9．具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂用于制备治疗和/或预防叫做《代谢综合征》的多代谢综合症的药物组合物的应用，尤其是该综合征的特征为高胰岛素血症、胰岛素耐受症、肥胖、葡萄糖不耐症、2型糖尿病、血脂异常和/或高血压。
10．根据权利要求9的应用，其中其中m≥13。
11．根据权利要求9的应用，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，Xi=5-25为CH2。
12．根据权利要求11的应用，其中其中Xi=3是硫。
13．根据权利要求11的应用，其中其中Xi=3是硒。
14．一种治疗或预防糖尿病的方法，该方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的步骤-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
15．根据权利要求14的方法，其中所述的动物是人。
16．根据权利要求14的方法，其中所述的动物是农用动物，例如鹑鸡类的鸟、牛、绵羊、公山羊或猪哺乳动物。
17.根据权利要求14的方法，其中所述的动物是家畜或观赏动物，例如狗或猫。
18．根据权利要求14的应用，其中m≥13。
19．根据权利要求14的方法，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，且Xi=5-25为CH2。
20．根据权利要求19的方法，其中Xi=3是硫。
21．根据权利要求19的方法，其中Xi=3是硒。
22．根据前述权利要求之一的方法，其中施用脂肪酸类似物以便给药期间动物的血液中大体上持续保持治疗上的有效浓度。
23．根据前述权利要求之一的方法，其中所述的脂肪酸类似物组合物是单位剂型的形式。
24．根据前述权利要求之一的方法，其中所述的脂肪酸类似物是经口服给药或非肠道给药。
25．一种治疗或预防高血糖症的方法， 该方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的步骤-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
26．一种治疗或预防高胰岛素血症的方法，该方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的步骤-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
27．一种治疗和/或预防对胰岛素的敏感性降低的方法，该方法包括对需要治疗的动物施用有效量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的步骤-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
28．一种预防和/或治疗动物糖尿病的药物组合物，该药物组合物包括具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
29．根据权利要求28的药物组合物，其中所述的药物组合物包括脂肪酸类似物与药学上可接受的载体或赋形剂的混合物。
30．根据权利要求28的药物组合物，其中m≥13。
31．根据权利要求28的药物组合物，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，且其中Xi=5-25为CH2。
32．根据权利要求31的药物组合物，其中Xi=3是硫。
33．根据权利要求31的药物组合物，其中Xi=3是硒。
34．一种包含一定量的具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与-COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的营养组合物，它可有效地减少或防止人或非人动物的血葡萄糖浓度的增加。
35．一种降低需要治疗的人或非人动物的血葡萄糖浓度的方法，该方法包括对其施用有效量包含具有通式(Ⅰ)CH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂的组合物-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
36．根据权利要求35的方法，其中其中m≥13。
37．根据权利要求32的方法，其中Xi=3是选自O、S、SO、SO2和Se，且Xi=5-25为CH2。
38．根据权利要求37的方法，其中Xi=3是硫。
39．根据权利要求37的方法，其中Xi=3是硒。
40．根据权利要求35的方法，其中所述的动物是人。
41．一种具有通式ⅠCH3-[CH2]m-[Xi-CH2]n-COOR的新的脂肪酸类似物或其盐、前体药物或复合剂-其中n为1-12的整数，和-其中m为0-23的整数，和-其中i为奇数、它表示与COOR相关的位置，和-其中Xi相互无关、选自O、S、SO、SO2、Se和CH2，和-其中R代表氢或C1-C4烷基，-条件是至少Xi之一不是CH2。
全文摘要
本发明涉及具有通式(Ⅰ):CH
文档编号A61K31/28GK1302204SQ99805966
公开日2001年7月4日 申请日期1999年4月23日 优先权日1998年5月8日
发明者罗尔夫·贝格 申请人:西尔医疗有限公司