专利名称：无限增殖的人角质细胞系的制作方法
相关申请交叉文献不适用。
关于联邦政府赞助的研究或开发的声明本发明是用美国政府资助授予的NIH第AR40284号资助金完成的。美国政府享有本发明的一定权利。
背景技术：
人角质细胞分离自复层鳞状上皮的人角质细胞易在体外培育(综述见Leigh，等人，1994)。培育的角质细胞易在早期传代期间复制，并能产生大量细胞，这些细胞表现出鳞状体内分化的某些特征。当将培养的正常人角质细胞移植到小鼠体内后，上皮组织结构会随时间以有序的方式再生(Breitkreutz，等人，1997)。由于人角质细胞的培育和移植很容易，且移植程序和随后的监测可达皮肤，致使这类体细胞对于治疗性基因输送有吸引力。然而，由于终末分化的启动，因此不管采用何种基因表达策略，角质细胞中的转基因表达始终会丢失。几个报道已经表明，基因工程改造的人角质细胞能重现表皮的全部厚度，从而证明具有干细胞样性质的细胞存在于移植的细胞群中(Choate和Khavari，1997；Choate，等人，1996；Gerrard，等人，1993；Garlick，等人，1991；Greenhalgh，等人，1994；Vogel，1993，Fenjves，1994)。
采用用复层鳞状上皮衍生的人细胞进行体外组织培养试验利用粘附细胞单层培养物的体外试验(该试验维持有正常体内组织内容)对人组织不能用。动物模型不能模拟某些涉及对人组织治疗起应答反应的过程。然而，动物系统只能定性地、主观地评价肿瘤的再生。在历史来看，简单的体外生长试验是在塑料组织培养皿上采用啮齿类动物或人细胞系的单层培养物进行的。评价集落大小或细胞数量，以便估计辐射处理后癌细胞的存活和再生程度。该方法的主要缺点是它没有解释肿瘤细胞环境内的粘附生长或旁分泌生长因子信号。出于这个原因，在没有正常的周围组织下研究肿瘤细胞的生长可能不能准确地反映肿瘤细胞的体内生长特征。
例如，每年在美国诊断出有43,000位患者患有人头颈(H&N)肿瘤，在全世界有750,000以上的患者。尽管在原代肿瘤部位附近的肿瘤复发是导致这些患者治疗失败和死亡的主要原因，但是对于导致治疗后肿瘤再生长的分子活动知之甚少。临床和放射生物学证据提示，因接触辐射而受损后，肿瘤增殖速度实际上可能有所提高(Hall，E.J.，1988；Peterit，D.G.，等人，1995)。已经有人提出，受伤环境提供了强效的肿瘤生长信号(Haddow，A.，1972)。例如，受伤部位的胞外基质(ECM)糖蛋白提供和/或隔离了正常组织再生所需的强生长刺激。从这些观察结果明显看出，在肿瘤开始发展和/或癌症治疗失败后肿瘤再生所在组织的成分可能对肿瘤生长有明显的影响。
细胞生物学领域所需的是自发性无限增殖的具有接近正常染色体的人角质细胞，以及将该无限增殖的细胞系用于体外组织试验的方法。
发明概述在一个实施方案中，本发明是无限增殖的人角质细胞系，其中该细胞系包含46条正常的染色体，只是染色体8长臂上有一额外的等臂染色体。在一个特别佳的实施方案中，细胞系是ATCC CRL12191。
在另一个实施方案中，本发明是用异源基因转染的转基因无限增殖人角质细胞系。该异源基因可以是标记基因，最佳的是绿色荧光蛋白(基因)(GFP)。
本发明还涉及一种测定受测试肿瘤细胞治疗剂的效果的方法，该方法是获得人复层鳞状上皮细胞培养物，该培养物包含恶性鳞状上皮细胞、较佳的是人鳞状上皮癌瘤细胞(SCC)，以及自发性无限增殖的人角质细胞。然后使该培养物形成重建的表皮。然后可用受测试的肿瘤细胞治疗剂处理该表皮，并评价表皮内SCC的生长。
本发明的一个优点是提供了无限增殖的角质细胞系。
本发明的其它目的、特征和优点可在阅读了说明书、权利要求书和附图后明了。
附图简述
图1是BC-1-Ep/SL细胞的染色体分析。在31代的BC-1-Ep/SL细胞上进行染色体组型分析。由于染色体8的长臂具有额外的等臂染色体，因此该细胞含有47条染色体。额外的染色体i(8q)在显示正常男性染色体组型的亲代角质细胞(第3代BC-1-Ep)中没有见到。
图2证明BC-1-Ep/SL细胞的连续传代需要表皮生长因子(EGF)。使BC-1-Ep/SL细胞在含有/不含10ng/ml EGF的标准培养基中连续传代。细胞在没有EGF时存活，但生长很差。
图3证明转化生长因子β-1(TGF-β1)抑制BC-1-Ep/SL角质细胞生长。将亲代细胞BC-1-Ep(6°)和BC-1-Ep/SL(28°)接种到不含EGF或3T3饲养层的标准培养基中。当细胞在不含EGF的标准培养基中至大约20％铺满时，用/不用5ng/ml TGF-β1处理细胞。3-5天后计数细胞。TGF-β1处理的效果以对照的百分数表示。
图4证明BC-1-Ep/SL细胞需要生长因子。使31代的BC-1-Ep/SL细胞生长在2.5％FCS＋3F121DME＋10ng/ml EGF中，其中不添加生长因子(-GF)、或添加了0.4微克/毫升氢化可的松(HC)、8.4ng/ml霍乱毒素(CT)、24微克/毫升腺嘌呤(Ade)、5微克/毫升胰岛素(Ins)、或所有生长因子(+GF)。在各生长因子单独存在下，细胞生长增加，但是在所有生长因子存在下，获得了最优的生长。
图5表明细胞汇合度增加会降低BC-1-Ep/SL细胞中的瞬时转染效率。用GeneFECTOR(vennNova Inc.)，用含有GFP的质粒pGreenLantern(Gibco)和pcDNA3neo(Invitrogen)转染BC-1-Ep/SL细胞。采用15-20微克的线性pGreenLantern和5-6.7微克的pcDNA3neo。通过胰蛋白酶消化并用血细胞计数器计数角质细胞，得到细胞数。低密度定义为6-7.5×105细胞/100毫米平皿。高密度定义为3-4×106细胞/100毫米平皿。转染效率用荧光活化的细胞分拣方法(FACS)获得。图中每一直方柱代表一个实验。
图6是皮肤和器官型SCC13yGFP+/BC-1-Ep/SL培养物的横截面示意图。图6A是皮肤内多层的示意图。图6B是主要由所示三个组分组成的肿瘤/正常组织模型的示意图。基底层是由胶原和成纤维细胞组成的皮肤等价物。在该层上是由BC1-Ep/SL上皮细胞分化形成的重建的表皮(带阴影)。在该表皮等价物中是SCC13yGFP+肿瘤(转化)灶(没有阴影的部分)。
发明简述A.无限增殖的人角质细胞系具有干细胞样性质的人角质细胞是外源基因稳定转染的最适合的靶标。当外源DNA导入细胞内并整合到宿主染色体中后，产生了稳定的转染体。随后，子细胞表达该转基因的基因产物，如果该表达通过随后的传代而无限增殖，则是稳定的。对于基因治疗应用，必需用干细胞样角质细胞，该角质细胞能重新产生全部厚度的表皮用于多轮组织周转，并同时维持感兴趣的转导基因的表达。
在一个实施方案中，本发明是一种自发无限增殖的人角质细胞系，BC-1-Ep/SL，它维持了细胞型特异性的生长需求，表达分化标记，并能稳定地转染。根据布达佩斯条约的条件和要求，BC-1-Ep/SL于1996年9月20日保藏于美国典型培养物保藏中心(University Boulevard，Manassas，Virginia 20110-2209，USA)，保藏号为No.CRL-12191。
BC-1-Ep/SL角质细胞是非致肿瘤的，在器官型培养中经历鳞状分化。器官型培养是这样一种培养使角质细胞在类似于真皮的底物上生长，并接触空气-培养基界面(Leigh和Watt，1994)。
我们预计，该人角质细胞系可作为能支持高效、长期表皮转基因表达的长期存活的表皮祖先细胞的来源。BC-1-Ep/SL角质细胞代表了一种用于研究复层鳞状上皮生长和分化的重要的新细胞制剂。
在另一个实施方案中，本发明是无限增殖的人角质细胞系，较佳的是BC-1-Ep/SL，更佳的是ATCC CRL-12191，它包含至少一个转基因。下面的例子说明了一种产生转基因细胞系的较佳的方法。其它许多方法对于分子生物学领域技术人员来说是显而易见的。我们已经发展了一种方法，根据GFP的表达来鉴定转染的BC-1-Ep/SL角质细胞，并根据细胞形态和GFP表达程度选择，因此保留了最高程度的细胞预转染、天然状态/质量。该技术避免了由于用标准化学zhiji(如F418、氨甲喋呤、潮霉素-B、氨基喋呤、霉酚酸和zeocyn)根据显性可选择标记选择而引起的可能改变特征的压力。
我们预计，可以各种方式使用该无限增殖的人角质细胞系，与单层细胞培养物形成器官型培养物，适用于短期和/或长期移植给人或研究动物的人组织工程改造的产物，以及作为生物膜组分，例如作为产生基因产物以连续静脉内给予患者的机器的一部分。
B.用BC-1-Ep/SL作为器官型系统模型如上所述，本发明的细胞系在重新产生正常人复层鳞状上皮的组织结构方面有很多优点。该模型适合作为人肿瘤再生的试验。通过在组织样环境中完全重建恶性人上皮细胞生长，就可以生理相关方式监测肿瘤细胞生长特征。
另外，可以监测定量的终点，因为每个肿瘤细胞可单独作基因工程改造，以表达标记蛋白如绿色荧光蛋白(GFP)。(下面的例子说明了用标记基因转染BC-1-Ep/SL的较佳方法)。该模型系统代表了筛选用于治疗复层鳞状上皮癌症的药物或制剂的技术进展。描述性的癌症包括头颈部癌、皮肤癌、口腔粘膜癌、宫颈癌和气管癌。
因此，本发明是一种人复层鳞状上皮模型系统，该系统被设计用来测定肿瘤细胞生长和再生的速度(见图6的示意性例子)。
