专利名称：与诊断/治疗剂有关的改进的制作方法
技术领域：
本发明涉及包含气体微泡的诊断和/或治疗活性剂，更具体地说，涉及包含用脂肽稳定化的气体微泡的诊断和/或治疗活性剂。如果需要，这些活性剂中可以引入对身体中的位点和/或结构具有亲合力的部分，从而可以增强体内特定部位的诊断成像和/或治疗。其中特别令人感兴趣的是用于超声波成像的诊断剂。新的脂肽构成了本发明的另一个特征。
众所周知，超声波成像包括可能非常珍贵的诊断器械，例如在血管系统、特别是在心动描记法中和在组织微脉管系统的研究中。现已提出了用于增强所得到的声像的各种各样的造影剂，包括固体颗粒的悬浮液、乳化液滴、气泡和包囊气体或液体。普遍可以接受的是，容易压缩的低密度造影剂在产生声反向散射方面是特别有效的，因此已在制备含有气体和生成气体的系统方面引起极大兴趣。
最初与通过心内注射可药用物质而在体内产生游离气泡有关的研究已证明了这类气泡作为回波描记术中的造影剂的潜在效能；然而，由于游离气泡的寿命非常短，使得这类技术在实际应用中受到很大限制。于是，稳定用于心回波描记术和其他超声波研究的气泡的方法引起了人们的兴趣，例如通过使用乳化剂、油、增稠剂或糖，或者通过在各种系统中产生或封包气体或其前体，例如作为含有气体的多孔微粒或作为包囊气体微泡。
有许多在先技术是关于可能存在于微粒、微泡等中的包囊物质和气体的性质的。一个优选的包囊系统使用带负电荷的磷脂作为成壁物质来使气体微泡稳定化-参见WO-A-9729783，该文结合在此作为参考并且此文中含有对这方面在先技术的全面回顾。尽管已进行了大量的研究，但仍然需要可用作超声造影剂并且是药理学上耐受和可产生回波的、稳定化的气体填充微泡或微粒。例如，许多现有造影剂因连续接受超声波处理而遭到破坏，因此，造影剂稳定性的任何一点增强都可减少此问题的出现。
近来已经发现，某些带有交替疏水残基和亲水残基的肽可以自发地形成稍放大即能可见的肽膜，这些肽膜可能是有用的医学产品用生物材料，例如作为用于缓慢扩散型药物释放的载体、隔离材料、可生物降解的聚合物和人工缝合线。US-A-5,670,483描述了用从蛋白质zuotin产生的肽EAK16形成的膜〔参见Zhang,S,《生物聚合物》(1994年)34,663；Zhang,S,《生物材料》(1995年)16,1385；和Zhang,S,《美国国家科学院院报》(1993年)90,3334〕。这些膜在水溶液中是稳定的，并且能抵抗热、酶降解、碱性和酸性pH的降解作用；同时也发现它们是非细胞毒性的。这些肽在水溶液中是可溶的，并且按照US-A-5,670,483的描述，它们需要至少12个氨基酸残基的序列长度，优选16个残基以上，目的是形成膜结构。
Fujita,K.等在《生物物理学进展》(1997年)34,127中描述了使用螺旋肽的超分子组件。当利用超声处理方法将这类肽悬浮于含水介质中时，得到了称之为“肽质体”的囊泡的分散体。这些肽质体具有与标准脂质体类似的大小分布，即在纳米范围内的；一般它们的平均粒径为75nm。Imanishi,Y.等在《超分子科学》(1996年)13中描述了其他包含肽结构的分子组件，其中发现短杆菌肽A/PEG缀合物也形成纳米尺寸范围内的肽质体。
我们现已发现，一定范围内的脂质取代的肽衍生物，在本文中称作脂肽，可以用于形成适于用作例如超声回波描记术中的诊断和/或治疗剂的稳定化的气体微泡。已发现这类微泡显示出良好的稳定性，例如在成像操作中的超声波处理过程中。另外我们还令人惊奇地发现，含有少到两个氨基酸残基的脂肽也可显示出成膜性能，这与US-A-5,670,483的有关自装配肽结构的发现形成对照。这类短脂肽可以相当容易且经济地制备，因此可能具有实质性的优于天然产的、半合成或合成的脂肽诸如磷脂酰丝氨酸的成本优势。
因此按照本发明的一个方面，它提供了一种诊断和/或治疗活性剂，例如一种超声造影剂，该活性剂包含利用成膜两亲性脂肽稳定化的包囊气体填充微泡。
从本发明的另一个方面来看，它提供了如上文所定义的活性剂作为超声造影剂的用途。
另一方面，本发明还提供了一种生成增强的人体或非人动物体影像的方法，该方法包含对所述人体或动物体给药如上所定义的活性剂并在至少部分所述躯体产生超声、磁共振、X射线、放射照相的或光学图像。
可以用包含2-50个氨酰基残基的单个的肽单元形成稍放大即能可见的膜。每个肽单元可以带有长度在5-约50个碳原子之间的一个或多个亲脂性烃链。
在一个优选的实施方案中，本发明的单个脂肽单元中氨基酸残基的数目应是形成一个有效的稳定化膜所需残基的最小数目，且优选少于20个残基，更优选少于10个残基，首选在2-8个残基之间。很清楚，保持残基的数目为最小将降低本发明脂肽的成本并使其制备更容易。
任何氨基酸残基都可以用于制备本发明的单个脂肽单元，尽管该脂肽必须是两亲性的。在一个优选的实施方案中，该脂肽将包含选自容易获得的天然存在的20个必需氨基酸的氨基酸残基。
在一个实施方案中，肽单元可以包含交替的疏水和亲水残基，诸如丙氨酰基和二氨基丙酰基，并可以包含一个或多个对生物受体具有亲和力的互补序列和/或引导肽。在一个特别优选的实施方案中，选择带电氨基酸如赖氨酸和谷氨酸来提供在中性pH下分别含有阳性和/或阴性电荷基团的侧链官能团。尽管不希望受到理论的限制，但预想这些带电基团通过形成离子对或盐桥来帮助使膜的外部稳定。只要所涉及的肽序列是彼此互补的，就有可能通过相反电荷基团的对准而使膜稳定，这构成了本发明的另一方面。
该脂肽的脂质组分优选包含烷基、链烯基或炔基链，尤其是烷基链。烃链优选具有5-25个碳原子，首选可从易于得到的脂肪酸衍生物获得。合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸、棕榈酸等；这类脂肪酸是本领域技术人员熟知的。每个脂肽单元中烃链的数目将根据所存在的氨基酸残基的数目而变化，并可由本领域技术人员容易地确定；一般每个脂肽分子将包含一个或两个烃链。
肽链可包含将达到自稳定二级结构诸如β-折叠或α-螺旋的氨基酸序列。这些可为膜和相应的微泡提供有利的行为表现特性，诸如稳定性、药动学、生物耐受性或受体亲和力。形成β-折叠的脂肽，例如象棕榈酰-(Glu-Ile-Lys-Ile)2，将通过抗衡离子和疏水性的重复而稳定化，并可为表面提供离子和疏水稳定作用。
除了具有稳定作用的脂肽自身的氨基酸序列以外，也可以选择与脂肽中的氨基酸残基相连的脂酰基链来提供具有某种特性的结构。于是，例如，将向无定形膜中加入顺式和反式不饱和酰基链的混合物，由此使膜的柔韧性更好，尤其是在较高的超声频率下，例如，提供更好的二次谐波信号。类似地，通过引入分支的脂酰基链，包括具有不同分支部位的酰基链的混合物，可以使脂质结构的无定形性增加或结晶度降低。
正如蛋白质化学领域中众所周知的，脂肽中的某些氨基酸序列可以形成α-螺旋。在这类序列中，适当分离的侧链和选定氨基酸之间的大量氢键将使该肽链保持α螺旋结构。例如，象Lys-Lys(酰基)-Gln-Lys(二酰基)-Asn-Lys(酰基)-Gln-Leu这样一个结构，将在Asn和Gln侧链之间提供强的氢键键合，并为含有这类结构的微泡提供一个极性的、不带电的表面。
上述脂肽构成了本发明的另一个方面，并且尽管本发明的脂肽优选是合成的，但它们的来源实际上可能是天然的、半合成的或合成的。因此，本发明也提供了一种通式如下的成膜两亲性肽A-B(其中A代表一个包含2-50个残基的肽，B代表一个或多个5至约50个碳原子的烃链)。
在一个实施方案中，一个或多个肽末端或可利用的侧链可以与一个聚乙二醇衍生物偶联，目的是延迟被网状内皮系统的吸收。聚乙二醇衍生物也被认为可降低血清蛋白对微泡的调理作用。当需要微泡的定向作用时，这一点被认为是尤其相关的。
