多聚核苷酸构建体及其应用的制作方法

专利名称：多聚核苷酸构建体及其应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种多聚核苷酸构建体，该构建体含有可操作地与启动子序列相连的缺氧反应元件，用于在肿瘤细胞等处于缺氧条件下的靶细胞中表达治疗基因。
背景技术：
基因疗法是指通过基因转移来治疗或预防疾病的方法，它是用于治疗多种人类恶性肿瘤的众多方法之一。详细地说，对癌症分子遗传学的日益了解导致多种癌症治疗新策略的出现。目前正进行临床试验测试的基于基因的疗法主要涉及先体外后体内或体内使用病毒性或脂质体性载体以向肿瘤传送基因，用来(ⅰ)取代肿瘤抑制基因或使癌基因灭活，(ⅱ)表达已知可激活或提高抗肿瘤免疫机制的细胞因子/疫苗，(ⅲ)提高药物灵敏度(如递送或激活药物前体)(ⅳ)产生耐药性以保护骨髓免受高剂量化疗的伤害，以及(ⅴ)产生可抑制肿瘤血管生成的物质。
直到最近，让特定实性肿瘤表达这些治疗基因仍是个问题。有些是通过在病毒壳体中插入配体/抗体来把带有治疗基因的重组病毒载体引入特定类型的细胞。这种方法要求恶性细胞能够表达肿瘤特异性和组织特异性抗原。因此，所有治疗都局限于特定患者群体以及能够表达选定肿瘤抗原的肿瘤中使用。作为选择，也可直接把裸露DNA或掺入病毒的DNA注射到肿瘤中(或至少注射到肿瘤的局部供血中)，以最大程度地实现传送的特异性及肿瘤部位的表达。尽管如此，该方法对表浅性肿瘤(如乳瘤和黑素瘤病变)而言所取得的成功仍十分有限，它依赖于对肿瘤的精确定位，并且不能确保DNA被整个肿瘤块吸收，也不能治疗局部或远端的继发转移性沉积。
最近开发出一种使目的肿瘤表达治疗基因的替代方法(Dachs等，1997)。它利用了几乎所有实体肿瘤中，无论其起源或定位，都存在的异常生理学。详细地说，该方法是利用肿瘤特异性重度局部缺血状态以及该状态对某些基因的特定增强子区域的影响来调控异种基因的表达(Dachs等，1997；英国专利申请号9701975.6)。
侵润性肿瘤通常会供血不足，这在一定程度上是由于肿瘤细胞比构成血管的内皮细胞生长得快，而且新形成的供血血管被破坏。这会导致局部缺血区域和营养缺乏区域的产生，其中包括不但氧张力下降(缺氧)而且葡糖水平降低的区域。对肿瘤进行氧电极测量的结果显示，有相当比例的读数低于2.5mmHg(正常组织为24-66mmHg)。此外，缺氧细胞对放疗和化疗的敏感性显著降低，而化疗在某种程度上正是多种癌症中与存活率降低相关的肿瘤缺氧程度加大的原因。
缺氧是众多不同类型细胞中基因表达的有力调节因素(Wang andSemenza,1993a)。通过对涉及血管形成及糖代谢的基因的研究，目前已鉴定出大量可在缺氧状态下被诱导的基因。例如，编码促红细胞生成素的基因即受缺氧的调控。
促红细胞生成素(EPO)是一种可调节红细胞生成，从而提高血氧含量的激素。具有人促红细胞生成素表达的组织特异性缺氧诱导增强子功能的顺式活化DNA序列目前已被鉴定出来(Semenza等，1991)。这些增强子中含有称作缺氧反应元件(HREs)的调控元件，它们是缺氧诱导转录因子，如缺氧诱导因子-1(HIF-1)，的结合位点。研究显示，位于小鼠促红细胞生成素基因3’端的一段DNA增强子序列可使多种异种启动子产生氧调控性表达(Pugh等，1991)。
缺氧相关性调控序列的第二个实例是位于小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因启动子5’端的一种增强子元件。该增强子的序列已经发表(McBurney等，1991)，其可受缺氧诱导的特性则公开于WO-A-95/21927。该PGK增强子内的HRE已确定是一段18 bp的序列。
Dachs等(1997)则利用小鼠PGK-1基因(Firth等，1994)的多聚体形式来调控人纤维肉瘤细胞在体外和体内实体瘤中对缺氧的反应(Dachs等，1997)。
当血液供应减少或撤除时，在其它组织中也可以发生局部缺血性损伤。中风、深度静脉栓塞、肺插入器和肾衰竭是此类损伤的疾病例子。心脏组织的死亡，即称为心肌梗塞，是由于局部缺血引起的大面积组织损伤和/或再灌注后局部缺血。再灌流局部缺血和再灌注通常导致由活性氧引起的氧化性损伤。损伤的程度和类型依赖于缺氧压力的严重性和性质。损伤的程度和类型取决于缺氧应力的严重程度和性质。例如这种应力可导致组织坏死。另外，这种应力也可引发凋亡(程序性细胞死亡)以清除损伤的细胞。
从理论上讲，用于肿瘤治疗的缺氧诱导型表达构建体应能够在缺氧条件下引发高水平的表达，而在含氧量正常的条件下仅引起低基准水平的转录。这样就能够在不影响周围正常充氧组织的情况下最大限度地向肿瘤细胞递送治疗产物。但是，尽管迄今为止的研究表明有可能在肿瘤细胞中获得受缺氧触发的转录，但所获得的转录水平及缺氧诱导比率(缺氧条件下的表达/含氧量正常条件下的表达)仍令人失望。例如，WO-A-95/21927对含有与PGK-1启动子、9-27启动子或胸腺嘧啶激酶基因启动子连接的三个小鼠PGK HRE拷贝的构建体进行了测试，但在缺氧和含氧量正常条件下获得的最大诱导比率仅为约18倍。
发明概述相比之下，我们如今已找到一种能够在缺氧条件下引发高水平转录同时在含氧量正常条件下仅引发低基准水平转录的新型调节构建体，该构建体含有可操作地与一种病毒强启动子，SV40或MLV启动子，相连接的三个重复的小鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因HRE(视需要而定，使中间的重复缺失HIF-1共有结合位点)。其缺氧/含氧量正常条件下的诱导比率至少为100倍。因此，本发明的多聚核苷酸构建体能够在不影响周围正常组织的情况下方便地用于肿瘤块内处于缺氧条件下的特定靶细胞。
此外，我们还首次描述可对缺氧及模拟缺氧的制剂做出反应的慢病毒载体。这种调节可用于体外以提高载体的产量，也可用于体内以调节随生理信号的基因表达。这些载体可广泛用于带有局部缺血，包括缺氧，特征的疾病，如心血管疾病、外周动脉疾病、癌症和关节炎。
因此，本发明提供一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸至少含有两个重复的缺氧反应元件(HRE)，其中，两个重复区内的缺氧诱导因子共有结合位点由一段至少20个连续核苷酸的间隔区隔开。
HRE重复区通常可操作地与一种病毒启动子相连。优选的HRE为一种磷酸甘油酸激酶(PGK)HRE。在一项优选实施方案中，本发明的多聚核苷酸含有三个重复的PGK，其中5’和3’端的HREs含有一种功能性HIF-1结合位点，并且中间的HRE不含HIF-1结合位点。优选而言，HRE重复区可操作地与一个SV40启动子或Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)启动子相连接。优选的HRE重复区为同向重复。更优选的是按其天然取向进行重复。
在另一实施方案中，本发明还提供一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有可操作地与一个SV40启动子或Moloney鼠白血病病毒(MoMLV)启动子连接的至少三个重复的磷酸甘油酸激酶(PGK)缺氧反应元件(HRE)。优选的HRE重复区为同向重复。更优选的是按其天然取向进行重复。
本发明优选的功能性HRE含有如序列编号1或序列编号2所示的一段核苷酸序列。本发明优选的HRE/启动子构建体含有如序列编号3、序列编号4、序列编号5或序列编号9所示的一段核苷酸序列。
在一项优选实施方案中，本发明的多聚核苷酸含有可操作地连接于启动子和启动子上游(5’端)的至少两个重复的HRE以及可操作地连接于启动子和启动子下游(3’端)的至少两个重复的HRE，其中，两个重复区内的缺氧诱导因子共有结合位点由一段至少20个连续核苷酸的间隔区隔开。
在另一项优选实施方案中，本发明的多聚核苷酸含有可操作地连接于启动子和启动子上游(5’端)的至少三个重复的HRE以及可操作地连接于启动子和启动子下游(3’端)的至少三个重复的HRE。
本发明还提供一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸可操作地与所需(NOI)核酸相连以产生一种有效的表达盒，使得该多聚核苷酸可指导NOI在宿主细胞中的表达。因此，本发明进一步提供一种可操作地与NOI相连的多聚核苷酸，用于在宿主细胞，如一种哺乳动物细胞，表达NOI时使用，更优选的宿主细胞为一种人细胞。
优选的NOI可编码一种具有治疗用途的多肽，如一种细胞毒性多肽或能够将前药前体转化成细胞毒性复合物的多肽。优选的NOI也可选自可编码参与细胞分裂调节的蛋白、参与细胞代谢途径的酶、转录因子及热休克蛋白的多聚核苷酸序列。
我们还证明了HIF-1α多肽核酸编码序列的包涵体可增进缺氧条件下的诱导。因此，在一项特别优选实施方案中，NOI编码一种HIF-1α多肽。
本发明还提供一种含有本发明所述多聚核苷酸的核酸载体。在一项优选实施方案中，本发明提供一种含有本发明所述多聚核苷酸的病毒载体。优选的病毒载体为一种逆转录病毒载体，如慢病毒载体、腺病毒载体或单纯疱疹病毒载体，更优选的则为一种慢病毒载体。
尽管插入到逆转录病毒载体中的NOI序列可处于受5’LTR序列(改进的或不改进的)或内部启动子调控的位置，但我们已证明，将该载体作为单转录单位载体进行装配具有特别的优势，其方式是将本发明的HRE/启动子构建体置于3’LTR内，使得3’LTR的复制能够同时引发该调节序列的复制。我们已证明这种排列可通过协同方式加强对缺氧的活性应答。
此项技术同样适用于其它调节序列，从而本发明还提供一种在病毒基因组U3区域内含有异种调节序列的逆转录病毒载体。因此，本发明进一步提供一种用于产生逆转录病毒载体的方法，该方法包括将调节序列插入到逆转录病毒载体的LTR区域，以使该调节序列可在原病毒基因组中进行复制。优选而言，该区域为U3区域。优选的逆转录病毒载体还可含有可操作地与调节序列相连的NOI。更优选而言，该NOI不处于逆转录病毒载体的某个区域内，从而不会使NOI在原病毒基因组中复制。
作为本发明的一个特定方面，可利用含有制备逆转录病毒载体或慢病毒载体所需组件的腺病毒载体来转导，例如，CD34+干细胞。由此，被该腺病毒载体转导的细胞可分泌逆转录病毒/腺病毒载体。因而，如前人所述(WO-A-97/27310)，该细胞中的腺病毒载体可作为逆转录病毒的原位制造厂。
本发明进一步提供一种含有本发明所述多聚核苷酸的宿主细胞。本发明的宿主细胞可体外、体内或先体外后体内产生。在一项特别优选实施方案中，该宿主细胞可以是已分化细胞，如巨噬细胞或内皮细胞，更优选的则是一种终末分化细胞。作为选择，该宿主细胞也可以是未分化细胞，如造血干细胞(HSC)。
优选的已分化细胞来源于HSC。其优势在于可提供一种方法，用于使选择性表达在，例如，由HSC分化的巨噬细胞中进行或由其进行或借其进行。
另一方面，本发明提供一种宿主细胞，该细胞可以是已分化细胞或能够被分化成已分化细胞的未分化细胞，该宿主细胞含有本发明所述多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有可操作地与NOI相连的HRE/启动子，其中本发明的多聚核苷酸已通过病毒转导，优选的是通过腺病毒转导和/或慢病毒转导，引入该细胞。
含有可操作地与包含治疗基因的NOI相连的HRE/启动子构建体的本发明所述多聚核苷酸可便利地用于向哺乳动物细胞递送治疗产物。详细地说，处于缺氧条件下的哺乳动物细胞将在HRE/启动子构建体的调控下优先表达NOI，而处于含氧量正常条件下的周围细胞只以低得多的水平表达NOI。
因此，本发明提供一种多聚核苷酸、核酸载体、病毒载体或宿主细胞，用于对患有以缺氧为病因或症状或可出现缺氧的疾病的人类或动物患者进行治疗的方法中使用。
本发明还提供一种药物组合物，该药物组合物含有本发明的多聚核苷酸、载体、病毒载体或宿主细胞以及一种药学上可接受的载体或稀释剂。
另一方面，本发明提供一种方法，用于对患有以缺氧为病因或症状或可出现缺氧情况的疾病的人类或动物患者进行治疗，该方法包括将有效剂量的本发明所述药物组合物向需要该治疗的患者给药。
另外一方面，本发明提供一种用于产生病毒株的方法，该方法包括将本发明的多聚核苷酸引入病毒基因组。优选而言，该方法包括经病毒基因组与本发明所述载体间的同源重组将该多聚核苷酸引入该基因组。
局部缺血可以指特定器官或组织的供血不足。供血减少的后果是该器官或组织供氧不足(缺氧)。长期缺氧可导致受影响器官或组织的损伤。
另一方面，本发明提供一种药剂，用于治疗或预防以局部缺血或缺氧为特征的病情，该药剂包括一种载体和/或上文所述的HSC以及一种药学上可接受的载体或稀释剂。
本发明的优选方面涉及所有上述产物在治疗或预防以局部缺血、缺氧或低葡糖为特征的病情中的应用；特别是癌症(尤其是实体肿瘤)、脑型疟、局部缺血性心脏病或类风湿性关节炎等病情，但不排除其它病情。
发明详述A．多聚核苷酸本发明的多聚核苷酸可包含DNA或RNA。可以是单链或双链。也可以是含有合成核苷酸或修饰核苷酸的多聚核苷酸。目前该领域已了解多种对寡聚核苷酸的不同类型的修饰。其中包括膦酸甲酯和硫逐磷酸酯主链，在分子的3’和/或5’末端添加吖啶或多聚赖氨酸链。就本发明而言，应了解文中所述多聚核苷酸可利用该领域已有的任何方法进行修饰。进行这些修饰的目的可以是，例如，提高本发明所述多聚核苷酸的体内活性或寿命。
1．启动子/增强子序列本发明的多聚核苷酸含有可操作地与一种启动子相连的缺氧反应元件(HRE)。本发明中使用的HRE是一种能够在缺氧条件下作用于可操作地与其相连的启动子并提高受该启动子调控的所需核苷酸序列(NOI)的转录速率的最小化核苷酸序列。优选而言，对含有本发明所述多聚核苷酸的HRE和启动子的选择应能够使可操作地与这些元件相连的NOI基因在健康供氧条件下的表达最小化，而在无氧或缺氧条件下可受增量调节。更优选而言，含氧量正常条件下(如含氧量21％)的转录速率与缺氧条件下(如含氧量低于1％或0.1％)的转录速率的比率至少为20∶1，更优选的为50∶1或100∶1。
本发明的多聚核苷酸可含有一个或多个HREs，优选的是至少含有两个或三个。若使用一个以上HRE时，其间通常由至少4-6个核苷酸隔开，优选的是至少6个核苷酸。在一项特别优选实施方案中，至少有两个HREs之间由至少20个核苷酸隔开，更优选的是由至少30或35个核苷酸隔开。间隔的计量通常是从一个HRE内的缺氧诱导因子(如HIF-1)结合位点的3’端到下一个HRE的缺氧诱导因子结合位点的5’端。HIF-1结合位点具有C/A.G.G/C.ACGT.G/C/A的共有序列(或其互补序列)。在一项实施方案中使用的是含有5’GTCGTGCAGGCA3’(序列编号10)序列或其互补序列的间隔区，更优选的则使用含有5’TCTAGTGTCGTGCAGGCATCTAGT 3’(序列编号11)序列或其互补序列的间隔区。
在一项优选实施方案中，其间隔区不含有缺氧诱导因子(如HIF-1)结合位点。举例来说，该间隔区可包含突变形式的缺氧诱导因子结合位点，其获得方式是将所有或部分共有位点突变，以使其结合缺氧诱导因子的能力明显降低或基本丧失(见下文)。
多个HRE重复区的取向可以相同或不同。在一项优选实施方案中，HREs的取向相同，在特定的适当情况下，可采用与其在原天然调控序列中的方向相同的取向。HREs可位于启动子的上游(5’)或下游(3’)，或两种同时采用。
已有多种HREs为该领域所了解。例如，与多种基因相关的HREs有促红细胞生成素(EPO)基因(Madan等，1993；Semenza and Wang,1992)。从肌糖酵解酶丙酮酸激酶(PKM)基因(Takenaka等，1989)、人肌特异性β烯醇酶基因(ENO3；Peshavaria and Day,1991)和内皮素(ET-1)基因(Inoue等，1989)的调节区中还分离出了其它HREs。下表1给出HREs的列表。特别优选的HRE为磷酸甘油酸激酶(PGK)HRE(WO95/21927)，如小鼠PGK HRE P24序列CGCGTCGGTGCAGGACGTGACAAAT(序列编号1)或其截尾的P18形式GTCGGTGCAGGACGTGACA(序列编号2)。另一种特别优选的HRE是实施例21的D2 HRE--GTCGTGCAGTACGTGACA(序列编号12)。
缺氧调节启动子的一个特殊实例是转录因子HIF-1结合因子(Dachs等，1997；Wang and Semenza,1993a；Firth等，1994)和/或内皮PAS区蛋白(EPAS)结合因子。在一项特别优选实施方案中，本发明使用的HRE能够与HIF-1和E-PAS结合。但是与HIF-1相比，本发明使用的HRE能够与E-PAS优先结合。因此，本发明所用HRE与E-PAS的结合至少比结合HIF-1强10倍，优选的是至少强20、30、40或50倍。这一点可通过，例如，体外结合测定如电泳带迁移测定，或用含有HRE位点并且被固定在琼脂糖小珠等固体基质上的核苷酸进行的竞争测定来加以测试。
表1-HRE′shEPO GGGCCCTACGTGCTGTCTCACACAGCmEPO GGGCCCTACGTGCTGCCTCGCATGGCmPGKCGCGTCGTGCAGGACGTGACAAATmLDH CCAGCGGACGTGCGGGAACCCACGTGTAGGGlucose trpt TCCACAGGCGTGCCGTCTGACACGCAhVEGF CCACAGTGCATACGTGGGCTCCAACAGGTCCTCTTrVEGF ACAGTGCATACGTGGGCTTCCACAhNOS ACTACGTGCTGCCTAGGhAldolase CCCCTCGGACGTGACTCGGACCACAThEnolase ACGCTGAGTGCGTGCGGGACTCGGAGTACGTGACGGAmHeme Oxygenase CGGACGTGCTGGCGTGGCACGTCCTCTC当使用结合EPAS的HRE时，可考虑将编码EPAS的NOI引入宿主细胞，以提高缺氧特异性/可诱导性。作为选择，也可使用天然表达EPAS的宿主细胞(如上皮细胞，其中包括肿瘤细胞，以及巨噬细胞)。
相比之下，当使用结合HIF-1的HRE时，可考虑将编码HIF-1，如HIF-1α，并通过自我调节系统受HRE调控的NOI引入宿主细胞，以提高缺氧特异性/可诱导性。
此外还可对已知HRE进行修饰，或根据HRE共有序列设计一种新HRE，以获得适用于本发明的HRE，前提是所得HRE，一般是在与启动子序列相连接的情况下，能够使可操作地相连接的NOI产生受缺氧诱导的转录。修饰包括核苷酸取代、缺失和插入。在一项特别优选实施方案中，至少使用了三个HRE重复区，并且通过，例如，缺失方法使一个HRE元件，如中间的重复区，突变以使其HIF-1位点的功能丧失。因此，仍保持有至少两个功能性HRE元件被来源于功能性HRE元件但不含缺氧诱导因子结合位点的间隔区隔开。这样的构建体的实例为Obhrell，它含有三个同向重复的小鼠PGK HRE元件，中间的一个在其HIF-1结合位点位置有一个缺失。
实施例21提供了另一个对HRE进行修饰以增强其缺氧反应的实例。
HRE还可包含额外序列，如作为增强子的一部分与其天然相连的那些序列，或其它序列。
通过对增强子/启动子区进行操作可调节在本发明所述特定多聚核苷酸调控下的NOI或NOIs的表达水平。例如，启动子区内的不同区域具有不同的基因调节活性。这些不同区域的作用通常可利用含有该启动子缺失特定区域的不同变异体的载体构建体来加以评定，(即缺失分析方法)。该方法可用来确定，例如，能够赋予组织特异性或缺氧诱导性的最小区域。
在本发明所述多聚核苷酸中使用的优选启动子为病毒启动子等强启动子。举例来说，强启动子包括SV40启动子、巨细胞病毒(CMV)启动子、劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子及鼠白血病病毒(MLV)启动子。特别优选的启动子为SV40启动子和MoMLV启动子。因此，优选的HRE/启动子构建体包括如序列编号3、4和5所示的构建体。
而在另一项优选实施方案中，特别是采用病毒启动子和HIF-1自我调节构建体时，可考虑使用不含一个或多个转录调控序列的启动子，而这些转录调控序列在正常情况下是与启动子TATA框或起始序列相连的。例如，启动子可如同实施例20所述MLV启动子的情况不含有CAAT框基序，以及/或者不含有通常出现在SV40启动子中的Sp1共有结合位点。另外也可使用基本包含与HRE相连的TATA框或起始密码子的启动子。
除HRE序列和启动子外，本发明的多聚核苷酸还可包含额外的调控序列。例如，可通过额外的转录调控来确保由本发明所述多聚核苷酸指导的表达被限制于特定细胞类型或特定条件之下。因此，可操作地将额外增强子与本发明的多聚核苷酸相连接，可连接于下游、上游或两种同时采用。
额外调控序列可以是存在于真核基因内的序列。举例来说，该序列可来源于能够表达NOI的细胞基因组，优选的则为肿瘤基因组。额外调控序列处于本发明所述HRE增强子/启动子构建体的最优先控制之下，其功能可以是赋予广泛表达，或作为选择，赋予组织特异性表达。特别优选的是使用在一种或多种特定类型细胞中具有优先活性的额外调控序列——如任何一种或多种巨噬细胞、内皮细胞或其组合。其它实例还包括呼吸气道上皮细胞、肝细胞、肌细胞、心肌细胞、滑膜细胞、初生乳房上皮细胞以及诸如巨噬细胞等有丝分裂期后终末分化的非复制细胞。
细胞特异性序列的实例包括巨噬细胞特异性启动子或增强子，如CSF-1启动子-增强子(见实施例8)，或来源于甘露糖受体基因启动子-增强子的元件。作为选择，也可使用在嗜中性粒细胞中具有优先活性的元件，或IL-2基因增强子等淋巴细胞特异性增强子。特别优选的组织特异性调控序列为可赋予巨噬细胞特异性表达的HIV衍生序列(如实施例8中描述的启动子序列——XiaMac(序列编号7))。
另一实例是内皮特异性启动子，它可用来将NOI的表达局限于血管内皮。特别是当正确选择调控序列时，可使表达局限于具有肿瘤特异性的新脉管系统。Jaggar等(1997)已利用E-选择蛋白及KDR启动子在内皮细胞中由逆转录病毒载体表达出治疗基因。内皮特异性缺氧调控启动子特别适用于将抗血管生成因子递送到肿瘤血管中。
术语“组织特异性”是指活性并不一定局限于单一组织类型但是会显示出选择性的调控序列，因为该序列可在一种组织团中具有活性，而在另一组织团中活性较低或保持沉寂。
上文所述的多种组织特异性增强子在本发明的实施中都具有特别的优势。在多数情况下，这些增强子可作为适于克隆到特定载体中的限制性消化片段被方便地分离出来。作为选择，也可使用聚合酶链反应来分离增强子片段。通过在引物5’端掺入限制酶切位点可方便地实现扩增片段的克隆。也可使用，例如，固相技术来合成增强子片段。
IRF系统是可加入本发明所述HRE/启动子中以使表达局限在处于规定条件下的巨噬细胞中的特别调控序列实例(Taniguchi等，1995；Kuhl等，1987)。该系统使用一种可结合转录因子IRF1和IRF2的干扰素反应因子(IRE)。巨噬细胞中的IRF2与该IRE在结构上相连接，并且不具有激活转录的能力。干扰素可激活IRF1的表达，继而IRF1可与IRF2竞争。因此，能够激活转录的IRF1可逆转IRF2的表达。IRF1也可诱导IRF2的表达，从而可通过“自我关闭作用”限制转录的活性。在缺乏IRF1活化作用的情况下，IRE四聚体的存在可阻断SV40启动子的功能。在HRE下游与ATATAA(即SV40启动子中类似TATA框的元件)的5’端之间加入该四聚体序列即可在缺乏干扰素活化作用的情况下进行表达。
在炎症反应，包括对肿瘤的反应，中天然存在γ干扰素。作为选择，也可由外部提供γ干扰素蛋白或基因并用作基因治疗。作为本发明的一个特定方面，可利用一种自分泌调节环路来提供γ干扰素。它是将单一的HRE启动子，如OBHRE，与γ干扰素编码序列相连接。将第二种基因，如一种前药活化酶或上文列表中的任何基因，与含有IRF-1反应序列的XiaMac启动子相连(序列编号8--见实施例)。该启动子在所有细胞中均不具有活性，其中包括巨噬细胞。一旦在病理条件下暴露于缺氧环境，γ干扰素即被表达。然后由巨噬细胞特异性因子和缺氧反应元件激活治疗基因的表达。这种双阶段策略可应用于任何阻遏蛋白。