在一个实施方案中，模型系统由基因标记的人鳞状上皮细胞癌(SCC)与未标记的自发无限增殖的人角质细胞BC-1-EP/SL的器官型共同培养物组成。BC-1-EP/SL角质细胞系是该模型系统中的关键组成，因为这些细胞提供了与SCC细胞生长特征相当的可再生的环境。BC-1-EP/SL无限增殖细胞系有很多优点，因为它保留了正常角质细胞的所有特征，即保留了终末分化、凋亡和不导致肿瘤的特征。
下面的例子公开了产生重建真皮的较佳方法。简言之，将BC-1-EP/SL和SCC细胞接种到含有正常人成纤维细胞的胶原基底上。以BC-1-EP/SL角质细胞标准数目中不同的标记SCC稀释度接种共同培养物。
本发明的体外肿瘤/正常组织模型还可用于导致肿瘤进展和再生的分子机理的实验。这一相同的模型还可用来鉴定能减缓肿瘤再生长的潜在的细胞抑制剂和具有特异性肿瘤选择性的化学预防剂。例如，可以用各种肿瘤细胞调节剂，例如物理(如X-辐射)或化学/生物制剂(即化疗剂，细胞抑制药物)，处理重建的器官型培养物，并监测培养物(宜采用GFP标记)，以测定SCC细胞(重新)生长的程度或没有生长。这样，BC-1-EP/SL模型系统就能为鉴定和发展用于接受治愈性治疗剂的癌症(头颈癌、皮肤癌、口腔粘膜癌、宫颈癌、气管癌和其它上皮癌症)患者的抗增殖剂或新的抗癌策略作出贡献。
肿瘤细胞生长可以最方便的下列方式监测用流式细胞计数仪，根据GFP荧光，可以最方便地监测肿瘤细胞总数以及与BC-1-Ep/SL细胞数之比。用共聚焦显微镜可以最方便地监测肿瘤细胞体积和位置。在组织切片中，可以用免疫染色和原位杂交技术来最方便地监测细胞-细胞的相互作用。
GFP导入哺乳动物细胞被越来越多地用于体外和动物模型系统。迄今为止，还没有报道描述说因为GFP表达而改变哺乳动物细胞生长特征。这些模型如预期那样表现的事实暗示，GFP表达是无害的，因此是理想的标记蛋白。该研究中的观察结果也已确认，将GFP导入人鳞状上皮细胞癌瘤细胞系SCC13y中对相关的生物终点没有影响。这些实验观察到的结果支持了以前的研究，即暗示GFP表达不干扰所研究的细胞类型的生长和分化特征。对于采用GFP作为标记的模型来说，GFP表达随时间的稳定性是其成功的另一关键变量。我们的实验观察结果提示，GFP表达在至少一种恶性细胞系SCC13y中是稳定的。目前正在考虑其它的基因标记方法，如酶促活性和/或培养装置，以便能重复相同培养样品的试验。
A.Javaherian及其同事(Javaherian，A.，等人，1998)最近报道了异常和正常人角质细胞的共同培养。在该研究中，使经基因工程改造而无限增殖的角质细胞(HaCat)生长在器官型培养物中。虽然这些细胞是无限增殖的，但它们并没有致肿瘤性(即能在裸鼠中形成恶性肿瘤)，因此不代表通常的恶性细胞。由于SCC13yGFP+细胞系从真实的患者肿瘤衍生获得并有致肿瘤性，因此它更适合以根除恶性肿瘤为目的的研究。
该器官型共同培养物模型可用于解决药物和生物技术产业所面临的至少三个关键的难题(1)怎样筛选新的肿瘤再生细胞抑制剂，(2)怎样在治疗前确定患者对化疗或放疗的特异性反应，和(3)怎样发展新的生物治疗剂。与直接以肿瘤细胞为靶标的传统细胞毒性制剂不同，肿瘤生长的细胞抑制剂可能靶向个别肿瘤或其微环境。产生这一差别主要是因为细胞毒性制剂的主要目的是杀死肿瘤细胞；而细胞抑制剂的目的是使肿瘤增殖扩增减慢或停止，而不必杀死它。理论上，这可通过直接干预细胞增殖(例如细胞周期抑制剂)或间接改变周围正常组织从而使这些组织不支持肿瘤生长(例如抑制伤口再生信号)来实现。
利用器官型肿瘤/正常组织共同培养物可以确定新的抗肿瘤策略，因为在重建的人组织中可以直接测定肿瘤和正常组织反应的体外功能。目前基于人肿瘤细胞单层培养物生长的体外试验在这方面并不成功，因为它们不需要正常的组织功能，也没有说明恶性细胞微环境的影响。在鉴定侧重于预防发展成侵袭性恶性肿瘤的化学防御剂时，了解肿瘤微环境可能是特别重要的。防止常规的细胞毒性或外科治疗后存活的恶性细胞重新生长也很重要。另外，细胞抑制剂和器官型肿瘤/正常组织共同培养物还可用于和临床放射治疗同时使用。在这种情况下，细胞抑制剂在治疗期间减慢肿瘤生长的能力在消除肿瘤中可能是关键的，并可能削弱常规治疗伴有的炎症所产生的并发症。
监测器官型肿瘤/正常组织共同培养模型中的肿瘤重新生长还可用来提供关于治疗反应性和治疗剂比例的预处理患者具体信息。目前的试验已经证实，单层培养物中人肿瘤的体外生长与患者实际的肿瘤反应之间的相关性很弱。通过在体外模型中加入正常组织物质，可以实现较高的相关性。
其它应用可提供具有直接影响患者治疗的潜能的额外预后性和/或生物物质。例如，肿瘤活检物的细胞可以与GFP标记的BC-1-Ep/SL细胞共同培养，在本文中定义为“反向培养”。反向培养模型可提供一种可再生的培养环境，该环境逼真地模拟了原位肿瘤微环境，并允许测定个别患者的肿瘤细胞。然后，在真正的患者治疗开始前，用活检肿瘤样品检验具体的治疗。这样，可根据测试反应针对每位患者个别修改治疗方案。
器官型肿瘤/正常组织“反向”共培养模型的一个重要性能是它可逼真地模拟患者所特有的肿瘤微环境。这对于发展某些新形式的生物治疗(如免疫治疗)是非常有好处的。免疫治疗的目的是在体外引发患者自身的免疫效应细胞(如B细胞、辅助T细胞、溶细胞性T细胞(CTL)或天然杀伤细胞(NK))，然后将这些激活的细胞返还给患者，以便靶向并根除肿瘤。目前的体外培养可能并不如器官型培养那样有效地引发免疫效应细胞。免疫效应细胞缺少激活的潜在原因是合适的肿瘤特异性抗原(TSA)的呈递无效和/或不成功。器官型肿瘤/正常组织“反向”共培养模型可消除该问题。因为它准确地重建了体内肿瘤微环境，因此TSA可能更容易在器官型培养物中表达；因此，呈递给免疫效应细胞的机会可能更高。
B.其它实施方案1.在活组织产物中作为通用的供体表皮细胞类型，用于修复和/或支持合适上皮组织。一个应用例子是腿静脉溃疡(美国大约有一百万人，全球大约有三百万人患有该疾病)，以及其它溃疡情况，如糖尿病溃疡和压迫性溃疡(褥疮)(全球有大约一千万患者)。BC-1-Ep/SL角质细胞系还可用于广泛的临床应用，例如急性烧伤覆盖、皮肤病学外科伤口、供皮部位伤口(获取用于其它处的皮肤后伤口的覆盖)。
2.用途包括发展和测试制剂，该制剂可用来配制以乳膏、洗液、液体和喷雾形式使用的治疗性、美容治疗性和美容性皮肤产品。该细胞为测试这些制剂的毒性、效力和效果提供了稳定的人角质细胞来源。该细胞可用于这些试验的单层培养物中或器官型培养物中。器官型培养物可用来发展和测试制剂对组织结构、分化、细胞复制和生长、屏障功能以及组织强度的影响。
3.用途包括作为培育生物制剂(如人乳头瘤病毒)的受体细胞，从而可产生针对该病毒的疫苗。该细胞系还可用来开发并测试抗病毒药物和制剂。有60种以上的不同类型的人乳头瘤病毒在人体内产生疣，包括与女性宫颈癌以及男性阴茎癌发展紧密相关的生殖器疣和病毒病损。人乳头瘤病毒是人群中广泛传播的小双链DNA病毒。它们是严格亲上皮性的，并仅仅感染一定范围解剖部位的皮肤和粘膜。人乳头瘤病毒仅在经历分化的人上皮细胞中复制。
实施例1.自发性无限增殖的近二倍体人角质细胞系BC-1-Ep/SL中的正常生长和分化A.材料和方法细胞培养从新生人包皮分离出正常的角质细胞(BC-1-Ep)。如Allen-Hoffmann和Rheinwald(1984)所述那样，在丝裂霉素C处理的Swiss小鼠3T3成纤维细胞存在下，接种等份单细胞悬浮液，建立角质细胞培养物。标准的角质细胞培养基由Ham′s F12Dulbecco改进的Eagle培养基(DME)的混合物(3∶1，0.66mM钙)组成，其中添加了2.5％胎牛血清(FCS)、0.4微克/毫升氢化可的松(HC)、8.4毫微克/毫升霍乱毒素(CT)、5微克/毫升胰岛素(Ins)、24微克/毫升腺嘌呤(Ade)、10毫微克/毫升表皮生长因子(EGF)、100单位青霉素和100微克/毫升链霉素(P/S)。使细胞每隔一周在加有饲养细胞的100mm2组织培养皿上传代至3×105个细胞。转化的细胞BC-1-Ep/SL(自发系)出现在第16代。第55代的BC-1-Ep/SL细胞测试呈支原体阴性(Wisconsin State Laboratory ofHygiene，Madison，WI)。从R＋D系统获得重组的人EGF。从人血小板纯化转化生长因子β(TGF-(1))。
染色体分析用50毫微克/毫升秋水仙碱使对数生长期的细胞停滞于中期，然后胰蛋白酶消化，用移液管瓶中取出离心。除去培养基和胰蛋白酶后，使细胞在低渗的75mM KC1溶液中悬浮20分钟，用3∶1甲醇/乙酸固定三次，滴在波片上。使波片老化两周，稍稍作胰蛋白酶处理，并用Giemsa(Seabright，1971)染色。在每份样品中，通过照相分析确定良好分散的G-条带中期中的染色体身份和畸变(abberation)，切下至少两个染色体组型，用于染色体同源物的条带与条带比较。
DNA指纹分析用Qiagen QIAamp Blood试剂盒(Qiagen，Inc.，Santa Clarita，CA)从角质细胞分离出DNA。DNA指纹分析使用GenePrint(Fluorescent Stratagene System，根据生产商建议的方法使用)。将12个引物对分为三个四倍体(CTTv，FFFL和GammaSTR)。每个四倍体用25毫微克DNA作为模板在分开的反应中扩增。扩增在Perkin-Elmer 9700热循环仪(Perkin-Elmer，Corp.，Norwalk，CT)中进行。使PCR产物在BRL测序装置(LifeTechnologies，Inc.，Gaithersburg，MD)中42cm×33cm×0.4mm的聚丙烯酰胺凝胶上电泳。然后在Hitachi FMBIO(II型荧光扫描仪)上扫描凝胶。