在另一个实施方案中，多官能芳香系统可以用于连接本发明的肽和亲脂部分，以增强膜的稳定性。由于π-π交盖相互作用，因此芳香系统的存在可以进一步加强膜中分子间的缔合。芳香基团，有可能是一个碳环或杂环、单环或多环芳基，最好是苯基。它可以连接一个或多个肽以及一个或多个疏水性烃类残基。该肽可以方便地经一个酰胺键连接到芳香系统上；例如，适宜肽的N末端可以偶联到一个苯甲酸衍生物上。一个或多个疏水基，如脂肪酸衍生物，可以直接连接到芳香基团上，例如借助于一个酰胺键，或者可以通过合适的一个或多个接头与芳香基团相连。在一个优选的实施方案中，这类脂肽可以用下式表示 其中A是通过合适的接头(如酰胺基)与苯环连接的烷基链，B或者是通过合适的接头与苯环连接的烷基链，或者是通过合适的接头与苯环连接的如上文所述的肽序列，C是通过合适的接头与苯环连接的如上文所述的肽序列。
优选这些取代基最好在苯环的1、3和5位。
一个特别优选的芳香系统是基于3,5-二氨基苯甲酸的。该二氨基苯甲酸支架结构允许不必采用复杂的保护策略就能进行差别偶联。这是因为当第一个氨基酰化后，第二个氨基的反应性降低了。
用于烃链或肽与芳香系统的连接的适宜连接基包括氨基、羟基、巯基、羧基和羰基，以及碳水化物基、邻位二醇、硫醚、2-氨基醇、2-氨基硫醇、胍基、咪唑基、酚基和X-CH2CO-(其中X=Br,Cl或I)类型的α-卤代乙酰化合物。本领域技术人员当然可以容易地确定其它连接部分。
上述芳基连接脂肽构成了本发明的另一个方面。
为了形成一个包囊膜，可以使用一个单个脂肽组分的均匀制剂或两个或多个互补脂肽组分的非均匀混合物。优选采用两个互补脂肽组分的混合物。
本发明微泡的膜可以包含一个或多个一价、二价或多价金属离子，尽管不希望受到理论的限制，但我们相信金属离子可能在使膜稳定中发挥作用。合适的金属离子包括钆(Ⅲ)、钇(Ⅲ)和钙(Ⅱ)，但优选一价金属离子，例如钠或钾离子。膜中存在金属离子也可促进它与缓冲系统的相容性，并可给膜提供一些络合或螯合稳定性。
在本发明的另一个实施方案中，可以制备掺合了结合金属离子如钆、铟或锝的螯合物的气体填充脂肽微泡。适合碘化的脂肽，例如含有酪氨酸的脂肽，可以形成包囊膜。以这种方式可以进行多模式成像。
例如，根据不同的制备方法，该微泡膜可以是一个单层、双层、少层或纤维网状结构的交织脂肽。
本发明的微泡中可以存在任何生物相容的气体。本文中所用的术语“气体”包括任何在人正常体温37℃下基本上或完全为气态形式(包括蒸汽)的物质(包括混合物)。因此，例如，气体可包含空气；氮气；氧气；二氧化碳；氢气；惰性气体如氦、氩、氙或氪；氟化硫如六氟化硫、十氟化二硫或三氟甲基五氟化硫；六氟化硒；可选卤代的硅烷如甲基硅烷或二甲基硅烷；低分子量烃(例如含有最多7个碳原子的)，例如烷烃，象甲烷、乙烷、丙烷、丁烷或戊烷，环烷烃，象环丙烷、环丁烷或环戊烷，烯烃，象乙烯、丙烯、丙二烯或丁烯，炔烃，象乙炔或丙炔；醚如二甲醚；酮；酯；卤代低分子量烃(例如含有最多7个碳原子)；或是前述任何几种物质的混合物。有利的是，卤代气体中至少有一些卤素原子是氟原子；于是，生物相容的卤代烃气体可以选自，例如溴氯二氟甲烷，一氯二氟甲烷，二氯二氟甲烷，一溴三氟甲烷，一氯三氟甲烷，一氯五氟乙烷，二氯四氟乙烷，一氯三氟乙烯，氟乙烯，乙基氟，1,1-二氟乙烷和全氟化碳，例如全氟烷烃，象全氟甲烷，全氟乙烷，全氟丙烷，全氟丁烷(例如全氟正丁烷，可选地是与其它异构体如全氟异丁烷的混合物)，全氟戊烷，全氟己烷和全氟庚烷；全氟烯烃，诸如全氟丙烯，全氟丁烯(例如全氟丁-2-烯)和全氟丁二烯；全氟炔烃，如全氟丁-2-炔；全氟环烷烃，诸如全氟环丁烷，全氟甲基环丁烷，全氟二甲基环丁烷，全氟三甲基环丁烷，全氟环戊烷，全氟甲基环戊烷，全氟二甲基环戊烷，全氟环己烷，全氟甲基环己烷和全氟环庚烷。其他卤代气体包括甲基氯，氟化(例如全氟化)酮如全氟丙酮，和氟化(例如全氟化)醚如全氟二乙醚。考虑到在含有这类气体的微泡的血流中的认可的高稳定性，特别有利的是使用全氟化气体，例如六氟化硫和全氟化碳，诸如全氟丙烷，全氟丁烷和全氟戊烷。
气体微泡的起始平均大小优选不超过10μm(例如为7μm或更小)，以允许它们在给药后自由地通过肺系统，例如在通过静脉注射给药后。不过也可以采用较大的微泡，此时这些微泡中含有例如一种或多种相对血溶性的或者可扩散的气体如空气、氧气、氮气或二氧化碳和一种或多种基本上不溶的或不可扩散的气体如全氟化碳的混合物。给药后可溶性/可扩散的气体内含物的向外扩散将使这类微泡迅速地缩小到一定尺寸，这个尺寸将由所存在的不溶性/不可扩散的气体的量决定，可以选择这样一个尺寸，以允许所产生的微泡通过肺系统的肺毛细管。
通过结合疏水、离子对和氢键键合相互作用使分子间产生缔合作用，可以使上面所讨论的脂肽结构有利地增强膜的稳定性。氢键键合可以发生在并排脂肽链上的供体和受体原子之间。疏水相互作用可以发生在疏水部分如烷基链或疏水氨基酸残基的序列之间，以致形成膜的一个疏水内芯。
本发明的一个优选方面涉及用于疾病成像和药物释放的超声微泡的定向。因此，在另一个方面，本发明提供了一种靶向诊断和/或治疗活性剂，例如一种超声造影剂，所述活性剂包含(ⅰ)利用能与超声辐射相互作用产生可检测信号的成膜两亲性脂肽稳定的气体填充微泡；(ⅱ)一种或多种载体或药物分子或二者的组合，其中所述载体对体内的特定目标位点和/或结构具有亲和力，例如对特定细胞或病变区域具有亲和力；(ⅲ)连接所述微泡与载体的一个或多个接头，结果微泡和接头不是直接相连的。
使用载体来定向到体内特定研究区域是本领域中众所周知的，载体的使用对熟练技术人员来说是常规的。用于本发明的适宜载体包括蛋白质和肽载体如抗体，细胞粘着分子如L-选择蛋白、RGD-肽、PECAM和整合蛋白(intergrin)，包含细胞因子/生长因子/肽激素及其片段的载体，链霉抗生物素蛋白，纤连蛋白结合蛋白，抗体的Fc部分，转铁蛋白，链激酶/组织纤溶酶原激活物，纤溶酶原，纤溶酶，肥大细胞蛋白酶，弹性蛋白酶，脂蛋白，脂肪酶，凝固酶，细胞外超氧化物歧化酶，肝素辅因子Ⅱ，视网膜生存因子，结合肝素的脑促分裂原，载脂蛋白(例如载脂蛋白B或载脂蛋白E)，粘着促进蛋白(例如紫红素)，病毒外壳蛋白(例如来自HIV或疱疹的)，微生物粘着物(例如β-淀粉样蛋白前体)，腱生蛋白(例如腱生蛋白C)，包含细胞因子/生长因子/肽激素/细胞粘着分子的非肽类兴奋剂/拮抗剂的载体，包含抗血管生成因子的载体，包含血管生成因子的载体，已知对血管生成相关受体具有亲和力的公认为血管生成因子以外的载体分子，与血管生成相关的受体/目标，寡核苷酸载体，修饰寡核苷酸载体，核苷与核苷酸载体，包含DNA结合药物的受体，包含蛋白酶底物的受体，包含蛋白酶抑制剂的受体，来自组合文库的载体，碳水化物载体，脂质载体和小分子载体，如肾上腺素和β-阻断剂。
本发明的微泡可以与一个或多个载体或者直接或者通过连接基偶联。这些微泡可以偶联到能识别特定目标区域的单克隆抗体之类的载体上，或者偶联到一个对初级抗体具有特异性的次生抗体上，所述初级抗体又对一个目标区域具有特异性。象这样使用次生抗体是有利的，其中适当地选择一个次生抗体可以允许制备用途广泛的“通用”微泡，因为初级抗体可以定制到特定的目标区域。
微泡与所需载体的偶联可以通过共价或非共价方式实现，例如这些方式牵涉到与位于微泡和/或载体上的一个或多个官能基的相互作用。可以用于这一目的的化学反应基的实例包括氨基、羟基、巯基、羧基和羰基，以及碳水化物基、邻位二醇、硫醚、2-氨基醇、2-氨基硫醇、胍基、咪唑基、酚基。载体和微泡也可以通过一个连接基相连；许多这类基团都是本领域中公知的。接头与载体和微泡的连接可以使用常规化学合成技术实现。国际专利申请WO-A-9818501中公开了在定向超声回波描记术中有用的已知载体和连接基的全面总结，该文的内容结合在此作为参考。
