专利名称：炎症疾病的治疗的制作方法
技术领域：
本发明涉及炎症而且特别是风湿性关节炎。
风湿性关节炎(RA)是一种滑膜关节的慢性炎症，它导致关节毁坏、伤残、及较早死亡。目前虽然风湿性关节炎(RA)的病因还不清楚，有人提出在关节的软骨中唯独发现的II型骨胶原可能是风湿性关节炎(RA)的自身免疫抗原。最近，有人提出gp39(一种39KD的糖蛋白)和由此衍生的肽就是这样一些自身免疫抗原。可是支持这种假说的资料有限，因此，gp39的作用仍然不确定。
本发明来自一种不同的途径，基于软骨细胞(一种关节软骨特异性细胞)的研究。我们从人软骨细胞和人软骨肉瘤细胞细胞系分离到一种蛋白质，该蛋白质与风湿性关节炎(RA)的病人血清中的抗体作用，并满足被称之为自身免疫所接受的标准。对该纯化的蛋白质进行了T细胞的增殖试验，而且表明对风湿性关节炎病人滑膜T细胞有选择性增殖。该蛋白质是免疫球蛋白重链结合BiP蛋白质(78KD)(immunoglobulin heavy chainbinding protein BiP(78KD))。
国际专利申请WO99/18131提出对海拉(HeLa)细胞得到的BiP的抗体检测作为风湿性关节炎的诊断指标。但是，已有技术没有描述从HeLa细胞提取BiP的方法，因此不能满足实际应用。
现在我们已经得到并且鉴定了正确的风湿性关节炎(RA)自身免疫抗原，而且基于该发现开发了对这种疾病的预后和诊断的测定方法以及特殊的治疗方法。我们已经分离了该蛋白质和测定了该蛋白质的DNA序列。我们也已经克隆并表达了这种DNA。其氨基酸和DNA的序列是新颖的，它们的序列在本发明说明书后附的序列表中给出。BiP蛋白质的氨基酸序列以SE1和SE2两种形式列出，任其一种都可以按照本发明用作为检测试剂。SE1的cDNA是以SE3序列给出的。该序列已经存放于基因库(GENBANK)，登记号为NO AF188611。
下文，该序列与基因库(GENBANK)提供的NOX87949进行比较。
下文第一部分描述的是关于这种自身免疫抗原；第二部分是关于克隆、序列测定和蛋白质的表达；第三部分是关于疾病(风湿性关节炎)的示范和组织(滑膜腔)T细胞对自身免疫抗原的特异性。
第一部分自身免疫抗原的表征软骨细胞和软骨肉瘤细胞软骨细胞是从关节置换取出的软骨中分离的。软骨被精细地切碎，用胶原酶(Worthington)1毫克/1毫升进行消化。消化后，细胞以300g离心，然后悬浮于添加了10％胎牛血清(FCS)(Harlan Sera-Lab，Loughborough，UK)的Dulbeccos最低基础培养基(DMEM)(LifeTechnology，Paisly，UK)中。24小时后，从附着细胞中洗去细胞碎片，使细胞生长至汇合。用0.25％胰蛋白酶和按1∶3的比例进行传代。
软骨肉瘤细胞(HTB94)(SW1353)是由美国典型培养物保藏中心ATCC(Rocville，Maryland，USA)和美国芝加哥鲁什大学(Rush University)的J.Block，博士个人提供。这些细胞是培养在含有10％的FCS的DMEM培养基中，当细胞布满时，经过温和地胰蛋白酶水解作用(0.25％胰蛋白酶Life Technology，Paisley，UK)后，用0.25％胰蛋白酶和按1∶3的比例分散细胞。
细胞裂解液的制备细胞从培养瓶中刮下，在蛋白酶抑制剂PMSF(2mM)，亮肽素(200ug/ml)和抑蛋白酶肽(50ug/ml)(Sigma，Pool，UK)的存在下进行细胞匀浆和超声破碎。
十二烷基磺酸钠(SDS)(Sigma，Pool，UK)最终浓度加到1％，在室温溶解蛋白质1小时。蛋白质浓度以牛血清白蛋白作标准用bicinchoninic酸检测的方法进行测定，细胞裂解液以10ug/孔的等份使用。
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和Western Blot凝胶电泳采用Mini Protean系统(BioRad Laboratories，HemelHempstead，UK)制备5，7.5，10％的SDS聚丙烯酰胺1.5mm厚度的变性胶(参见附录1)。每个胶孔加入10μg的蛋白质或等量加入制备胶。电泳在恒定的100V电压及宽范围Kaleidoscope标准蛋白质(BioRad)与细胞水解物平行进行电泳。
电泳后，蛋白质被转印在硝酸纤维素膜上(电压恒定在100V，电泳1小时)(参见附录1)。然后硝酸纤维素膜用3％BSA(Sigma，Poole，UK)封闭(4℃过夜。当需要时，制备的胶膜切成16个薄条，每一条均有一个确定的蛋白质图谱。这些膜用病人的血清(1/100稀释)或特异的单克隆抗体(在所需的浓度)在室温探查1小时，然后用1小时在TTBS(参见附录1)中洗三次。加入以1/1000稀释的第二抗体，即辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗人IgG(Fab2)结合物(Sigma)，在室温保温1小时。然后这些膜用1小时在TTBS(参见附录1)中洗三次。用增强的化学荧光剂(Amersham)使抗原-抗体系统显影。当显影后，HRP复合物在X光片上显现不连续的带。