BC-1-Ep/SL细胞在无胸腺小鼠中的生长将BC-1-Ep/SL细胞注射到无胸腺裸鼠中，以确定它们是否能形成肿瘤。将100微升Ham′s F12中的5×106细胞悬液皮下注射入6只裸鼠的肋部。亲代BC-l-Ep6(注射了3×106细胞/100微升F12的细胞)作为阴性对照。注射了3×106细胞/100微升F12的SCC4细胞作为阳性对照。对小鼠称重，26天后测定肿瘤。
半固体培养基中的悬浮液为了进行悬浮研究，用0.5mM EDTA、0.1％胰蛋白酶从培养皿中取出预先汇合的培养物，用含血清的培养基洗涤，使残余的胰蛋白酶失活。短时间离心(440×g，3分钟)后，将细胞以1×106细胞/毫升重悬于3份Ham′s F-12加上1份DME的用1.68％甲基纤维素(4,000厘泊，Fisher Scientific，Fairlawn，NJ)制作的半固体中(如Sadek和Allen-hoffmann，1994所述(Sadek，C.M.和B.L.Allen-Hoffman，1994))。反复用无血清培养基稀释和离心(440×g，10分钟)，从悬浮液回收得到细胞。用磷酸缓冲盐溶液(0.137M NaCl；2.7mM KCL；8.1mM Na2HPO4；1.4mM KH2PO4；pH7.2)(PBS)清洗一次后，将细胞重悬于PBS(pH7.2)中测定CE形成，或在SLS缓冲液中(50mM Tns；10mMEDTA，pH8.0；0.5％(w/v)月桂酰肌氨酸钠)裂解，以确定DNA片段化。对照由3份Ham′sF-12加上1份DME处理类似次数后的粘附性角质细胞组成。
Northern分析使细胞在3T3饲养层上标准角质细胞培养基中生长。在用含0.02％EDTA的PBS分离RNA前24小时，除去饲养层。如前所述(Sadek和Allen-Hoffmann，1994)，从对数生长细胞中分离聚A+RNA。使该聚A+RNA在含有甲醛的1.2％琼脂糖凝胶中电泳，并电印迹到Zeta-probe膜(Bio-Rad Laboratories，Richmond，CA)上。根据供应商的建议，使膜预杂交，然后在随机引物[32P]-dCTP-标记的cDNA探针存在下杂交。用于检测的cDNA探针包括大鼠甘油醛-3-磷酸脱氢酶、pGPDN5(Fort，等人，1985)、猴TGF-βl(Sharples，dr，1987)、EGF受体(Xu，等人，1984)、小鼠角蛋白14(Dennis Roop赠送)、TGF-α(Kudlow，dr，1988)和人c-myc的830-bp 5片段(Miyamoto，等人，1989)。
角质化包膜(CE)的形成从上述的培养板和悬液回收角质细胞。计数每次处理的细胞，并以106细胞/毫升重悬于含1％SDS和20mM二硫苏糖醇的PBS(pH7.2)中。使样品在水浴中沸腾5分钟，然后冷却至室温。加入DNA酶(0.5微克/毫升)，用血细胞计数器计数CE。将CE形成无计算成输入细胞的百分数。
核小体DNA片段化的分析如前所述(Sachsenmeier和Allen-Hoffmann，1996)，分离并标记DNA。简言之，使2.5×106细胞在500微升的50mM Tris，10mM EDTA pH8.0和0.5％(w/v)月桂酰肌氨酸钠中裂解。用苯酚氯仿异戊醇(25∶24∶1，v∶v∶v)抽提裂解物，并用乙醇沉淀。将DNA溶解于20微升TE缓冲液(pH8.0)，测定260nm吸光度。如Tilly和Hsueh(1993)所述那样，用末端双脱氧核苷酸胞外转移酶，对完整的和片段化的DNA作3′端[α32P]-ddATP标记。将每种标记样品的一半上样于1.5％琼脂糖凝胶上，进行电泳。用SE 1200 Easy Breeze(Hoefer Scientific，San Francisco，CA)加热干燥凝胶，并曝光于Kodak Biomax MR胶片。
器官型培养物的形成如前所述(N.Parenteau，1994)，使器官型培养物生长。将正常的人新生儿成纤维细胞、CI-1-F和I型胶原混合在10％FCS＋F12＋青霉素/链霉素中，形成胶原支架(raft)。使该支架收缩5天。将亲代细胞BC-1-Ep(5°)和BC-1-Ep/SL(38°)细胞以3.5×105细胞(50微升含有1.88毫摩尔钙的0.2％FCS＋3F121DME＋HC＋Ade＋Ins＋CT＋P/S)接种到支架中。使细胞附着2小时，然后加入额外的13毫升培养基(第0天)。在第1天和第2天，重新喂养细胞。在第4天，用棉花垫将细胞上升至空气界面，并转换为角质化培养基(2％FCS＋3F121DME＋HC＋Ade＋Ins＋CT＋P/S，含有1.88毫摩尔钙)。每3天给细胞喂角质化培养基。在第15天，用新鲜制备的由含3％戊二醛和1％多聚甲醛的0.1M二甲胂酸盐缓冲液组成的改进的Kamovsly′s固定剂(pH7.4)在室温下固定3小时。在除去培养基之前，将固定剂轻轻地加到支架顶部的细胞上，以防止角质化层漂走。随后，吸出培养基，用固定剂填充培养孔。将支架切成两半，一半作光学显微镜检，另一半用于电子显微镜检。
组织切片将固定的支架包埋在石腊中，切片，并用苏木精和伊红(Surgical Pathology，University Hospital，Madison，WI)染色。观察染色的切片，并用装有35mm相机的OlympusIX-70显微镜拍照。
电子显微镜检用0.1M二甲胂酸盐缓冲液(pH7.4)洗涤固定的培养物3次。在解剖显微镜下，用手术刀将支持支架培养物的聚酯筛网从塑料插入物上拆下。用手术刀将支架切成大约2毫米×4毫米的片，在缓冲液中保藏过夜。用1％四氧化锇4℃下后固定后，用0.1M马来酸(pH6.5)洗涤角质细胞4次，每次15分钟，然后用2％水性乙酰双氧铀整块染色1小时。用蒸馏水洗涤后，用浓度增加的乙醇、100％环氧丙烷使角质细胞脱水，用l∶1的环氧丙烷eponate浸润过夜。将支架包埋在平包埋模具中的新鲜Eponate中，安置方向使支架能在装有钻石刀具的Reichert Ultracut E3超微切片机上作垂直切片。用柠檬酸铅对薄切片染色，并在75kV下操作的Hitachi H-7000电子显微镜(Hitachi，San Jose，CA)中检查。
转染细胞培养物对于转染试验，将BC-1-Ep/SL细胞以3×105细胞的密度接种到100毫米平皿中经丝裂霉素C处理的Swiss小鼠3T3成纤维细胞上。使细胞粘附48小时，此时用0.5毫摩尔EDTA除去3T3层。用DME清洗细胞两次，加入含有血清的培养基。24小时后，转染细胞。
质粒DNA用不含内毒素的Maxiprep试剂盒(Qiagen)制备质粒DNA。用XmnI使pGreenLantern线性化。用BglII(Promega)使pcDNA3 neo和pTracer-SV40(Invitrogen)线性化。用pGreenLantern和pTracer-SV40质粒中的组成型活性CMV启动子驱动绿色荧光蛋白(GFP)的表达。
BC-1-Ep/SL细胞转染最优条件的确定用聚阳离子脂质GeneFECTOR(VennNova)转染30-40代的BC-1-Ep/SL细胞。在100毫米平皿的500微升milli-Q无菌水中加入20-33微克线性化质粒DNA，制得转染混合物。根据总DNA与GeneFECTOR的比例在1∶2至1∶4之间的不同，加入不同量的GeneFECTOR。轻轻旋转混合转染混合物，并在室温下培育15分钟。从BC-1-Ep/SL细胞中除去培养基，用DME清洗平板两次，重新加入5毫升DME。在每个平板内滴加入转染混合物，在5％CO2下37℃培育5小时。除去培养基，用DME清洗细胞两次，并重新加入含血清培养基。转染后24小时，用装有GFP短带通滤光器的IX-70倒置荧光显微镜(Olympus)观察细胞，以检查在分析或流式激活细胞分拣(FACS)之前是否转染成功。
最优的瞬时转染效果用聚阳离子脂质GeneFECTOR(VennNova)转染30-40代的BC-1-Ep/SL细胞。对于每个100毫米平皿，在500微升milliQ无菌水中加入15微克线性化pGreenLantern和5微克pcDNA3neo(20微克总DNA)，制得转染混合物。然后加入Genefector，其量为总DNA的3倍(DNA与GeneFECTOR之比为1∶3)。轻轻旋转混合转染混合物，并在室温下培育15分钟。从BC-1-Ep/SL细胞中除去培养基，用DME清洗平板两次，重新加入5毫升DME。在每个平板内滴加入转染混合物，在5％CO2下37℃培育5小时。除去培养基，用DME清洗细胞两次，并重新加入角质细胞培养基。如上所述观察细胞。
流式细胞计数转染后24小时，用0.5毫摩尔EDTA和0.1％胰蛋白酶从培养物中取出BC-1-Ep/SL细胞。在短暂离心(440×g，5分钟)后，将细胞以2×106细胞/毫升重悬于含血清培养基中。将500微升该细胞悬液过滤通过42微米筛网(Tetko，Inc.)，并用5微克/毫升碘化丙锭(PI)染色，然后立即分析。在装有调至488纳米的激光器的FACSean或FACSCalibur台式流式细胞计数仪(均购自Dickinson)上分析转染的BC-1-Ep/SL细胞。用CellQuest软件(Becton Dichinson)获得10000个行为(event)，并分析，分析只局限于活的行为(根据PI染色)。获得细胞存活和瞬时转染效力的数据。