本发明也提供了一种器械，用于将与载体介导的产品方向结合在一起的治疗药物释放到所需部位。“治疗药物”是指对活人或非人动物的特定疾病具有有益作用的药剂。虽然在例如WO-A-9428873和WO-A-9507072中已经提出了药物与超声造影剂的组合物，但这些产品不含对特定部位具有亲和力的载体，因此在药物释放前和药物释放当中在所需部位显示出较低的比保留值。
按照本发明所用的治疗化合物可以包封在微泡的内部，或者附着到胶囊壁上，或者结合在胶囊壁中。 因此，治疗化合物可以通过例如共价键或离子键与部分胶囊壁相连；或者可以物理混合到包囊材料中，特别是如果药物与膜物质具有类似的极性或溶解性的话，以便阻止其在体内发挥预期作用之前从产品中漏失。药物给药后只要与血液接触变湿后就可以开始释放，或者也可以是其他内部或外部影响的结果，例如酶催化的溶解过程或超声波的使用。就超声造影剂而言，使用外部超声波来破坏含有气体的微粒是一种众所周知的现象，例如象WO-A-9325241中所描述的；根据治疗应用的类型，通过使用来自转换器的特定量的超声能量就可以改变药物释放的速率。
治疗剂可以利用合适的连接剂与包囊膜表面共价连接。于是，例如，我们可以一开始先制备一个脂肽衍生物，药物通过一个可生物降解的或者可以选择性断裂的接头键合在该衍生物上，然后将该物质加入到微泡中。或者，可以将不需要加工就可释放活性药物的脂质化的药物分子直接加入到膜中。例如，该活性脂质化药物可以通过提高超声波束的强度而释放出来。
举例而言，适合用于本发明组合物的药物释放系统包括含有巯基的已知治疗药物和其活性类似物；他们可以在氧化条件下与含有巯基的微泡偶联形成二硫桥键。与一个载体或多个载体结合后，这种药物/载体修饰微泡可以在靶组织中蓄积；然后给药一种还原剂如还原谷胱甘肽，就可使药物分子在靶组织附近从该定向微泡中释放出来，从而增加了药物的局部浓度，增强了其治疗作用。也有可能制备能在使用前立即与治疗药物偶联或者用治疗药物包覆的微泡。因此，例如，可以将治疗药物加入到这类微泡在含水介质中的悬浮液中并进行振摇，以使药物附着或粘附到微泡上。
在前面所提到的WO-A-9818501中可以找到有关在药物释放应用中使用微泡的全面总结。
例如，本发明的脂肽可以使用适宜的保护策略利用常规肽合成技术制备。合成可以方便地使用自动肽合成仪进行，例如使用Merrifield固相肽合成技术。例如使用标准有机化学方法可以将烃链在任何适当阶段偶联到肽上，例如在将残基加入肽中之前，或者在整个肽已合成完之后。优选任一烃链上带有一个羧化官能团如一个酰基氯部分或羧酸基，他们可以容易地偶联到肽的游离氨基侧链或N-末端上。如果肽和亲脂组分想要经一个芳香系统如3,5-二氨基苯甲酸连接的话，熟练技术人员将容易地完成与芳香系统的结合。例如，可以利用简单的肽合成法将肽偶联到3,5-二氨基苯甲酸的羧酸基上。然后可以将一个脂肪酸偶联到一个氨基官能基上，从而得到一个1,3-二取代衍生物；这种与一个氨基的反应钝化了其他的游离氨基官能团，所以不会再产生1,3,5-三取代化合物。然后，再次使用简单的合成化学步骤，但使用更严格的反应条件，可以将该1,3-二取代衍生物进一步与一个所需肽或亲脂基偶合。
例如，通过超声处理和加热包含所需脂肽以及可选地还包含任何金属离子和/或其他所需组分的水溶液，同时让该溶液接触适宜的气体，就可制备本发明的微泡。其他微泡制备技术，以及适宜的分离和纯化步骤，都是本领域中公知的。
现在将参考以下非限制性的实施例和附图对本发明作进一步的描述。
在附图中
图1阐明了包封了一种气体微泡的部分两亲性脂肽膜的理论结构。该膜包含两个含有阳性和阴性电荷的氨基酸残基的互补脂肽。疏水相互作用由双向箭头表示。
图2显示了含有一种2×2脂肽的互补混合物的、含有气体的单层膜的理论切面图。图上部显示了疏水和离子对相互作用，据认为他们能稳定膜的形成。
图3阐明了作为肽/脂质接头的3,5-二氨基苯甲酸的使用。
实施例1含有全氟戊烷的微泡的制备，该微泡包含脂肽N-α-棕榈酰-N-ε棕榈酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酸和N-α-棕榈酰-N-ε棕榈酰-赖氨酰-谷氨酰-谷氨酰-谷氨酰-谷氨酸的1∶1w/w混合物a)N-α-棕榈酰-N-ε-棕榈酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酸的合成 用ABI 433A自动肽合成仪合成该脂肽，合成从Fmoc-Lys(Boc)-王氏树脂以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，同时除去树脂中的肽和侧链保护基，得到200mg粗产物。用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化粗物质的等分试样，使用80％-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)。冷冻干燥后得到65mg纯物质(分析型HPLC梯度70-100％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈；柱-Vydac218TP54；在UV 214下检测；产物保留时间=12分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物的特性预期M+H在1136，实际在1138。
b)N-α-棕榈酰-N-ε-棕榈酰-赖氨酰-谷氨酰-谷氨酰-谷氨酰-谷氨酸的合成 用ABI 433A自动肽合成仪合成该脂肽，合成从Fmoc-Glu(OtBu)-Wang树脂以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，同时除去树脂中的肽和侧链保护基，得到200mg粗产物。使用0.1％的氨溶液在Sephadex G-200柱上进行纯化，得到30mg纯产物-在UV 214下检测。使用MALDI质谱法描绘产物的特性预期M+H在1138，实际在1140。
c)制备包含实施例1(a)和(b)所得肽的1∶1 w/w混合物的、含有全氟戊烷的微泡储备溶液1存在于水中的1.4％丙二醇/2.4％甘油。
储备溶液2:20mg NaCl溶于10ml水(大约34mmol)。
储备溶液3:4ml储备溶液1与1ml储备溶液2混合。
将从实施例1(a)和(b)得到的肽(各1.0mg)称取到一个干净的小瓶中并加入0.6ml储备溶液3。该混合物首先超声处理2-3分钟，然后加热至79℃并保持几分钟。之后将该样品冷却至室温，将顶部空间用全氟戊烷气体充满。该小瓶在一个有盖的混合器中振摇60秒钟后，将所得微泡分散体转移到一个干净的5ml小瓶中。加入水使体积接近4ml。使浮渣漂浮到顶部，用一个注射器从下面收集微泡。
d)描绘微泡的特性用库尔特计数器分析实施例1(c)的半分离微泡，并分析其压力稳定性大小分布％直径1-10微米93直径1-3微米 6直径3-5微米 29直径5-7微米 36直径7-10微米21直径10-30微米 7压力稳定性120mmHg 稳定160mmHg 稳定200mmHg 稳定实施例2含有全氟丁烷的微泡的制备，该微泡包含N-β-PEG2000-Dpr-Lys(Hds)-Lys-Lys(Hds)-Glu-OH(其中Dpr=二氨基丙酸，Hds=2-正十六烷基硬脂酸)a)N-β-PEG2000-Dpr-Lys(Hds)-Lys-Lys(Hds)-Glu-OH的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Glu(OtBu)-Wang树脂以0.2mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。Fmoc-Lys(Dde)-OH在与2-正十六烷基硬脂酸偶联之前，先用2％肼/DMF溶液选择性脱保护。所有的氨基酸用HBTU预活化。Hds和PEG2000用HATU预活化后人工加入合成仪中。用含有5％H2O的TFA处理2小时，同时除去树脂中的脂肽和侧链保护基，得到500mg粗产物。用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱-二苯基)纯化粗物质的等分试样，使用70-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=水，B=甲醇)。冷冻干燥后得到8mg纯物质(分析型HPLC梯度70-100％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈；柱-Vydac 218TP54；在UV 214下检测；产物保留时间=19.7分钟)。使用MALDI质谱法描绘产物的特性预期多个M+H峰在3600周围，实际在3600。