额外调控序列还可含有能对特定刺激其反应的元件，如能够与甾体激素受体结合的元件。
另外还可加入可诱导型调控因子，以便能够，例如，通过提供外源物质来调控表达。这样就可以在细胞寿命期内对NOI的表达水平进行调节。可诱导型是指能够对利用该启动子获得的表达水平进行调节。举例来说，在一项优选实施方案中，本发明的多聚核苷酸含有对前人报导的破伤风阻遏物/VP16转录活化物融合蛋白(Gossen andBujard,1992；Gossen等，1995)敏感的调控序列。因而第二种多聚核苷酸通常含有可驱动破伤风阻遏物/VP16融合蛋白表达的强启动子(如CMV IE启动子)。因此，该实施例中第一种NOI的表达将取决于是否存在四环素。
本发明所述多聚核苷酸的理想特性在于，它们在缺乏活化的缺氧调控增强子元件的情况下具有相对较低的转录活性，甚至在靶组织中亦是如此。例如，可使用能够在不缺氧情况下抑制特定启动子活性的“沉默子”元件。另一策略是如上文及实施例所述使用HIF-1自我调节构建体。
2．特定核酸(NOI)本发明的多聚核苷酸通常可操作地与一种NOI相连，NOI一般为异种基因。术语“异种基因”包括任何基因。该异种基因可以是野生型基因的任何等位变异体，也可以是一种突变基因。术语“基因”则涵盖能够至少被转录的核酸序列。因此，该定义包括编码mRNA、tRNA和rRNA的序列。该序列相对于启动子可采用有义或反义取向。可通过众所周知的技术利用反义构建体来抑制细胞中的基因表达。核酸可以是，例如，核糖核酸(RNA)或脱氧核糖核酸(DNA)或其类似物。编码mRNA的序列可选择性地包含一些或所有在自然条件下被转录但不翻译的5’和/或3’侧翼序列，或与被翻译的编码序列相连的序列。还可进一步选择性地包含通常与被转录序列相连的转录调控相关序列，如转录终止信号、多腺苷酸化位点及下游增强子元件。核酸还包括cDNA或基因组DNA(可能含有内含子)。但优选的一般是使用cDNA，因为它无需去除内含子，从而可以更有效地表达。
术语“可操作地连接于”是指一种邻接，其中的所述组件互相关联，使它们能够以预期方式行使功能。一种调控序列可操作地连接于一种编码序列是指其连接方式能够使编码序列在适合于调控序列的条件下实现表达。
根据本项发明，适当的NOI序列包括可用于治疗和/或诊断的那些序列，举例来说有，但不局限于细胞因子、化学因子、激素、抗体、设计出的免疫球蛋白样分子、单链抗体、融合蛋白、酶、免疫辅助刺激分子、免疫调节分子、反义RNA、靶蛋白的转显性负突变体、毒素、条件毒素、抗原、肿瘤抑制蛋白以及生长因子、膜蛋白、血管活性蛋白和肽、抗病毒蛋白、核糖酶及其衍生物(如带有一种相关报告基团)的编码序列。
适用于在本发明中用来治疗或预防癌症的NOIs包括可编码以下蛋白的NOIs可破坏靶细胞的蛋白(如核糖体毒素)；可充当肿瘤抑制因子(如野生型p53)；抗肿瘤免疫机制活化因子(如细胞因子、共刺激分子和免疫球蛋白)；血管形成抑制剂的蛋白；或能够使药物敏感性加强(如前药活化酶)的蛋白；可利用天然效应细胞间接引发对靶细胞的破坏的蛋白(如能够激励免疫系统或将前体物质转化成可破坏靶细胞的毒性物质(如前药活化酶)的强抗原)。也可编码能够破坏旁观肿瘤细胞的蛋白(如利用分泌的抗肿瘤抗体-核糖体毒素融合蛋白)、能够间接引发对旁观肿瘤细胞的破坏的蛋白(如能够激励免疫系统或引发局部血管闭塞的促凝剂原蛋白的细胞因子)或能够将前体物质转化成可破坏旁观肿瘤细胞的毒性物质的蛋白(如能够将前药活化成可扩散药物的酶)。
能够对肿瘤存活所需细胞基因的表达进行干扰的反义转录体或核糖酶的编码NOI(s)也可以使用(例如抗Burkitt淋巴瘤中的异常myc转录体或抗慢性粒细胞性白血病中的bcr-abl转录体)。另外还可以联合使用这些NOIs。
除在靶组织中选择性表达一种或多种NOI以外，还可使其编码一种或多种前药活化酶，该酶在对个体施加其作用的一种或多种前药之前不具有明显影响或有害影响。在活性NOI存在的情况下，用适当前药对个体进行治疗可更有效地降低肿瘤的生长或存活率。
前药活化酶被递送到肿瘤部位以对癌症进行治疗。在各自情况下，均需将适当前药活化酶与适当前药一同用来对患者进行治疗。适当的前药可与载体一同给药。前药的实例包括磷酸鬼臼亚乙苷(同碱性类似酶)；5-氟胞嘧啶(同胞嘧啶脱氨酶)；阿霉素-N-p-羟基苯氧乙酰胺(同青霉素-V-酰胺酶)；对-N-二(2-氯乙基)氨基苯甲酰谷氨酸(同羧肽酶G2)；头孢菌素氮芥氨基甲酸酯(同β-内酰胺酶)；SR4233(同P450还原酶)；更昔洛韦(同HSV胸腺嘧啶激酶)；芥子前药(同硝基还原酶)以及环磷酰胺(同P450)。
用于在本发明中使用的适当前药活化酶实例包括可激活5-氟尿嘧啶capcetabine和furtulon的胸腺嘧啶磷酸化酶；来自单纯疱疹病毒的可激活更昔洛韦的胸腺嘧啶激酶；可将环磷酰胺等前药活化成DNA损伤剂的细胞色素P450；以及可激活5-氟胞嘧啶的胞嘧啶脱氨酶。优选的是使用人来源的酶。
用于在局部缺血性心脏病的治疗和预防中使用的适当NOIs包括编码纤溶酶原激活质的NOIs。用于在类风湿性关节炎或脑型疟的治疗和预防中使用的适当NOIs包括编码消炎蛋白、抗α肿瘤坏死因子(TNF)抗体和抗粘着分子(如对粘着分子具有特异性的抗体分子或受体)的基因。
NOIs编码的表达产物可以是能够被细胞分泌的蛋白。作为选择，NOI表达产物也可不被分泌，而是在细胞内发挥作用。在这两种情况下，优选的NOI表达产物均可显示出旁观效应或远端旁观效应；也就是说一个细胞中产生该表达产物即可杀死临近的或远端的(如迁移性的)其它具有正常表型的相关细胞。
当采用巨噬细胞或其它造血细胞时，可使用编码细胞因子的NOIs。它们可用来指导含有治疗性NOI的HSCs的后续分化。适当的细胞因子和生长因子包括，但不局限于ApoE、Apo-SAA、BDNF、促肾上腺皮质激素-1、EGF、ENA-78、Eotaxin、Eotaxin-2、Exodus-2、酸性FGF、碱性FGF、成纤维细胞生长因子-10、FLT3配体、分形因子(CX3C)、GDNF、G-CSF、GM-CSF、GF-β1、胰岛素、IFN-γ、IGF-Ⅰ、IGF-Ⅱ、IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8(72个氨基酸)、IL-8(77个氨基酸)、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18(IGIF)、抑制素α、抑制素β、IP-10、角质细胞生长因子-2(KGF-2)、KGF、Leptin、LIF、Lymphotactin、Muller抑制性物质、单核细胞集落抑制因子、单核细胞引诱蛋白、M-CSF、MDC(67个氨基酸)、MDC(69个氨基酸)、MCP-1(MCAF)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MDC(67个氨基酸)、MDC(69个氨基酸)、MIG、MIP-1α、MIP-1β、MIP-3α、MIP-3β、MIP-4、髓样祖细胞抑制因子-1(MPIF-1)、NAP-2、Neurturin、神经生长因子、β-NGF、NT-3、NT-4、制瘤素M、PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB、PF-4、RANTES、SDF1α、SDF1β、SCF、SCGF、干细胞因子(SCF)、TARC、TGF-α、TGF-β、TGF-β2、TGF-β3、肿瘤坏死因子(TNF)、TNF-α、TNF-β、TNIL-1、TPO、VEGF、GCP-2、GRO/MGSA、GRO-β、GRO-γ和HCC1。
就某些应用而言，优选的是将这些细胞因子中的一些进行组合，特别是对维持和扩展干细胞而言，可包括IL-3、IL-6和SCF在内构成一组。对体外分化而言，还可加入其它细胞因子，如加入GM-CSF和M-CSF来诱导巨噬细胞的分化，或加入GM-CSF和G-CSF以获得嗜中性粒细胞。当把加工后的细胞重新引入其起源的个体时，该个体的自身机制将允许这些细胞或其分化后代迁移到受影响的区域，如肿瘤。
视需要而定，NOI也可以是一种自杀基因，该基因在外源物质存在情况下的表达可破坏其转染的或转导的细胞。自杀基因的实例包括单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSV tk)，该基因在经更昔洛韦处理后可杀死其侵染的细胞或旁观细胞。
视需要而定，NOI也可以是一种靶蛋白(如抗干细胞因子受体的抗体(WO-A-92/17595；WO-A-92/21766))。例如，可表达抗HSCs表面受体(如CD34或干细胞因子)抗体(或生长因子或肽)的(同向性)重组逆转录病毒即可通过与病毒共培育的未分级骨髓的先体外后体内递送方式或静脉内递送病毒方式来将细胞递送定位于这些细胞。
NOIs还可包含标记基因(如编码β半乳糖苷酶或绿色荧光蛋白的基因)或其产物能够对其它基因(如转录调节因子，其中包括上文所述的破伤风阻遏物/VP16转录活化物融合蛋白)的表达进行调控的基因。此外，NOIs还可包含编码配偶融合蛋白的序列，该序列的阅读框要与所需蛋白的编码序列相符。配偶融合蛋白的实例包括GAL4的DNA结合区或转录活化区、6×His标记以及β半乳糖苷酶。另外还可加入导向序列，以将NOIs编码的蛋白引导至特定细胞区域或分泌通路。这些导向序列已为该领域所广泛了解。
在一项优选实施方案中，至少有一种可操作地连接于本发明所述HRE/启动子的NOI可编码HIF-1转录因子或能够与HIF-1结合位点结合的其同系物或片段。上述构建体可提供一种自我调节系统，因为HRE构建体在缺氧条件下将加强HIF-1的表达，从而可进一步加强该HRE构建体及其它存在的HRE构建体的转录。
通过抑制VHL介导的HIF降解来加强缺氧反应Maxwell等，(1999)已发表了一些证据，说明肿瘤抑制蛋白VHL可将缺氧诱导因子引入氧依赖性蛋白水解。在此之前公布的资料也表明，为了调控缺氧诱导基因的表达，VHL需要与其它蛋白相结合，包括elonginsB和C以及Cu12(Lonergan,1998)。破坏这种复合蛋白可成为阻断HIFs降解，从而提高HRE调控基因的表达寿命/程度的一个途径。有多种适当的方法可用来抑制VHL的功能。
可利用衍生于pVHL的合成肽(如第157-172位氨基酸)来阻断内源性全长pVHL与Elongin B和C的结合。利用标准转染技术将该肽引入细胞，优选的是将其作为脂类复合物的一部分引入细胞，可防止内源性VHL与剩余复合物结合继而未能降解HIF的情况发生。
作为选择，VHL肽可处于HRE/启动子构建体的调控下并与另一种NOI一同表达。可选择使用一种IRES序列以使VHL构建体和NOI均在调节序列的控制下表达。
通常可将VHL肽或能够抑制VHL功能的其它肽与一种HRE自身调节系统协同使用，该系统可利用HRE对治疗性/报告基因及HIF转录因子的表达进行协同调控。也可使用IRES序列来进行并行调控。
就抑制VHL功能的适当肽而言，可利用蛋白结构域知识设计出能够保留某些特性但在其它情况下不行使功能的蛋白，例如仍能够与该复合物的一种成分结合但不与其它成分结合的蛋白。表达的这种突变蛋白应能够在正常的蛋白蛋白相互作用中具有显性负效应，也就是能够与野生型内源蛋白进行竞争。
其实例是表达出突变VHL(可利用患有VHL相关疾病，如肾细胞癌、血管母细胞瘤，的患者中的天然突变来进行设计)，它可降低HIF的蛋白水解寻靶作用，从而可提高HRE-依赖性的基因表达。事实上，在HRE调控的基因，如糖酵解酶基因，在含氧量正常条件下的异常表达中经常会发现VHL突变。
因此，另一项优选实施方案中的NOI可编码一种能够对肿瘤抑制蛋白VHL(Maxwell等，1999)与一种或多种elongin B、elongin C和Cu12(Longergan,1998)的结合加以抑制的多肽。如上文所述，适当的多肽包括能够与复合蛋白进行竞争的野生型VHL的变异体或其结合配偶体。对适当多肽的鉴定可通过，例如，用VHL和/或其一种结合配偶体进行体外结合测定。其它筛选技术还包括确定相互作用序列的两种杂交筛选技术。
特别优选的肽为基本含有全长VHL序列的第157-172位氨基酸的肽。
作为选择，也可使用其它方法来引入能够抑制肿瘤抑制蛋白VHL与一种或多种elongin B、elongin C和Cu12的结合的多肽，如将编码该多肽的构建体分别转染到靶细胞中，或引入预先合成的肽。
替代方法还包括在靶细胞中表达可影响VHL mRNA和/或前体RNA的直接或间接剪切的抑制性RNA分子。抑制性RNA分子包括反义VHL构建体、可裂解VHL mRNA的核糖酶以及外部指导序列。可将编码该抑制性RNA分子的NOIs引入本发明的核苷酸构建体、载体和病毒载体中，其方式与上文所述及下文用于其它NOIs的方法类似。通常还可加入反义VHL构建体，因为反义抑制效应的介导机制不同于RNase裂解。因此，可结合并阻止VHL RNA加工和/或表达，例如剪接、运输和/或翻译，的抑制性RNA分子的编码NOI也被包括在内。
所以在本发明的另一项实施方案中，NOI可编码(ⅰ)一种或多种可影响VHL mRNA和/或前体RNA的直接或间接剪切的抑制性RNA分子，或(ⅱ)一种或多种可结合并阻止VHL RNA加工和/或表达的抑制性RNA分子。
C．核酸载体可将本发明的多聚核苷酸掺入到可复制的重组载体中。该载体可用来在相容宿主细胞中复制该核酸。因此，在另一项实施方案中，本发明提供一种制备本发明所述多聚核苷酸的方法，包括将本发明的多聚核苷酸引入一种可复制载体，将该载体引入一种相容宿主细胞，以及在可引发该载体复制的条件下培养宿主细胞。载体可由宿主细胞回收。适当的宿主细胞包括诸如大肠杆菌等细菌、酵母、哺乳动物细胞系及其它真核细胞系如昆虫Sf9细胞。
含有可操作地与一种NOI相连接的本发明所述多聚核苷酸的载体可被认为是一种表达载体，因为在适当条件下，NOI将在本发明的HRE/启动子构建体的调控下进行表达。而本发明的载体并非必须含有一种NOI。但也可以在后期将NOI引入该载体。因此，不含NOI的本发明所述载体可被认为是一种克隆载体。本发明的优选克隆载体可在HRE/启动子序列的下游含有一个多克隆位点，以能够在需要的情况下将NOI克隆到该载体中，继而可将其可操作地与HRE/启动子序列相连接。
该载体可以是，例如，质粒、染色体、人造染色体或病毒载体。该载体可含有一种或多种可选标记基因，如采用大肠杆菌质粒时使用氨苄青霉素抗性基因，或采用哺乳动物载体时使用新霉素抗性基因。在体外或体内条件下均可使用载体来，例如，转染、转化或转导宿主细胞。
非病毒递送系统包括DNA转染方法，但并不局限于此。用非病毒载体将基因递送到哺乳动物靶细胞中的方法以包括在此转染方法中。典型的转染方法包括电穿孔、DNA轰击、脂类介导的转染、致密DNA介导的转染、脂质体法、免疫脂质体法、脂转染、阳离子制剂介导的转染、阳离子表面两亲体(CFAs)、多价阳离子如精胺、阳离子类脂或多聚赖氨酸、1,2-二(油氧基)-3-(三甲铵)丙烷(DOTAP)-胆固醇复合物以及这些方法的组合。
病毒递送系统包括，但不局限于，腺病毒载体、腺伴随病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体如慢病毒载体、杆状病毒载体以及组合载体如腺慢病毒载体。在使用病毒载体时，一般是通过对靶细胞的病毒侵染来介导基因的传递。
D．病毒载体逆转录病毒本发明的逆转录病毒载体可来源于或衍生于任何适当的逆转录病毒。目前已鉴定出众多不同的逆转录病毒。例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、猿免疫缺陷病毒、人T细胞白血病病毒(HTLV)、马传染性贫血病毒(EIAV)、鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳氏肉瘤病毒(RSV)、菠罗肉病毒(FuSV)、Moloney鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、Moloney鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、鸟髓细胞瘤病病毒-29(MC-29)以及鸟成红细胞增多病病毒(AEV)。在Coffin等，1997，“逆转录病毒”，Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JMCoffin,SM Huges,HE Varmus pp 758-763中有逆转录病毒的详细列表。
该领域已详细了解某些逆转录病毒的基因组结构。例如，在NCBI基因库中可找到有关HIV和Mo-MLV的细节(基因组登录号分别为AF033819和AF033811)。
逆转录病毒大致可分为两类即“单纯的”和“复合的”。逆转录病毒可进一步分为7个类群。其中有5类为可能致瘤的逆转录病毒。剩余两类为慢病毒和泡沫病毒。在Coffin等，1997(如上)中有关于这些病毒的综述。
慢病毒群可被进一步划分为“灵长类”和“非灵长类”。灵长类慢病毒的实例包括人自身免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体人免疫缺陷病毒(HIV)，以及猿免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括慢病毒原型维斯那/梅迪病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和近期描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族与其它类型逆转录病毒的区别在于，慢病毒既可侵染分裂细胞，也能够侵染非分裂细胞。相比之下，其它逆转录病毒，如MLV，则不能侵染非分裂细胞，例如构成肌、脑、肺及肝组织的那些细胞。
每种逆转录病毒基因组均含有称为gag、pol和env的基因，它们可编码病毒颗粒蛋白和酶。在原病毒中，这些基因位于长末端重复(LTRs)区域的两侧。LTRs负责原病毒的整合及转录。LTRs还可作为增强子-启动子序列并调控病毒基因的表达。依靠病毒基因组5’端的psi序列可将逆转录病毒的RNAs壳体化。
LTRs自身的序列均相同，该序列可被划分为三种元件，分别称为U3、R和U5。U3来源于RNA 3’端特有序列。R来源于在RNA两端重复的序列，U5则来源于RNA 5’端特有序列。在不同逆转录病毒中，这三种元件的大小可有很大不同。
传染性逆转录病毒RNA基因组的基本分子构成为(5’)R-U5-gag,pol,env-U3-R(3’)。在缺损逆转录病毒载体基因组中，gag,pol和env可缺失或不具有功能。RNA两端的R区为重复序列。U5和U3分别代表RNA基因组5’和3’端的单一序列。
不同逆转录病毒的宿主范围及组织趋向性各不相同。有时这种特异性会限制重组逆转录病毒载体的转导潜力。因此，有许多基因治疗实验采用的是MLV。已知有一种具有被称为4070A的包膜蛋白的特异病毒，它是一种兼向性病毒，并且还可侵染人细胞，因为其包膜蛋白可停靠于一种在人和鼠之间十分保守的磷酸盐运输蛋白。该运输蛋白的存在十分普遍，因此这些病毒可侵染许多类型的细胞。
但在某些情况下，尤其是从安全角度来看，以特定的细胞为目标将会更有利。将env基因取代为异种env基因是用来定向于某些特定细胞类型的技术或策略的实例。该技术称为假型法，其实例在WO-A-98/05759、WO-A-98/05754、WO-A-97/17457、WO-A-96/09400和WO-A-91/00047中均可找到。
术语“重组逆转录病毒载体”(RRV)是指一种带有足够逆转录病毒遗传信息的载体，该载体能够在存在包装组件的情况下将RNA基因组包装在可侵染靶细胞的病毒颗粒中。对靶细胞的侵染包括反转录及整合到靶细胞基因组中。使用的RRV通常带有将借助该载体被递送到靶细胞中的非病毒编码序列。RRV在终末靶细胞内不能独立进行复制以产生传染性逆转录病毒颗粒。
在用于基因治疗的典型重组逆转录病毒载体中，可至少将复制所必需的一种或多种gag,pol和env蛋白编码区中的一部分从病毒中去除。这可导致逆转录病毒载体的复制缺损。也可将去除部分用NOI替代，以产生一种可将其基因组整合到宿主基因组中但由于缺乏结构蛋白而无法使修饰后病毒基因组进行自身繁殖的病毒。整合到宿主基因组中的NOI即可进行表达——产生，例如，治疗和/或诊断效应。因此，将NOI转移到所需部位的实现方法通常是将该NOI整合到重组病毒载体中；将修饰后的病毒载体包装在病毒外壳中；并且对所需部位进行转导——如靶细胞或靶细胞群体。
通过包装细胞系或辅助细胞系与重组载体的结合使用，一般可将复制缺损的逆转录病毒载体繁殖至适当滴度，以用于逆转录病毒载体的后续转导。也就是说，可反式提供三种包装蛋白。
“包装细胞系”可含有逆转录病毒gag,pol和env基因中的一种或多种。包装细胞系可产生包装逆转录病毒DNA所需的蛋白，但它由于缺乏psi区而无法进行壳体化。然而当把带有NOI和psi区的重组载体引入包装细胞系时，辅助蛋白即可包装psi-阳性重组载体以产生重组病毒储备。该病毒储备可用来转导细胞以把NOI引入靶细胞基因组。优选的是使用一种称为psi plus的psi包装信号，因为它可提高病毒滴度，该包装信号含有覆盖剪接供体上游至gag起始密码子下游的额外序列(Bender等，1987)。
其基因组缺乏所有制备病毒蛋白所需基因的重组病毒只能转导一次，并且不能繁殖。这些只能单次用于靶细胞转导的病毒载体称为复制缺陷载体。因此，将NOI引入宿主/靶细胞基因组不会产生具有潜在危害的逆转录病毒。在Coffin等，1997(如上)中提供有可使用的包装细胞系一览表。
优选的是使用所含gag,pol和env病毒编码区分别处于不同表达质粒的逆转录病毒包装细胞系，这些质粒可各自独立地被转染到包装细胞系中。这种有时称作三质粒转染法(Soneoka等，1995)的策略能够降低可复制病毒产生的可能性，因为野生型病毒的产生需要三种重组件。由于同源性可极大地促进重组的产生，因此也可通过降低或消除载体基因组与辅助基因组间的同源性来减轻可复制辅助病毒产生的问题。
也可利用瞬时转染的细胞系来替代稳定转染的包装细胞系。瞬时转染的优势在于，可用来在载体产生时测量其生产水平。在这一点上，瞬时转染可避免象产生稳定产载体细胞系那样需要较长的时间，并且还可以在载体或逆转录病毒包装组分对细胞有毒性的情况下加以采用。通常用于产生逆转录病毒载体的组分包括编码gag/pol蛋白的质粒、编码env蛋白的质粒及含有NOI的质粒。载体的产生涉及将这些组分中的一种或多种转染到含有其它所需组分的细胞中。如果载体编码毒性基因或可干扰宿主细胞复制的基因，如细胞周期抑制剂基因或可诱导凋亡的基因，那么将会难以产生稳定产载体细胞系，而在细胞死亡之前可利用瞬时转染来产生该载体。此外，利用瞬时转染方法已获得了产载体滴度水平与稳定产载体细胞系相当的细胞系(Pear等，1993)。
在实验和实践应用中最好使用高滴度的病毒制品。提高病毒滴度的技术包括如上文所述使用psi plus包装信号以及将储备病毒浓缩。此外，在浓缩后使用不同的包膜蛋白，如来源于水泡性口炎病毒的G蛋白，可将滴度提高至109/ml(Cosset等，1995)。用于构建逆转录病毒载体的其它技术还有断裂内含子系统。这将于稍后进行描述。
除了对逆转录病毒载体进行操作以提高病毒滴度以外，还可对其进行设计以在被转导细胞中产生特定的NOI。如上文所述，最常见的逆转录病毒载体设计包括用一种或多种NOIs替代逆转录病毒序列，以产生复制缺陷型载体。就调节NOI表达而言，目前使用的方法主要有三种。
1．最简单的方法是在逆转录病毒5’LTR内使用启动子以调控编码NOI的cDNA的表达，或改变LTR的增强子/启动子以产生组织特异性表达或可诱导性。一旦将多NOIs插入，即可利用内部核糖体进入位点由多顺反子mRNA表达额外的下游NOIs。
2．可将NOI可操作地与内部异种启动子相连接。这种安排可使启动子选择更具灵活性。仍然可以由5’LTR表达额外NOIs，也可将LTR突变以阻止侵染后靶细胞的表达。
3．可将NOI与调控元件一同以相反方向插入到5’LTR中。也可加入含有增强子、启动子、内含子和3’区的基因组序列。这样将可以获得受严密调控的组织特异性基因表达。