细胞分拣我们用下列方法获得稳定表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞。转染后24小时，用0.5毫摩尔EDTA和0.1％胰蛋白酶取出细胞。在短暂离心(440×g，5分钟)后，将细胞以5-7×106细胞/毫升的密度重悬于含有血清的培养基中。使该悬浮液过滤通过42微米的无菌筛网(Tetko，Inc.)。用5微克/毫升碘化丙锭染色，然后立即进行分拣。在装有调至488纳米的相干氩激光器的FACStar Plus(Becton Dickinson)上分拣出转染的BC-1-Ep/SL细胞。用CellQuest软件(Becton Dickinson)获得转染效率数据。以2000/秒的速度分拣出细胞，分拣后收集样品，以检查存活力和GFP表达。
集落形成效率如下获得集落形成效率(CFE)将1000个行为接种到存在丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞的一式两份60毫米平板上。1周后，使平板在10％福尔马林中固定10分钟，用自来水清洗，并用亚甲基蓝染色过夜。计数集落，并除以接种的行为数，获得最终的CFE。根据计算出的CFE，将行为数乘以CFE，获得形成集落的总数。在分拣后10-12天，用具有GFP短带通滤光器的IX-70倒置荧光显微镜计数表达GFP的集落数。将表达GFP的集落数除以形成的集落总数，获得稳定表达GFP的集落形成效率。
分离和鉴定稳定转染了pGreenLantern的BC-1-Ep/SL细胞如上所述，用pGreenLantern转染BC-1-Ep/SL细胞，并根据荧光进行分拣。在细胞分拣后，立即重新开始培养GFP-阳性BC-1-Ep/SL细胞。将细胞以2-3×104细胞/100毫米平皿的低密度接种到经丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞上。每隔一天，用装有GFP短带通滤光器的IX-70倒置的荧光显微镜(Olympus)监测细胞。刮去不表达GFP的集落，使稳定表达GFP的集落扩张。当表达GFP的集落生长至估计密度为1000细胞或更高时，用环挑取克隆(ring clonging)分离这些集落，并用环重新接种到具有丝裂霉素C处理过的3T3的60毫米平板上，并扩张。
pTracer-SV40稳定转染的BC-1-Ep/SL细胞的分离和鉴定用20微克pTracer-SV40和1∶4的DNAGeneFECTOR(VennNova)转染BC-1-Ep/SL细胞。转染24小时后，用0.5毫摩尔EDTA、0.1％胰蛋白酶取出细胞，并以2×106细胞/毫升的密度重悬于含有血清的培养基中。将3×106个细胞重新接种到具有丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞的两个100毫米平板上。传代后48小时，用250微克/毫升zeocin(Invitrogen)处理5天，选出GFP阳性细胞。如上文所述，用无菌细胞分拣纯化稳定表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞，并进行扩张。
转染的器官型培养物的组织学分析以3×105细胞/胶原支架的密度接种43代的表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞，并在器官型培养物中生长16天。在包埋在石腊中之前，支架培养物在4％多聚甲醛中固定至少1小时。切成5微米切片，用苏木精和伊红(H&E，Surgical Pathology，UW-Madison)对交替切片染色。使未经H&E染色的切片重新水合，用5微克/毫升Hoechst染料(33258)染色15分钟，脱水，并用Cytoseal固定介质(Stephens Scientific)固定。观察切片，并用装有双重FITC-Hoechst滤片的IX-70倒置荧光显微镜(Olympus)拍照。
用共聚焦显微镜检分析GFP表达以3×105细胞/胶原支架的密度接种43代的表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞，并在器官型培养物中生长16天。支架培养物在4％多聚甲醛-PBS中固定过夜，并于4℃用0.1M甘氨酸-PBS溶液清洗1小时。固定整个支架，盖上Vectashield固定介质(Vectorlabs)，并用橡皮泥密封。用在488纳米下激发、在500-530纳米下检测的带通滤光器的共焦激光扫描显微镜(Nikon Diaphot 200)分析GFP的表达。在上方的角质化层开始，以10微米的间隔拍摄图像。显微镜装置在W.M.Keck Neural ImagingLaboratory(University of Wisconsin-Madison)内。
B.结果BC-1-Ep/SL细胞系的分离通过胰蛋白酶处理将细胞从新生儿包皮中脱离出细胞。将等份细胞悬液接种到含0.66毫摩尔钙的标准角质细胞生长培养基中丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3饲养层上，开始培养角质细胞。将等份成纤维细胞悬液接种到含有Ham′s F-12培养基(其中添加了10％胎牛血清)的组织培养板上，开始培养成纤维细胞。
大约9天后，将命名为BC-1-Ep株的角质细胞原代培养物冷冻保藏，并传代培养在饲养层上。使成纤维细胞培养物也生长至几乎铺满，并且也作冷冻保藏。在较早的代数中，BC-1-Ep细胞没有表现出培养的正常人角质细胞的非典型的形态或生长特征。培养的BC-1-Ep细胞表现出分层以及编程性细胞死亡的特征。
为了确定复制寿命，在标准角质细胞生长培养基中以3×105细胞/100毫米平皿的密度将BC-1-Ep细胞连续培养至开始衰老。到了第15代，群体中大多数角质细胞呈现开始衰老(通过存在许多发育不全的集落表现为大的扁平细胞来判断)。
然而，在第16代，发现有较小细胞体积的角质细胞。到第17代，培养物中只有小的角质细胞，而没有发现大的衰老的角质细胞。在该转折点后存活的所得小角质细胞群看来具有均一的形态，并且产生的角质细胞集落表现出典型的角质细胞特征(包括细胞-细胞附着且产生明显的鳞状)。
在衰老后存活的角质细胞以3×105细胞/100毫米平皿的密度连续培育了59代，这证明该细胞获得了无限增殖性。从最初的衰老群体发育产生的角质细胞称为BC-1-Ep/自发系(BC-1-Ep/SL)。
细胞遗传学分析和DNA指纹分析在第3代的亲代BC-1-Ep细胞和第31代以及第54代的BC-1-Ep/SL细胞上进行染色体分析。亲代BC-1-Ep细胞具有46条正常的染色体XY。在31代，所有的BC-1-Ep/SL细胞含有47条染色体，因为染色体8的长臂有额外的等臂染色体(图1)。没有检测到其它染色体异常或标记染色体。在第54代，所有细胞含有等臂染色体8，然而，在小部分细胞群中存在额外的染色体1长臂的等臂染色体以及标记染色体(附录1中表1)。已经在BC-1-Ep/SL细胞中筛选有无前病毒HIV DNA序列的存在，结果发现为阴性。酶促扩增了HIV前病毒的区域，与放射性标记的HIV-1特异性DNA探针杂交，根据大小分离扩增的DNA，用琼脂糖凝胶电泳和放射自显影显色。比较聚合酶链反应产物与已知的HIV-1阳性和阴性对照的大小和特异性。用Southern分析测定HPV16以及31个病毒序列的存在，结果未检测到。
BC-1-Ep/SL细胞系和BC-1-Ep角质细胞的DNA指纹在所有12个基因座均是相同的。BC-1-Ep/SL细胞具有随机的亲代BC-1-Ep DNA指纹的几率为4×10-16。ED-1-Ep，SCC4和SCC13y的DNA指纹与BC-1-Ep图案不同。我们对BC-1-Ep/SL细胞系的DNA指纹分析的数据证实，它是从亲代BC-1-Ep细胞产生的。该数据还表明，分离自其它人的角质细胞、ED-1-Ep、SCC4和SCC13y与BC-1-Ep细胞是不相关的，且它们之间也互不相关。BC-1-Ep/SL DNA指纹数据提供了鉴定BC-1-Ep/SL细胞系的明确方法。
BC-1-Ep/SL角质细胞在无胸腺裸鼠中没有致肿瘤性为了确定亲代BC-1-Ep角质细胞以及无限增殖的BC-1-Ep/SL角质细胞系的致肿瘤性，将细胞注射入无胸腺裸鼠的肋部。用人鳞状细胞癌瘤细胞系SCC4作为在裸鼠内产生肿瘤的阳性对照。设计样品的注射方案，使得每个动物在一侧肋部接受SCC4细胞的注射，相对的一侧接受亲代BC-1-Ep角质细胞或BC-1-Ep/SL细胞注射。这种注射策略消除了动物与动物之间的在肿瘤产生方面的差别，并确证小鼠支持致肿瘤细胞的旺盛生长。亲代BC-1-Ep角质细胞(第6代)和BC-1-Ep/SL角质细胞(第35代)均不在裸鼠中产生肿瘤。致肿瘤性测试的结果显示在附录1的表2中。
体外生长特征BC-1-Ep/SL角质细胞是非致肿瘤的，当在丝裂霉素C处理过的3T3饲养细胞存在下在标准角质细胞生长培养基中培养时，它表现出正常人角质细胞的形态特征。为了进一步评价BC-1-Ep/SL细胞的生长特征，我们检查了角质细胞生长的已知自分泌调节剂的稳态mRNA水平。用Northern分析BC-1-Ep/SL细胞系的mRNA，结果揭示自分泌生长因子如转化生长因子-α(TGF-α)和转化生长因子-β(TGF-β)的表达水平，以及表皮生长因子受体(EGFR)和c-myc的水平与亲代BC-1-Ep角质细胞不是相同就是相似。