b)PEG化(pegylated)脂肽微泡的制备将从实施例2(a)得到的2.5mg脂肽称取到一个干净的小瓶中，并加入0.5ml 1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。将该混合物加热至60℃持续3分钟，然后冷却至室温。该小瓶的顶部空间用全氟丁烷气体充满并在一个带盖的混合器中振摇30秒钟。所得微泡用去离子水洗涤3次。
c)描绘微泡的特性利用库尔特计数器分析实施例2(b)的微泡悬浮液的大小分布
直径1-3微米--17.0％直径3-5微米--32.4％直径5-7微米--25.3％实施例3含有全氟戊烷的微泡的制备，该微泡包含互补肽棕榈酰-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-OH和棕榈酰-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-OH的混合物a)棕榈酰-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-OH的合成在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Lys(Boc)-王氏树脂以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，同时除去树脂中的肽和侧链保护基，得到300mg粗产物。用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化30mg粗物质试样，使用70-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=水，B=甲醇)。冷冻干燥后得到13mg纯物质(分析型HPLC梯度30-80％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈；柱-Vydac 218TP54；在UV 214下检测；产物保留时间=12.6分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物的特性预期M+H在1853，实际在1858。
b)棕榈酰-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-Ala-Lys-Ala-Lys-Ala-Glu-Ala-Glu-OH的合成在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Glu(OtBu)-王氏树脂(Novabiochem)以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，同时除去树脂中的肽和侧链保护基，得到300mg粗产物。用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化30mg粗物质试样，使用30-80％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)。冷冻干燥后得到4mg纯物质(分析型HPLC梯度30-80％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈；柱-Vydac 218TP54；在UV 214下检测；产物保留时间=9.6分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物的特性预期M+H在1853，实际在1858。
c)制备包含实施例3(a)和(b)所得肽的1∶1 w/w混合物的、含有全氟戊烷的微泡储备溶液1存在于水中的1.4％丙二醇/2.4％甘油。
将从实施例3(a)和(b)得到的肽(各0.5mg)称取到一个干净的小瓶中并加入0.5ml储备溶液1。该混合物首先超声处理2-3分钟，然后加热至79℃并保持几分钟。之后将该样品冷却至室温，将顶部空间用全氟戊烷气体充满。该小瓶在一个有盖的混合器中振摇120秒钟后，将所得微泡分散体转移到一个干净的5ml小瓶中。加入水使体积接近4ml。使浮渣漂浮到顶部，用一个注射器从下面收集微泡。
d)描绘微泡的特性用库尔特计数器分析实施例3(c)的半分离微泡的大小分布大小分布 ％直径1-10微米100直径1-3微米 24直径3-5微米 51直径5-7微米 22直径7-10微米1实施例4含有全氟丁烷的微泡的制备，该微泡包含N-[3-(2-氨基乙酰氨基)-5-[2-(正十六烷基)硬脂酰氨基]-苯甲酰基]-甘氨酸 a)3,5-二(Fmoc-氨基)苯甲酸的合成使用碳酸氢钠作为碱，在水和适宜有机溶剂的混合物中，从3,5-二氨基苯甲酸和Fmoc-氯合成该化合物。NMR分析数据与结构一致。
b)N-[3-(2-氨基乙酰氨基)-5-[2-(正十六烷基)-硬脂酰氨基]苯甲酰基]甘氨酸的合成使用一个手动氮气鼓泡器装置，从Fmoc-Gly王氏树脂开始并使用实施例4(a)所得化合物、2-正十六烷基硬脂酸和Fmoc-保护的甘氨酸，以0.15mmol的规模合成该结构。使用标准TBTU/HOBt/DIEA方案进行偶联。使用95％TFA处理2小时而从树脂上除去该化合物。该产物利用制备型液相色谱法(Vydac 218TP1022柱)纯化，使用90-100％B的梯度以10ml/分钟的流速洗脱60分钟(A=水/0.1％TFA，B=乙腈/0.1％TFA)。冷冻干燥后得到4mg纯化物质(分析型HPLC柱-Vydac 218TP54；梯度95-100％B洗脱20分钟(A和B如上所述)；流速1.0ml/分钟；在254nm下检测，保留时间为24.9分钟)。使用MALDI质谱法(α-氰基-4-羟基肉桂酸基质)进一步描绘产物特性，如期在m/z 758产生[M+H]+峰。
c)制备含有全氟丁烷的微泡，该微泡包含N-[3-(2-氨基乙酰氨基)-5-[2-(正十六烷基)硬脂酰氨基]-苯甲酰基]-甘氨酸将DMF(25μl)加入到实施例4(b)所得化合物(1mg)在1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液(0.5ml)中的悬浮液中。该混合物在70℃下加热2分钟并超声处理2分钟。将该小瓶的顶部空间充满全氟丁烷并在一个有盖的混合器中振摇45秒钟。在偏振光下用显微镜检查，在微泡周围显示出层状类型结构的图形特征。