此外，我们已证明将逆转录病毒载体，特别是慢病毒载体，作为单转录单位载体进行装配具有特别的优势，其方式是将本发明的HRE/启动子构建体置于3’LTR内，使得3’LTR的复制能够同时引发该调节序列的复制(即原病毒的5’LTR将含有复制于3’LTR的HRE/启动子构建体)。我们已证明这种排列可通过协同方式加强对缺氧的活性应答。因此，优选的是使用一种在其LTR内含有本发明所述HRE/启动子的逆转录病毒载体。更明确地说，可将HRE/启动子构建体(可选择连同任何额外调节序列如组织特异性增强子元件)插入到逆转录病毒载体的3’U3区或5’U5区内，最优选的是插入到3’U3区内。优选而言，也可不将NOI插入LTR，因为在原病毒中加入两个拷贝会使逆转录病毒载体可容纳的NOI大小降低。替代的优选方案是将NOI插入到逆转录病毒载体的通常由env基因占据的区域内。
NOI可包含或不含一种可选择标记。若载体含有不属于可选择标记的NOI，则可通过和单独质粒上的可选择标记进行共转染的方法来将载体引入包装细胞。这种策略对基因治疗而言具有诱人的优势，因为在终末靶细胞中只表达一种蛋白，从而避免了可选择标记可能产生的毒性或抗原性。但如果插入的基因不具有选择性，那么该方法的缺点就是更难以产生可制造高滴度载体储备的细胞。此外，载体滴度的缺点通常也会更加困难。
目前用来设计可表达两种或多种蛋白的逆转录病毒载体的方法主要有三种常规策略。包括(ⅰ)由一种启动子转录出的mRNAs经不同的剪接而表达出不同的蛋白；(ⅱ)利用5’LTR中的启动子及内部启动子来驱动不同cDNAs的转录，以及(ⅲ)利用内部核糖体进入位点(IRES)元件对来源于单纯mRNA或融合蛋白并且能够按开放阅读框加以表达的多编码区进行翻译。
含有内部异种启动子的载体已广泛用于多基因的表达。内部启动子使我们能够除病毒LTR之外还可利用启动子/增强子组合来驱动基因的表达。逆转录病毒载体中可含有多种内部启动子，并且已证明可以由其自身启动子表达出至少三种不同的cDNAs。
慢病毒慢病毒群可分为“灵长类”和“非灵长类”。灵长类慢病毒的实例包括人自身免疫缺陷综合症(AIDS)的病原体人免疫缺陷病毒(HIV)，以及猿免疫缺陷病毒(SIV)。非灵长类慢病毒群包括慢病毒原型维斯那/梅迪病毒(VMV)，以及相关的山羊关节炎-脑炎病毒(CAEV)、马传染性贫血病毒(EIAV)和近期描述的猫免疫缺陷病毒(FIV)和牛免疫缺陷病毒(BIV)。
慢病毒家族与其它类型逆转录病毒的区别在于，慢病毒既可侵染分裂细胞，也能够侵染非分裂细胞。相比之下，其它逆转录病毒，如MLV，则不能侵染非分裂细胞，例如构成肌、脑、肺及肝组织的那些细胞。因此，慢病毒载体可有利地用于本发明，因为其它某些逆转录病毒需要细胞分裂来稳定整合，相比之下，慢病毒则能够侵染广泛的非分裂细胞。
根据逆转录病毒科慢病毒亚科的不同病毒已开发出多种载体，其中有许多已被申请专利(WO-A-98/18815；WO-A-97/12622)。基于HIV、SIV或EIAV的慢病毒载体为优选的。由HIV-1构建的最简单载体除部分env编码区缺失或nef编码区被取代以外含有完整的IHV基因组。值得一提的是，这些载体可表达gag/pol及所有附属基因，因而只需一种包膜蛋白即可产生传染性病毒颗粒。在附属基因中，vif、vpr、vpu和nef为非必需基因。有一些近期报导的载体虽不含大多数或所有附属基因，但仍效率很高，如Blomer等，1997和Kim等，1998。因此，本发明的优选慢病毒载体可至少不含一种附属基因，更优选的是不含所有附属基因。
基于HIV的慢病毒载体的一种优选通用形式为HIV 5’LTR和前导区、一些gag编码区序列(以赋予包装功能)、一种报告盒、rev反应因子(RRE)及3’LTR。在这些载体中，gag/pol、附属基因产物和包膜蛋白可由单一质粒提供，或由两种或多种共转染的质粒提供，或以HIV对含载体细胞的共侵染方式提供。最近，慢病毒载体的构造得到了进一步的改进。例如产生了自灭活HIV载体，其中的HIVLTR被删除，以限制内部表达盒的表达(Myoshi等，1998)。
在一项优选实施方案中，本发明的慢病毒为非灵长类慢病毒，如EIAV。我们最近发现(英国专利申请号9811037.2和9727135.7)，与HIV载体相比，由非灵长类慢病毒产生有效克隆载体所需的载体基因组序列的量要少得多。我们还发现，不含大区域gag基因的最小化EIAV载体足以进行有效的包装，实际上还可产生更高的病毒滴度。因此，最小化EIAV基因组载体通常含有一种启动子和可选的一种能够指导逆转录病毒载体基因组表达的增强子，逆转录病毒载体基因组依次包含以下元件含有R区和U5区的5’LTR的一部分；来源于gag基因5’未翻译区的序列，该序列含有功能性包装信号和部分gag编码序列；所需基因的插入位点以及来源于EIAV的3’LTR。3’LTR可以是至少含有多聚嘌呤区和EIAV R-U5区以及将所有或部分U3区替代的异源序列的杂合LTR。作为选择，也可替代5’和3’LTRs中的R区。WO-A-96/33623描述了一种将逆转录病毒载体基因组的U3区和R区均取代的方法。
优选而言，部分gag基因是指少于gag编码区的前350个核苷酸，更优选的仅为gag编码区的前150或109个核苷酸，特别优选的仅约为前109个核苷酸。
在关于本发明第一方面的一项特别优选实施方案中，是使用hCMV-MIE启动子增强子来指导逆转录病毒RNA转录体的表达。其U3区增强子可被，例如，本发明的缺氧反应增强子(HRE)和SV40或MLV启动子所取代。
最小化EIAV载体也可不含S2、Tat、Rev和dUTP酶基因，但仍把这些基因用于载体产生或对分裂细胞和非分裂细胞的转导。通过gagpol和env功能的反式提供，病毒基因组通常可在细胞中被包装。例如，一般可按照上文逆转录病毒部分所述，将编码gagpol和env的DNA序列与最小化载体一同引入细胞。优选的gagpol序列来源于非灵长类慢病毒。在5’LTR末端与gagpol编码序列的gag上游ATG起始密码子之间加入前导序列以获得gagpol最大表达的方法具有特别的优势。也可考虑加入Rev和/或RRE序列，尽管这并不是必需的，而且通过EIAV gagpol的密码子优化可将其去除。
逆转录病毒断裂内含子技术原病毒DNA经转录可重新产生全长病毒RNA基因组和亚基因组大小的RNA分子，这些分子是经RNA加工而产生。通过RNA转录体的剪接以及翻译过程中核糖体的框架转移即可实现RNA产物的表达。
高等真核细胞通过核RNA加工机制可实现RNA转录体的剪接，该机制可识别待剪接序列交界处的短共有序列。这些共有剪接位点复合所谓的“GT-AG法则”(在RNA序列中GT自然为GU)。5’部位的剪接供体(SD)在第一个外显子-内含子交界处具有高度保守的GT二核苷酸，而3’部位的剪接受体(SA)在第二个外显子-内含子交界处具有高度保守的AG二核苷酸。这些共有序列使剪接过程具有方向性。剪接位点具有一般性——它们对特定RNA前体而言不具有特异性，并且可被所有细胞剪接。剪接过程还依赖于将被剪接掉的区域中存在被称为分支位点的序列。该分支位点通常位于3’SA上游的18-40核苷酸之间，并且被认为可将最近的SA识别为与5’SD相连的正确剪接位点。
与大多数细胞mRNAs中的所有内含子均可被有效剪接不同，新合成的逆转录病毒RNA必然会被转换成两类。一类不被剪接以作为基因组RNA，另一类被剪接以产生亚基因组RNA。
在单纯逆转录病毒中，一类新合成的逆转录病毒RNA不被剪接，以作为基因组RNA和gag与pol的mRNA。另一类则被剪接，将基因组RNA的5’部分与下游基因，最常见的是env，相融合。剪接的实现使用了位于gag上游的剪接供体和接近pol 3’端的剪接受体。剪接供体与剪接受体之间通过剪接被去除的内含子中含有gag和pol基因。该剪接事件可产生包膜(Env)蛋白的mRNA。剪接供体通常位于gag上游，但在某些病毒中，如ASLV，剪接供体的一些密码子位于gag基因内，使得Env初级翻译产物中包含有一些常见于Gag的氨基末端氨基酸残基。Env蛋白在与膜结合的多核糖体上合成，并通过细胞的囊泡运输被运送至原生质膜，在这里被整合成病毒颗粒。
复合逆转录病毒既产生单剪接转录体，也产生多剪接转录体，这些转录体不但可编码env基因产物，也可编码这些病毒特有的调节和附属蛋白组。复合逆转录病毒如慢病毒，尤其是HIV，可在其侵染过程中发生具有惊人复杂性的可变剪接。例如，目前已了解HIV-1可通过对原初基因组转录体的次优剪接产生出30多种不同的mRNAs。这种选择性加工似乎受到调控，因为可破坏竞争剪接受体的突变能够导致剪接模式的改变，并且可影响病毒的侵染性。
根据本项发明可通过逆转录病毒载体对高等真核细胞剪接5’SD与3’SA间序列的能力加以利用。在断裂内含子技术(在PCT/GB98/02885中有所描述)中构建的逆转录病毒载体含有一种能够提供功能性剪接供体位点(FSDS)的第一核苷酸序列(NS)和能够提供功能性剪接受体位点(FSAS)的第二NS；其中第一NS位于第二NS下游并存在于逆转录病毒载体3’LTR(U3区)内的序列中，这些序列在5’LTR中复制，其方式是由RNA形式的逆转录病毒载体反转录成DNA形式并整合到宿主细胞基因组中。由于可提供FSDS的第一NS位于可提供FSAS的第二NS的下游，因此在逆转录病毒载体中不会发生使用这些位点的剪接。但是在反转录后的DNA形式载体中，如整合的原病毒，第一NS是位于第二NS的上游，因此产生了功能性的5’剪接供体-3’剪接受体配对。从而当原病毒发生转录时，所得RNA即能够被剪接以去除FSDS与FSAS间的插入序列。根据由原病毒产生的RNA转录体剪接的序列的性质，该方法可具有不同的用途。
优选使用断裂内含子技术的优选实施方案涉及一种杂合载体系统(见上文)。在该系统中，由初级病毒载体，如腺病毒载体，递送到初级靶细胞中的逆转录病毒基因组的构造是第一NS位于第二NS的下游。因而由于其错误定向而不会出现以第一NS为剪接供体并以第二NS为剪接受体将第一NS与第二NS间的序列剪接掉的情况。但是由初级靶细胞包装的病毒颗粒可用来侵染次级靶细胞。在次级靶细胞中通常会发生病毒基因组的反转录和整合。由于此时FSDS位于5’LTR内，即FSAS的上游，因而会出现功能性剪接供体/剪接受体的结构。继而可发生剪接以去除FSDS与FSAS间的序列。
逆转录病毒载体5’LTR与第二NS间原本存在于原病毒FSAS与FSDS之间的核苷酸序列可包含一种NOI。该NOI可含有产生病毒颗粒所必需的序列，如env或gagpol序列。由于该NOI将会从原病毒转录体中被剪接掉，因此该原病毒不会产生活病毒颗粒。这将使我们能够，例如，构建出具有更高安全性的腺逆转录病毒载体，该载体可含有编码病毒组分和所需基因产物，如治疗性多肽，的NOI，当把初级靶细胞中组装的病毒颗粒引入次级靶细胞时不会产生所述病毒组分。
另一实施方案可以使NOI能够在次级靶细胞中表达，但不能在初级靶细胞中表达。在该实施方案的一项可选方案中，把原病毒RNA转录体中FSDS与FSAS之间的插入序列去除就相当于把位于原病毒基因组FSDS 5’端的调节序列带到了位于原病毒基因组FSAS 3’端的NOI的5’端附近，从而使该调节序列可操作地与NOI相连并且可指导该NOI的转录，而当插入序列存在时，该调节序列就不是可操作地与NOI相连。尽管调节序列可位于逆转录病毒内的NOI的上游，但在一项优选实施方案中，该调节序列是位于逆转录病毒内的第一NS的上游，处于3’LTR的U3区内，因而是位于NOI的下游。因此，只有当次级靶细胞中发生逆转录病毒RNA的反转录时，调节序列才位于NOI的5’端。
总之，位于FSDS与FSAS之间(因而是在逆转录病毒载体内的第二NS的上游)的NOIs序列通常会在次级靶细胞中由原病毒从病毒RNA转录体中剪接掉。因此，这些NOIs可包含初级细胞进行逆转录病毒颗粒组装所必需的逆转录病毒序列，但并不局限于此。这些序列包括env序列、gagpol序列、必需附属基因编码序列和/或包装序列。因此，在原病毒基因组中位于FSAS下游(从而在逆转录病毒中亦处于第二NS下游)的NOIs通常包括，但并不局限于，需要在次级靶细胞中表达的基因产物，如治疗性产物，的编码序列。
应该了解的是，腺逆转录病毒杂合系统中的逆转录病毒载体空白对照应包括初级腺逆转录病毒载体中的逆转录病毒基因组序列以及随后在初级靶细胞中产生并继而被包装成病毒颗粒的RNA基因组。
如上所述，功能性剪接序列还需要一种位于FSAS 5’端附近(且随后位于第二NS 5’端附近)的分支序列，因此需要存在一种适当的分支序列。还应了解的是，构建断裂内含子载体时要求已有功能性剪接供体位点的功能丧失，以防止，例如，初级靶细胞内转录的逆转录病毒RNA基因组中发生剪接。这通常可利用标准技术将GT二核苷酸共有序列突变，如突变成GC，来加以实现。
腺病毒腺病毒是一种无需采用RNA中间态的双链线性DNA病毒。约有50多种不同人血清型的腺病毒均显示出类似的遗传构成，根据遗传序列同源性可将其分为6个亚群。腺病毒载体系统中最常用的是人腺病毒C群2和5血清型病毒(序列同源性为95％)，这些病毒通常与年轻人上呼吸道感染相关。
本发明的多腺病毒/腺病毒载体可来源于人或动物。就来源于人的腺病毒而言，优选的腺病毒为归类于C群的病毒，尤其是2型(Ad2)、5型(Ad5)、7型(Ad7)或12型(Ad12)的腺病毒。更优选的为Ad2或Ad5腺病毒。在来源于动物的多种腺病毒中，可使用犬腺病毒、鼠腺病毒或鸟腺病毒如CELO病毒(Cotton等，1993)。就来源于动物的腺病毒而言，优选的是使用来源于犬的腺病毒，尤其是CAV2腺病毒品系〔如曼哈顿品系或A26/61(ATCC VR-800)〕。来源于动物的其它腺病毒包括专利申请WO-A-94/26914中引用的那些病毒，在此均引入作为参考。
如上所述，所有腺病毒群中的腺病毒基因组结构均类似，并且特定的功能通常都位于所研究的各血清型的相同位置。腺病毒基因组含有一段壳化序列(Psi)、早期基因和晚期基因，并且在两端各含有一个反向末端重复(ITR)。主要的早期基因被划分为中早期区(E1a)、晚早期区(E1b、E2a、E2b、E3和E4)和中间区(见下文图表)。其中，特别是包含于E1区的基因是病毒繁殖必需的。主要的晚期基因包含于L1-L5区。Ad5腺病毒的基因组已被完整测序，并且可由数据库获得(详见Genbank登录号M73260)。其它腺病毒基因组(如Ad2、Ad7、Ad12)也同样被部分或完整地测序。
用作重组载体的腺病毒通常需进行修饰，以使其不能在侵染的细胞中复制。
因此，该领域早期描述的构建体包括去除病毒复制所必需的E1区的腺病毒，其间插入有异种DNA序列(Levrero等，1991；Gosh-Choudhury等，1986)。此外，还计划对腺病毒基因组进行其它删除或修饰以改善载体的特性。因此将一种热敏感性点突变引入ts125突变体，使它能够将72kDa的DNA结合蛋白(DBP)灭活。用于本发明的优选重组腺病毒载体在其基因组E1区含有一个缺失。更详细地说，是在E1a和E1b区含有一个缺失。特别优选的E1区灭活方式是将Ad5腺病毒序列(Genbank登录号M73260)中第454-3328位核苷酸的PvuⅡ-Bg1Ⅱ片段删除。在另一项优选实施方案中的E1区灭活方式是将覆盖第382-3446位核苷酸的HinfⅡ-Sau3A片段删除。
还有将病毒复制和/或繁殖所必需的另一区域，E4区，删除的其它腺病毒载体。E4区涉及对晚期基因表达的调控、晚期核RNAs的稳定性、宿主细胞蛋白表达的降低以及病毒DNA的复制效率。因此，E1和E4区都缺失的腺病毒载体的病毒基因表达水平和转录背景噪音均大大降低。这些载体在，例如，专利申请WO-A-94/28152、WO-A-95/02697和WO-A-96/22378中均有所描述。此外，带有经修饰的Iva2基因的载体亦有所描述(WO-A-96/10088)。
另外，就优选变体而言，本发明使用的重组腺病毒载体可在其基因组E4区含有一个缺失。更详细地说，E4区的该缺失可影响所有开放阅读框。作为明确的实例，可以是第33466-35535位或第33093-35535位核苷酸缺失。特别优选的载体则是整个E4区缺失。即删除或切除相当于第35835-32720位核苷酸的MaeⅡ-MscⅠ片段。E4区内其它类型的缺失在专利申请WO-A-95/02697和WO-A-96/22378中有所描述，在此均引入作为参考。
作为选择，也可只将E4的功能性部分删除。该部分至少包含0RF3和0RF6框。例如，这些编码框可分别以相当于第34901-34329位及第34115-33126位核苷酸的PvuⅡ-AluⅠ和BglⅡ-PvuⅡ片段的形式从基因组中去除。在本发明的框架内，也可使用E4区缺失的Ad2dl808病毒或Ad5 dl1004病毒、Ad5 dl1007病毒、Ad5 dl1011病毒或Ad5 dl1014病毒。
以上给出的位置是参考在数据库上发表并可获取的野生型Ad5腺病毒序列。尽管在不同血清型的腺病毒之间可能存在细微的变化，但这些位置一般可适用于本发明中来自所有血清型的重组腺病毒的构建，特别是腺病毒Ad2和Ad7。
此外，产生的腺病毒还可在其基因组中含有其它变化。详细地说，也可将其它区域删除以提高病毒的容量，并降低与病毒基因表达相关的副作用。因此可删除整个或部分的E3区或特别是Iva2区。但就E3区而言，特别优选的是保留其编码pg19K蛋白的部分。该蛋白可防止腺病毒载体成为免疫反应的作用对象，免疫反应会(ⅰ)限制其功能，并且(ⅱ)产生不良的副作用。作为一种特别方式，可先将E3区删除，然后把编码gp19K蛋白的序列重新引入于异种启动子的调控之下。
本发明的多聚核苷酸/NOI可插入于重组基因组的不同位点。它可替代缺失序列或冗余序列而插入到E1、E3或E4区内。也可被插入到产生病毒所必需的顺式序列(ITR序列和壳化序列)以外的其它任何部位。
E2区是必不可少的区域，因为它可编码72kDa DNA结合蛋白、DNA聚合酶以及55kDa终止蛋白(TP)的80kDa前体，它们是启动蛋白质以起始DNA合成所必需的蛋白。
制备更缺损的病毒的替代方法是把病毒完全“掏空”，只保留病毒复制所必需的末端重复区。利用第一代辅助病毒可使这种“被掏空的”或“濒死的”病毒在293细胞系中生长至高滴度。
重组腺病毒的生产通常是在壳化细胞系中进行，该细胞系能够反式填补重组腺病毒基因组中的一种或多种功能缺陷。这类细胞系的一个实例是293细胞系，该细胞系已整合了一部分腺病毒基因组。更明确地说，293细胞系是一种人肾胚性细胞系，它含有5血清型腺病毒(Ad5)基因组的左端部分(约11-12％)，其中包括左ITR、壳化区、E1区，包括E1a和E1b、蛋白pⅨ编码区以及蛋白pⅣa2编码区的一部分。该细胞系能够反式填补E1区缺陷的重组腺病毒，也就是缺乏整个或部分E1区的重组腺病毒，而且能够产生高滴度的病毒储备。此外，该细胞系还能够在许可温度下(32℃)产生含有热敏感性E2突变的病毒储备。
可填补E1区的其它细胞系亦有所描述，特别是基于人肺癌细胞A549(WO-A-94/28152)或人视网膜母细胞(Hum.Gen.Ther.(1996)215)的细胞系。此外，对能够反式填补腺病毒某些功能的细胞系也有所描述，例如，填补E1和E4区的细胞系(Yeh等，1996a,b；Krougliak等，1995)及填补E1和E2区的细胞系(WO-A-94/28152、WO-A-95/02697、WO-A-95/27071)。
重组腺病毒的产生方式一般是把病毒DNA引入壳化细胞系，再于约2或3天后将细胞裂解(腺病毒周期的动力学为24-36小时)。实施该方法时，引入的病毒DNA可以是完整的重组病毒基因组，可选择把病毒基因组构建在细菌内(WO-A-96/25506)或酵母内(WO-A-95/03400)，然后转染到细胞中。也可以用重组病毒来侵染壳化细胞系。也可将病毒DNA以片段形式引入，每个片段各带有重组病毒基因组的一部分，另外还需带有一段同源区，该同源区使重组病毒基因组能够在被引入壳化细胞后通过不同片段间的同源重组而重新建立。
也可以把可复制腺病毒用于基因治疗。举例来说，可将E1a基因插入到第一代病毒内并使其受肿瘤特异性启动子的调控。在把该病毒注射到肿瘤中后，理论上可以只在肿瘤中复制，而不在周围正常细胞中复制。这类载体可用来通过裂解作用直接杀死肿瘤细胞，也可用来递送“自杀基因”，如单纯疱疹病毒胸腺嘧啶激酶基因(HSV tk)，该基因经更昔洛韦处理后可杀死被侵染的细胞及旁观细胞。
由于许多实性肿瘤块中都存在缺氧条件，所以本发明所述HRE构建体在某些肿瘤组织中可具有优先活性，因此本发明提供一种腺病毒载体，该载体含有可操作地与编码腺病毒E1a多肽的核酸序列相连的本发明所述多聚核苷酸。处于HRE增强子调控下的E1a多肽将只在缺氧条件下表达，因而腺病毒将只在缺氧条件下才可复制。该腺病毒可不含内源性E1基因，优选的是同时不含内源性E3基因。腺病毒基因组中可删除的其它区域如上文所述。也可加入完整的或部分的E3基因并使其处于缺氧反应元件的调控之下，以使宿主细胞的免疫调节保持平衡，从而使病毒能够在肿瘤内适当传播并对侵染的细胞产生免疫应答。
在抗肿瘤治疗的一期临床试验中专门使用了一种只有E1b缺陷的腺病毒。E1b编码的多肽可阻断p53介导的凋亡，从而防止细胞由于对病毒侵染产生应答而杀死自己。因此在不含E1b的情况下，正常非肿瘤细胞中的病毒无法阻断凋亡，从而不会产生并传播传染性病毒。而在缺乏p53的肿瘤细胞中，E1b缺陷的病毒可以生长，并可扩散至邻近的p53缺陷肿瘤细胞，但不会扩散至正常细胞。此外，还可使用这类病毒来递送治疗性基因，如HSV tk。
因此，本发明所述可表达E1a的腺病毒优选的是不含有功能性E1b基因。
另外也可将病毒的其它必需基因置于缺氧反应调节因子的控制之下。
杂合载体系统也可使用杂合腺病毒/逆转录病毒系统，借此把腺病毒的特性与逆转录病毒的遗传稳定性结合起来。这些杂合病毒载体利用腺病毒来转染靶细胞，使细胞能够瞬时产生可稳定侵染邻近细胞的逆转录病毒。
本发明的杂合病毒载体系统含有一种或多种可编码次级病毒载体的初级病毒载体，该初级载体能够侵染一级靶细胞并在那里表达可转导次级靶细胞的次级病毒载体。
因此，本发明的遗传载体包括体外加工的初级载体，该载体可编码为次级载体的体内产生所必需的基因。所用次级载体可带有一种或多种用于插入次级靶细胞的选定基因。这些选定基因可以是一种或多种标记基因和/或治疗性基因(见上文)。
初级病毒载体可以是多种不同的病毒载体，如逆转录病毒(包括慢病毒)载体、腺病毒载体、单纯病毒载体或痘病毒载体，在初级病毒载体为多载体的情况下，也可以是不同来源的病毒载体的混合物。无论哪种情况，优选的初级病毒载体都应带有缺陷，因为它们不能够自主复制。因此，这些载体能够进入靶细胞并递送次级载体序列，但不能够进行复制，从而不会继续侵染其它靶细胞。
当杂合病毒载体系统含有一种以上编码次级载体的初级载体时，一般可将所有初级载体同时用来侵染初级靶细胞群体。优选的是使用一种可编码次级病毒载体所有组分的单一初级病毒载体。
腺病毒载体为优选的单一初级病毒载体或多初级病毒载体。从体外培养可获得的滴度方面来看，腺病毒载体与其它病毒载体相比具有明显的优势。与包膜病毒相比，腺病毒的颗粒还具有相当的稳定性，因而更易于纯化和保存。
优选的次级病毒载体为逆转录病毒载体，更优选的为慢病毒载体。实施例中对腺慢病毒系统的构建进行了描述。通过在初级靶细胞中表达缺陷型病毒载体颗粒组装及包装所必需的基因即可产生次级载体。使用缺陷型载体是因为它不能进行自主复制。因此，转导次级靶细胞后的次级逆转录病毒载体将不能通过复制而扩散至任何其它靶细胞。
次级载体的产生方法是将初级载体DNA中编码的产生逆转录病毒载体所必需的基因进行表达。这些基因可包括来源于逆转录病毒的gag-pol基因、来源于包膜病毒的包膜基因以及含有一种或多种治疗性基因的缺陷型逆转录病毒基因组。该缺陷型逆转录病毒基因组一般应含有进行逆转录所必需的序列、5’长末端重复(LTR)的至少一部分、3’LTR的至少一部分以及包装信号。
重要的是，该次级载体还可安全地用于体内，因为该载体使用了一种或多种安全措施，它们可排除通过重组而产生能够自主复制的传染性病毒的可能性。