接着，我们测定了标准角质细胞生长培养基的哪些组成是BC-1-Ep/SL细胞最优生长所需要的。在表皮生长因子(EGF)不存在下的连续培育导致每一代的细胞数减少60-90％(与含有EGF的对照培养物相比，图1)。BC-1-Ep/SL细胞生长对EGF的依赖性看来是一个稳定的特征。第50代的BC-1-Ep/SL细胞继续表现出最优生长对EGF的依赖性。
在表皮稳态中起重要作用的另一多肽生长因子是转化生长因子-β1(TGF-β1)。在体外，TGF-β1是培养的正常人角质细胞生长的抑制剂(Pientenpol，dr，1990)，但是角质细胞的恶性转化通常导致TGF-β1诱导的生长抑制作用减弱(Bascom，等人，1989；Parkinson，等人，1983；Pietenpol，等人，1990；Rice，等人，1992)。与正常的亲代BC-1-Ep角质细胞一样，TGF-β1抑制了BC-1-Ep/SL细胞系的生长(图3)。TGF-β1诱导的生长抑制作用在亲代以及BC-1-Ep/SL角质细胞均是可以逆转的。
为了进一步确定BC-1-Ep/SL角质细胞体外最优生长的需求，将培养物培育在添加了2.5％胎牛血清、EGF以及标准生长培养基各组成的培养基中。图4证明单独加入胰岛素促使细胞数增加15倍。然而，标准角质细胞生长培养基的所有组成的加入促使BC-1-Ep/SL细胞数增加30倍。这些发现证明BC-1-Ep/SL细胞系保留了体外生长的细胞类型特异性需求。
体外分化特征然后，我们调查了BC-1-Ep/SL细胞是否能在表面培养以及器官型培养中均经历正常的分化。我们监测鳞状分化的标记，即角质化包膜(CE)的形成。在培养的人角质细胞中，CE装配的早期阶段导致形成不成熟的角质化包膜，该包膜由总苞(involucrin)、半胱氨酸蛋白酶抑制剂-a以及其它蛋白质组成，它代表成熟角质化包膜的最内的第三层。我们检查了亲代细胞以及BC-1-Ep/SL角质细胞中的CE形成(附录1中的表3)。附着的亲代细胞或BC-1-Ep/SL细胞系有少于2％的角质细胞产生了角质化包膜。该发现与我们以前的研究相符，证明活跃生长的、亚铺满的角质细胞产生少于5％的CE(Hines和Allen-Hoffmann，1996)。为了确定BC-1-Ep/SL细胞系在受诱导分化后是否能产生CE，从表面培养中取出细胞，并在用甲基纤维素制成的半固体培养基中悬浮24小时。通过使角质细胞丧失细胞与细胞之间以及细胞与基底之间的粘附，可在体外引发终末分化的许多情况(包括角蛋白的差异表达(Drozdoff和Pledger，1993)和CE形成(Green，1977))。我们发现，BC-1-Ep/SL角质细胞产生了与亲代角质细胞一样多且通常更多的CE(附录1中表3)。这些发现证实BC-1-Ep/SL角质细胞并不缺乏形成该细胞类型特异性分化结构的能力。
BC-1-Ep/SL细胞在丧失粘附后经历凋亡然后，我们通过测定DNA的核小体切割来确定BC-1-Ep/SL角质细胞是否经历凋亡。特异的DNA切割成寡核小体片段是凋亡的一个特点(Arends，等人，1990；Wyllei，1980)。到目前为止研究的所有种类的角质细胞在体内和体外都经历凋亡。表皮角质细胞的部分分化通道必定是去核和丧失代谢活性。角质细胞终末分化和凋亡之间存在许多类似情况。我们评价了亲代BC-1-Ep以及BC-1-Ep/SL角质细胞在悬浮后经历核小体切割的能力。当细胞悬浮在半固体介质中而除去细胞-细胞以及细胞-基底之间的接触后，正常培养的人角质细胞表现出凋亡的形态和生化特征。使亲代或BC-1-Ep/SL细胞系的附着的、预先铺满的角质细胞在无血清、无添加剂的培养基中生长24小时，显示出没有可检测的DNA片段化。类似的，用无血清、无添加剂的半固体培养基处理粘附性细胞相同时间，结果没有显示出核小体片段化。当悬浮于半固体培养基中时，亲代以及BC-1-Ep/SL角质细胞均表现出DNA片段化。这些发现与我们实验室以前的研究相一致，即证明了丧失附着而被诱导分化的正常人角质细胞其DNA会发生片段化(Hines和Allen-Hoffmann，1996a，b；Sachsenmeier，等人，1996)。综合起来，这些数据证明BC-1-Ep/SL角质细胞能够分化，并对细胞类型特异性信号产生正常反应而经历凋亡。
BC-1-Ep/SL细胞的器官型培养物表现出正常的鳞状分化为了确证BC-1-Ep/SL角质细胞能经历正常的鳞状分化，将细胞培养在器官型培养物中。培养在塑料基材上培养基下的角质细胞的分化促进了生长，并且限制了分化。具体地说，人角质细胞变成铺满，分层细胞并产生了类似于分层上皮的多层。然而，通过光学和电子显微镜，发现组织培养物形成的多层结构与完整的人皮肤显著不同。器官型培养是一种在类似于体内的条件下培养角质细胞的技术。具体地说，使细胞附着于生理基质，将原纤维胶原包埋在皮肤成纤维细胞内，并将细胞升至空气-培养基截面处，使细胞能生长成上层接触空气而使增殖的基底细胞靠近经胶原凝胶扩散而提供的营养物梯度。在这些条件下，就形成了正确的组织结构。
我们将第5代亲代细胞BC-1-Ep与生长在器官型培养物中的第38代BC-1-Ep/SL细胞系作了比较。结果显示了正常分化表皮的几个特征。在亲代细胞和BC-1-Ep/SL细胞系中，单层立方形基底细胞静止在表皮与皮肤等价物的连接处。圆形形态和细胞核与细胞质的高比值表明是一群分裂活跃的角质细胞。在正常的人表皮内，当基底细胞分裂时，它们产生的子细胞向上迁移至组织的分化层。子细胞体积增加，并变平，呈鳞状。最后，这些细胞脱核并形成角质化结构。这种正常的分化过程可从BC-1-Ep亲代细胞以及BC-1-Ep/SL细胞的上层中看出。变平的鳞状细胞出现在基底细胞上的角质细胞上层中，这证明已经发生分层。在最上部的组织(A和B)中，脱核的鳞片显示出与培养物顶部脱离。到目前为止，我们还未在光学显微镜水平发现亲代BC-1-Ep角质细胞与生长在器官型培养物中的BC-1-Ep/SL角质细胞系之间在分化方面有组织学差异。
为了确证我们的组织学观察结果，我们用电子显微镜分析了第6代BC-1-Ep和第38代BC-1-Ep/SL。更高的放大倍数使我们能够观察支架培养物中正常分化的更详细的特征性结构。显微照相检查使我们相信，BC-1-Ep/SL细胞在器官型培养时经历正常的分层。这与用亲代BC-1-Ep细胞所见的结果相似(数据未显示)。我们还注意到基底层中还形成了半桥粒，这也暗示该细胞系能形成正常人表皮中所见的结构。半桥粒是特化的结构，它增加了角质细胞与基底层的粘附性，并有助于保持组织的完整和强度。光学和电子显微镜的数据均证实，BC-1-Ep/SL细胞系能在器官型培养物中正常分层和分化。
BC-1-Ep/SL细胞系的最优瞬时转染效率我们已经选用含有绿色荧光蛋白(GFP)基因的质粒pGreenLantern作为转染标记。GFP是一种来自水母的天然发荧光的无毒性蛋白，它很容易在接触UV光时看到。另外，一些实验包括pGreenLantern与另一质粒pcDNA3neo的共转染，后者含有新霉素抗性基因，从而使细胞能在G418存在下生长。然而，用G418作为选择方法对角质细胞有很大的毒性，并可能无意中杀死阳性转染的细胞。我们相信，根据GFP表达来无菌分拣细胞将为选择阳性转染体提供一种快速的方式，且是目前可行的毒性最低的选择方法。
在优化该系统中的转染时，要考虑许多参数。我们已将这些参数缩小至获得最大转染效率所最必需的三个参数。这些参数包括细胞汇合度、DNA总量(浓度)以及DNA与转染剂(GeneFECTOR)之比。利用设定的参数完成转染，在第二天用倒置的荧光显微镜分析细胞中GFP表达的存在。另外，用流式细胞计数仪来获得关于GFP阳性细胞的存活力和数量的信息。
细胞汇合度看来是获得最大转染效率中的关键因素。用转染20-25微克DNA不同汇合度水平的BC-1-Ep/SL细胞，24小时后用流式细胞计数仪分析。几个实验的瞬时转染效率表明，5-7×105细胞/100毫米平皿的低的汇合度(汇合度约为30％)将产生最高的转染效率(10-19.5％之间)。在高汇合度(2-4×106细胞/100毫米平皿，汇合度约为70％)下进行的转染将产生低得多的瞬时转染效率(1-3％)(图5)。
另外，用总量为20-33微克的pGreenLantern和pcDNA3neo，测试最优的DNA浓度。所有其它参数保持恒定。我们发现，较高水平的总DNA没有产生较佳的转染效率。我们的数据暗示，总共20微克DNA对于BC-1-Ep/SL细胞的转染来说是最合适的，导致的瞬时转染效率为3.79-13.64％(附录1中表4)(该表中包括了细胞汇合度，以说明实验之间转染效率的差别。)我们发现较高的DNA用量导致对细胞的毒性增加(流式细胞计数仪，数据未显示)。
在优化BC-1-Ep/SL细胞转染效率中检验的第三个参数是DNA与转染剂之比。调查了几个不同的DNA与GeneFECTOR的比值，包括1∶2、1∶3和1∶4。从一式三份的实验收集到的瞬时转染效率表明，1份DNA对3份GeneFECTOR(1∶3)的比值是最优的，转染效率在10-19.5％之间(附录1表5)(表中包括细胞汇合度用来说明实验间转染效率的差异)。我们得出结论，30％的细胞汇合度(5-7×105细胞/100毫米平皿)、20微克DNA的总量以及DNA与GeneFECTOR的1∶3的比值是BC-1-Ep/SL细胞系中最优瞬时转染效率的条件。