实施例5包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的、含有全氟丁烷的微泡的制备a)Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的合成 使用一个手动氮气鼓泡器装置，从Fmoc-Lys(Boc)王氏树脂开始并使用硬脂酸和从实施例4(a)得到的Fmoc-保护的3,5-二氨基苯甲酸，以0.15mmol的规模合成所示结构。使用标准TBTU/HOBt/DIEA方案进行偶联。用90％TFA处理3小时，从树脂上除去该化合物的同时进行侧链Boc基的脱保护。该产物利用制备型液相色谱法(Vydac 218TP1022柱)纯化，使用90-100％B的梯度以10ml/分钟的流速洗脱60分钟(A=水/0.1％TFA,B=在乙腈/0.1％TFA中的20％2-丙醇)。冷冻干燥后得到46mg纯化物质(分析型HPLC柱-Vydac218TP54；梯度95-100％B洗脱20分钟(A=水/0.1％TFA,B=乙腈/0.1％TFA)；流速1.0ml/分钟；在254nm下检测，保留时间为13.2分钟)。使用MALDI质谱法(α-氰基-4-羟基肉桂酸基质)进一步描绘产物特性，在m/z 815产生[MH]+峰，预期在814。
b)包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的、含有全氟丁烷的微泡的制备将Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸(1.4mg)和1.4％丙二醇/2.4％甘油混合物(463mg)的混合物在60℃下加热2分钟后冷却。在小瓶的顶部空间填充了全氟丁烷后，将该小瓶在一个有盖的混合器中振摇30秒钟。所得气体填充微泡利用库尔特计数器进行分析，并分析其压力稳定性。
实施例6用于靶向超声波成像的、用凝集素包覆的、含有全氟丁烷的脂肽微泡的制备a)硫醇官能化的脂质分子棕榈酰-Lys(棕榈酰)-Lys-Lys-Ahx-Cys-OH(其中Ahx=氨基已酸)的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成如上所示的脂肽结构，合成从Fmoc-Cys(Trt)-王氏树脂以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％EDT和5％H2O的TFA处理2小时，在从树脂上除去肽的同时进行侧链保护基的脱保护，得到250mg粗产物。用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化40mg粗物质试样，使用90-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱50分钟(A=0.1％TFA/水，B=MeOH)。冷冻干燥后得到24mg纯物质(分析型HPLC梯度70-100％B，其中B=0.1％TFA/乙腈，A=0.01％TFA/水；柱-Vydac 218TP54；在UV 214nm下检测；产物保留时间=23分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物的特性预期M+H在1096，实际在1099。
b)制备含有全氟丁烷的微泡，该微泡包含从实施例6(a)得到的含有硫醇的脂肽结构和从实施例1(b)得到的脂肽的混合物将2mg从实施例1(b)得到的脂肽和0.5mg从实施例6(a)得到的含有硫醇的脂肽称取到一个干净的小瓶中，加入0.6ml含有1.4％丙二醇/2.4％甘油在0.05M NaCl中的溶液。该混合物加热至80℃持续5分钟。将该样品冷却至室温，将顶部空间充满全氟丙烷气体。该小瓶在一个有盖的混合器中振摇60秒钟后，所得微泡用去离子水洗涤一次。
c)用磺基-SMPB修饰凝集素向1mg荧光素标记的凝集素(Ulex europaeus,Sigma)在PBS(0.8ml)中的混合物中加入含有1mg磺基-SMPB[磺基琥珀酰亚氨基-4-(对马来酰亚氨基苯基)丁酸酯-Pierce]的0.1ml DMSO溶液。该混合物在室温下搅拌45分钟，然后通过一个Sephadex G-200柱，用PBS作为洗脱剂。收集蛋白质级分，在使用前储存于4℃下。
d)微泡与修饰凝集素蛋白偶联向从实施例6(b)得到的含有硫醇的脂肽微泡中加入1.5ml从实施例6(c)得到的修饰凝集素蛋白溶液。将该溶液的pH调节至pH8后，使该偶联反应在室温下进行1小时。然后用水充分洗涤这些微泡。
e)描绘微泡的特性从实施例6(d)得到的微泡悬浮液用库尔特计数器进行分析，并分析其压力稳定性大小分布直径1-10微米--84％直径1-3微米--12.5％直径3-5微米--37％直径1-7微米--24％压力稳定性120mmHg--稳定200mmHg--稳定f)用凝集素包覆的含有全氟丁烷的靶向脂肽微泡的体外研究在流动条件下与内皮细胞的结合从正常脐带衍生的人内皮细胞系ECV 304(ATCC CRL-1998)在260ml Nunc培养瓶(Chutney 153732)中在RPMI 1640培养基(BioWhittaker)中培养，其中RPMI 1640培养基中加入了L-谷氨酰胺200mM，青霉素/链霉素(10000U/mL和10000mcg/mL)和10％胎牛血清(Hyelone Lot no.AFE 5183)。当这些细胞铺满时，以割裂比1∶5-1∶7进行传代培养。将直径为22mm的盖玻片灭菌后置于12孔培养板的底部，之后将在0.5ml带有血清的完全培养基中的细胞加在上面。当细胞铺满后，将盖玻片置于一个特制的流动室中，该流动室由一个开口到玻璃板中的凹槽构成，带有细胞的盖玻片置于该玻璃板上，使细胞面对凹槽，由此形成一个流动通道。使用一个蠕动泵，使从实施例6(d)得到的微泡从一个保存在37℃下的储器中开始流出，通过该流动室后又返回到该储器中。调节流速以模拟生理学相关剪切速率。将该流动室放置在显微镜下，直接观察微泡和细胞间的相互作用。安装在该显微镜上的摄影机与一个彩色图象打印机和一个监视器相连。微泡逐渐在细胞上蓄积，这取决于流速。随着流速的增加，细胞开始从盖玻片上分离，而微泡仍然结合在这些细胞上。未携带载体的对照微泡不粘附到内皮细胞上，并在最小流动条件下从细胞上消失。
实施例7用于靶向超声波成像的、用FITC标记的凝集素包覆的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的、含有全氟丁烷的微泡的制备a)包含掺杂了含有硫醇的脂肽的、Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的含全氟丁烷的微泡的制备将1.4％丙二醇/2.4％甘油混合物(1.0ml)加入到一个含有从实施例6(a)得到的硫醇官能化的脂肽(0.5mg)和从实施例5(a)得到的Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸(4.5mg)的小瓶中。该混合物在60℃下加热3分钟，然后超声处理2分钟，将小瓶的顶部空间充满全氟丁烷后，将其在一个有盖的混合器中振摇45秒钟。所得微泡用水洗涤，大泡沫利用简单的浮选法除去。
b)微泡与修饰的带有磺基-SMPB的FITC标记的凝集素偶联向从实施例7(a)得到的微泡悬浮液中加入从实施例6(c)得到的修饰凝集素溶液。使该反应在室温下进行1小时。微泡用去离子水洗涤并用库尔特计数器进行分析(81％在1-3μm之间)。用流式细胞计测量凝集素的存在，结果显示荧光总数为75％。
c)与内皮细胞结合按照实施例6(f)的方法分析实施例7(b)所得微泡与内皮细胞的结合情况。