次级载体可采用多转录单位形式来编码，以确保其复制缺陷性，这些转录单位可位于一种或两种或多种腺病毒载体或其它初级载体中。因此，可使用一种编码次级载体基因组的转录单位、一种编码gag-pol的转录单位和一种编码env的转录单位。作为选择，也可将其中的两种或多种进行合并。例如，可将编码gag-pol和env的核酸序列或编码env和基因组的核酸序列合并成单转录单位。其实现方法已为该领域所了解。
文中所述的转录单位是指含有编码序列和能够使这些编码序列独立于任何其它编码序列而表达的信号的核酸区域。因此，每种转录单位通常都至少含有一种启动子、一种增强子和一段多腺苷酸化信号。编码次级载体的转录单位的优选启动子和增强子应具有强活力，或能够在处于次级病毒载体产生条件下的初级靶细胞中被强烈诱导。该启动子和/或增强子可以是组成型，也可以是组织特异型或时间特异型。
下文将对可被杂合病毒载体系统使用的安全措施进行描述。这些措施可以只使用一种，也可同时使用多种。
首先，可通过删除同源区域来避免编码次级载体组件的序列之间存在同源性。同源区域可导致遗传重组的发生。在一项特别实施方案中，共使用了三种转录单位来构建次级逆转录病毒载体。第一种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的逆转录病毒gag-pol基因。第二种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的逆转录病毒env基因。第三种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的缺陷型逆转录病毒基因组。在天然逆转录病毒基因组中存在有包装信号，其位置使得部分gag序列成为正常行使功能所必需的序列。因此在构建逆转录病毒载体系统时，载体基因组中通常保留有包装信号，其中包括部分gag基因。而本发明的缺陷型逆转录病毒基因组中含有一种最小化的包装信号，该信号不包含与第一转录单位中的gag序列同源的序列。此外，在逆转录病毒中，如Moloney鼠白血病病毒(MMLV)，pol编码序列3’端与env编码序列5’端之间有一小段重叠区。通过改变密码子选择但不改变所编码蛋白的氨基酸序列的方式来修改pol编码序列的3’端序列或env编码序列的5’端序列，这样就可以去除第一转录单位与第二转录单位相应序列之间的同源性。
其次，通过将一种逆转录病毒的基因组假型化为另一种逆转录病毒或包膜病毒的包膜蛋白的方法即可去除env与gag-pol组件之间的同源区域，这样就可以排除次级病毒载体进行复制的可能性。在一项特别实施方案中，逆转录病毒载体是由以下三种组件构建而来。第一种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的逆转录病毒gag-pol基因。第二种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的来源于替代包膜病毒的env基因。第三种转录单位含有受非逆转录病毒启动子和增强子调控的缺陷型逆转录病毒基因组。缺陷型逆转录病毒基因组中含有一种最小化的包装信号，该信号不包含与第一转录单位中的gag序列同源的序列。
假型化可使用，例如，基于慢病毒，如HIV或马传染性贫血病毒(EIAV)，的逆转录病毒基因组，包膜蛋白则可以是，例如，被称为4070A的兼向性包膜蛋白。作为选择，也可使用基于MMLV的逆转录病毒基因组，而包膜蛋白可以是来自能够在初级靶细胞中以无毒剂量产生的另一种病毒的蛋白，如流感血细胞凝集素或水泡性口炎病毒G蛋白。作为另一选择，包膜蛋白还可以是修饰的包膜蛋白，如突变的或改造的蛋白。进行修饰或所选修饰的目的可以是为了引入导向能力或降低毒性或是其它目的。
第三，利用以特殊方式构建的两种转录单位即可排除逆转录病毒进行复制的可能性。第一种转录单位含有gag-pol编码区，该编码区处于在初级靶细胞中具有活性的启动子-增强子如hCMV启动子-增强子，或是在限定组织内具有活性的启动子-增强子的调控之下。第二种转录单位编码可被包装成病毒颗粒的逆转录病毒基因组RNA。第二种转录单位含有包装、整合及逆转录所必需的逆转录病毒序列，并含有编码一种包膜病毒的env蛋白的序列和一种或多种治疗性基因的编码序列。
在一项优选实施方案中，本发明的杂合病毒载体系统含有可编码逆转录病毒次级载体的单一或多重腺病毒初级载体。本发明使用的腺病毒载体可来源于人腺病毒或通常不侵染人的腺病毒。优选的载体则来源于2型腺病毒或5型腺病毒(Ad2或Ad5)或鼠腺病毒，或鸟腺病毒如CELO病毒。该载体可以是能够复制的腺病毒载体，但更优选的是复制缺陷型腺病毒载体。使腺病毒载体产生复制缺陷的方法可以是删除一种或多种病毒复制所必需的组件。通常每种腺病毒载体至少在E1区含有一个缺失。若要产生传染性腺病毒载体颗粒，则可在含有Ad5左侧部分，其中包括E1基因，的已整合拷贝的人胚胎纤维母细胞系，如人293细胞系，中利用病毒来填补该缺失。这些载体可容纳异种DNA的量高达约7kb。因此，这些载体可有效用来构建本发明所述系统，即含有三种独立重组载体且各包含一种构建次级逆转录病毒载体所必需的转录单位的系统。
该领域还了解一些在其它腺病毒基因中含有其它缺失的替代腺病毒载体，这些载体同样适用于本发明。其中一些腺病毒载体在第二代时具有较低的免疫原性(如E1+E2缺失，Gorziglia等，1996；E1+E4缺失，Yeh等，1996)。延长缺失可获得额外的克隆能力，以用于在载体中引入多种基因。例如有报导使用一种25kb的缺失(Lieber等，1996)，也有报导使用一种所有病毒基因均被删除的克隆载体(Fisher等，1996)，该载体可引入35kb以上的异种DNA。这些载体均可用来产生本发明所述编码两种或三种转录单位以用于次级逆转录病毒载体构建的初级逆转录病毒载体。
本发明所述实施方案可解决与腺病毒载体及其它病毒载体相关的主要问题，即这些载体可进行瞬时基因表达。由初级靶细胞产生的逆转录病毒颗粒可侵染次级靶细胞，由于逆转录病毒载体基因组已被整合到宿主细胞基因组中，因而次级靶细胞可保持稳定的基因表达。次级靶细胞不会表达大量的病毒蛋白抗原，与利用腺病毒载体转导细胞相比，这样做可获得更低的免疫原性。
将腺病毒载体作为次级载体加以使用还具有其它优势，它可通过，例如，允许定向于快速分裂的细胞而对细胞具有一定程度的辨别力。此外，逆转录病毒的整合使治疗性基因能够在靶组织中稳定表达，包括在增殖靶细胞中进行稳定表达。
优选的初级病毒载体可优先侵染某一或某些类型的细胞。更优选的初级载体为定向载体，即与天然病毒相比具有被改变的组织趋向性，使得该载体可定向于特定的细胞。术语“定向载体”并非与术语“靶细胞”必然相关。“靶细胞”只是指可被一种载体，无论是天然载体还是定向载体，侵染或转导的细胞。
本发明所述载体系统的初级靶细胞包括，但不局限于，造血细胞(包括单核细胞、巨噬细胞、淋巴细胞、粒细胞或其祖细胞)；内皮细胞；肿瘤细胞；基质细胞；星形胶质细胞或神经胶质细胞；肌细胞；和上皮细胞。
因此，本发明所述可产生次级病毒载体的初级靶细胞可以是任何上述类型的细胞。在一项优选实施方案中，本发明的初级靶细胞是被缺陷型腺病毒载体侵染的单核细胞或巨噬细胞，缺陷型腺病毒载体含有逆转录病毒gag-pol使用的第一转录单位和能够产生可包装的缺陷型逆转录病毒基因组的第二转录单位。在该实例中，优选的是至少第二转录单位受一种可优先在体内病灶部位，如局部缺血部位或实性肿瘤微环境，显示活性的启动子-增强子的调控。在本发明该方面的一项特别优选实施方案中，第二转录单位的构建方式使基因组在插入到次级靶细胞内时可产生一段内含子，该内含子可降低病毒env基因的表达，但允许治疗性基因进行高效表达。
次级病毒载体也可以是定向载体。对逆转录病毒载体而言，可通过修饰包膜蛋白来实现。该逆转录病毒次级载体的包膜蛋白需是一种无毒包膜蛋白或能够在初级靶细胞中以无毒剂量产生的包膜蛋白，如MMLV兼向性包膜蛋白或经修饰的兼向性包膜蛋白。在该实例中，优选安全措施是删除逆转录病毒组件之间的同源区或同源序列。
次级靶细胞群体可以与初级靶细胞群体相同。例如，将本发明的初级载体递送至肿瘤细胞可复制和产生出更多的载体颗粒，它们可转导更多的肿瘤细胞。作为选择，次级靶细胞群体也可以与初级靶细胞群体不同。此时，初级靶细胞可作为被治疗的个体体内的内源制造厂，并产生更多可侵染次级靶细胞群体的载体颗粒。例如，初级靶细胞群体可以是被初级载体经体内或先体外后体内转导的造血细胞。然后将初级靶细胞递送或使其迁移到体内某个部位，如肿瘤部位，继而产生能够转导，如实性肿瘤内的肿瘤细胞，的次级载体颗粒。
本发明允许在体内需要一种或多种治疗性蛋白发挥作用的部位或该部位附近局部产生高滴度的缺陷型逆转录病毒载体颗粒，从而对次级靶细胞进行高效转导。该方法比单独使用缺陷型腺病毒载体或缺陷型逆转录病毒载体更加有效。
本发明还允许在体内非分裂细胞和慢分裂细胞中产生逆转录病毒载体，如基于MMLV的载体。此前已能够只在快速分裂细胞，如体外繁殖的组织培养适应性细胞或体内的快速分裂肿瘤细胞，中产生基于MMLV的逆转录病毒载体。扩展可产生逆转录病毒载体的细胞类型的范围将会利于把基因递送到大多分裂缓慢的实性肿瘤细胞中，也利于把非分裂细胞，如内皮细胞和多种造血细胞谱系的细胞，作为内源制造厂来产生治疗性蛋白产物。
单纯疱疹病毒1．病毒品系含有本发明所述多聚核苷酸的本发明所述HSV载体可来源于，例如，HSV1或HSV2品系或其衍生品系，优选的是来源于HSV1。衍生品系包括含有来自HSV1和HSV2品系的DNA的种间重组体。优选的衍生品系与HSV1或HSV2基因组相比应具有至少70％的同源性，更优选的为至少90％，还更优选的为95％。
在治疗程序中使用的HSV品系需要被减毒，以使它们无法形成裂解周期。详细地说，若要将HSV载体用于人类的基因治疗，则优选的是将多聚核苷酸插入到一种必需基因内。这是因为如果载体病毒遇到野生型病毒，则会发生异种基因通过重组被转移至野生型病毒的情况。而只要该多聚核苷酸是被插入到必需基因内，那么这种重组转移也同样会去除受者病毒内的必需基因，从而防止异种基因“逃逸”到可复制的野生型病毒群体中。
减毒株可用于本发明所述HSV品系的产生，这里只给出一些实例，其中包括在ICP34.5或ICP27内突变的品系，例如在ICP34.5内突变的1716品系(MacLean等，1991)、R3616与R4009品系(Chouand Roizman,1992)和R930品系(Chou等，1994)，以及ICP27缺失的d27-1(Rice and Knipe,1990)。也可使用ICP4、ICP0、ICP22、ICP6、ICP47、vhs或gH缺失并且VMW65内有失活突变或其任意组合的替代品系来产生本发明所述HSV品系。
文中描述不同HSV基因所使用的命名法与Coffin and Latchman,1996，《基于单纯疱疹病毒的载体》相同，该文章在Latchman DS(ed).《神经系统的遗传操作》Academic Press:London的第99-114页。
2．补充细胞系ICP27缺陷的HSV病毒能够在表达ICP27的细胞系中繁殖，如V27细胞(Rice and Knipe,1990)或2-2细胞(Smith等，1992)。产生可表达ICP27的细胞系的方法是对哺乳动物细胞，如Vero或BHK细胞，进行共转染，共转染使用的是一种含有能够在所述细胞中表达的功能性HSV ICP27基因的载体，优选的为质粒载体，以及一种编码可选择标记，优选的为新霉素抗性标记，的载体，优选的为质粒载体。然后对带有可选择标记的克隆做进一步筛选以确定可同时表达功能性ICP27的克隆，例如可使用该领域技术人员熟知的方法(如按Riceand Knipe,1990所述)根据其支持ICP27-HSV突变品系生长的能力来进行筛选。
也可利用上述方法来产生不能将ICP27-HSV突变品系回复成具有功能性ICP27的品系的细胞系，以确保含有功能性ICP27基因的载体不含有与ICP27-突变病毒的剩余序列重叠(即同源)的序列。
当本发明所述HSV品系在其它必需基因，如ICP4，内含有灭活修饰时，补充细胞系将另含有一种功能性HSV基因，该基因可补充被修饰的必需基因，其方式与ICP27所述相同。
3．突变方法利用该领域熟知的一些方法可以使HSV基因的功能丧失。举例来说，通过缺失、取代或插入均可以使基因的功能丧失，优选的是通过缺失。缺失可以是去除部分基因或整个基因。插入序列可包括上文所述的表达盒。
利用该领域技术人员熟知的同源重组方法可使HSV品系内产生突变。例如，可使用一种在HSV同源序列两侧含有突变序列的载体，优选的为质粒载体，与HSV基因组DNA一同进行转染。该突变序列可含有多个缺失、插入或取代，其构建可采用常规技术来实现。插入部分包括可选择标记基因，如lacZ，这样可通过，例如，β半乳糖苷酶活性对重组病毒进行筛选。
也可以使其它HSV基因发生突变，如ICP0、ICP4、ICP6、ICP22、ICP47、VMW65、gH或vhs基因。在使VMW65基因发生突变的情况下，不能把整个基因均删除，因为该基因编码一种必需的结构蛋白，但可通过插入使其少量失活，使VMW65可激活IE基因转录的能力丧失(Ace等，1989)。
4．含有本发明所述多聚核苷酸的HSV品系本发明所述多聚核苷酸可插入于HSV基因组的任何位置，前体是该病毒仍能够繁殖，或是当NOI被插入到一种必需基因内时需要使用一种带有另一HSV必需基因的细胞系即能够繁殖(如第2小节所述)。例如，当该核苷酸被插入到HSV品系的ICP27基因内时，则需要一种可表达ICP27的细胞系。优选而言，本发明的多聚核苷酸应插入到ICP27突变区内，因为在该突变通过与野生型病毒的重组而被修复这种不太可能出现的情况下，这种修复将会去除插入的多聚核苷酸。
也可通过HSV品系与，例如与上文引入突变部分所述相同，在HSV序列两侧带有表达盒的质粒载体之间的同源重组将本发明的多聚核苷酸插入到该HSV基因组中。也可利用该领域熟知的克隆技术将该多聚核苷酸引入含有HSV序列的适当质粒载体。
特别优选的是将本发明所述多聚核苷酸可操作地与WO-A-98/30707(上文转载了其部分公开内容)所述LAT P2序列相连接，因为该序列已被证明能够极大改善哺乳动物细胞中的长期表达。
E．宿主细胞和靶细胞本发明的多聚核苷酸构建体、核酸载体及病毒载体可被引入多种宿主细胞。宿主细胞可包括原核细胞，如细菌，及真核细胞，如酵母和高等真核细胞(昆虫细胞、哺乳动物细胞或人细胞)。非病毒载体和病毒载体的繁殖均可使用宿主细胞，例如可用来制备含有本发明所述多聚核苷酸的核酸载体，或用来制备高滴度的病毒储备。
作为选择，也可在治疗中使用含有本发明所述多聚核苷酸/NOI的宿主细胞，例如，在先体外后体内的治疗中使用下文所述的巨噬细胞。
通常可利用该领域熟知的技术，如转化或转染，将非病毒核酸和病毒载体引入宿主细胞。也可通过侵染将病毒载体引入宿主细胞。
本发明提及的靶细胞通常是指需要治疗的机体的细胞或来源于该机体的细胞，而不是仅指细胞系。可将靶细胞从该机体移出，继而在治疗后再移回，也可在体内直接定向于靶细胞。因此，举例来说，体内的肿瘤细胞即可被认为是靶细胞。
靶细胞的实例包括肿瘤细胞(见下文的肿瘤列表)，特别是处于缺氧条件下的肿瘤细胞。靶细胞可以是能够进行细胞分裂但生长停滞的细胞，如实性肿瘤块中心部分的细胞，或干细胞如HSC细胞或CD34+细胞。作为另一选择，靶细胞还可以是分化细胞的前体，如单核细胞前体细胞、CD33+细胞或髓细胞前体细胞。靶细胞也可以是已分化细胞，如神经元、星形胶质细胞、神经胶质细胞、小胶质细胞、巨噬细胞、单核细胞、上皮细胞、内皮细胞或肝细胞。可将靶细胞自个体分离后于体外进行转染或转导，也可直接在体内进行转染或转导。
优选的宿主细胞/靶细胞包括可表达EPAS的细胞，更优选为可表达EPAS但不表达(或以极低水平表达)HIF-1的细胞。
在一项特别优选实施方案中，是以造血干细胞，如巨噬细胞，为宿主细胞/靶细胞。HSCs属于在哺乳动物中可生成所有血细胞谱系的多能干细胞。HSCs在微环境因素，如细胞与细胞的相互作用及适当细胞因子的存在，的影响下可分化成不同的细胞谱系。HSCs主要可分化出四种细胞谱系。包括红系(红细胞)、巨核系(血小板)、髓系(粒细胞和单核细胞)和淋巴系(淋巴细胞)。这些细胞可在组织特异性蛋白调节剂的一系列交叉影响下发育成熟，这些调节剂有多种名称，如生长因子、细胞因子和白介素。
来源于血流中单核细胞的巨噬细胞已作为一种运载工具被用来将药物和治疗性基因定向于实性肿瘤。目前已证明，在乳癌患者中，巨噬细胞可不断进入实性肿瘤，并能够在血管形成不良的局部缺血部位聚集。此外，这些肿瘤中由局部缺血导致的坏死程度与肿瘤内巨噬细胞的侵润程度正相关。
单核细胞和巨噬细胞还可侵润局部缺血性损害部位，局部缺血性损害可作为其它病状的一个特征，如脑型疟、冠心病和类风湿性关节炎。因此，单核细胞和巨噬细胞适于在本发明中用作宿主细胞。详细地说，含有本发明所述多聚核苷酸和/或载体，如病毒载体，的单核细胞和/或巨噬细胞适合于在先体外后体内方法及体内方法中用来治疗缺氧相关性疾病。
HSCs的分离方法以及HSCs在培养过程中的维护和分化方法已为该领域所了解(Santiago-Schwartz等，1992；Charbord等，1996；Dao等，1997；Piacibello等，1997及WO-A-91/09938)。已有报导显示可把逆转录病毒基因转入常规的人HSCs(Duphar and Emmons,1994)。在Dunbar等，1996中还描述了对HSCs进行逆转录病毒介导的转导并传送给患者的方法。
小鼠的体内研究表明，在收集骨髓前用5-氟尿嘧啶对供体小鼠进行预处理可诱发原始细胞的细胞循环并提高对逆转录病毒侵染和整合的易感性，从而可提高转导效率。将靶细胞与产逆转录病毒的细胞系共培养以及使用产率至少为105病毒颗粒/ml的细胞系同样能够提高效率(Bodine等，1991)。把基因引入长期种群恢复细胞的试验也已成功实现，几乎所有受者小鼠内均稳定重建了多种造血细胞谱系，并且带有原病毒基因组的细胞达到1-50％或更高(Fraser等，1990)。
当本发明使用一种载体来把NOI递送至体内HSCs时，优选的载体为能够定向于CD34+HSCs的定向载体。
术语“定向载体”是指能够侵染/转染一种细胞，或能够在靶细胞中表达，并且这种能力仅局限于宿主机体内通常具有相同或相似表型的某些细胞类型的载体。定向载体的实例如一种带有经遗传修饰的包膜蛋白的定向逆转录病毒载体，该包膜蛋白能够与只在宿主机体内有限类型的细胞表面出现的细胞表面分子结合。定向载体的另一实例如一种含有启动子和/或增强子的载体，该启动子和/或增强子只能够在宿主机体的一定比例的细胞类型中表达一种或多种逆转录病毒转录体。因此，所提供的载体可带有一种对CD34具有特异性的配体，如定向于CD34的一种抗体或免疫球蛋白样分子。当这种载体被引入待治疗的个体内时，将特异性转导CD34+HSCs。可通过全身给药将载体引入外周循环。
F．治疗应用相信本发明将具有广泛的治疗应用性——这将取决于其选择的一种或多种NOIs。此外，或是作为可选方案，本发明适用于对WO-A-98/09985中列出的病症进行治疗。为了便于参考，这里给出其中的一部分巨噬细胞抑制活性和/或T细胞抑制活性以及抗炎活性；抗免疫活性，即对细胞免疫应答和/或体液免疫应答的抑制作用，其中包括与炎症无关的应答；对巨噬细胞和T细胞能够与细胞外基质成分和粘连蛋白粘连的能力以及T细胞中受增量调节的fas受体表达进行抑制；对不必要的免疫反应和炎症进行抑制，如关节炎，其中包括类风湿性关节炎，过敏性相关炎症、变应性反应、哮喘、系统性红斑狼疮、胶原病和其它自身免疫疾病、动脉粥样硬化相关炎症、动脉粥样硬化、动脉粥样硬化性心脏病、多次灌注损伤、心脏停搏、心肌梗塞、血管炎性病症、呼吸窘迫综合症或其它心肺疾病、消化性溃疡相关炎症、溃疡性结肠炎和其它胃肠道疾病、肝纤维化、肝硬化或其它肝脏疾病、甲状腺炎或其它腺性疾病、肾小球肾炎或其它肾与泌尿系疾病、耳炎或其它耳-鼻-喉疾病、皮炎或其它皮肤疾病、牙周疾病或其它牙疾病、睾丸炎或附睾-睾丸炎、不育症、睾丸创伤或其它免疫相关性睾丸疾病、胎盘功能障碍、胎盘功能不全、习惯性流产、子痫、先兆子痫和其它免疫和/或炎症相关性妇科疾病、后葡萄膜炎、中间葡萄膜炎、前葡萄膜炎、结膜炎、脉络膜视网膜炎、葡萄膜视网膜炎、视神经炎、眼内炎症，如视网膜炎或囊样黄斑水肿、交感性眼炎、巩膜炎、色素性视网膜炎、变性性眼底疾病的免疫及炎症部分、眼创伤的炎症部分、由感染引起的眼炎、增生性玻璃体视网膜病变、急性局部缺血性视神经病变、结瘢过度，如青光眼滤过手术后的结瘢过度、对眼植入物的免疫反应和/或炎症反应及其它免疫相关性和炎症相关性眼疾病、与中枢神经系统(CNS)或其它任何器官内的自身免疫疾病或病情或病症相关的炎症中对免疫和/或炎症进行抑制可带来好处的炎症、帕金森病、由帕金森病治疗导致的并发症和/或副作用、AIDS相关性痴呆复合HIV相关性脑病、德维克病、西德纳姆舞蹈病、阿尔茨海默病和其它CNS变性性疾病、病情或病症、斯托克斯病的炎症部分、脊髓灰质炎后综合症、精神疾病的免疫和炎症部分、脊髓炎、脑炎、亚急性硬化性全脑炎、脑脊髓炎、急性神经障碍、亚急性神经障碍、慢性神经障碍、Guillaim-Barre综合症、西德纳姆舞蹈病、重症肌无力、脑假瘤、唐氏综合症、亨廷顿病、肌萎缩性侧索硬化症、CNS受压或CNS创伤或CNS感染的炎症部分、肌肉萎缩及营养不良的炎症部分，以及与免疫和炎症相关的中枢神经系统与周围神经系统疾病、病情或病症、创伤后炎症、感染性休克、传染病、外科手术的炎性并发症或副作用、骨髓移植或其它移植的并发症和/或副作用、基因治疗导致的炎性和/或免疫性并发症及副作用，如由病毒载体感染导致，或与AIDS相关的炎症，借此来排除或抑制体液免疫应答和/或细胞免疫应答，通过减少单核细胞或淋巴细胞的数量来治疗或改善单核细胞或白细胞增生性疾病，如白血病，从而预防和/或治疗在移植诸如角膜、骨髓、器官、晶状体、起搏器、天然或人造皮肤组织等天然或人造细胞、组织或器官情况下的移植物排斥反应。
特别地，可将本发明的多聚核苷酸、核酸载体、病毒载体和宿主细胞用于肿瘤的治疗。可通过本发明加以治疗的肿瘤实例包括，但不局限于肉瘤，包括骨源性肉瘤和软组织肉瘤，癌，包括乳癌、肺癌、膀胱癌、甲状腺癌、前列腺癌、结肠癌、直肠癌、胰腺癌、胃癌、肝癌、子宫癌和卵巢癌，淋巴瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、肾母细胞瘤，以及白血病，包括急性淋巴细胞白血病和急性粒细胞白血病，神经胶质瘤和视网膜母细胞瘤。
作为定向于肿瘤的另一实例，已知在VHL基因位点带有突变的患者其血管瘤和肾细胞癌的发病率提高。此外，有些肾细胞癌患者在VHL基因内同时含有多处改变。这些患者的肿瘤细胞内的HIF表达水平将大大提高，继而无论是这些细胞的含氧量正常还是缺氧都将刺激由HRE构建体驱动的表达。因此，将一种核苷酸序列，其中含有可编码可操作地与一种HRE，如本发明的HRE，相连的治疗性基因产物的NOI，引入HIF表达水平较高的细胞，如由VHL基因位点突变导致其HIF表达水平提高，即可有效地治疗或预防与一处或多处可抑制VHL功能的VHL基因位点突变相关的病情。这些病情的实例包括血管瘤和肾细胞癌。
本发明的一个特别有利的特点是NOIs能够在缺氧细胞中表达，但不在含氧量正常条件下的细胞中表达。因此，本发明的多聚核苷酸、核酸载体、病毒载体和宿主细胞可用于一系列以缺氧为特征的病情的临床管理。以缺氧症状为特征的病情包括，例如，中风、深静脉血栓形成、肺栓塞和肾衰竭。称为心肌梗塞的心脏组织细胞死亡在很大程度上是由局部缺血引起的组织损伤和/或多次灌注后引发的局部缺血所造成。其它实例还包括脑型疟和类风温性关节炎。特别优选的是将本发明的多聚核苷酸、核酸载体、病毒载体和宿主细胞用于实性肿瘤的临床管理，如卵巢肿瘤，特别是含有处于缺氧条件下的肿瘤细胞的肿瘤。治疗的效果可以是肿瘤生长速率降低、肿瘤生长终止或甚至是肿瘤块皱缩，而不一定是导致受影响患者内所有恶性细胞的完全凋亡/坏死性死亡。
也可在预防医学中使用本发明的多聚核苷酸、核酸载体、病毒载体和宿主细胞。此时，本发明使用的NOIs可通过预防来发挥治疗效果。例如，当诊断发现患癌症的风险加大时，可将本发明用于有危险个体的预防接种。
预防的适用性取决于对癌的遗传易感性，例如由BRCA-1基因、BRCA-2基因(Cornelisse等，1996)或其它相关基因内的一处或多处突变引起的乳癌或卵巢癌。