稳定的GFP转染的BC-1-Ep/SL细胞的鉴定和分离用上述瞬时转染效率最优化的条件，我们成功地分离并获得了稳定表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞。稳定表达定义为GFP基因整合到宿主细胞染色体内。从以前观察瞬时转染的GFP阳性细胞的结果看出，注意到最亮的细胞(具有最高GFP表达的那些细胞)可能过于分化而不能在表面培养物中复制时保留集落形成能力。为了测试这一现象，转染了细胞并根据从最暗淡到最亮的GFP表达荧光强度作无菌分拣。接种从细胞分拣获得的GFP阳性细胞，分拣后10-12天检测稳定的集落并计数。注意到这些集落中的GFP表达差异。较大的分化的细胞看来具有较亮的GFP表达。如上所述，计算稳定的、GFP阳性集落形成效率(CFE)。已经完成了三个分开的细胞分拣实验，计算出稳定的GFP阳性细胞百分数为3.2％、4.7％和5.64％。附录1中表6显示了代表这些实验之一的例表。在一式三份实验中获得的数据暗示，GFP荧光最强的那些细胞的集落形成效率似乎低于GFP荧光较弱的细胞。GFP阳性CFE使我们能够估计出接种所需的GFP阳性细胞数量，以获得合理数量的稳定转染的集落。
作为无菌分拣的结果，我们能分离并扩增数个稳定表达GFP的BC-1-Ep/SL细胞的克隆系。已对从pTracer-SV40和pGreenLantern载体表达GFP的细胞系作了连续传代，而细胞形态没有明显改变，GFP表达没有下降。
表达绿色荧光蛋白的BC-1-Ep/SL角质细胞的稳定转染体在器官型培养中表现出正常的分层为了测试稳定转染GFP的阳性BC-1-Ep/SL细胞重新产生正常的组织结构的能力，我们将这些细胞接种到器官型培养物中。此类培养物能使细胞在三维微环境中尽可能多地展现出完整皮肤的特征。重复该程序三次，用荧光显微镜以及共聚焦显微镜对得到的组织作组织学分析(数据未显示)。结果看来稳定转染的细胞以类似于未转染的BC-1-Ep/SL对照的方式分化。两种培养物显示出相当的细胞分层，且在光学显微镜水平下没有显著的组织学差别。令人感兴趣的是，在培养物的分化上层中，GFP的显现最强。我们用荧光显微镜和共聚焦显微镜观察了该表达方式。GFP强度的差别可能是细胞层中累积的该蛋白质量的差异所引起。或者，推动GFP表达的CMV启动子可能直到细胞达到更分化的状态时才具活性。
2.用器官型培养系统中的自发无限增殖的人角质细胞BC-1-Ep/SL作为人鳞状细胞癌生长的模型A.材料和方法细胞组分的描述BC-1-Ep/SL细胞系是一种自发无限增殖的人角质细胞系，它保留了正常的角质细胞生长和分化特征。用标准方法来分离它，用于培育新生儿人包皮样品的原代角质细胞。如Allen-Hoffmann和Rheinwald(Rheinwald，J.G.，等人，1981)所述的那样，在丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞存在下接种等份单细胞悬液，建立角质细胞培养物。
从正常人新生儿分离出MW-1-F成纤维细胞，并在采用新生儿包皮胰蛋白酶解聚标准方法后培育。将等份解聚细胞悬浮液接种到含有添加了10％胎牛血清的Ham′sF-12培养基的组织培养板上，开始培养。如下所述，用第二代和随后代次的成纤维细胞培养物作为器官型培养模型的部分非表皮组分。
SCC13y细胞系作为发展器官型共培养模型的原型H&N恶性细胞系。SCC13y从SCC13细胞系传代培养获得。SCC13从放疗后复发的面部表皮肿瘤衍生获得(Rheinwald，J.G.，等人，1981)。用胶原酶解聚程序从该肿瘤的外科活检物产生单细胞悬液。将细胞悬液接种到丝裂霉素C3T3成纤维细胞饲养层上，以便分离和扩增原代培养物。通过在培养物中连续传代建立了SCC13细胞系，并保留了衍生获自该肿瘤的非整倍体染色体组型。SCC13y在甲基纤维素悬浮(该技术促进正常角质细胞中某些分化标记和结构的表达)后保留有限的分化能力。然而，SCC13y在无胸腺裸鼠中有致肿瘤性。
细胞培养使BC-1-Ep/SL细胞生长在标准的角质细胞生长培养基中。标准的角质细胞培养基是Ham′s F12Dulbecco改进的Eagle培养基(DME)的混合物(3∶1，0.66mM钙)，其中添加了2.5％胎儿克隆II(FCII，是Hyclone生产的胎牛血清替代物)、0.4微克/毫升氢化可的松(HC)、8.4毫微克/毫升霍乱毒素(CT)、5微克/毫升胰岛素(Ins)、24微克/毫升腺嘌呤(Ade)、10毫微克/毫升表皮生长因子(EGF)、100单位青霉素和100微克/毫升链霉素(1％P/S)。使细胞在含有丝裂霉素C灭活的Swiss小鼠3T3成纤维细胞饲养层的100mm2组织培养皿上以3×105个细胞隔周传代。
MW-1-F成纤维细胞原种维持在添加了10％牛血清的DME中，在100mm2组织培养皿上隔周传代。
将SCC13y细胞系原种维持在SCC培养基上(DME，其中添加了5％FCII、0.4微克/毫升HC以及1％P/S)。使细胞在有丝裂霉素C灭活的Swiss小鼠3T3成纤维细胞饲养层的100mm2组织培养皿上隔周传代。
器官型培养物的形成器官型培养物如上所述那样(Parenteau，N.，1994)生长。修改该程序，使肿瘤灶在重建的表皮/真皮等价物中生长(图2)。将正常人新生儿成纤维细胞MW-1-F(第5代)与10％FCII＋F－12＋青霉素/链霉素中的I型胶原混合，形成胶原基底。使该胶原基底收缩5天。将BC-1-Ep/SL(第31代)接种到胶原基底上，在50微升0.2％FCS＋3F121DME(含有1.88毫摩尔钙)＋HC＋Ade＋Ins＋CT＋P/S中为3.5×105细胞。为了使分层的角质细胞与恶性细胞共同培养，在接种前将SCC13yGFP+细胞以500、5000和100,000个SCC13yGFP+细胞对3×105BC-1-Ep/SL细胞的比例与BC-1-Ep/SL细胞混合(图1)。在另外加入13毫升培养基前，使细胞附着2小时(第0天)。在第1天和第2天重新喂养细胞。第4天，将细胞上升至空气与棉花垫的界面处，并换成角质化培养基(2％FCS＋3F121DME＋HE＋Ade＋Ins＋CT＋P/S，含有1.88毫摩尔钙)。每隔3天给细胞喂角质化培养基。第15天除去培养基，用4％多聚甲醛固定该器官型培养物过夜，并用0.1M甘氨酸PBS保藏。
GFP表达载体和SCC13y的转染用市售的人化绿色荧光蛋白(GFP)表达载体pGreenLantern(Life Technologies，Gaithersburg，MD)基因标记SCC13y细胞系。用组成型活性人巨细胞病毒启动子控制GFP表达，以使GFP在稳定转染的SCC13y细胞中积累。用Endotoxin Free Maxiprep试剂盒(Qiagen)从载体转化的细菌原种制得质粒DNA。
对于转染实验，将SCC13y(第60代)细胞以1×105细胞密度接种到6孔平板内丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞饲养层上。使SCC13y细胞粘附24小时，然后用0.5毫摩尔EDTA除去3T3层。用DME清洗SCC13y细胞两次，加入含有血清的介质。24小时后转染细胞。
用聚阳离子脂质GeneFECTOR(VennNova)转染SCC13y细胞(第60代)。在这里，用GFP转染的细胞称为SCC13yGFP+。第10代是转染后的第一代。将10毫克pGreenLantern加入6孔平板每个孔中的200微升未添加其它物质的DME中，制得转染混合物。将30微克GeneFECTOR加入DNA溶液中，至DNA与GeneFECTOR的最终比例为1∶3，总体积为400微升。轻轻旋转混合该转染混合物，并在室温下暗处培育15分钟。从SCC13y培养物中除去介质，用不含磷酸的DME清洗平板两次，重新加入2毫升不含磷酸、未添加其它物质的DME。在每个平板内滴加入转染混合物，5％CO2下37℃培育细胞3小时，每隔30分钟振动一次。除去培养基，用DME清洗细胞两次，并重新加入SCC培养基(没有抗生素)。24小时后，用添加了抗生素的SCC培养基替代原培养基。
GFP表达的流式细胞计数仪检测和定量测定转染后24小时，用0.5毫摩尔EDTA和0.1％胰蛋白酶从培养物中取出SCC13y细胞。离心(440×g，5分钟)收集细胞，并以2×106细胞/毫升的细胞密度重悬在含血清培养基中，用5毫克/毫升碘化丙锭(PI)染色。使500微升该细胞悬浮液过滤通过42微米目筛(Tetko，Inc.)，立即分析除去团块。在装有488纳米激光器的FACScan或FACSCalibur台式流式细胞计数仪(均购自Dickinson)上分析转染的SCC13y细胞。用CellQuest软件(Becton Dichinson)获得10000个行为并分析。分析排除PI染色的、不存活的细胞。计算活细胞总数中的SCC13yGFP+活细胞百分数，作为SCC13yGFP+的瞬时转染效率或百分数。在测定SCC13yGFP+群体中GFP表达随时间的稳定性的实验中，每隔4周测定表达GFP的细胞的百分数。