实施例8包含阳性和阴性电荷结构的混合物的带电脂肽微泡的制备a)N-α-棕榈酰-N-β-棕榈酰-L-二氨基丙酰-赖氨酰-赖氨酸酰胺的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Rink酰胺树脂以0.2mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，从树脂上除去肽的同时除去侧链保护基，得到150mg粗产物。在SephadexG-10凝胶过滤柱上进行纯化，使用pH2的1∶1甲醇/水洗脱。MALDI质谱法预期M+H在836，实际在837。在制备微泡之前，将该肽以0.5mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油标准溶液。加入0.1％HCl溶液将该储备溶液调节至pH3。
b)N-α-棕榈酰-N-β-棕榈酰-L-二氨基丙酰-谷氨酰-谷氨酸的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Glu(OtBu)-王氏树脂以0.2mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有的氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，从树脂上除去肽的同时除去侧链保护基，得到120mg粗产物。在Sephadex G-10凝胶过滤柱上进行纯化，使用pH8的1∶1甲醇/水洗脱。MALDI质谱法预期M+H在839，实际在839。在制备微泡之前，将该肽以0.5mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油标准溶液。通过逐滴加入0.1MNaOH溶液使该储备溶液呈碱性，最终pH为9。
c)使用从实施例8(a)和(b)得到的脂肽混合物制备微泡将不同体积的从实施例8(a)和8(b)得到的溶液在一个小瓶中混合，从而得到电荷性能不同的混合物。然后将该小瓶的顶部空间充满全氟戊烷气体，并将该小瓶在一个有盖的混合器中振摇2分钟。所得微泡用蒸馏水洗涤几次。在一个希望得到具有负Z电势的微泡的典型试验中，将0.4ml从实施例8(b)得到的脂肽溶液和0.2ml从实施例8(a)得到的脂肽溶液在一个干净的小瓶中混合，并向顶部空间加入全氟戊烷气体。将该小瓶置于有盖的混合器上振摇2分钟。微泡用蒸馏水洗涤几次，并分析其压力稳定性、大小分布和Z电势。
实施例9治疗性脂肽微泡制剂制备加载阿霉素(doxirubicin)的微泡将阿霉素以0.2mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液。向在一个干净小瓶中的、0.4ml从实施例8(b)得到的负电荷脂肽的储备溶液中加入0.2ml从实施例8(a)得到的储备溶液和0.05ml上述阿霉素溶液。所得溶液因存在阿霉素而呈桔红色。将该小瓶的顶部空间充满全氟戊烷气体并在一个有盖的混合器上振摇1分钟。微泡经过浮选后，观察到桔红色现在已到了微泡层，而上清液则事实上没有颜色。然后这些微泡用蒸馏水洗涤几次，洗完后它们仍然具有桔红色外观，这表明存在阿霉素。
实施例10治疗性脂肽微泡制剂制备加载放线菌素D的微泡重复实施例9的步骤，只是用放线菌素D代替阿霉素。所观察到的颜色不是桔红色而是黄色。
实施例11表面PEG化的脂肽微泡的制备a)合成脂肽棕榈酰-Dpr(棕榈酰)-Arg-Arg-Lys(PEG2000)-NH2(其中Dpr=二氨基丙酸) 该脂肽在一个ABI 433A自动肽合成仪上部分地合成。从Rink酰胺AM树脂(0.25mmol规模)开始，将各为1mmol的HBTU活化的氨基酸衍生物Fmoe-Lys(Dde)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Arg(Pmc)-OH、Fmoc-Dpr(Fmoc)-OH和棕榈酸以上述顺序装配到该聚合物上。然后将该树脂转移到一个氮气鼓泡器中，通过用2％在DMF中的一水合肼处理而除去Dde保护基。接着通过用(HATU)预活化的CH3O-POE-NHCOCH2CH2COOH(分子质量2000道尔顿，RappPolymere)重复偶联而引入PEG2000部分。用含有5％苯酚、5％三异丙基硅烷和5％H2O的TFA处理2.5小时，从该树脂上同时除去肽和侧链保护基，得到27mg粗制脂肽。使用MALDI质谱法描绘该粗制脂肽的产品特性由于PEG2000组分的不均匀性质，使得图谱很复杂(M+H)+预期范围是2900-3200，实际是2900-3200。在制备微泡之前，将该脂肽以0.5mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油标准溶液。
b)制备微泡向在一个干净小瓶中的、从实施例8(b)得到的脂肽溶液(0.4ml)中加入0.15ml从实施例8(a)得到的脂肽溶液和0.1ml从实施例11(a)得到的脂肽溶液。将该小瓶的顶部空间充满全氟戊烷气体并在一个有盖的混合器上振摇2分钟，从而产生含有全氟戊烷的微泡。向该小瓶中加入0.4ml蒸馏水，然后将其置于一个滚子台上3小时。之后这些微泡用蒸馏水洗涤几次并用库尔特计数器进行分析。
实施例12包含阳性和阴性电荷结构的混合物的带电脂肽微泡的制备a)N-α-棕榈酰-N-β-棕榈酰-L-二氨基丙酰-赖氨酸的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Lys(Boc)-SASRIN树脂以0.3mmol规模开始，使用1mmol柱体并用HBTU预活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，从树脂上除去肽的同时除去侧链保护基，得到210mg粗产物。MALDI质谱法预期M+H在710，实际在709。在制备微泡之前，将该脂肽以0.5mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油标准溶液。加入10％HCl溶液将该储备溶液调节至pH2。
b)N-α-棕榈酰-N-β-棕榈酰-L-二氨基丙酰-谷氨酸的合成 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Fmoc-Glu(OtBu)-王氏树脂以0.3mmol规模开始，使用1mmol柱体和HBTU活化。用含有5％H2O的TFA处理2小时，从树脂上除去肽的同时除去侧链保护基，得到150mg粗产物。MALDI质谱法预期M-H-在709，实际在709。在制备微泡之前，将该脂肽以0.5mg/ml的浓度溶于1.4％丙二醇/2.4％甘油标准溶液。通过逐滴加入1M NaOH溶液使该溶液呈碱性，最终pH为10。
c)使用从上述实施例12(a)和(b)得到的脂肽混合物制备微泡向在一个干净小瓶中的从实施例12(b)得到的脂肽溶液(0.4ml)中加入0.4ml从实施例12(a)得到的脂肽溶液。将该小瓶的顶部空间充满全氟戊烷气体并在一个有盖的混合器中振摇1分钟，从而产生气体填充微泡。向该小瓶中加入0.4ml蒸馏水，然后将其置于一个滚子台上1小时。之后这些微泡用蒸馏水洗涤几次并用库尔特计数器进行分析。