G．给药本发明的多聚核苷酸、核酸载体和病毒载体可用来将治疗性基因递送至需要治疗的人或动物。
本发明的多聚核苷酸可作为裸核酸构建体，优选的可进一步在两侧含有与宿主细胞基因组同源的序列，直接进行给药。通过一些已知技术可提高哺乳动物细胞对裸核酸构建体的吸收，其中包括轰击转化法和脂转染法。作为选择，也可将本发明的多聚核苷酸作为核酸载体的一部分进行给药，核酸载体包括质粒载体或病毒载体，优选的为慢病毒载体。
优选的是将递送载体(即含有，例如，多聚核苷酸的裸核酸构建体或病毒载体)与一种药学上可接受的载体或稀释剂合并，以形成药物组合物。因此，本发明还提供一种用于通过基因疗法对个体进行治疗的药物组合物，其中该组合物含有药学有效剂量的本发明所述含有一种或多种可供使用的治疗性和/或诊断性NOI(s)或由其产生或得到的病毒颗粒的多聚核苷酸、载体或病毒载体以及药学上可接受的载体、稀释剂、赋形剂或佐剂。该药物组合物可用于人或动物。
药用载体、赋形剂或稀释剂可根据预定的给药途径及标准制药准则来加以选择。适当的载体和稀释剂包括等张盐溶液，如磷酸缓冲盐溶液。该药物组合物可含有——或另含有——作为载体、赋形剂或稀释剂的任何适当的粘合剂、润滑剂、悬浮剂、涂层剂、增溶剂及其它能够协助或促进病毒进入靶部位的运载制剂(如液体运载系统)。
该药物组合物可配制成用于胃肠外、肌内、静脉内、颅内、皮下、眼内或穿皮给药的形式。
该药物组合物可在适当情况下通过以下任何一种或多种方法给药以栓剂或阴道栓形式进行吸入给药、利用皮肤贴剂以洗剂、溶液、乳膏剂、软膏剂或撒粉剂形式进行局部给药、以含有赋形剂，如淀粉或乳糖，的片剂或单独或与赋形剂混合的胶囊剂或胚珠剂或含有调味剂或着色剂的酏剂、溶液或悬浮液形式进行口服给药，也可将其进行胃肠外注射，如胸腔内注射、静脉内注射、肌内注射或皮下注射。该组合物用于胃肠外给药时最好采用无菌水性溶液形式，其中可含有其它物质，如足以使该溶液与血液等张的盐或单糖。该组合物用于颊部或舌下给药时可采用以传统方式配制的片剂或锭剂形式。
该药物组合物的给药方式应能够使包含用于基因治疗的治疗性基因的多聚核苷酸/载体被引入适当区域的细胞内。
当利用本发明所述病毒载体将本发明的多聚核苷酸递送至细胞时，病毒的给药量可为103-1010 pfu，优选的为105-108 pfu，更优选的为106-107 pfu。当用于注射时，通常可将1-10μl的病毒置于药学上可接受的适当载体或稀释剂中给药。
当本发明的多聚核苷酸/载体作为裸核酸给药时，核酸的给药量通常为1μg-10mg，优选的为100μg-1mg。
当NOI处于可诱导型调节序列的控制之下时，只需在治疗期间对基因表达加以诱导。一旦对病情的治疗结束，即可去除诱导物，使NOI的表达终止。这一点具有很明显的临床优势。该系统涉及，例如，将四环素抗生素给药以利用其对破伤风阻遏物/VP16融合蛋白的影响来激活基因的表达。
在利用本发明所述多聚核苷酸/载体对疾病进行治疗的过程中，使用组织特异性启动子可具有协助作用。例如，一些神经障碍只不过是由一小类细胞内特定基因产物的表达异常所导致的。从利益观点考虑，应该使治疗基因只能在受影响的相应细胞类型中表达，尤其是在这些基因于其它类型细胞中表达时可产生毒性的情况下。
可将本发明所述经修饰的HSCs置于适当制剂中给药于患者或有危险个体。这些制剂可包括等张盐溶液、缓冲盐溶液或组织培养基。细胞的给药可采用快速浓注或静脉内输注方法，或直接输注至肿瘤部位或骨髓，其浓度可约为，例如，106-1012细胞/剂，优选的为108或1010细胞/剂。
可首先对个体进行处理以排除骨髓中的干细胞，也可用一种或多种细胞因子，如G-CSF，处理个体以促进干细胞移动至周围血液或加强骨髓的再增殖。也可考虑将这些治疗结合使用。本发明的治疗方法还可以与目前可用的抗肿瘤疗法结合使用。
如果用于干细胞工程的载体可编码一种前药活化酶，则可利用相应的前药对患有癌症的个体进行额外处理，其给药可根据该领域所了解的原则而采用适当的方案。
当把HSCs从要治疗的个体内移出并用载体对其进行体外转染或转导时，通常需要在利用一种或多种NOI进行转导之前及之后将这些细胞置于培养基中扩增。当HSC被培养在体外适当条件下或在体内接受适当信号时，可分化成内皮细胞、骨髓细胞、树突细胞和免疫效应细胞等其它类型的细胞，如嗜中性粒细胞、淋巴细胞、单核吞噬细胞及NK细胞。
HSCs的维持涉及使用该领域已知的组织培养方法，还需暴露于细胞因子和/或生长因子(Santiago-Schwartz等，1992；Charbord等，1996；Dao等，1997；Piacibello等，1997)。也可以加入能够诱导HSCs分化的制剂。
HRE因子除能够对缺氧起反应外，还能够对模拟缺氧的化学诱导剂起反应。其中有两种已为该领域所了解，即氯化钴和去铁铵(Meliillo等，1996；Wang and Semenza 1993b)。因此，本发明的产品还可用来治疗将模拟缺氧的复合物给药的病症，如利用化学活化剂去铁铵或类似化学物来治疗神经母细胞瘤(Blatt,1994)、β地中海贫血(Giardina and Grady,1995)、阿尔茨海默病(Crapper等，1991)、VEGF缺乏(Beerrepoot等，1996)、促红细胞生成素缺乏(Wang and Semenza,1993b)以及用于加强肿瘤化疗(Voest等，1993)。本发明的产品可与模拟缺氧的复合物一同、依次或单独给药。
文中描述的给药途径和剂量仅作为一种参考，因为熟练医师将能够很容易地确定用于任何特定患者和病情的最佳给药途径和剂量。
本发明可使用该领域技术人员所了解的常规分子生物学技术。这些技术在文献中均有详细描述。例如，可参考Sambrook等，(1989)分子克隆实验手册；Ausubel等，新编分子生物学指南(1989)JohnWiley&Sons,Inc.；Hames and Glover(1985-1997)DNA克隆实验方法，Ⅰ-Ⅳ卷(第二版)；McCafferty等，1996，《抗体工程实验方法》则提供了对免疫球蛋白基因进行加工的方法。
应该了解的是，上文所述的本发明的不同部分、方面和实施方案的特性一般可同样适用于细节上已作必要改动的其它部分、方面和实施方案。
本发明将通过实例做进一步的描述，这些实例只是用来协助该领域普通技术人员实施本发明，而并非想通过任何方式来限制本发明的范围。实例涉及有附图。在这些附图中

图1为OB37质粒示意图。该质粒含有OBHRE1或OBHRE11启动子；图2a的图表显示合成的缺氧反应性启动子的相对强度。条带显示报告基因的活性水平。条带上方的数字为诱导倍数；图2b的图表显示与最小化SV40启动子结合使用的缺氧反应启动子同CMV启动子相比的缺氧介导活化作用；图3的图表说明，OBHRE11可介导初级人巨噬细胞内的缺氧诱导作用；图4的照片显示对利用Xiavector转导的HT1080细胞内的β半乳糖苷酶表达的诱导；图5的图表显示对利用Xiavector转导的乳癌细胞内的β半乳糖苷酶表达的诱导；图6的图表显示与萤光素酶编码序列相连接的人造启动子构建体5’和/或3’HRE中的突变对缺氧介导的表达的影响；图7为pKAHRE构建体示意图；图8显示含有受HRE调控的治疗基因的逆转录病毒XiaGen-P450载体的草图；图9的图表显示巨噬细胞和乳癌细胞系中，受XiaMac启动子(标为OBHREMAC)驱动的报告基因与受CMV启动子驱动的报告基因的缺氧活性比较；图10的图表说明，HRE对XiaMac启动子的缺氧反应起决定性作用。将XiaMac中的HRE去除(XiaMac-HRE)后发现缺氧不再具有诱导作用；图11a为pEGASUS-4(+)质粒图谱示意图11b为pONY2.11acZ质粒图谱示意图；图11c为pONYHRELucLac质粒图谱示意图；图11d为pEGHRELacZ质粒图谱示意图；图12的图表显示把表达LacZ的Pegasus载体植入培养细胞后的病毒滴度。处理后的细胞被置于含氧量正常或缺氧条件下；图13的图表显示慢病毒载体中萤光素酶报告蛋白的缺氧介导活化作用；图14为将HRE引入EIAV载体的PCR方法的示意图；图15为以单转录单位形式构建的缺氧反应性EIAV载体示意图；图16为以单转录单位形式构建的缺氧反应性自我调节EIAV载体示意图；图17显示，重组腺病毒载体Ad.OBHRElacZ的一种构建方案是把来自OB37的OBHRElacZ表达盒插入到MiCrobix转移载体pE1sp1A内；图18的图表显示被转导入Chiang肝细胞的Ad.OBHRElacZ的缺氧诱导作用(0.1％)；图19的照片显示初级人巨噬细胞中由AdOBHRElacZ转导对β半乳糖苷酶基因表达的缺氧调控；图20a为pE1HREPG质粒图谱示意图；图20b为pE1CMVPG质粒图谱示意图；图21为pE1RevE质粒图谱示意图；图22为pE1HORSE3.1质粒图谱示意图；图23为pE1PEGASUS质粒图谱示意图；图24为pCI-Neo质粒图谱示意图；图25为pCI-Rab质粒图谱示意图；以及图26为pE1Rab质粒图谱示意图；图27的图表显示将不同HRE构建体与或不与HIF-1一同使用时的缺氧诱导作用。LTR=完整MLV启动子上游的3×PGK HRE。-CAAT是指核心启动子不含CAAT框。
图28为HRE HIF-1自我调节表达盒示意图。
图29的图表显示在T47D细胞中使用不同HRE构建体的缺氧诱导作用。
图30的图表显示在CTC12细胞中使用不同HRE构建体的缺氧诱导作用。
实施例实施例1——最佳缺氧反应元件——Obhre11的构建一种基于鼠PGK HRE的启动子有多种HRE构建体已为该领域所了解。但如上文所述，迄今为止，由构建体中的这些序列指导的缺氧限制性表达的程度仍不完全令人满意。适当的HRE构建体应能够以缺氧限制性方式指导高水平的表达。因此，我们测试了一些不同构建体的缺氧特异性活性，其中包括两种基于被克隆到SV40启动子序列上游的三个鼠PGK HRE同向重复的新型构建体，希望借此获得一种具有所需特性的序列。
材料与方法质粒构建合成含有缺氧反应元件(HRE)序列的合成寡核苷酸，并将其以Bg1Ⅱ/BamH1片段形式克隆到pGL3启动子质粒(Promega；Genbank登录号U47298)的BamH1位点内。合成PGK序列的Xba1/Nhe1片段，并将其克隆到该载体的Nhe1位点内。PGL3是一种不含增强子的表达质粒，该质粒在萤光素酶编码序列的上游含有一种最小化SV40启动子。HRE的插入位点位于该最小化SV40启动子的上游。
该测试使用的病毒增强子/启动子序列如下OBhre1含有三聚体形式的以天然取向与SV40启动子相连的鼠PGK-307/-290序列(Firth等，1995)(用斜体字印刷)(序列编号3)。GCTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACANhe1HREHRETCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGHRE XbalATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGstart start尽管此处给出的结果是OBhre11的结果(见下文)，但利用基于Obhre1的构建体也获得了十分类似的结果。
OBhre11除了中间的HRE在HIF-1结合位点处含有一个缺失之外，其余与Obhre1类似(删除的残基的两边两个核苷酸以黑体字显示(序列编号9))。GCTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGG CANhe1 HRE mutant HRETCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAGCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGHRE XbalATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGstart start该启动子序列被定名为OBhre11。所得的质粒称为OB37质粒(图1)。
PGK(图2a显示PGK×3)除了取向与天然结构相反之外，其余与Obhre1相同。该构建体也是新构建体。CTAGCTGTCACGTCCTGCACGACACTAGATGTCACGTCCTGCACGACAHRE HRECTAGATGTCACGTCCTGCACGACTCTAGCCCGGGCTCGAGATCTGCGAHRETCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTG烯醇化酶A含有三个HRE共有位点且位置与在天然人基因中的位置相同的序列(Semenza等，1996)。GATCTGAGGGCCGGACGTGGGGCCCCAGAGCGACGCTGAGTGCGTGC(HRE) HREGGGACTCGGAGTACGTGACGGAGCCCCGGATCTGCATCTCAATTAGTCHREAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTG烯醇化酶×2除了插入有两个拷贝的合成序列之外，其余与上文相同。GATCTGAGGGCCGGACGTGGGGCCCCAGAGCGACGCTGAGTGCGTGC(HRE) HREGGGACTCGGAGTACGTGACGGAGCCCCGGATCTGAGGGCCGGACGTGHRE (HRE)GGGCCCCAGAGCGACGCTGAGTGCGTGCGGGACTCGGAGTACGTGACHRE (HRE)GGAGCCCCGGATCT etc.of SV40 sequenceEpo×4人促红细胞生成素增强子的四聚体(位置为+3065/3089),(HRE？)标记的是一个与LDH共用的位点，LDH能够与一种可促进缺氧反应的组成型因子相结合，Wang and Semenza,1993。GATCTGCCCTACGTGCTGTCTCACACAGCCTGGCCCTACGTGCTGTCTCHRE (HRE？)HREACACAGCCTGGATCTGCCCTACGTGCTGTCTCACACAGCCTGGCCCTA(HRE？) HRE (HRE？)CGTGCTGTCTCACACAGCCTGGGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCHRE (HRE？)ATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGLDH
该序列来源于鼠乳酸脱氢酶A(-88/-40)，序列中含有一种同样与epo HRE相连的共有序列、一种HRE和一个CRE位点，可提高增强子的活性(Firth等，1995)。这里是天然取向。
注释在Firth等中，该序列的互补链为CCAGCGGACGTGCGGGAACCCACGTGTAGG(-50/-88)，书写方式为传统的5’-3’方向，并且HRE加有下划线。以斜体字突出显示的为一种附加的调节因子。GATCTCTACACGTGGGTTCCCGCACGTCCGCTGGGCTCCCACTCTGAC(HRE？) HRE CREGTCAGCGGGATCTGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATCGCTGACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGLDH×2除使用了两个拷贝的合成序列外，其余与上文相同。GATCTCTACACGTGGGTTCCCGCACGTCCGCTGGGCTCCCACTCTGAC(HRE？)HREGTCAGCGGATCTCTACACGTGGGTTCCCGCACGTCCGCTGGGCTCCCACRE(HRE？) HRECTCTGACGTCAGCGGGATC etc. of SV40 sequenceCRE细胞系MCF-7(ECACC)和HT1080(ECACC)细胞系培养于Dulbecco改进的Eagle’s培养基。T47D细胞系培养于RPMI1640培养基。所有培养基均加有10％(v/v)胎牛血清、2mM谷氨酰胺和2mM非必需氨基酸。进行瞬时测定时，培养基还需添加抗生素。所有组织培养基/溶液均购于Sigma(Dorset UK)。
萤光素酶测定通常是利用Gugene-6试剂(Boehringer Mannheim,East Sussex,UK)以0.21μl报告载体(购于Promega的pGL3系列载体)来转染接种于24孔培养皿的铺满度为60-80％的细胞。在需要时，也有将报告载体与1/50的基于Renilla的pRL-SV40载体(Promega)进行共转染以控制转染的效率。培育16小时(过夜)后(21％O2,5％CO2,74％N2)，或是将转染细胞于常规培养箱的含氧量正常条件下(21％O2,5％CO2,74％N2)再培养16小时，或是利用购于Heto(Surrey,UK)的多气种培养箱将其于缺氧条件下(0.1％O2/5％O2,5％CO2,74％N2)再培养16小时。
实施萤光素酶或β半乳糖苷酶化学发光报告测定时均采用Promega Dual-LuciferaseTM报告测定系统和Dynex公司(WestSussex)的MLX微量滴定板(r)发光计。所有报告测定均重复三次。
蛋白测定实施测定时均采用Biorad去污剂配伍蛋白测定试剂盒(BioRad,UK)及Dynex公司的MRX读板仪，读板时以牛血清白蛋白为标准样品。
结果萤光素酶测定使用的细胞为利用上文所述的一种构建体转染的T47D细胞，以比较不同构建体在含氧量正常和缺氧(0.1％O2)条件下的功能。结果以相对表达水平形式显示于图2a。所有这些序列均能够使最小化SV40启动子产生缺氧诱导的表达。但在缺氧条件下的诱导率和表达规模也有明显不同。在缺氧条件下，OBhre11构建体的相对表达水平是此前该领域最好的构建体(烯醇化酶×2)的2.5倍。PGK×3构建体(反式取向)也显示出很好的结果。
另外还利用萤光素酶测定法对OBhre11构建体相对于不含HRE因子的CMV及SV40强病毒启动子的表达水平进行了测量。结果显示于图2b，该结果说明OBhre11在正常氧张力情况下具有低基准活性，而在缺氧条件下可被强烈诱导且表达水平等于或大于CMV中早期启动子。还应指出的是，HRE因子可在含氧量正常条件下抑制下游SV40启动子的活性，其证据是，在含氧量正常条件下单独使用SV40启动子可产生明显的基础水平表达，而这种基础水平的表达在HRE/SV40构建体中显著降低。
根据已发表的有关HREs活化作用的数据，本发明的OBhre11序列具有意想不到的活化作用程度。因此，OBhre11启动子构建体可作为一种良好的候选构建体用来产生能够把NOIs递送至处于缺氧条件下的组织的载体。为了测试OBhre11启动子在病毒载体递送系统中的性质，可分离出Mlu1/Xba1片段形式的OBhre11 pGL3质粒(OB37)片段，该片段在萤光素酶编码序列上游含有上文所述的PGK三聚体/最小化SV40启动子。该片段可作为起始位点用于下文所述受控慢病毒及腺病毒载体的构建。
实施例2——OBhre11内含有转录因子HIF-1共有序列的PGK HRE可在巨噬细胞，一种不表达HIF-1的细胞，内引发缺氧介导的表达。
上文描述的所有HRE启动子均含有典型HRE与转录因子HIF-1结合所需的DNA基序。这是一种由HIF 1α和HIF 1β组成的异二聚体，它属于基本螺旋-环-螺旋(bHLH)/PAS结构域蛋白家族(该基因家族的最初成员有Period、ARNT和SIM)。HIF 1α最初被鉴定为一种能够在肝细胞瘤细胞中与促红细胞生成素基因的HRE结合的蛋白(Wang等，1995)，但后来发现它可参与对其它在大多数细胞中由缺氧调节的基因家族的调节。
巨噬细胞能够侵润肿瘤，并且可达到在肿瘤总质量中占有相当比例的程度。特别是巨噬细胞可在坏死区域聚集，并由此导致缺氧。在以缺氧为特征的其它局部缺血性疾病中，如RA和心血管疾病，也会出现明显的巨噬细胞侵润现象。
因此，巨噬细胞可被用来将基因递送到与治疗有关的区域，并且它还会特别定向于缺氧区域。所以，该细胞介导的递送系统内的对治疗基因的缺氧调控可提高治疗的目的性及治疗指数。
由于在文献中未见到有关初级人巨噬细胞可通过HIF途径对缺氧产生反应的资料，因此，重要的是需证实巨噬细胞可对缺氧产生反应，并且含有可通过对HRE的调控来驱动基因表达的调节系统。所以，我们通过实验评定了巨噬细胞是否含有HIF蛋白，以及如果含有该蛋白，那么这些转录因子是否能在缺氧条件下被诱导。此外，我们还评定了受HRE调控的基因是否能在巨噬细胞环境中对缺氧产生反应。
材料与方法制备巨噬细胞裂解物用于蛋白印记测定将7天龄巨噬细胞以3×105细胞/孔的密度铺在Primera 24孔塑料平板上并培养至相互粘连。然后在37℃下将细胞暴露于0.1％O2、5％CO2(缺氧)或21％O2,5％CO2，时间为16小时。取出平板，立即把细胞置SDS缓冲液(2％SDS、10％甘油、0.0625 M Tris-HClpH6.8、5％β-巯基乙醇)中裂解并于99℃下加热5分钟。在进行蛋白电泳和蛋白印记(如Weisener等，1998)前将裂解物保存于-70℃。蛋白印记的探测使用抗HIF-1抗体和抗相关因子EPAS-1的抗体。
结果我们惊奇地发现，利用蛋白印记方法无法在巨噬细胞中检测到HIF-1蛋白，甚至在缺氧条件下也是如此，而把这些细胞置于缺氧条件下时，OBHRE启动子(PGK)仍可被激活(图3)。我们通过蛋白印记测定还发现，巨噬细胞表达的一种称为EPAS-1(内皮PAS结构域蛋白)或HRE(HIF相关因子)的bHLH/PAS家族相关因子(Ema等，1997；Flamme等，1997；Tian等，1997)。EPAS-1与HIF-1似乎可结合相同的共有序列(定义为HRE)，这一点与这两种蛋白的DNA结合区的保守性预测结果相同。而已发表的资料显示EPAS表达仅局限于内皮细胞，这是首次在非上皮细胞中发现了EPAS。
因此，OBhre11在巨噬细胞中的诱导主要或完全由EPAS-1介导，同时也可作为一种EPAS反应性增强子。所以，可利用OBhre11来驱动不表达HIF1但表达EPAS的细胞的表达。
实施例3——MLV逆转录病毒启动子中的来源于PGK的增强子序列把PGK HRE三聚体构建在MLV逆转录病毒核心启动子的上游，以此来进一步确定PGK HRE三聚体在其它强病毒启动子中的特性。除评定该HRE在其它核心启动子内的广泛应用之外，还预测了被进一步构建到基于MLV基因组的逆转录病毒载体系统中的HRE的特性。该实验是把PGK HRE三聚体以正(天然)取向加入MLV逆转录病毒启动子中。该构建体除HRE位于Moloney MLV逆转录病毒启动子而不是SV40启动子的上游之外，其余与OBhre11相同。显示的序列终止于转录起始位点(序列编号4)。MLV序列则以斜体字显示。AGCTAGCCTAGCGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGG也可将PGK HRE三聚体以反式取向加入上述MLV逆转录病毒启动子中。显示的序列终止于转录起始位点(序列编号5)。AAGCTAGCTGTCACGTCCTGCACGACACTAGATGTCACGTCCTGCACGACACTAGATGTCACGTCCTGCACGACTCTAGAGAACCATCAGATGTTTCCAGGGTGCCCCAAGGACCTGAAATGACCCTGTGCCTTATTTGAACTAACCAATCAGTTCGCTTCTCGCTTCTGTTCGCGCGCTTCTGCTCCCCGAGCTCAATAAAAGAGCCCACAACCCCTCACTCGG这两种新型构建体均利用实施例1所述的萤光素酶测定法进行了测试，结果显示其在缺氧条件下的诱导水平要高2个数量级。因此，这些结果说明可以用MoMLV启动子替代SV40启动子，并且实施例1中由SV40启动子获得结果，即PGK HREs在相对于启动子元件的两种取向情况下均可正常发挥功能，在此得到了证实。