稳定的SCC13yGFP+细胞的分离和鉴定转染后，将瞬时转染的SCC13y细胞连续传代到100mm2组织培养皿上。扩增1周后，再次将这些细胞传代到150mm2组织培养皿上，并使其再生长1周。这使得稳定的转染体扩增，且瞬时转染体中丧失GFP表达。用0.5毫摩尔EDTA和0.1％胰蛋白酶取出细胞。离心后(440×g，5分钟)，将细胞以5×106细胞/毫升的密度重悬于含5毫克/毫升PI的含血清培养基中。然后使该悬浮液过滤通过42微米的无菌筛网(Tetko，Inc.)，然后立即进行分拣。转染的SCC13y细胞在装有相干氩488纳米激光器的FACStar Plus(Becton Dickinson)上进行分拣。细胞以2000/秒的速度分拣，分拣后收集样品，检查存活力和GFP表达。没有收集到非存活细胞。
在细胞分拣后，立即重新开始培养SCC13yGFP+细胞。将获得的所有细胞(通常1-3×104)接种到具有丝裂霉素C处理过的Swiss小鼠3T3成纤维细胞饲养层的100mm2平皿上。每隔一天用装有GFP短带通滤光器的IX-70倒置的荧光显微镜(Olympus)监测细胞。从平皿中刮下集落，除去不表达GFP的集落。重新培养稳定表达GFP的集落使其扩增。当表达GFP的集落生长至估计密度为1000细胞或更多时，将细胞重新接种到含有丝裂霉素C处理过的3T3饲养层的100mm2平板上并扩增。如上所述，用流式细胞计数仪建立群体中SCC13yGFP+细胞的基线百分数。
连续培育SCC13yGFP+的稳定性使SCC13yGFP+细胞在下列条件下的标准SCC培养基中生长。所有细胞在具有丝裂霉素C灭活的3T3饲养层的6孔板中生长，在3个孔中一式三份。每隔6天，用0.1％胰蛋白酶收获各培养物，将1×105个细胞传代到具有饲养层的6孔板的新孔内。每隔两周更换培养基。在间隔4周时，以2×106细胞/毫升悬浮样品，并如上述用流式细胞计数仪分析GFP的表达。
SCC13yGFP+的体外生长将1×105细胞接种到无丝裂霉素C处理的小鼠3T3饲养层的6孔组织培养板的复制孔内。每天收获各样品的复制孔，用血细胞计数器计数确定总细胞数。用标准ANOVA统计分析测试SCC13y对照(未转染的)和SCC13yGFP+之间的细胞平均数差别。
SCC13yGFp+细胞在无胸腺小鼠中的生长将5-10×106细胞/100微升未添加其它物质的DME注射到3-4周龄雌性无胸腺裸鼠(Harlan-Sprague-Dawley)中，测定表达GFP的SCC13y细胞生长成肿瘤异种移植物能力。每个动物在背部和腹部皮下分别注射一剂未转染的SCC13y和SCC13yGFP+。改变不同小鼠中各部位注射的细胞类型。检查了总共8只小鼠，对每个细胞系作一次测试。所有小鼠均饲养在授权的动物研究机构中，且实验技术和方法均得到Wisconsin-Madison大学卫生科学动物管理委员会的评审和批准。
SCC13yGFP+的克隆源性存活将指数生长培养物的某范围细胞密度接种到含有丝裂霉素C处理过的小鼠3T3饲养层的复制的6孔板中，测定集落形成效率(CFE)。在标准的SCC中生长大约2周后，在10％福尔马林中固定平板10分钟，用自来水清洗，然后用亚甲基蓝染色过夜。计数约有50个细胞的集落。根据[(集落计数)/(接种的细胞数)]×100％，计算CFE。一式两份测定平均CFE，并用标准的ANOVA统计分析测试未转染的SCC13y对照和SCC13yGFP+之间的差别。
SCC13yGFP+的辐射后存活用0、1、3、6和10Gy剂量辐照一式两份的指数生长的培养物，测定SCC13y和SCC13yGFP+细胞的辐照后存活。培养物维持在25mm2组织培养瓶中，当用5.86Gy/分钟的当前剂量速率照射137Cs隔热箱时，每个瓶子具有1-2×106细胞的总细胞数。辐照后，用胰蛋白酶处理细胞，计数，稀释，并接种到3-5个60mm2平皿中丝裂霉素C处理过的3T3饲养层上至一定范围的细胞密度，以检测集落生长。如上所述测定集落形成效率。一式两份测定平均CFE，并用标准的ANOVA统计分析测试未转染的SCC13y和SCC13yGFP+之间的差别。
转染的器官型培养物的组织学分析以500、5000、100000细胞/胶原基底的密度接种第9代的SCC13yGFP+细胞，并在器官型共培养物上生长16天。在包埋在石腊中之前，使器官型培养物在4％聚甲醛中固定过夜。切取切片(5微米)，交替固定切片，并由Surgical Pathology，UW-MadisonHospital，Madison，WI用苏木精和伊红(H&E)染色。使没有H&E的切片重新水化，用5毫克/毫升Hoechst染料(33258)染色15分钟，脱水并用Cytoseal固定基质(StephensScientific)固定。用装有双重FITC-Hoechst滤光器(470nm±20和525nm±带通)的IX-70倒置荧光显微镜(Olympus)观察切片。
角共聚焦显微镜分析GFP表达如上所述，以每个胶原支架500个细胞的密度接种第9代表达GFP的SCC13y细胞，并在器官型培养物中生长16天。将器官型培养物固定在4％聚甲醛-PBS中过夜，然后用4℃ 0.1M甘氨酸-PBS溶液清洗1小时以上。用Vectashield固定基质(Vectorlabs)固定培养物并盖上盖波片，并用橡皮泥密封。用激发波长为488纳米、和500-530纳米带通滤光器检测的共聚焦激光扫描显微镜(Nickon Diaphot 200)分析GFP表达。从上层角质化层开始，以大约1微米的间隔拍摄图像(W.M.Keck Neural ImagingLaboratory，University of Wisconsin-Madison)。
B.结果SCC13y的转染效率该组实验的一个目的是优化SCC13y的转染效率。瞬时转染定义为在转染后48小时内转染的构建物阳性表达。主要检查了三个变量对于转染效率的影响DNA的浓度、GeneFECTOR的浓度以及细胞密度。附录1中的表7归纳了转染后用流式细胞计数仪测得的GFP+细胞的百分数。用10微克的DNA加入量和1∶2的DNAGeneFECTOR比率，观察到最优的SCC13y转染效率为21.4％。当细胞处于指数生长期，但在培养物达到铺满之前，观察到最适合转染的细胞密度。尽管未存活的细胞可能是阳性转染物，但流式细胞计数仪软件将此类细胞排除在分析之外。在所有实验中，观察到的死亡细胞总数小于分析细胞总数(＜8％)。
SCC13yGFP+群体的分离采用上述最优的瞬时转染条件，用pGreenLantern GFP质粒转染指数生长的SCC13y，分离出稳定的SCC13yGFP+细胞。稳定转染定义为在不少于4周的连续培育期间有阳性GFP表达。瞬时转染细胞的GFP表达在流式细胞计数图上在大约2个log的范围内变化，并代表了转染细胞总体群数的大约4％。在接种分拣细胞后，观察到在集落内(和集落间)有个别SCCl3yGFP+集落表达水平不同，然而很少观察到有混合的GFP+/GFP-集落。到第3代，分拣SCC13yGFP+群体后的分拣后核查显示大约85％的细胞表达GFP。
SCC13yGFP+转染体中稳定的GFP表达第7代的SCC13yGFP+合并群体表现出GFP表达基线水平比不表达GFP的SCC13y中检测到的自发荧光背景高大约1个对数。
用FACS分析软件发现群体中SCC13yGFP+细胞百分数为90％。这与上述较早代分拣后发现的GFP+细胞百分数(85％)非常相当。SCC13yGFP+细胞定义为其GFP信号大于存活的、未转染的SCC13y细胞中检测到的最高GFP信号的所有细胞。用荧光显微镜肉眼观察，确证该群体中存在很少(如果有的话)的不表达GFP的SCC13y。
另一组实验已经证实SCC13y中的GFP表达在较长的时间内稳定。在分离稳定的SCC13yGFP+后12代测得的GFP表达的直方图证明GFP+百分数(85％)几乎没有变化，且GFP信号仍旧比不表达GFP的对照高大约1个对数。荧光显微镜确证，用肉眼看，100％的细胞均呈现绿色。
体外SCC13y生长不受GFP表达影响然后，检查SCC13yGFP+细胞的体外生长，以确定GFP表达是否影响SCC13y生长。SCC13yGFP+和未转染的SCC13y细胞以几乎相同的生长速度生长，且在体外生长6天后达到相近的细胞总数。另外，两个细胞系均表现出在指数型快速生长期后有一典型的缓慢生长的初始滞后期。
SCC13yGFP+保留致肿瘤性SCC13y细胞系是恶性细胞系，能在裸鼠中形成肿瘤。检查SCC13yGFP+细胞，以确定外源GFP表达是否改变了SCC13y细胞形成肿瘤异种移植物的能力。在注射了两种细胞系的8只小鼠中，每只小鼠均在注射后的第一周内产生可见的肿瘤。另外，没有发现肿瘤消退(监测8周)。继续这些实验，所有肿瘤的大小均按周增加，但是每个肿瘤的生长速度不一定相同。
SCC13yGFP+辐照后反应没有改变SCC13y细胞系对辐照的反应已有详细的描述(Petereit，D.G.，等人，1994)。6Gy的辐照剂量能杀死大约99％(2个对数)的指数生长细胞，而10Gy能杀死大约99.9％(3个对数)的指数生长细胞。在相同剂量范围内，采用表达GFP的SCC13y细胞的相似实验产生了几乎相同的结果。另外，在该克隆源性存活试验中测定的SCC13yGFP+集落形态看来与未转染的SCC13y细胞相似。在2周试验期间，集落在集落大小或细胞密度方面没有呈现差异。这些观察结果确证GFP表达对SCC13y辐照敏感性没有影响。