实施例13合成N-α-棕榈酰-N-γ-棕榈酰-L-二氨基丁酰-赖氨酰-赖氨酰-PEG3400-赖氨酰-精氨酰-赖氨酰-精氨酰-赖氨酰-精氨酸酰胺这是一种适于引入脂肽微泡的载体-PEG-脂质分子在Rink酰胺树脂上以0.1mmol规模合成该脂肽，其中使用1mmol氨基酸柱体。在一台ABI 433合成仪上，先使用HBTU预活化的Fmoc-Arg(Pmc)-OH，再使用HBTU预活化的Fmoc-Lys(Boc)-OH偶联剂，经过数次循环后装配上载体部分。为了在载体和脂质之间引入PEG间隔，将该肽树脂转移到一个氮气鼓泡瓶装置中，将Fmoc-PEG3400-NHS(Shearwater)偶联到该肽树脂上，直到Kaiser试验为阴性。然后将该树脂转回到合成仪上，继续用两次Fmoc-Lys(Boc)-OH循环、一次二-Fmoc-二氨基丁酸和一次棕榈酸进行装配，从而引入脂质组分。用含有5％H2O和5％酚的TFA处理2小时，从树脂上除去肽的同时除去侧链保护基。该产物用反向制备色谱法纯化(柱-Vydac 218TP1022；溶剂A=水/0.1％TFA，B=乙腈/0.1％TFA；梯度为50-100％B 40分钟；流速为9ml/分钟；在214nm下检测)，纯产物经过分析型HPLC柱-Vydac 218TP54；溶剂A=水/0.1％TFA，B=乙腈/0.1％TFA；梯度为50-100％B 20分钟；流速为1.0ml/分钟；在214nm下检测，保留时间为18.9分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物特性，预期M+H在4500-5300，实际在4500-5300。
实施例14合成一种适于微泡制备的带阳性和阴性电荷的脂肽棕榈酰-Dpr(棕榈酰)-Dpr-Asp-NH2(其中Dpr=二氨基丙酸) 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Rink酰胺AM树脂以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。棕榈酸和Fmoc氨基酸衍生物在偶联前用HBTU预活化。用含有EDT(0.2ml)和H2O(0.1ml)的TFA(15ml)处理2小时，从树脂上同时除去肽和侧链保护基。粗物质(171mg)通过从水/甲醇(80∶20,20ml)中重结晶而纯化，得到73mg纯物质(分析型HPLC梯度为85-90％B，其中A=水/0.1％TFA,B=CH3CN/0.1％TFA；柱-PLRP-S；在UV214nm下检测；产物保留时间为17.92分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物特性，预期M+H+在782，实际在783。
实施例15合成适于制备靶向脂肽微泡的结合了硫酸肝素的脂肽棕榈酰-Lys(棕榈酰)-Lys-Lys-Ahx-Lys-Arg-Lys-Arg-Lys-Arg-NH2(其中Ahx=氨基己酸)。 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Rink酰胺树脂(Novabiochem)以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。首先使用Fmoc-Arg(Pmc)-OH和Fmoc-Lys(Boc)衍生物装配结合了肝素的共有序列。接着使用Fmoc-氨基己酸和两次Fmoc-Lys(Boc)-OH循环引入一个间隔。最后，通过偶联Fmoc-Lys(Fmoc)-OH后再偶联棕榈酸而引入脂质组分。用含有5％苯酚、5％三异丙基硅烷和5％H2O的TFA处理2小时，从该树脂上同时除去肽和侧链保护基，得到150mg粗产物。利用制备型HPLO(Vydac 218TP1022柱)纯化30mg粗物质试样，使用70-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=0.1％TFA/水，B=乙腈)。冷冻干燥后得到19mg纯物质(分析型HPLC梯度为70-100％B，其中B=乙腈，A=0.01％TFA/水；柱-Vydac 218TP54；在UV 214nm下检测；产物保留时间=11分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物特性，预期M+H在1845，实际在1850。
实施例17合成适于制备微泡的含有二十二烷酸(Beh)-Beh-Asp-Ala-Asp-Ala-Dpr-Ala-Dpr-NH2的脂肽(其中Dpr=二氨基丙酸) 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Rink酰胺树脂(Novabiochem)以0.25mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有氨基酸和二十二烷酸用HBTU预活化。用含有5％EDT和5％H2O的TFA处理2小时，从该树脂上同时除去肽和侧链保护基，得到150mg粗产物。粗物质利用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化，使用70-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/MeOH)。冷冻干燥后得到6mg纯物质(分析型HPLC梯度为70-100％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/MeOH；柱-Vydac 218TP54；在UV 214nm下检测；产物保留时间为21分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物特性，预期M+H在955，实际在957。
实施例18制备在膜上夹杂了PEG化衍生物的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的、含有全氟丁烷的微泡a)合成用于引入到微泡膜中的PEG化衍生物 使用一个手动氮气鼓泡器装置，从Fmoc-Lys(Boc)-王氏树脂开始，以0.30mmol规模合成所示结构。氨基酸、从实施例5(a)得到的Fmoc-保护的3,5-二氨基苯甲酸和硬脂酸用TBTU/HOBt/DIEA预活化。PEG化侧链使用从Rapp Polymere购得的CH3O-POE-NH-CO-CH2CH2-COOH(MW 750)进行偶联。使用90％TFA处理2.5小时，在从该树脂上除去该化合物的同时进行侧链Boc基的脱保护。该产物利用反向制备色谱法纯化(Vydac 218TP1022柱；溶剂A=水/0.1％TFA，B=乙腈/0.1％TFA；梯度为70-100％B洗脱60分钟后用100％B洗脱140分钟；流速为10ml/分钟；在254nm下检测)。得到83mg纯物质(分析型HPLC柱-Vydac 218TP54；溶剂A=水/0.1％TFA,B=乙腈/0.1％TFA；梯度为70-100％B 20分钟；流速为1.0ml/分钟；在254nm下检测，保留时间为17.4分钟)。使用MALDI质谱法(α-氰基-4-羟基肉桂酸基质)进一步描绘产物特性，得到集中在m/z1767周围的[M+H]+峰分布。
b)制备含有全氟丁烷的微泡，该微泡包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和从实施例18(a)得到的PEG化衍生物的8.5∶1w/w混合物将从实施例5(a)得到的Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸(1.7mg)、从实施例18(a)得到的PEG化衍生物(0.2mg)和1.4％丙二醇/2.4％甘油溶液(1.0ml)的混合物在70℃下加热2分钟得到一个均匀的悬浮液。将该小瓶的顶部空间充满全氟丁烷并在一个有盖的混合器中振摇60秒钟。除去泡沫，微泡利用浮选法收集并用去离子水洗涤3次。
c)描绘该微泡的特性从实施例18(b)得到的微泡利用库尔特多功能计数器进行分析，并分析其压力稳定性大小分布直径(微米)1-10--99.8％1-3 --84％3-5 --13％声能衰减测量显示，这些微泡在120和200mmHg的过压下是稳定的。