实施例4——受缺氧调控的逆转录病毒载体的构建我们构建了基于MLV的逆转录病毒载体，以测试处于逆转录病毒载体递送系统内的本发明所述HRE/启动子构建体。
HRE逆转录病毒载体质粒的构建用Nhe1切下pLNSX质粒(A D Miller,Fred Hutchinson CancerCenterMiller and Rosman,1989；Genbank登录号M28246)的5’和3’LTR并重新连接，以去除该质粒的逆转录病毒基因组。将所得质粒pLNhe用Nhe1和Xba1酶切以去除3’LTR中包含有逆转录病毒增强子的267bp片段，再与含有磷酸甘油酸激酶(PGK)缺氧反应元件三聚体的72bp寡聚物连接，从而产生pLNheHRE。将质粒pMOI(Kim等，1998)用Nhe1酶切并将所得逆转录病毒基因组与pLNheHRE连接，从而创建出pMOIHRE质粒。将定位于核的LacZ以Stu1-Xhol片段形式连接于pMOIHRE的IRES 3’端，从而创建出pHRE。lacZ序列的制备采用PCR方法，设计的PCR引物使LacZ基因的5’端被修饰，即添加了SV40大T抗原的核定位信号，氨基酸序列为MGTAPKKKRKV。
pMUTHRE是pHRE的一种变体，其构建时插入的是一种72bp的突变PGK寡聚物，该寡聚物在HIF1结合位点内含有一个点突变(见下文)。另外还构建了一种作为阳性对照的类似质粒pLTR，该质粒含有完整的3’LTR。此外还利用萤光素酶报告基因替代LacZ构建了一组类似的质粒。
β-半乳糖苷酶化学发光报告测定实施这些测定时均采用Tropix Galacton-Plus(r)报告测定系统和Dynex公司(West Sussex)的MLX微量滴定板(r)发光计。所有报告测定均重复三次。
蛋白测定实施这些测定时均采用Biorad去污剂配伍蛋白测定试剂盒(BioRad,UK)及Dynex公司的MRX读板仪，读板时以牛血清白蛋白为标准样品。
瞬时重组逆转录病毒产物重组逆转录病毒载体的产生均使用前人所述的三质粒表达系统(Soneoka等，1995)并有少量修改用16μg上述基因组质粒与16μg gag-pol质粒pHIT60(Soneoka等，1995)及8μg VSV-G/env质粒(Kim等，1998)对培养于10cm培养皿且铺满度为70％的293T细胞进行共转染。在约6小时后去除培养基。再36小时后收集病毒上清并用0.45μm滤膜过滤。
利用D17细胞测量逆转录病毒的滴度。转导的前一天将该细胞铺在12孔培养皿上，密度为6×104。将含有8μg/ml聚凝胺(Sigma)的上清(原储液经适当稀释后取1ml)加到每个孔中。如上文所述在含氧量正常或缺氧条件下培养24小时后，通过X-gal染色及β半乳糖苷酶阳性细胞计数来测量病毒的滴度。
结果由这些受缺氧调控的基于MLV的逆转录病毒获得的结果表明，合并的稳定转导体显示出惊人的调节程度，病毒滴度提高了两个数量级以上，并且在缺氧条件下显示出40倍的报告基因诱导活性(见图4和图5)。
实施例5——在两侧复制和产生HREs可加强缺氧反应已知插入到逆转录病毒载体3’LTR区域内的序列可在该病毒整合到宿主基因组内时进行复制。我们制备了一系列可模拟原病毒基因组的逆转录病毒载体质粒，以确定实施例5中由MLV逆转录病毒构建体获得的惊人结果是否与插入到3’LTR中的HRE序列的复制有关。将5’和3’位置的HRE依次突变并置于用来进行瞬时转染测定的瞬时报告系统中加以分析。
构建一系列载体并用来分析连接于MoMLV启动子的HRE在瞬时测定中的活性。以Nhe1-SmR1片段形式取出pLNheHRE中的HRE及MoMLV启动子，再将其插入pGL3基本质粒(Promega)的MCS中，从而产生pGLHRE和pGLMUT。分别以pGL3启动子和pGL调控系列作为阴性和阳性对照。
p5’HRE3’MUT、p5’MUT3’HRE、p5’MUT3’MUT及p5’HRE3’HRE质粒的构建方法是用Sac1消化pGLHRE和pGLMUT，并将所得逆转录病毒基因组连接于经相同酶切的线性pLNheHRE。
所示数据(图6)清除地表明，5’和3’HRE均可参与转录调控，并且实施例5获得的惊人结果是由5’和3’HRE序列之间的协同效应所导致。因此，我们利用MLV逆转录病毒载体系统证明了HRE序列的复制可通过协同方式加强对缺氧的转录应答。将HRE构建到3’LTR内的策略能够使增强子在转导细胞内的逆转录过程中进行复制，从而使原病毒基因组同样在两侧都具有HREs。因此，逆转录病毒系统中的这种复制很可能就是对缺氧的强转录应答的基础。所以，在缺氧调控基因递送系统中使用逆转录病毒具有重要的优势。
逆转录病毒生物学可提供一些策略用来优化对其它递送系统的调控。例如，若需递送非病毒基因，则可模拟逆转录病毒的原病毒基因组结构来构建两侧均带有增强子的质粒载体。
必须指出的是，由这些数据可外推出其它可能具有类似协同作用的非HRE增强子系统。
实施例6——受缺氧调控的含NOIs逆转录病毒载体的构建RRVs的构建可使用诸如FLYRD18(Cosset等，1995)等包装细胞系系统。按其所述(Cosset等，1995)将含有待包装载体基因组的质粒载体转染到包装细胞内，以获得生成细胞系。含有载体基因组的适当质粒为pHIT111(Soneoka等，1995)。利用常规分子生物学技术将所需NOI插入到pHIT111的LacZ基因内。也可类似地将HRE调控因子引入pHIT111的逆转录病毒LTR内以替代逆转录病毒增强子，以此来确保NOI的表达受缺氧调控。然后将该质粒与带有适用于FLYRD18细胞的可选标记(如pSV2neo；Genbank登录号U02434)的NOI一同进行共转染，在培养于1mg/ml G418(Sigma)的细胞中挑选被转染的细胞。
含有HRE的适当增强子可包含三个来源于PGK基因的HRE拷贝(Firth等，1994)。下文显示的是一个实例WT PGK18+++(序列编号6)。下文还给出MUT PGK18+++作为对照，这是一种含有突变HRE且不受缺氧调控的序列。将下文所示的合成寡核苷酸插入到pHIT1113’LTR的Nhe1与Xba1位点之间，以产生一种其所含基因在靶细胞中的表达可受缺氧调控的逆转录病毒载体。图7显示的pKAHRE是以相同方式构建的可选逆转录病毒载体。WT PGK18+++ (SEQ ID. No.6)5′ CTA GCT GTC ACG TCC TGC ACG ACA CTA GAT GTC ACG TCC TGC(Nhe1)GA CAG TGC AGG ACG TGC TGT GAT CTA CAG TGC AGG ACGACG ACA CTA GAT GTC ACG TCC TGC ACG ACTTGC TGT GAT CTA CAG TGC AGG ACG TGC TGA GATC 3′(Xba1)MT PGK18+++5′ CTA GCT GTC CAT TCC TGC ACG ACA CTA GAT GTC CAT TCC TGC(Nhe1) GA CAG GTA AGG ACG TGC TGT GAT CTA CAG GTA AGG ACGACG ACA CTA GAT GTC CAT TCC TGC ACG ACTTGC TGT GAT CTA CAG GTA AGG ACG TGC TGA GATC 3′(Xba1)XiaGen-P450是根据上述原则构建的另一种构建体(见图8)。该载体包含的治疗性基因为能够激活抗癌复合物环磷酰胺的人细胞色素P450的基因。也可使用上文列举的其它任何治疗性基因。XiaGen-P450还包含一种编码绿色荧光蛋白的报告基因，以及一种编码新霉素抗性的可选基因。
CYP2B6基因是如下所述通过对来源于人肝细胞的mRNA进行PCR扩增而获得。
利用寡聚-dT引物经反转录由购得的肝总RNA(Clontech)获得含有P450 CYP2B6编码区的单链cDNA。利用P450F引物(序列CAGACC ATG GAA CTC AGC GT)和P450R引物(序列GGA CAC TGA ATGACC CTG GA)经PCR扩增出相应的双链cDNA片段。由于肝RNA制品中的CYP2B6 mRNA丰度较低，所以用第一次PCR的产物进行了第二轮PCR，正链与负链使用的寡核苷酸引物分别为P450FOR(序列TCA TGCTAG CGG ATC CAC CAT GGA ACT CAG CGT C)和P450REV(序列AAAATC ACA CTC TAG ATT CCC TCA GCC CCT TCA GC)。
利用购于Invitrogen的TOPO TA克隆试剂盒将PCR扩增产生的cDNA克隆到pCRⅡ-TOPO载体中。其克隆的位置如实施例4所述，位于pHRE内的IRES序列的上游。通过与已确定序列(Yamano等，1989Genbank登录号M29874)的比较而验证了基因序列的正确性。
实施例7——组织局限型缺氧反应性启动子的构建为了使用本发明的缺氧调控表达系统对NOIs的表达实施进一步的调控，可将组织特异性调节序列可操作地连接于HRE/启动子序列。因此，我们构建并测试了一些构建体，这些构建体除可进行缺氧调控的表达之外，还可将NOI的表达局限于已分化为粒细胞/单核细胞谱系的细胞。通过使用对单核细胞/巨噬细胞谱系具有特异性或在该谱系中可被增量调节的启动子，即可将治疗性基因的表达局限于这些类型的细胞。用于此用途的适当启动子包括，含有能够与诸如PU1等骨髓特异性转录因子结合的共有序列的那些启动子，或含有能够与CEBP-β(NF IL 6)等在分化成巨噬细胞过程中受增量调节的转录因子结合的共有序列的那些启动子(见Clarke and Gordon 1998)。
使用的构建体有两种。第一种含有巨噬细胞的细胞调控序列。第二种含有HIV调控序列。
a)细胞启动子分两部分合成一种含有M CSF受体启动子内的组织特异性调控因子(Zhang等，1994)的寡核苷酸，该寡核苷酸的两侧具有用于克隆到pGL3基本质粒(Promega)中的HindⅢ/Nco1位点，然后通过萤光素酶报告测定加以分析。标明的位点为转录因子结合位点。AGCTTCCTGCCCCAGACTGCGACCCCTCCCTCTTGGGTTCAAGGCTTTGTTTTCTTSP1CTTAAAGACCCAAGATTTCCAAACTCTGTGGTTGCCTTGCCTAGCTAAAAGGGGAACEBP？ PEBP2/CBF PU.1GAAGAGGATCAGCCCAAGGAGGACb)HIV启动子HIV的转录调控序列位于LTR内，该序列在ATATAA框上游通常含有两个NFkβ位点和三个SP1位点(Koong等，1994)。
对HIV LTR序列进行Entrez核苷酸数据库搜索，并对其进行上述基序的完整性分析。提交的U63538(Zacharova等，1997)描述了一种分离序列，该序列具有很保守的二NFkβ位点与三SP1位点基序。但我们发现，这种特殊的分离序列还含有用于结合NF-IL6(C/EBPβ)的共有序列。如上文所述，已知该转录因子在巨噬细胞中可具有活性。
分两部分合成含有Genbank登录号U63538的第279-447位序列的寡核苷酸。为便于克隆，合成的这些寡核苷酸均带有Nhe1/Sma1末端。将退火并连接的寡核苷酸克隆到OB37内。最终的结构如下(序列编号7)。
XiaMac序列GCTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAHRE HRETCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAGCTAGCATTCCATCACGTGGCCCGHRE NF-IL6AGAGAAGCATCCGGAGTACTACAAGGACTGCTGACAGCGAGATTTCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGTGTGGCCTGGGCGNFkβ NFkβ Sp1 Sp1GGACTGGGGAGTGGCGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCAGCTGCTTSp1TTGCCCC因此，我们构建了一种新型的合成启动子(XiaMac)，该启动子不但能够对缺氧产生HRE介导的应答，而且具有组织特异性(巨噬细胞)。
如图9所示，当在非巨噬细胞，如乳癌细胞，中测试时，XiaMac启动子完全不具有活性。但如果该细胞缺氧，则可观察到活性(阴性对照为只含pGL3启动子，CMV对照为不含HREs的CMV启动子)。相比之下，该启动子在巨噬细胞中具有活性，而缺氧可使其活性急剧增加。如果将HRE灭活，则XiaMac启动子不再对缺氧产生应答(图10)。
实施例8——受抑制的巨噬细胞特异性启动子的构建为了将表达进一步局限于处在规定条件下的特定细胞，如巨噬细胞，还可将其它序列加入本发明的HRE增强子/启动子序列内。其实例为IRF系统(Taniguchi等，1995；Kuhl等，1987)。此时使用的是能够结合IRF1与IRF2转录因子的干扰素反应因子(IRF)。巨噬细胞中的IRF2与该IRE在结构上相连接，并且不具有激活转录的能力。干扰素可激活IRF1的表达，继而IRF1可与IRF2竞争。因此，能够激活转录的IRF1可逆转IRF2的表达。IRF1也可诱导IRF2的表达，从而可通过“自我关闭作用”限制转录的活性。在缺乏IRF1活化作用的情况下，IRE四聚体的存在可阻断SV40启动子的功能。我们发现，在HRE下游与ATATAA(即SV40启动子中类似TATA框的元件)5’端之间加入该四聚体序列即可在缺乏干扰素活化作用的情况下进行表达。
如下所述将该IRE克隆到XiaMac启动子中设计的寡核苷酸含有如下的IRE位点四聚体及BanⅡ粘性末端C(AAGTGA)4GAGCC。
在XiaMac启动子的最后一个SP1位点3’端及TATAA上游15bp处具有一个BanⅡ位点。将IRE因子插入于该位点即产生一种受抑制的启动子(XiaMac-IRE(序列编号8))，该启动子只有当干扰素存在并且缺氧时才会具有活性。
XiaMac-IRE序列GCTAGAGTCGTGCAGGACGTGACATCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAHRE HRETCTAGTGTCGTGCAGGACGTGACAGCTAGCATTCCATCACGTGGCCCGHRE NF-IL6AGAGAAGCATCCGGAGTACTACAAGGACTGCTGACAGCGAGATTTCTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGTGTGGCCTGGGCGNFkβ NFkβ Sp1 Sp1GGACTGGGGAGTGGC AAGTGAAAGTGAAAGTGAAAGTGASp1 IRE IRE IRE IREGAGCCCTCAGATGCTGCATATAAGCAGCAGCTGCTTTTGCCCC实施例9——受缺氧调控的慢病毒载体的构建慢病毒载体与传统的基于MLV的逆转录病毒载体相比具有明显的优势，因为该载体可将基因传送给非分裂细胞和缓慢分裂细胞。
上文实施例5和6所示数据表明，受缺氧调控的载体的最佳结构是在5’及3’LTRs内含有双重的HRE。这导致我们设计出单转录单位形式的受控慢病毒载体。
材料与方法质粒构建将缺氧反应性启动子构建到慢病毒载体pEGASUS-1(即pEGASUS-4(+)--图11a)和相关载体pONY2.1(图11b)中。这两种载体均来源于传染性原病毒EIAV克隆pSPEIAV19(Payne等，1998；登录号U01866)。载体的构建如下所述(引自U.K.专利号9727135.7)。
pONY2.1
将EIAV 5’LTR插入到pBluescript Ⅱ KS+(Stratagene)中即构建出pONY1质粒。EIAV 5’LTR是利用pfu聚合酶经PCR由pSPEIAV19扩增而来，使用的引物如下--5’GCA TGG ACC TGT GGGGTT TTT ATG AGG以及3’GCA TGA GCT CTG TAG GAT CTC GAA CAG AC。将扩增产物的5’突出端补平以形成钝末端，然后插入到经BssHⅡ酶切并利用T4 DNA聚合酶将3’突出端切除的钝末端pBluescript ⅡKS+中。该构建体称为pONY1，其取向相对于pBluescript Ⅱ KS+的β-半乳糖苷酶为5’-3’。pONY1的测序结果显示没有突变。
将pSPEIAV19的env区以HindⅢ/HindⅢ片段形式删除，即产生pSPEIAV19ΔH。然后将pSPEIAV19ΔH的MluⅠ/MluⅠ(216/8124)片段插入到经MluⅠ酶切的pONY1中，这样就在pBluescript Ⅱ KS+中创建了一种野生型原病毒克隆(pONY2ΔH)。用BssHⅡ将pBluescript Ⅱ KS+消化(619/792)以获得多克隆位点。将多克隆位点的5’突出端补平以形成钝末端，然后连接于经BglⅡ和NcoⅠ酶切(1901/4949--在pol内)并将5’突出端补平的钝末端pONY2ΔH。其取向相对于EIAV序列为5’-3’。该构建体称为pONY2.1。
将pLNCX(Genbank登录号M28246)(PstⅠ/HindⅢ)插入pSP72(Promega；Genbank登录号X65332)中即产生pSPCMV。将来源于pTIN414(Cannon等，1996)的β-半乳糖苷酶基因插入到pSPCMV中(XhoⅠ/SphⅠ)即产生pSPlacZ。将β-半乳糖苷酶基因的5’端用来源于pAD.RSVbgal的SV40 T抗原核定位信号(Stratford-Perricaudet等，1992)取代即产生pSPnlslacZ(XhoⅠ/ClaⅠ)。用PstⅠ切出pSPlacZ和pSPnlslacZ的CMV核定位β-半乳糖苷酶及非核定位β-半乳糖苷酶，并将其以相对于EIAV的5’-3’方向插入于pONY2.1的PstⅠ位点。这些构建体称为pONY2.1nlslacZ和pONY2.11acZ(图11b)。
pEGASUS-1这是一种基于EIAV的载体，该载体仅含有EIAV序列的759 nt(268nt-675nt及7942nt-8292nt)。通过PCR由pONY2.1扩增出含有EIAV多聚嘌呤区(PPT)和3’LTR的序列，所用引物为PPTEIAV+(Y8198):GACTACGACTAGTGTATGTTTAGAAAAACAAGG和3’NEGSpeⅠ(Y8199):CTAGGCTACTAGTACTGTAGGATCTCGAACAG。将产物纯化，用SpeⅠ消化，再与经SpeⅠ消化及碱性磷酸酶处理的pBS Ⅱ KS+相连接。将其转化到大肠杆菌XL-1B1ue中，然后筛选出含有3’LTR且其方向使3’LTR的U5区最接近pBS Ⅱ KS+衔接序列NotⅠ位点的菌落。将克隆的插入序列测序，结果显示该序列与EIAV克隆pSPEIAV19相比仅有一处改变。即在R区的第3和第4位碱基之间插入了一个“C”。在用于PCR反应的模板中也发现了相同的变化。该克隆称为pBS.3’LTR。
然后将一种报告基因表达盒，CMV启动子/LacZ，插入于pBS.3’LTR的PstⅠ位点。CMV/LacZ表达盒是以PstⅠ片段形式由pONY2.1获得。将上述片段连接后的反应物转化到大肠杆菌XL-1Blue中。挑选出CMV/LacZ的插入取向能够使LacZ基因最接近3’LTR的多个克隆，利用常规方法将CMV/LacZ表达盒转染到293T细胞系以评定其活性。选出能够使细胞在转染48小时后经X-gal显色而呈蓝色的克隆，该克隆称为pBS CMVLacZ.3’LTR并用于进一步使用。
将EIAV载体的5’区域构建到表达载体pCI-Eneo中，pCI-Eneo是在pCI-Neo(Promega；Genbank登录号U47120)中加入来源于上述完整CMV启动子的5’端约400个碱基对后所得的衍生物。这400个碱基对的片段是通过PCR扩增而获得，使用的引物为VSAT1(GGGCTATATGAGATCTTGAATAATAAAATGTGT)和VSAT2(TATTAATAACTAGT)，模板为pHIT60(Soneoka等，1995)。用BglⅡ和SpeⅠ将产物消化，并连接到已进行类似消化的pCI-Neo中。
利用引物CMV5’EIAV2(GCTACGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGGGCACTCAGATT CTG〔加下划线的序列可与EIAV的R区退火〕)和3’PSI.NEG(GCTGAGCTCTAGAGTCCT TTTCTTTTACAAAGTTGG)并以pSPEIAV19为DNA模板扩增从R区直至gag编码区第150nt的EIAV基因组片段(第268-675nt)。CMV5’EIAV2引物的5’区含有直接位于CMV启动子转录起始位点上游并可被SacⅠ酶切的序列(黑体字)。3’PSI.NEG可结合由缺失分析确定的EIAV包装序列的3’端，并含有一个XbaⅠ位点。
PCR产物用SacⅠ及XbaⅠ酶切，并连接到经相同酶切的pCI-Eneo中。该操作使EIAV的R区开始于CMV启动子的转录起始位点处，从而使产生的转录体真正开始于EIAV的起始位置并延伸到包装信号的3’端旁。由限制酶切分析评定出的可能正确的克隆，然后进行测序。选出正确克隆用于进一步的工作，该克隆称为pCI-Eneo.5’EIAV。
下一步将pBS.CMVLacZ.3’LTR中的CMVLacZ及3’LTR表达盒引入pCI-Eneo.5’EIAV。用ApaⅠ消化pBS.CMVLacZ.3’LTR，并利用T4DNA聚合酶切除3’突出端，然后用NotⅠ消化。利用常规分子生物学技术纯化含有CMVLacZ.3’LTR的片段。用于连接该片段的载体的制备方法是用SalⅠ消化pCIEneo.5’EIAV，并利用T4 DNA聚合酶将5’突出端补平。然后用NotⅠ消化该DNA，纯化后即可用于连接反应。转化到大肠杆菌XL-1Blue中后，筛选出含有插入序列的菌落，并利用限制酶切分析鉴定出所需的克隆，该克隆称为pEGASUA-1(见图11a，该图实际显示的是pEGASUS-4(+)，它的EIAV RRE紧接在EIAV R-U5-psi区域的下游，属于pEGASUA-1的一种变型--细节见下文)。
pEGASUS-4(+)为了增加滴度，可通过引入额外元件来进一步改进EIAV载体pEGASUA-1。SalⅠ位点是引入此类元件的理想位点，该位点处于XbaⅠ及包装信号3’端之间，并且在pEGASUA-1的CMV/LacZ上游。例如，可将来源于EIAV的RRE插入于该位点。
通过PCR扩增获得上述EIAV RRE的方法如下。以pONY2.10LacZ为模板进行两次扩增以获得EIAV RRE的两个部分。5’端元件采用ERRE1引物(TTCTGTCGACGAATCCCAGG GGGAATCTCAAC)和ERRE2引物(GTCACCTTCCAGAGGGCCCTGGCTAAGCATAACA G)，3’端元件采用ERRE3引物(CTGTTATGCTTAGCCAGGGCCCTCTGGAAGGTGAC)和ERRE4引物(AATTGCTGACCCCCAAAATAGCCATAAG)。这些产物可彼此间退火，因而可用于第二次PCR反应以获得可“编码”EIAV RRE的DNA。第二次PCR扩增的前10个循环不加ERRE1及ERRE4引物，然后在反应中加入这些引物并再进行10个循环的扩增。所得PCR产物与pEGASUA-1经SalⅠ消化后连接，再转化到大肠杆菌XL-1Blue中。选出含有正取向或反取向的克隆用于进一步的工作。这些载体质粒称为pEGASUS-4(+)(见图11a)和pEGASUS-4(-)。
pONY HRE 1uc/1ac将pONY2.1中的CMV启动子以XbaⅠ/AscⅠ片段形式切除，并用一种含有MluⅠ/XbaⅠ位点的寡核苷酸取代。这样就可以插入由OB37(图1)分离的MluⅠ/XbaⅠ片段以产生pONY HRE 1uc/1ac(图11c)。以NcoⅠ片段形式切除萤光素酶编码序列，然后将主要部分重新连接以产生pONY HRElac。与此类似，以XbaⅠ/SalⅠ片段形式切除lacZ编码序列，然后将主要部分重新连接以产生pONY HREluc。