SCC13yGFP+共同培养没有改变BC-1-Ep/SL角质细胞的正常分层前面已经表明，BC-1-Ep/SL细胞能在器官型培养物中形成完全分化的皮肤。将恶性细胞类型导入这一功能正常组织中看来不会改变BC-1-Ep/SL正常鳞状分化的能力。BC-1-Ep/SL和SCC13yGFP+细胞的共同培养物生长的观察结果确定了与分层的上皮相似的多层。BC-1-Ep/SL细胞继续表现出正常分化表皮的几个特征。发现基底细胞形成单层立方体细胞，该细胞在表皮与皮肤等价物的连接处。圆形的形态和高的胞核胞质比表明是活跃分裂的角质细胞群。在向皮肤表面移动的细胞中明显有正常的分化，因为它们变平，变成鳞状，并且在上层组织中丢失细胞核。
鉴定器官型培养物SCC13yGFP+和BC-1-Ep/SL分层上皮中的3-D肿瘤灶为了确定恶性SCC13yGFP+细胞系是否能在主要是非恶性的角质细胞培养物中形成肿瘤灶，将不同数目的SCC13yGFP+细胞接种到BC-1-Ep/SL角质细胞器官型培养物中。在实验开始时，SCC13yGFP+细胞以每300000个BC-1-Ep/SL细胞500、5000和100000个细胞的密度接种。培养两周后，所有实验组均形成GFP+的生长的肿瘤灶。最高浓度的SCC13yGFP+细胞(100000个SCC13yGFP+对300000个BC-1-Ep/SL细胞)产生了连续的GFP+细胞层，该细胞层看来压倒了BC-1-Ep/SL细胞的生长。能以三维方式检查器官型培养物的共聚焦显微镜确证形成了许多单个的SCC13yGFP+肿瘤灶，这些肿瘤灶生长在BC-1-Ep/SL细胞器官型培养物形成的正常组织样结构内。SCC13yGFP+灶主要以椭圆形块生长，且每个灶含有不少于50个细胞。令人感兴趣的是，看来SCC13yGFP+细胞灶的生长没有因BC-1-Ep/SL(非绿色)共培养细胞而中断，即，一个灶的所有GFP+细胞彼此毗邻。这些观察结果确证SCC13y恶性细胞能在工程改造的人组织中共同培养，且GFP表达是一种有效的标记方法，可用来鉴定和显示非常少的人肿瘤灶。
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附录I表1染色体随着传代而畸变在第3代的亲代BC-1-Ep以及第31代和54代的BC-1-Ep/SL细胞的20条染色体上进行染色体分析。传代数 条数46，XY47，XY＋i(8q)48，XY＋i(iq)＋i(8q)48，XY＋i(8q)＋标记49，XY＋i(1q)＋i(8q)＋标记3 20 20 0 0 0031 20 0200 0054 20 0171 11表2BC-1-Ep/SL细胞在裸鼠中的致肿瘤性为了确定BC-1-Ep/SL细胞是否形成肿瘤，将细胞以5×106细胞/100微升F12的浓度皮下注射入6只裸鼠的肋部。将第6代BC-1-Ep以3×106细胞/100微升F12的浓度注射入6只裸鼠的肋部作为阴性对照。将第20代的SCC4y注射入4只裸鼠的肋部作为阳性对照。对小鼠称重，26天后测定肿瘤。注射方法如下所示。动物数目条件 体重(克)肿瘤面积(mm2)1 左肋＝BC-1-Ep第6代22 -右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -2 左肋＝BC-1-Ep第6代24 -右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -3 左肋＝SCC4y第20代 21 105.2右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -4 左肋＝BC-1-Ep第6代25 -右侧＝SCC4y第20代1183.65 左肋＝BC-1-Ep第6代23 -右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -6 左肋＝BC-1-Ep第6代22 -右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -7 左肋＝SCC4y第20代 22 51.3右侧＝BC-1-Ep/SL第35代 -8 左肋＝BC-1-Ep第6代19 -右侧＝SCC4y第20代 463.3
表3BC-1-Ep/SL细胞中角质化包膜的形成使BC-1-Ep/SL细胞在3T3饲养层存在下生长。除去饲养层，2-3天后，使细胞在1.68％甲基纤维素制成半固体的3F121DME＋青霉素/链霉素中以大约106/毫升的浓度悬浮24小时。清洗粘附的细胞，在3F121DME＋青霉素/链霉素中培育24小时。使细胞在含有1％SDS和20毫摩尔DTT的PBS中沸腾5分钟，分离包膜，并用血细胞计数器计数。
处理 粘附的 悬浮的实施例1 亲代(*第4代) 1.51％ 43.3％BC-1-Ep/SL(第31代) 1.32％ 69.8％实施例2 亲代(第6代)1.79％ 32.8％BC-1-Ep/SL(第33代) 1.05％ 73.7％表4DNA浓度对BC-1-Ep/SL细胞中瞬时转染效率的影响用含有GFP的质粒pGreenLantern(Gibco)和pcDNA3neo(Invitrogen)以及下述不同量的DNA转染BC-1-Ep/SL细胞。DNA与GeneFECTOR之比维持恒定在1∶4。用FACS获得转染效率。通过胰蛋白酶处理并用血细胞计数器计数角质细胞，测得细胞数。
表5DNA与GeneFECTOR之比影响瞬时转染效率用不同比值的质粒DNA(pGL＋pcDNA3neo)和转染剂(GeneFECTOR)转染BC-1-Ep/SL细胞。DNA浓度维持恒定在15微克pGreenLantern和5微克pcDNA3neo。用FACS获得转染效率。通过胰蛋白酶处理细胞和血细胞计数器计数测得细胞数。
表6用pGreenLantern稳定转染BC-1-Ep/SL细胞用最优的瞬时转染参数，用pGreenLantern和pcDNA3转染BC-1-Ep/SL细胞。转染24小时后，以4-6×106/毫升的密度悬浮角质细胞，用5毫克/毫升碘化丙锭染色。根据GFP荧光强度，将BC-1-Ep/SL细胞无菌分拣成四类。通过计数每p60接种的1000个细胞形成的集落数，计算出集落形成效率。用具有GFP短带通滤光器的倒置荧光显微镜计数GFP阳性集落。该表代表了一个细胞分拣实验。
表7转染％
权利要求
1.一种无限增殖的角质细胞系，其中细胞系包含正常的46条染色体，而且染色体8的长臂还有额外的等臂染色体。
2.根据权利要求1所述的细胞系，其中细胞系是ATCC CRL-12191。
3.转染了异源基因的权利要求1所述的无限增殖的人角质细胞。
4.根据权利要求3所述的细胞系，其中细胞系是ATCC-12191。
5.根据权利要求4所述的细胞系，其中转基因是标记基因。
6.根据权利要求1所述的细胞系，其中细胞是单层培养物或生物膜。
7.根据权利要求1所述的细胞系，其中细胞是器官型培养物。
8.根据权利要求5所述的细胞系，其中标记基因编码绿色荧光蛋白。
9.一种测定受测试的肿瘤细胞调节剂效果的方法，该方法包括下列步骤a)获得人复层鳞状上皮细胞培养物，其中该培养物包含恶性鳞状上皮细胞和自发性无限增殖的人角质细胞，且该培养物形成重建的表皮，b)用受测试的肿瘤细胞治疗剂处理该表皮，和c)评价表皮内的恶性细胞。
10.根据权利要求9所述的方法，其中对恶性细胞作基因标记。
11.根据权利要求10所述的方法，其中基因标记是绿色荧光蛋白。
12.根据权利要求11所述的方法，其中用荧光激活细胞分拣法测定恶性细胞的生长。
13.根据权利要求9所述的方法，其中对人角质细胞作基因标记。
14.根据权利要求13所述的方法，其中标记是绿色荧光蛋白。
15.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)评价的是细胞生长。
16.根据权利要求9所述的方法，其中步骤c)评价的是细胞大小或形状。
17.根据权利要求9所述的方法，其中恶性细胞分离自单个患者组织。
18.一种器官型培养物，它包含无限增殖的人角质细胞与人鳞状细胞癌SCC细胞。
19.根据权利要求18所述的培养物，其中角质细胞是ATCC CRL-12191。
20.根据权利要求19所述的培养物，其中SCC细胞是SCC13y细胞。
21.根据权利要求18所述的培养物，其中用编码绿色荧光蛋白的基因转染SCC细胞。
22.根据权利要求18所述的培养物，其中SCC细胞分离自单个患者组织。
23.根据权利要求18所述的培养物，它还包含胶原和成纤维细胞的基底层。
24.一种评价受测试化合物对人毒性的方法，该方法包括下列步骤a)使受测试化合物接触权利要求1所述的细胞系，和b)评价该化合物对细胞系的影响。
全文摘要
本发明公开了一种自发性无限增殖的人角质细胞系。在一个较佳的实施方案中,该细胞系是ATCC 12191。在本发明的另一实施方案中,公开了测定受测试肿瘤细胞调节剂效果的方法。该方法包括以下的步骤:获得人复层鳞状上皮细胞培养物,其中培养物包含人恶性鳞状上皮细胞和自发性无限增殖的人角质细胞,其中该培养物形成了重建的表皮。然后用受测试肿瘤细胞调节剂处理该表皮,然后评价该表皮内恶性细胞的生长。
文档编号A61P35/00GK1326354SQ99808564
公开日2001年12月12日 申请日期1999年7月12日 优先权日1998年7月13日
发明者L·艾伦－霍夫曼, S·J·施洛斯尔, M·A·皮卡特 申请人:威斯康星校友研究基金会