如下确认在膜中存在从实施例18(a)得到的PEG化衍生物将100μl微泡悬浮液试样加入到200μl甲醇中，该混合物用超声波处理20秒。利用分析型HPLC(条件如上所述)显示存在从实施例18(a)得到的衍生物。另外，该混合物利用MALDI质谱法(α-氰基-4-羟基肉桂酸基质)进行分析，在m/z 814产生一个对应于Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸的[M+H]+峰，和一个对应于PEG化衍生物的集中在m/z 1767周围的峰分布。
实施例19制备用于医疗用途的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和一种含有卡托普利的脂肽的、含有全氟丁烷的微泡 如WO-A-9818501中所述合成如上所示的含有卡托普利的脂肽。向一个含有Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸(0.92mg)和含有卡托普利的脂肽(0.13mg)的小瓶中加入1.4％丙二醇/2.4％甘油混合物(1.0ml)。该小瓶在60℃下加热2分钟，然后超声处理得到一个均匀的悬浮液。该小瓶的顶部空间充满全氟丁烷后，在一个有盖的混合器中振摇60秒。所得微泡用浮选法收集并用去离子水充分洗涤。这些微泡用库尔特多功能计数器进行分析，并分析其压力稳定性。
实施例20制备用于诊断和医疗用途的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和一种含有阿替洛尔的脂肽的、含有全氟丁烷的微泡
如WO-A-9818501中所述合成如上所示的含有阿替洛尔的脂肽。使用0.96mg Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和0.11mg含有阿替洛尔的脂肽，按照实施例19中描述的方法形成微泡。这些微泡用库尔特多功能计数器进行分析，并分析其压力稳定性。
实施例21制备用于医疗用途的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和一种含有苯丁酸氮芥的脂肽的、含有全氟丁烷的微泡 如WO-A-9818501中所述合成如上所示的含有苯丁酸氮芥的脂肽。使用0.97mg Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和0.13mg含有苯丁酸氮芥的脂肽，按照实施例19中描述的方法形成微泡。这些微泡用库尔特多功能计数器进行分析，并分析其压力稳定性。
实施例22制备用于医疗用途的、包含Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和一种阿糖胞苷的亲脂衍生物的、含有全氟丁烷的微泡
如Akiyama,M.等在《化学与药学通报》1978年26卷981-984页中所述合成N4-硬脂酰-1-β-D-阿糖型呋喃糖基胞嘧啶(结构如上所示)。使用O.97mg Nα-[3,5-二(硬脂酰氨基)苯甲酰基]赖氨酸和0.15mg N4-硬脂酰-1-β-D-阿糖型呋喃糖基胞嘧啶，按照实施例19中描述的方法形成微泡。这些微泡用库尔特多功能计数器进行分析，并分析其压力稳定性。
实施例23合成适于碘化(多模式成像)的脂肽N-α-棕榈酰-N-ε-棕榈酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-赖氨酰-酪氨酰-酪氨酸酰胺 在ABI 433A自动肽合成仪上合成该脂肽，合成从Rink酰胺树脂以0.2mmol规模开始，使用1mmol氨基酸柱体。所有氨基酸和棕榈酸用HBTU预活化。用含有5％H2O和5％EDT的TFA处理2小时，从该树脂上除去肽的同时除去侧链保护基，得到300mg粗产物。粗物质试样利用制备型HPLC(Vydac 218TP1022柱)纯化，使用50-100％B的梯度以9ml/分钟的流速洗脱40分钟(A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈)。冷冻干燥后得到50mg纯物质(分析型HPLC梯度为50-100％B，其中A=0.1％TFA/水，B=0.1％TFA/乙腈；柱-Vydac 218TP54；在UV 214下检测；产物保留时间=14分钟)。使用MALDI质谱法进一步描绘产物特性预期M+H在1463，实际在1462。
权利要求
1.一种诊断和/或治疗活性剂，它包含用成膜两亲性脂肽稳定化的包囊气体填充微泡。
2.如权利要求1所述的诊断剂，它是一种超声造影剂。
3.如权利要求1或2所述的活性剂，其中所述脂肽的肽部分各包含少于20个氨基酸残基。
4.如权利要求3所述的活性剂，其中所述肽部分各包含少于10个氨基酸残基。
5.如权利要求4所述的活性剂，其中所述肽部分各包含2-8个氨基酸残基。
6.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中所述脂肽的肽部分由来自天然必需氨基酸的氨基酸残基构成。
7.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中所述脂肽的肽部分包含交替的亲水和疏水氨基酸残基。
8.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中所述脂肽的肽部分因存在能对准的带相反电荷的基团而成为互补的。
9.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中所述脂肽的脂质部分包含5-25个碳原子的烷基、链烯基或炔基。
10.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中气体包含空气，氮气，氧气，二氧化碳，氢气，惰性气体，氟化硫，六氟化硒，可选卤代的硅烷，可选卤代的低分子量烃，醚，酮，酯或前述任何几种的混合物。
11.如权利要求10所述的活性剂，其中气体包含一种全氟化碳或一种氟化硫。
12.如权利要求11所述的活性剂，其中气体包含六氟化硫、全氟丙烷、全氟丁烷或全氟戊烷。
13.如上述权利要求任一项所述的活性剂，其中脂肽具有偶联其上的聚乙二醇部分。
14.如上述权利要求任一项所述的活性剂，它进一步包含(a)一种或多种对人体或动物体内的目标位点或结构具有亲和力的载体，或者包含(b)一种对初级抗体具有特异性的次生抗体，所述初级抗体又对这样一个目标位点或结构具有特异性。
15.如上述权利要求任一项所述的活性剂，它进一步包含一种治疗药物。
16.如权利要求1-13任一项所述的活性剂，它进一步包括用于超声以外的成像模式的对比度增强部分。
17.如权利要求1-13任一项所述的活性剂，它混入了结合金属离子的螯合物。
18.一种生成增强的人体或非人动物体影像的方法，该方法包含对所述人体或动物体给药如上述任一项权利要求所定义的活性剂并产生一个至少部分所述躯体的超声、磁共振、X射线、放射照相的或光学图像。
19.一种成膜两亲性脂肽，它包含一个含有2-50个氨基酸残基的肽和一个或多个各含有5-50个碳原子的烃链。
20.一种成膜两亲性脂肽，它包含一个具有至少一个含2-50个氨基酸残基的肽部分的芳环和至少一个偶联或连接其上的含5-50个碳原子的烃链。
21.如权利要求20所述的脂肽，其中所述芳环是一个1,3,5-三取代的苯环。
22.本文实施例中所公开的脂肽。
全文摘要
包含一个或多个含2—50个氨酰基残基的肽部分和一个或多个含5—50个碳原子的烃链的新的成膜两亲性脂肽。这类脂肽可以用于形成稳定化的气体微泡分散体,该分散体适于用作诊断和/或治疗剂,例如用作超声造影剂。
文档编号A61K51/12GK1302211SQ9980655
公开日2001年7月4日 申请日期1999年4月22日 优先权日1998年4月28日
发明者A·卡斯比尔特森, M·索巴肯, H·R·沃尔弗 申请人:奈科姆成像有限公司