pEGHRELacZ/luc用EcoRⅠ切除EIAV载体质粒pEGASUS-1中的CMV启动子lacZ表达盒，并用一种含有一个SacⅠ位点及一个Bsu36位点的合成寡核苷酸取代。这样就可分别以SacⅠ/Bsu36片段及SacⅠ/EcoRⅠ片段形式克隆出pONY HREluc和pONY HRElac中的HRE luc/HRE lac。最终的载体称为pEG-HRE-lacZ(显示于图11d)和pEG-HRE-luc。
利用相同方法可构建出用治疗性基因，如上文列出的任何治疗性基因，替代1acZ或Luc基因来加以表达的pEGHRE载体。将这些基因克隆到pEGHRE载体中的方法是分别用SacⅠ/Bsu36和SacⅠ/EcoRⅠ切除pEG-HRE-lacZ或pEG-HRE-luc中的1acZ/luc片段，接入含有编码序列的适当片段。可使用的治疗性基因的实例为编码抗血管生成因子凝血栓蛋白的基因(Genbank登录号X04665)。
利用可由pEGHRE质粒产生病毒颗粒的细胞进行萤光素酶及β-半乳糖苷酶测定在瞬时三质粒系统(Soneoka等，1995)中产生含有pEGHRE基因组的病毒颗粒。转染48小时后收集组织培养液，并经0.45μm滤膜过滤。在含有8mg/ml聚凝胺的培养基中稀释10倍，取500μl试样滴加到培养于平行板的犬骨肉瘤细胞上，细胞是在前一天以0.8×105/孔的浓度接种于12孔板。将被转导的细胞分离，并在在含氧量正常(21％O2)或缺氧(0.1％O2)条件下培养过夜。
利用X-gal组织化学方法(MacGregor等，1991)将表达lacZ的病毒转导的细胞染色，并计算终点滴度。滴度可作为β-半乳糖苷酶基因表达的一种度量手段，它能够反映处于含氧量正常及缺氧条件下的细胞群体之间的基因表达变化。由表达luc的病毒转导的细胞则测试其萤光素酶的活性。
结果实验结果显示，亲本“pEGASUS-1”载体(含有CMV lacZ转录定位)的滴度在缺氧条件下没有明显的变化，而受控载体pEG-HRE-1acZ的滴度经诱导至少提高了100倍(图12)。pEG-HRE-luc转导的细胞的萤光素酶活性在缺氧条件下可提高12倍(图13)。这些数据表明，我们首次在慢病毒载体中实现了高效的缺氧调控。
实施例10——受缺氧调控的慢病毒单转录单位载体的构建可用于本发明的一种替代EIAV载体是由单转录单位表达出治疗性基因与标记基因。对SIN载体及含有内部转录单位的载体而言，单转录单位的载体通常为优选的，因为它在载体产生方面具有优势。这些优势为，SIN载体必须通过转染被引入到生产细胞中，而不能使用转导方法，这样通常会降低可获得的高产率克隆的数量。另外还发现，含有内部转录单位的载体其产率通常低于单转录单位载体。此外，如上文所述，可通过在单转录单位载体中实现HRE复制来优化缺氧调控。受缺氧载体调控的单转录单位慢病毒载体如下载体构建利用PCR方法由pIRES-1hyg(Clontech)产生IRES并在两侧引入限制位点，使其能够进行随后的克隆；ST1(先导链)-ATCGCTCGAGCTGCAGGGCCGCACTAGAGGAATTCGCST2(互补链)-GGTTGTGGCCCATGGTATCATCGTGTTTTTCAAAGG这样可产生一种XhoⅠ IRES NcoⅠ表达盒。然后把该表达盒克隆到pSPlacZ(见实施例9)的lacZ上游，使NcoⅠ位点刚好与lacZ的ATG起始密码子重合(pSPIRESlacZ)。分离出PstⅠ/Bst1107片段形式的IRES lacZ表达盒，并用其替代pPEGASUS4(+)的CMVlacZ表达盒(以sse8387/Bst1107片段形式切除)。该质粒称为pEG4+IRESZ。
通过重叠PCR方法用HRE替代3’LTR中的一部分EIAV U3增强子区域(见图14)。还可构建一种其U3区域主要来源于诸如上文所述的任何逆转录病毒或慢病毒或其它杂合启动子的类似载体。其限制仅为，需保留亲本载体的末端核苷酸以确保与慢病毒整合酶的相容性，并且两个R区需同源以便能够进行有效的逆转录。这种杂合LTR的典型结构在WO-A-96/33623和WO-A-98/17816中有详细描述。该载体的最终结构显示于图15。
实施例11——自我调节的缺氧反应性慢病毒载体的构建此前已证明，HIF-1α的过表达可加强多种缺氧调节启动子的表达。已知该蛋白在正常细胞中不稳定，但可利用过表达来避开这一点。因此，这种过表达会损害缺氧反应的特异性。OBHRE启动子可对E-PAS产生反应，这为加强缺氧反应性开辟了一条新途径。为了避免HIF-1的组成型表达问题，我们把E-PAS基因构建到本身可对缺氧产生反应的慢病毒载体中。这样可通过缺氧来激活载体表达E-PAS基因，继而E-PAS蛋白可进一步作用于HRE以加强表达。已知HIF-1在含氧量一旦恢复正常时不稳定，因此该载体系统的优势在于可提供较长时间的对缺氧的反应。HRE与HIF-1或E-PAS的相互作用使载体的最初起动具有特异性。而E-PAS的产生能够使表达在最初缺氧刺激停止后得以维持。最终该反应将根据E-PAS蛋白的半衰期而衰减。
可表达E-PAS和lacZ的自我调节载体显示于图16。利用由其已知cDNA序列(登录号U81984；Tian等，1997)确定的引物经PCR扩增获得E-PAS编码序列，然后克隆到EMCV IRES下游。然后将所得IRES EPAS1表达盒插入到实施例10及图15所述的IRES lacZ表达盒的下游。
该方法并不局限于慢病毒系统，它可用于该专利申请提及的任何由HRE调控的病毒性及非病毒性NOI递送系统。
实施例12——用于表达治疗性基因的缺氧反应性腺病毒载体的构建可广泛用来将基因递送至细胞的另一种病毒载体系统为基于腺病毒的系统。腺病毒可侵染众多类型的细胞，其中包括非分裂细胞，并且还可生长至高滴度。腺病毒不整合到宿主细胞基因组中，因而一般仅适用于短期基因递送。但在某些情况下，瞬时基因治疗是一种更适当的方法。
详细地说，腺病毒利于用来侵染干细胞，从而可用于基因治疗。当干细胞的后代分化并迁移至靶组织时，仍能够在不分裂且不分化的情况下递送治疗性基因。由于腺病毒不整合到细胞基因组中，因而当干细胞分裂时，载体将逐步从细胞群体中消失。但已分化成不同谱系的后代细胞中仍明显含有载体。因此，含有腺病毒的干细胞仍可分化成已分化细胞群体，这些腺病毒不会对其进行永久性修饰。
第一代重组腺病毒载体(E1/E3缺失)的构建需能够使细菌β-半乳糖苷酶报告基因处于缺氧调节启动子的控制之下。
第一代腺病毒载体的病毒E1区和E3区缺失，从而可插入外源DNA，通常是插入到病毒左臂邻近左反向末端重复(ITR)的位置。病毒包装信号(194-358nt)与E1a增强子重叠，因而存在于大多数E1缺失的载体中。该序列可易位到病毒基因组的右端(Hearing andShenk,1983)。因此，在E1缺失的载体中有3.2kb(358-3525nt)可以删除。
腺病毒可包装相当于基因组长度105％的序列，从而还可额外加入2.1kb。因此，在E1/E3缺失的载体中，克隆容量为7-8kb(2.1kb+1.9kb(去除E3)+3.2kb(去除E1))。由于重组腺病毒缺乏必需的E1早期基因，所以它不能在非E1补充型细胞系中复制。已由Graham等(1977)开发出的补充型293细胞系含有来源于Ad5基因组左端的约4kb序列，其中包括ITR、包装信号、E1a、E1b和pⅨ。该细胞可稳定表达E1a及E1b基因产物，但不表达晚期蛋白Ⅸ，尽管它在E1b内含有pⅨ序列。
在非补充型细胞中，E1缺失病毒可转导该细胞，并可被运输到细胞核内，但E1缺失的基因组不进行表达。
一般策略是将外源DNA克隆到一种E1穿梭载体中，并用该外源DNA表达盒替代该载体第402-3328bp的E1区。然后将重组质粒与pJM17质粒(Microbix Biosystems Ins.(Ontario,Canada))共转染到293细胞内。
pJM17可用来构建在早期蛋白区域1(E1)内含有插入序列/突变的腺病毒5型载体。pJM17的E3区缺失，另外在E1区的3.7图单位处含有一段来源于原核pBR322载体的插入序列pBRX(包括氨苄青霉素抗性和细菌ori序列)。因此，这种40kb的质粒因过大而不能被包装到腺病毒核壳体中，但它可在细菌内繁殖。293细胞的胞内重组可导致Ampr及ori序列被外源DNA插入序列所替代。
在以下实例中使用了两种转运载体。第一种购于Microbix，称为pE1sp1A，第二种购于Quantum Biotechnologies，称为pAdBN。pAdBN的优势在于可将新(外源)DNA以任何一种方向插入。这样就能够使插入序列与剩余腺病毒基因的空间关系有所不同，有时这会对表达产生相反的影响。在这两种情况下，第二种DNA均为腺病毒基因组的缺损形式，它可以是一种质粒如pJM17，也可以是病毒DNA的一部分如所谓的Ad5右臂。通过同源重组即可产生最终的基因转运载体。
缺氧调控腺病毒载体的构建方法如下用来源于pONY2.1载体(图11b)的NcoⅠ-XbaⅠ片段形式的β-半乳糖苷酶编码基因替代OB37(图1)的萤光素酶基因。以KpnⅠ-SalⅠ片段形式从OB37中切出所得OBHRELacZ表达盒并将其克隆到Quantum BiotechnologiesTM pAdBN转运载体中，即获得Ad.OBHRElacZ。
将重组Ad.OBHRElacZ载体线性化(AseⅠ)，并与纯化的Ad5病毒右臂(由ClaⅠ位点切)共转染到293细胞中进行体内，使其进行同源重组以形成所需重组腺病毒。该方法的要点列于图17。含有HRE的腺病毒载体称为AdHRE，然后是插入的基因，举例来说，Ad.OBHRElacZ即含有细菌β-半乳糖苷酶基因，其表达受OBhre11启动子调控。在OBhre11启动子下游的多克隆位点内可方便地插入多种不同的特定核酸序列。MCS包括5’BglⅡ-AscⅠ-Asp718-KpnⅠ-XhoⅠ-HindⅢ-EcoRV-SnaBⅠ-BclⅠ-MluⅠ-NotⅠ-3’。
被插入到腺病毒转运载体中的DNA构建体采用含有OBhre11启动子、LacZ编码序列及SV40多腺苷酸化信号的自主表达盒形式(如果需要也可加入剪接位点)。我们在用于构建AdHRE载体的该系统中发现，若表达盒的取向与E1基因相同，则可获得稳定的高水平蛋白表达。因此，为了由OBhre11启动子获得紧密调控(即在含氧量正常条件下为低基准表达水平)而将OBHRElacZ表达盒按E1基因的方向进行克隆(使残留腺病毒基因组对所有转录的干扰达到最小)。
用Ad.OBHRElacZ转导一系列不同的细胞系。用重组腺病毒第20-100位的MOI转导已在补加有5％FCS的DMEM中培养90分钟的指数增长期细胞，温和摇动6-8小时，然后去除病毒并以适用于该细胞系的新鲜培养基置换。再将转导的细胞在含氧量正常(20％O2,5％CO2,75％N2)条件下培育16小时，或是利用购于Heto的多气种培养箱在结果部分所述的缺氧条件下培育16小时，或是在含有150μM氯化钴或去铁铵(Sigma)的条件下培育16小时。
由两种类型的细胞获得的结果显示于图18，该结果说明了腺病毒载体内的LacZ报告基因在Chiang肝细胞系和MCF-7人乳癌细胞系中的缺氧诱导性。
此外还利用Ad.OBHRElacZ对7-14天龄的初级人巨噬细胞进行了类似的转导，然后将细胞培养于含氧量正常或缺氧条件下。用Ad.OBHRElacZ病毒第150-200位的MOI将培养在补加有5％胎牛血清的DMEM中且密度为2×105 100μl的初级人巨噬细胞(来源于血沉棕黄层并培养在聚四氟乙烯袋内的补加有雄性AB血清的无血清AIM-V培养基中)转导过夜。然后将细胞分成两份，分别培养在含氧量正常或缺氧条件下。结果显示于图18和19，该结果表明了对lacZ报告基因的缺氧诱导。
这些结果不但说明了受HRE调控的重组腺病毒在造血谱系细胞中的转导能力，而且也说明了其应用性。
实施例13——含有编码治疗产物的NOIs的受缺氧调控的腺病毒载体的构建下文描述的是利用Microbix Biosystems构建系统构建AdHRE-2B6及AdCMV-2B6重组腺病毒载体的实例。下述质粒显示于图20pElHREPG-OBHRE-2B6转运载体(经设计后含有受Obhre11驱动的2B6表达盒)由pIRES2-EGFP(购于Clontech Laboratories UK Limited(目录号6064-1))获得EcoRⅠ-HpaⅠ片段形式的EMCV IRES GFP，将其钝化后克隆到pGL3PBHRE11p450载体内位于2B6编码序列3’端的XbaⅠ-HapⅠ位点中(将2B6/p450编码序列——见实施例6——以HindⅢ-XbaⅠ片段形式克隆到OB37内以取代萤光素酶报告基因，即获得pGL3PBHRE11p450)。
将完整表达盒以MluⅠ-PshAⅠ片段形式克隆到Microbix转运载体pΔElsp1B中即获得pE1HREPG(图20a)。
pJM17和pΔE1sp1B转运载体均购于Microbix Biosystems Inc.(Ontaio,Canada)。pJM17可用来构建含有早期蛋白区域1(E1)插入序列/突变的5型腺病毒载体。该质粒在E1区内含有一段pBR322衍生物插入序列，这使它在对诸如293等辅助细胞的单次转染中不具有侵染性，这是因为该病毒基因组过大而不能被包装。与转运载体衍生物pΔE1sp1B一同进行共转染可使体内发生重组，从而产生可被包装的E1-重组腺病毒载体。
pE1CMVPG-CMV-2B6转运载体(经设计后含有受CMV驱动的2B6表达盒)
将pCI-2B6的BglⅡ-NaeⅠ片段CMV2B6克隆到pΔE1sp1B的BamHⅠ-EcoRV位点中。将EcoRⅠ-XbaⅠ片段形式的EMCV IRES2 EGFP经钝化后克隆到所得质粒内位于2B6编码序列3’端的XbaⅠ位点中，即创建出pE1CMVPG(图20b)。
如上文所述克隆2B6 cDNA并把PCR产物克隆到Promega pCI-neo哺乳动物表达载体的NheⅠ-XbaⅠ位点内即获得了pCI-2B6。
注释使用EMCV IRES2 EGFP报告序列可以更容易地对重组腺病毒进行噬斑纯化，该序列可作为适当的细胞标记用于不同生理条件下的基因表达研究。
任何NOI或NOI的组合均可插入到上文所述的腺病毒载体中。
实施例14——构建腺病毒载体以传送慢病毒组分对于腺病毒/慢病毒组合载体已有相关描述。为了产生慢病毒载体，通常需要制备四种腺慢病毒构建体基因组、gagpol、包膜蛋白(如狂犬病G)和可选的Rev。这些构建体通常被包含在四种不同的腺病毒构建体中。慢病毒组件的表达可由异种启动子调控，并且可在需要(高水平表达gagpol、Rev及狂犬病包膜蛋白)时含有内含子及多腺苷酸化信号。当把这四种病毒转导到Elaminus细胞中时，腺病毒组件将不会表达，但异种启动子能够使慢病毒组件表达。在此，以实施例方式对能够产生慢病毒载体的腺病毒载体的产生加以描述。
下文将简要描述构建EIAV腺病毒系统(U.K.专利号9727135.5)的一个实例。EIAV来源于一种最小化系统，该系统不含任何非必需EIAV编码蛋白(S2、Tat或编码蛋白)。用来使EIAV假型化的包膜蛋白为狂犬病包膜(G蛋白)。该蛋白已被证明可良好地使EIAV假型化(U.K.专利号9811152.9)。
转化质粒下文所述为来源于转运质粒pE1sp1A并含有EIAV组件的转运质粒的构建。然后可利用该重组转运质粒通过在293细胞内的同源重组产生出重组腺病毒。
质粒构建详述pONY3将来源于pSPEIAV19ΔH(见实施例9)的MluⅠ/MluⅠ片段插入到经MluⅠ酶切的哺乳动物表达质粒pCI-neo(Promega)中，使gagpol基因的表达受hCMV-IE启动子-增强子的调控，这样即产生出该EIAVgagpol表达质粒(pONY3)。质粒pONY3由于缺乏适当的LTR序列而不会产生功能性基因组。
pONY3.1用NarⅠ和EcoRV酶切pONY3以去除pONY3内的剩余5’LTR。将所得2.4kb片段插入到pBluescript KS+(Stratagene)的ClaⅠ和EcoRV位点内，即构建出pBSpONY3.0。用XhoⅠ和EcoRV酶切pBSpONY3.0并将所得2.4kb片段插入到pONY3的XhoⅠ和EcoRV内，即制备出pONY3.1.该操作可去除位于引物结合区内NarⅠ位点上游的5’LTR(386nt)。
A．pElRevE——可提供高效表达gag及pol所需的Rev蛋白构建pCI-Rev时首先是通过PCR扩增获得EIAV REV编码序列。通过PCR扩增获得该EIAV REV编码序列的方法如下。以pONY3为模板进行2次扩增，以获得EIAV RRE的两个部分。获得5’因子使用的引物为EIAV.REV-5’O(CCATGCACGTCTGCAGCCAGCATGGC AGAATCGAAG)和EAIV.REV-IN(CCTGAGGATCTATTTTCCACCAGTCATTTC)，获得3’因子使用的引物为EIAV.REV-IP(GTGGAAAATAGATCCTCAGGGCCCTCTGG)和EIAV.REV3’O(GCAGTGCCGGATCCTCATAAATGTTTCCTCCTTCG)。这些产物可彼此间退火，因而可用于第二次PCR反应以获得可“编码”EIAV REV的DNA。第二次PCR扩增首先使用EAIV.REV-IN和EIAV.REV-IP引物，10个循环之后再加入EIAV.REV-5’O和EIAV.REV3’O引物。
将所得产物与PCR片段“TA”克隆载体pCR2.1(Invitrogen)相连接，然后通过限制酶切分析评定EIAV REV插入序列的方向，并证实EIAV REV序列的正确性。通过SpeⅠ及NotⅠ消化切出EIAV REV插入序列，然后将其连接于经NheⅠ和NotⅠ消化的pCI-Neo(图24)。从而产生pCI-Rev。然后用ApaLI和ClaⅠ将pCI-Rev质粒酶切。用Klenow聚合酶将编码EIAV Rev的2.3kb序列的末端钝化，并插入于pE1sp1A的EcoRV位点，即产生pE1RevE质粒(图21)。
B．pE1HORSE3.1——gagpol构建体构建pHORSE时首先是如下所述通过PCR扩增获得EIAV gagpol编码序列。以pONY3为模板进行2次扩增，以获得EIAV gagpol的两个部分。获得5’因子使用的引物为EGAGP.5’OUTER(CCATGCACGTCTCGAGCCAGCATGGGAGACCCTTTGAC)和EGAGP.INNER3(GCAATGGAATGACATCCCTCAGCTGCCAGTCC)，获得3’因子使用的引物为EGAGP.3’OUTER(CGAGCTAGAGGTCGACTCAATTTGGTTTATTAGTAAC)和EGAGP.INNER5(GGGATGTCATTCCATTGCCACCATGGGAAGTATTTATCACTA)。这些产物可彼此间退火，因而可用于第二次PCR反应以获得可“编码”EIAV gagpol的DNA。
将二次PCR的产物纯化，合并，然后利用EGAGP.5’OUTER和EGAGP.3’OUTER再次扩增。将所得产物插入于pSP72的XhoⅠ和SalⅠ位点内即产生pSP72EIAVgagpolO’lap。用PvuⅡ和NcoⅠ酶切pONY3，并将所得4.3kb片段插入到经PvuⅡ和NcoⅠ酶切的pSP72EIAVgagpolO’lap中，即获得pSP-EGP。用XhoⅠ和SalⅠ将其酶切(4.7kb)并插入于pCI-Neo的XhoⅠ和SalⅠ位点内。该构建体称为pCI-EGP。用SalⅠ切出pEGASUS-4(+)中的RRE(0.7kb)并插入于pCI-EGP的SalⅠ位点，即产生pHRESE。
用pONY3.1的1.6kb XhoⅠ/XbaⅠ片段取代pHRESE的1.5kbXhoⅠ/XbaⅠ片段即获得pHRESE3.1。
然后用SnaBⅠ和NotⅠ将pHRESE3.1酶切。将编码EIAV gagpol的6.1kb片段插入到经SnaBⅠ和NotⅠ酶切的pE1RevE中(纯化出7.5kb的片段)。这就是pE1HRESE3.1(图22)。
C．pE1PEGASUS——基因组构建体用BglⅡ和NotⅠ将pEGASUS-4(+)酶切。把含有EIAV载体基因组的6.8kb片段插入到经BglⅡ和NotⅠ酶切的pE1RevE中(纯化出6.7kb的片段)。这就是pE1PEGASUS(图22)。
pCI-Rab在pCI-Neo中插入狂犬病病毒G蛋白开放阅读框(图27)。方法是用NSiⅠ和AhdⅠ酶切pSA91RbG质粒。用T4 DNA聚合酶将所得1.25kb片段的末端钝化，并插入到经SmaⅠ酶切的pCI-Neo中。这样即产生pCI-Rab质粒(图25)。
如U.K.专利号9811152.9所述，把pSG5rabgp(Burger等，1991)中的狂犬病G蛋白片段以1.7kb的BglⅡ片段形式克隆到pSA91中(ERA品系)即构建出pSA91RbG,pSA91是pGW1HG(Soneoka等，1995)的一种衍生物，其中的gpt基因已通过BamHⅠ消化及再连接而被去除。
D．pE1Rab——狂犬病构建体用SnaBⅠ和NotⅠ酶切pCI-Rab。将编码狂犬病包膜蛋白的所得1.9kb片段插入到经SnaBⅠ和NotⅠ酶切的pE1RevE中(纯化出7.5kb的片段)。这样即产生pE1Rab质粒(图26)。
实施例15——对干细胞进行设计使其随缺氧而表达一种前药活化酶。
含有受OBhre11构建体调控的人凝血栓蛋白基因的逆转录病毒载体，如XiaGen-450，或慢病毒载体可用来转导任何类型的细胞。举例来说，我们使用的是人造血干细胞(HSCs)、人周围血棕黄层细胞和人脐血细胞。CD34+HSCs的分离方法以及将基因通过逆转录病毒介导转运到这些细胞中的方法此前已有描述(如Charbord等，1996；Dunbar等，1996；Cassel等，1993；Emmons等，1997；WO-A-96/33281；WO-A-96/09400)。例如，可使用如下适当方法。
在利用G-CSF和/或环磷酰胺进行动员之后，可从周围血中收集HSCs(Cassel等，1993)。G-CSF(Amgen)可采用皮下注射方式，剂量为10μg/kg/天，共持续7天。HSCs的血浆分离置换与富集可使用CellPro干细胞分离系统(Cassel等，1993)。将富集HSCs的群体以105细胞/ml的浓度培养于产RRV细胞(实施例1)使用过并加有4μg/ml鱼精蛋白硫酸盐和20ng/ml IL-3(Sandoz)、50ng/ml IL-6(Sandoz)、100ng/ml SCF(Amgen)的废弃培养基中(Santiage-Schwartz等，1992；Charbord等，1996；Dao等，1997；Piacibello等，1997；Cassel等，1993)。也可加入按文献所述(Dunbar等，1996,231)制备的其它细胞因子和/或自身基质细胞。24小时后将细胞离心并重悬于含有RRV及上述生长因子和鱼精蛋白硫酸盐的新鲜培养基中。再过24小时后将该步骤重复一次，并将细胞再培养48小时。之后用胰蛋白酶处理细胞，再把细胞置于新鲜培养基中清洗，离心并重悬在用于多次灌注的Plasma-Lyte A中，如此清洗数次。多次灌注的总体积约为25-50ml。患者灌注的间隔时间为2小时。灌注的细胞数量至少为105细胞，也可多至1012数量级的细胞。
也可根据已发表方法使细胞在多次灌注前通过髓分化途径成熟(Haylock等，1992)。
以下转导方法与用于逆转录病毒载体的方法相同，但转导慢病毒载体也可使用相同方法通过优化分离的CD34细胞的培养条件来加强由逆转录病毒或慢病毒载体转运的基因，使这些细胞在转导时处于循环期内。使用基于MLV的载体时还特别需要使细胞处于分裂期，这样才能够进入核内并进行整合。带有不同包膜蛋白的假型化MLV载体对基因转运也有重大影响。如文献所述，GALV要明显优于VSVG。
我们使用的是一种规定的培养基包容物，以确保细胞在转导时处于循环期内。使用规定的培养基可确保含有增殖因子，同时又不含抗增殖因子，而在血清或更复杂的培养基中可能会含有抗增殖因子。
一旦分离出CD34细胞，即需将其转移到以下培养基中(主要基于Becker等，1998)，至少24小时后才可进行转导。无血清培养基X-VIVO10,1％BSA、2mM L-谷氨酰胺、1％青/链霉素、20ng/ml IL3、100 U/ml IL6、50ng/ml SCF、100ng/ml kang TGFβ、100ng/mlFlt3-L。采用的转导方案如前人所述(Becker等，1998)。该方案涉及三个循环，持续时间在3天以上，此外还涉及使大多数细胞在含病毒载体情况下同时进行有丝分裂。以下对该方法做简要描述以10μg/cm2的密度用粘连蛋白片段CH-269涂布非组织培养级平板(Takahara)。将病毒加到空孔中并结合30分钟。PBS清洗。每孔加入含有105个细胞的0.5ml培养基。加0.5ml病毒上清。1020×g下离心90分钟。4小时后用上文所述新鲜培养基置换。连续重复3天。
由周围血或来源于周围血的血源分离的细胞可优先形成较高比例的红系祖细胞，而来源于脐血的CD34细胞可形成更广泛类型的祖细胞。来源于脐血的细胞具有更高的先天增殖能力。在利用GM-CSF进行分离之前对周围血进行“动员”可增加干细胞的数量。在移植患者中，该方法被广泛使用。
然后根据以下方案在Ⅱ类安全等级的暗橱中将细胞铺在含有生长因子的甲基纤维素培养基上(甲基纤维素中含有10％胎牛血清、转铁蛋白、谷氨酰胺、2-巯基乙醇、牛血清白蛋白、IL3、IL6、IL11、SCF、Epo、GCSF、GMCSF)。利用连结于2.5ml注射器的钝头针将2.5ml甲基纤维素注入10ml U形管中，避免气泡产生。将0.5ml悬浮于Iscove培养基(Gibco)的细胞悬浮液(含有三倍于每孔所需细胞的数量，从而使1ml甲基纤维素中含有500/2000细胞每孔的所需细胞数量)注入含有甲基纤维素的管中，并温和搅拌。利用钝头针和注射器轻缓地取出1ml甲基纤维素与细胞的混合物，加到非组织培养型培养皿(25×10mm)或单孔玻盖培养盒中。每种样品可重复三个培养皿/孔。将培养皿/盒置于Falcon 3025培养皿(150×25mm)中，该培养皿中另放有装无菌蒸馏水的小培养皿以确保适当的湿度。将培养皿置于37℃、5％CO2、5％O2条件下培养，14天后进行菌落分析。
为了提高来源于CD34的单核细胞的产量，可逐步确定培养条件以优化GM祖细胞(Haylock等，1992)及后续单核祖细胞的形成。方法是利用CFU测定对初级培养物试样进行监控，以确定产生单核细胞的最佳条件。补加含有相对较高剂量GM CSF的培养基以优化GM祖细胞的产生，然后分期添加MCSF，因为这种优势生长因子可使分化倾向于髓系。在HSC转导后，这些细胞可分化形成GM前体细胞。
通过观测GFP荧光来分析GM前体细胞菌落的逆转录病毒载体表达情况。该评定是在含氧量正常及缺氧条件下进行。
作为选择，也可利用除在分离后立即进行转导外其余与上文所述相同的方法对干细胞群体进行转导。然后可将这些细胞冷冻，或立即用来转移给患者。此时，全能干细胞可进行保存。
实施例16——经改造的HSCs与卵巢癌异种移植物的相互作用作为本发明的一个实例，我们选择卵巢癌为测试系统来研究HSC对肿瘤的侵润。这种癌主要局限于腹膜腔。有多种动物模型可用来分析HSC对卵巢肿瘤的侵润。OS、HU和LA这三种人卵巢癌异种移植物均来源于初级人肿瘤，并且是在腹膜内形成，它们可通过该途径以连续传代来维持(Ward等，1987)。这些品系都不能在长期培养中良好生长。它们都主要以粘蛋白包绕的自由浮动腹水形式生长。这一点不属于以实性植入性肿瘤沉积物伴腹水形式存在的人类疾病。将TNF进行腹膜内给药可以把HU和LA模型由这种腹水状态转变成沉积在腹膜及相关器官表面的植入性实性肿瘤(Malik等，1989)。这充分体现出这种人类疾病的病理学机理，更明确地说，它类似于其源肿瘤的早期病理。这种实性肿瘤模型已作为更相关的起始点用于卵巢癌治疗制剂(如γ干扰素，Malik等，1989；Burke等，1997)的研究。把经过上文所述腺病毒或逆转录病毒或慢病毒载体改造的人类干细胞以106/0.1ml浓度引入患有上述肿瘤的小鼠腹膜腔。HSCs即可表达治疗性基因。这些基因的作用可超出HSC的范围，即存在一种可将周围肿瘤组织杀死的旁观效应。在本发明的一个特别实例中使用的是XiaGen-P450载体。先用改造的HSCs处理小鼠，然后将100mg/kg的环磷酰胺经腹膜内给药。被改造的HSC处理过的小鼠肿瘤可被环磷酰胺杀死。
AdHRE载体所采用的方法类似于已发表的下述干细胞转导方法。将培养在小量含有200 units/ml IL-3、200 units/ml GM-CSF、200units/ml G-CSF的培养基中的HSC利用腺病毒载体转导24小时，即可获得高倍数的侵染(100-500)。经腺病毒载体转导后的细胞可在分化后使用，也可直接使用。如果要使用已分化细胞，则可在含有上述细胞因子的软琼脂内培养14天后计算粒系/巨噬系集落形成单位(CFU-GM)。将CD34+细胞或已分化细胞引入动物体内后，这些细胞可迁移至靶组织并表达治疗性基因。
实施例17——利用修饰的人类干细胞治疗卵巢癌如下所述收集卵巢癌患者的周围血淋巴细胞。再如上文所述用XiaGen-P450逆转录病毒载体转导这些细胞。大致按照Stevenson等，1987所述的用于单核细胞的方法经腹膜内注射将改造的干细胞输回患者。基本上可利用导液针将悬浮于50ml等张盐溶液的108-109个细胞直接引入腹膜腔，同时利用超声波进行监控。这些细胞可在腹膜腔内广泛分布并保持与浆膜表面相连，而且不会移至其它器官。1-7天后，用环磷酰胺处理患者，再过2周后对肿瘤进行分析。改造的干细胞是环磷酰胺在局部具有活性，从而导致肿瘤质量的减少。
AdHRE载体使用了类似于上文所述的干细胞转导方法。
实施例18——用慢病毒载体转导肿瘤细胞作为本发明的另一实例，我们还研究了对神经胶质瘤的基因转运。神经胶质瘤的特征在于血管形成过度以及其侵袭力，但它是研究过的最缺氧的肿瘤类型之一〔J.Folman pp3075-3085 in癌症肿瘤学原理与实践，Fifth Edition ed DeVita,Hellman,Rosenberg.Pub.Lippincott-Raven 1997〕。构建一种可提供前药活化酶与抗血管生成因子结合治疗的慢病毒载体，在该实例中使用的是均受HRE构建体调控的人细胞色素P450基因和抗血管生成因子TSP-1(类似于图16但是用P450和TSP-1序列替代lacZ和E-PAS序列)。其表达可在缺氧条件下被激活，从而能够确保在肿瘤的局部环境中实施治疗。适当的慢病毒载体如图30所述。该模型系统使用人U87MG细胞系或大鼠RT-2细胞系。这两种细胞系均能够导致正常大鼠或裸鼠或SCID鼠中产生可用于分析的典型血管形成型肿瘤(如Wei等，1994)。这两种肿瘤细胞系都是通过脑内移植来创建肿瘤模型。慢病毒载体制品可直接注射到肿瘤块的多个部位。载体的提供量为1-3μl，滴度至少为104转导单位/μl。治疗人类患者也可采用相同方法。此时可通过PET或MRI扫描将肿瘤定位，然后注射0.1μl载体试样，或可选择在外科除瘤手术时用载体处理肿瘤部位。然后用环磷酰胺对患者进行处理，并利用MRI扫描监控肿瘤生长的减缓。
实施例19——利用去铁胺诱导慢病毒载体的产生与表达去铁铵购于Sigma，或是作为临床制剂以注册产品名Deferal购于Novartis制药公司。由Deferal获得的诱导程度等于或大于由缺氧获得的诱导程度。
就体外使用而言，可将含有缺氧调控慢病毒载体的生产用细胞置于含有50μM-1mM去铁铵的三角瓶中培养10天。在此期间，培养物可释放载体颗粒，其总产量超过107/ml。用于递增培养的细胞可在滚瓶中培养7天，使用的去铁铵为50-200μM。因此，该系统由于含有HRE而得以低水平诱导病毒载体。利用该系统可通过HRE对去铁铵的反应来调控其包含的基因组。它也可用来对其它组件，即gagpol和包膜蛋白，进行类似调控。而且该系统还可用来调节任何逆转录病毒或慢病毒载体的组件的产生。
就体内使用而言，可利用受缺氧调控的慢病毒载体或含有该载体的细胞对患者进行处理。然后对患者实施一个常规疗程的去铁铵治疗。除了缺氧的所有影响外，这样做也可激活治疗，并且在某些情况下还可替代局部缺氧来发挥作用。举例来说，如果把细胞植入体内以提供一种治疗性蛋白，如Epo或诸如因子Ⅸ等凝血因子，则可通过调整Deferal的剂量来对这种传送进行控制。
实施例20——MLV逆转录病毒载体中的HIF-1自我调节HRE构建体构建出用三个来源于PGK的HRE拷贝取代内源性MLV启动子及MLV核心启动子上游的HRE HIF1自我调节表达盒，以进一步检测本发明所述HRE的缺氧诱导作用。利用EMCV IRES产生双顺反子表达盒，以驱动萤光素酶报告基因后的HIF-1α或对照(lacZ)的表达(见图28)。
所得结果显示，与HIF-1α共转染可显著提高缺氧条件下的表达，但是却会使诱导比率下降，因为含氧量正常条件下的表达也相应提高(见图27)。
MLV的“最小化”核心启动子大多在TATAA框的上游含有一个CAAT框。我们希望了解的是，是否去除CAAT框会降低核心启动子的基础活性并继而降低在含氧量正常情况下的活性。这一点由图27显示的结果所证实——即去除CAAT框可降低luc-IRES-HIF在含氧量正常条件下的活性，但似乎可保持在诱导情况下的活性水平，从而会显著提高诱导比率。
因此，与HIF-1共转染可提高诱导水平。但这种提高只出现在含氧量正常条件下。降低核心启动子的活性可导致诱导比率的增加。事实上，只对核心启动子进行操作既可改进诱导曲线，也可提高HIF-1表达。因此，这是一种改善缺氧的途径，并且该途径可应用于其它核心启动子，如CMV和SV40最小化启动子。此外，该技术作为降低含氧量正常条件下的活性的一种方法也同样适用于含氧量正常条件下的因子表达水平异常高的细胞，例如，C2C12小鼠骨骼肌细胞。
实施例21——OBHRE1和OBHRE11 HRE的优化尽管HRE因子含有一种共有序列，但在天然HRE因子内仍发现有细微的单碱基变化，这些变化将取决于特定的基因启动子。此外还发现，HIF家族(bHLH PAS家族)的特定成员能够与某些半位点序列优先结合。通过使这些半位点内发生单碱基取代，可以使特定类型细胞中的缺氧反应加强，这些细胞的类型将取决于HIF/bHLH PAS家族成员在靶细胞中的表达曲线。因此，举例来说，如果有一种特定类型的细胞能够高水平表达一种特定的HIF/bHLH PAS家族成员，那么就可相应地去除HRE而加入该特定家族成员可结合的半位点。
这一点经实验测试后的解释如下合成5种带有与OBHRE1(质粒OB36)内的HRE结合位点不同的变化的寡聚核苷酸。
12MousePGK1 GTCGTGCAGGACGTGACA (x3)CAGCACGTCCTGCACTGT3D1 TACGTGCAGGACGTGACA (x3)ATGCACGTCCTGCACTGTHRE位点1上游一侧的GT被变成TA(在其它大多数HREs中都存在)D2 GTCGTGCAGTACGTGACA (x3)CAGCACGTCATGCACTGT位点2由GAC变成TAC，使得该序列更类似于HIF/MOP3结合位点。D3 GTCGTGCAGCACGTGACA (x3)CAGCACGTCGTGCACTGT位点3被突变，将最后的C替换成G，这种变化在其它大多数确定的HREs中都存在。这还导致位点2突变成CACGTGA，这是一种MOP4/MOP3结合位点。D4 GTCGTGCAGGACGTGGCA (x3)CAGCACGTCCTGCACCGT预计把该碱基突变成G会使位点2可以结合ARNT，而不是MOP3。
D5 GTCGTGCAGTACGTGGCA(x3)CAGCACGTCATGCACCGT该构建体含有如D4的相同突变。但另外还加入了D2突变。由此得到的是一种假定的HIF/ARNT位点。
结果(见图29和图30)D1——该构建体在含氧量正常条件下的表达水平提高，但对缺氧条件下的表达水平影响很小，因此与OBHRE1相比其诱导比率下降。
D2——该构建体在含氧量正常及缺氧条件下的表达水平均明显提高。
D3——将鼠PGK HRE因子内的CGTC突变成CGTG后，在T47D细胞内的含氧量正常及缺氧条件下的表达水平均降低，并且导致诱导比率明显下降。但是这种影响在C2C12细胞中却弱得多，这表明该构建体的活性高度依赖于所测试的细胞背景。
D4——在T47Ds内，缺氧条件下的表达水平很低，诱导比率下降。在C2C12内，含氧量正常条件下的表达水平降低，因而与OBHRE1相比其诱导比率明显增加。
D5——在D4中加入D2的突变，使得在T47D内的含氧量正常及缺氧条件下的表达水平均降低，诱导比率不变。在C2C12内，缺氧条件下的表达水平降低，从而对诱导比率严重的影响。
总结D2的单碱基变化是OBHRE1的一种改进。上述单碱基变化可作为一种方法用来把HRE的功能带到特定的靶细胞中，细胞的类型将取决于其中的HIF转录因子。
以上说明书中提到的所有出版物均在次引入作为参考。本发明所述方法及系统的多种改动和变化对该领域的技术人员而言是显而易见的，这些改动和变化并未脱离本发明的范围和精神。尽管本发明在描述时使用了特别优选实施方案，应该了解的是，申请专利的本发明不应过度局限于这些特定实施方案。事实上，文中叙述所述的本发明实施方式具有多种对分子生物学技术或相关领域的技术人员而言是显而易见的变化，这些变化仍会处于下文的权利要求范围之内。
参考文献Ace等，1989，病毒学杂志63:2260-2269Becker等，1998，人类基因治疗9,1561Beerrepoot等，1996,56,3747Bender等，1987，病毒学杂志61:1639-1646Blatt 1994，抗癌研究，14,2109Blomer等，1997，病毒学杂志71:6641-6649Bodine等，1991，室验血液学19:206-212Bregni等，1998，基因治疗5,465Burger等，1991，普通病毒学杂志72.359-367Burke等，1997，欧洲癌症杂志，33Cassel等，1993，室验血液学21,585Charbord等，1996英国血液学杂志Chou and Roizman,1992，美国国家科学院院刊Chou等，1994，病毒学杂志68:8304-8311Clarke and Gordon 1998，白血病生物学杂志63,153Cornelisse等，1996，病理学研究和实践192:684-693Cosset等，1995，病毒学杂志69:7430-7436Cotton等，1993病毒学杂志67:3777-3785Crapper等，1991，柳叶刀，337,1304Dao等，1997血液89:446-456Dunbar等，1996，人类基因治疗7:231-253.Duphar and emmons,1994，干细胞12:563-576Ema等，1997，美国国家科学院院刊94,4273Emmons等，1997，血液89,4040；Firth等，1994，美国国家科学院院刊91,6496Firth等，1995，生物化学杂志270,21021Fisher等，1996病毒学杂志217:11-22Flamme等，1997，发育学机理63,51Fraser等，1990，血液76:1071-1076Frey等，1998，血液91,2781).
Gorziglia等，1996病毒学杂志70:4173-4178；Gosh-Choudhury等，1986，基因50:161Gossen and Bujard,1992，美国国家科学院院刊89:5547-5551Giardina and Grady 1995，血液学论坛32,304Gossen等，1995，科学268:1766-1769)Graham等，1997，普通病毒学杂志36,59Haylock等，1992，血液80,1405Hearing and Shenk 1983细胞33,695Inoue等，1989，生物化学杂志264:14954-14959Jaggar等，1997(人类基因治疗8 2239Kim等，1998，病毒学杂志，72,811-816.
Koong等，1994，癌症研究54,1425Krougliak等，1995，人类基因治疗6:1575Kuhl等，1987，细胞50,1057Levrero等，1991，基因101:195Lieber等，1996病毒学杂志70:8944-8960Lonergan等，1998，分子细胞生物学18:732Maclean等，1991，普通病毒学杂志72:632-639MacGregor等，1991分子生物学方法Vol7 ed E.J.Murrayp217-235Madan等，1993，美国国家科学院院刊90:3928Malik等，1989，国际癌症杂志44,918Malik等，1991，癌症研究51,6643Maxwell等，1999，自然399:271Meliillo等，1996生物化学杂志272,12236-12243Miller,A.D.and G.J.Rosman,1989，生物技术7(9):p.980-2,984-6,989-90.
Myoshi等，1998病毒学杂志72,8150Neering等，1996血液88,1147Payne等，1998，病毒学杂志72,483.
Pear等，1993，美国国家科学院院刊90:8392-8396Peshavaria and Day,1991，生物化学杂志275:427-433Piacibello等，1997血液89:2644-2653Rice and Knipe,1990，病毒学杂志64:1704-1715Santiago-Schwartz等，1992，白血病生物学杂志52:274-281Semenza and Wang,1992，分子细胞生物学12:5447-5454Semenza等，1996，生物化学杂志51 32529Smith等，1992，病毒学186:74-86Soneoka等，1995核酸研究23:628-633Steventson等，1987，癌症研究47,6100Stratford-Perricaudet等，1992，临床研究杂志90:626-630Takenaka等，1989，生物化学杂志264:2363-2367Taniguchi等，1995，癌症研究和临床癌症学杂志121,516Trian等，1997，基因和发育11,72Voest等，1993，癌症化疗药理学31,357Wang and Semenza,1993a，美国国家科学院院刊90:4304Wang and Semenza 1993b，血液，82,3610Wang等，1995，生物化学杂志270,1230Ward等，1987，癌症研究47,2662Watanabe等，1996，血液87,5032Watanabe等，1998，白血病和淋巴瘤29,439Wei等，1994，人类基因治疗5,969Weisener等，1998血液92 2262-2268Yeh等，1996，病毒学杂志70:559Zacharova等，1997，艾滋病研究和人类逆转录病毒13,719Zhang等，1994，分子细胞生物学14,808权利要求
1．一种至少含有两个重复的缺氧反应元件(HRE)的多聚核苷酸，其中，两个重复区内的缺氧诱导因子(HIF)共有结合位点每一个都由一段至少20个连续核苷酸的间隔区隔开。
2．权利要求1的多聚核苷酸，其中的HRE重复可操作地与一种病毒启动子相连接。
3．权利要求1或2的多聚核苷酸，其中所述间隔区含有如序列编号10或序列编号11所示的核苷酸序列。
4．权利要求2或3的多聚核苷酸，其中所述启动子选自SV40启动子或MLV启动子。
5．上述权利要求任一项的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有经操作连接于启动子和启动子上游(5’端)的至少两个重复的HRE以及可操作地连接于启动子和启动子下游(3’端)的至少两个重复的HRE。
6．一种多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有可操作地与一种SV40启动子或MLV启动子连接的至少三个重复的磷酸甘油酸激酶(PGK)缺氧反应元件(HRE)。
7．权利要求6的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有可操作地连接于启动子和启动子上游(5’端)的至少三个重复的HRE以及可操作地连接于启动子和启动子下游(3’端)的至少三个重复的HRE。
8．上述权利要求任一项的多聚核苷酸，其中的HRE重复为同向重复。
9．上述权利要求任一项的多聚核苷酸，其中的HRE含有如序列编号1或序列编号2所示的一段核苷酸序列。
10．权利要求1的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有如序列编号9所示的一段核苷酸序列。
11．权利要求6的多聚核苷酸，该多聚核苷酸含有如序列编号3、序列编号4或序列编号5所示的一段核苷酸序列。
12．上述权利要求任一项的多聚核苷酸，该多聚核苷酸经操作与特定核酸(NOI)相连接，使得该多聚核苷酸可指导NOI在宿主细胞中的表达。
13．权利要求12的多聚核苷酸，其中的NOI编码HIF-1。
14．权利要求13的多聚核苷酸，其中的启动子不含CAAT框序列。
15．权利要求12-14任一项的多聚核苷酸，其中的宿主细胞为一种肿瘤细胞。
16．权利要求12的多聚核苷酸，其中的NOI可编码一种具有治疗用途的多肽。
17．权利要求12的多聚核苷酸，其中的NOI可编码一种具有细胞毒性的多肽。
18．权利要求12的一种多聚核苷酸，其中的NOI可编码一种能够将前药前体转化成细胞毒性化合物的多肽。
19．权利要求15-18任一项的多聚核苷酸，其中的NOI选自可编码参与细胞分裂调节的蛋白、参与细胞代谢途径的酶、转录因子及热休克蛋白的多聚核苷酸序列。
20．权利要求15-19任一项的一种多聚核苷酸用于将NOI递送至哺乳动物细胞。
21．一种核酸载体，包括上述权利要求任一项所定义的多聚核苷酸。
22．一种病毒载体，包括权利要求1-20任一项所定义的多聚核苷酸。
23．权利要求22的病毒载体，该病毒载体进一步含有一种核苷酸序列，该核苷酸序列选自(ⅰ)可编码一种能够以直接或间接方式影响VHL RNA剪切的抑制性RNA分子的核苷酸序列；(ⅱ)能够与VHL RNA结合并阻止其加工和/或表达的一种或多种抑制性RNA分子；以及(ⅲ)编码一种能够抑制VHL与Elongin B和/或Elongin C结合的多肽的核苷酸序列。
24．权利要求23的病毒载体，其中所述多肽为野生型VHL的一种非功能性衍生物。
25．权利要求22-24任一项的一种病毒载体，其中的病毒载体为一种逆转录病毒载体。
26．权利要求22-24任一项的一种病毒载体，其中的病毒载体为一种腺病毒载体。
27．权利要求25的一种病毒载体，其中的病毒载体为一种慢病毒载体。
28．权利要求12-19任一项的一种多核苷酸、权利要求21的一种核酸载体或权利要求22-27任一项的一种病毒载体在对患有一种疾病的人类或动物患者进行治疗的方法中的应用，其中该疾病以缺氧为病因或症状，或可出现缺氧。
29．一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求12-19任一项的一种多聚核苷酸、权利要求21的一种核酸载体或权利要求22-27任一项的一种病毒载体，以及药学上可接受的一种载体或稀释剂。
30．一种方法，用于对患有以缺氧为病因或症状或可出现缺氧的疾病的人类或动物患者进行治疗，该方法包括将有效量的权利要求29的药物组合物向需要该治疗的患者给药。
31．一种产生病毒株的方法，该方法包括将权利要求1-19任一项的一种多聚核苷酸引入病毒基因组。
全文摘要
本发明提供一种多聚核苷酸,该多聚核苷酸至少含有两个重复的缺氧反应元件(HRE),其中,两个重复区内的缺氧诱导因子共有结合位点由一段至少20个连续核苷酸的间隔区隔开。本发明还提供一种多聚核苷酸,该多聚核苷酸含有可操作地与一种SV40启动子或MLV启动子连接的至少三个重复的磷酸甘油酸激酶(PGK)缺氧反应元件(HRE)。该多聚核苷酸可操作地与特定核酸相连接,以促使NOI在处于缺氧条件下的细胞中表达。
文档编号A61P11/06GK1319139SQ9981131
公开日2001年10月24日 申请日期1999年9月22日 优先权日1998年9月23日
发明者K·M·宾利, S·内勒 申请人:牛津生物医学(英国)有限公司