推定的自身免疫抗原p78的分离如前所述，用于筛选细胞可溶物的风湿病关节炎的血清大约有30％可以被发现有趣的这条带。
用截断分子量为30,000的过滤器(Vivascience)浓缩分离的蛋白质细胞可溶物23倍。该蛋白质平行的加入到5％和7％的凝胶上。每种胶的一个泳道以正常量加样而另外的两个泳道加入过量的蛋白质。Kaleidoscope标准蛋白质被加入到检验泳道的两边。按照如前所述的方法进行电泳直到70,000MW的标准蛋白质电泳到第三个胶底部即将泳出时中止电泳。然后将胶转印到PVDF膜(Immobilon P，Millipore)上，蛋白质转印完成后立即放入蒸馏水中。正常加样量的胶条用于进行蛋白质带的免疫检测。该免疫检测显影的胶片和Ponceau红染色的胶条被用于鉴定风干膜上的蛋白带。借助基体激光解析电离光谱(MALDI)对这些胶条进行蛋白质分离和测序。
电转印的蛋白质采用快速染色方案1 Ponceau S(0.05％w/v液体甲醇/0.1％醋酸)进行染色。干燥过的、染过色的蛋白质用胰蛋白酶(Boehringer，modified)进行水解和用甲酸∶乙醇为1∶1的比例(2)提取肽。取一份0.2ul的等分样品(大约总水解液的5％)直接用一种基质支持的激光解析电离光谱(MALDI)飞行时间质谱仪激光Mat2000质谱仪(ThermoBioanalysis，UK)(3)进行分析。第二个0.2ul的等分样品用含1％v/v亚硫酰(二)氯的甲醇等量酯化而提供的酸性的残余组分也通过MALDI进行分析(4)。非酯化和酯化的肽通过MOWSE肽指纹图谱数据库检出(5)。为了提高b-离子的量有利于两种质谱仪进行序列分析，剩余的消化的肽(总水解液的90％)与2-(3-砒啶)醋酸琥珀酰亚胺(SPA)反应(6)。干燥的肽部分在0.5M含有15％乙腈的HEPES溶液v/v(pH7.8用NaOH调)中用7ul1％的2-(3-砒啶)醋酸琥珀酰亚胺w/v在冰浴中处理20分钟。用1ul十七氟丁酸(HFBA)终止反应并且立即注入毛细管反向柱(300um×15cm)，反向柱用PPOROS2/H材料(PerseptiveBiosystem，MA)填装并且用2％乙腈v/v/0.05％TFAv/v洗柱平衡3分钟。被吸附的肽用10％乙腈v/v/0.05％TFAv/v恒定地以过量的试剂和缓冲液HEPES每分钟3ul的速度洗脱30分钟。衍生肽用75％乙腈v/v/0.1％蚁酸v/v一步梯度洗脱并且以每管4ul收集样品。用装有纳电雾化源(7，8)的FinniganMATTSQ7000通过低能量碰撞活化(CAD)测定衍生肽。用2.5mTorr氩碰撞迂回电压在-18V至-28V之间进行CAD。用Q3在500amu/秒扫描搜集产生的离子光谱。
结果从7.5％的凝胶(单一带)得到的序列数据来自人蛋白质GR78特殊鉴定的肽NQLTSNPENTVFDAK 82-96SDIDEIVLVGGSTR353-366TWNDPSVQQDIK 107-113鉴定人蛋白质GR78Kd葡萄糖相关蛋白质前体(GRP78)免疫球蛋白重链结合的蛋白质(BIP)第二部分p78的克隆，测序和的表达
1)被鉴定基因的mRNA的分离和PCR扩增如前描述过的方法，进行人软骨细胞分离以及培养3周。从总量1-2×106的细胞中用Micro-Fastrack试剂盒(Invitrogen)提取Poly(A)mRNA(1-2ug)。在20ul体积中加1ul的鼠白血病病毒逆转录酶(200u/ul)、45℃、1小时将得到的1微克mRNA逆转为cDNA。5倍第一条链缓冲液(Tris-HCl pH8.3，250mM；KCl 375mM；MgCl 15mM)；0.1M DTT；寡dT(12-18)20/ul(LifeTechnologies)；和dNTP混合100mM(Amersham Pharmacia Biotec，Uppsala)。
在50ul的反应体积中按标准条件(见下)，使用循环变温加热器PE2400(Perkin Elmer Applied Biosystems)进行PCR反应。引物的序列得自基因数据库的序列、登记号X87949，与免疫球蛋白重链结合蛋白Bip(grp78)的人基因一致。合成特殊引物用于扩增由软骨细胞cDNA推定的自身抗原基因。形成的PCR产物认为绝大部分是由grp78编码区，除去未翻译的区域外，信号序列，和终止密码子(grp78数据库序列的279-2169位的核甘酸)组成的。
设计PCR引物引人限制性位点使得cDNA快速亚克隆到细菌的表达载体上。向前延伸的引物编码一个Ndel位点，逆向的引物编码一个Xhol限制性位点给出向前延伸的引物的序列(以下称谓SE4)和逆向延伸的引物的序列(称谓SE5)。
Bip向前延伸引物5′TATACATATGGAGGAGGACAAGAAGGAGGACG3’(32聚体)Bip逆向引物5’CCACCTCGAGTTCTGCTGTATCCTCTTCACCA3′(32聚体)在起始变性96℃，2分钟后，用每个循环为94℃，30秒，60℃，30秒，72℃，2分钟共28次进行PCR反应，最后链延伸是72℃，7分钟。PCR反应产生一个单一的1890bp的特殊的Bip片段。
2)PCR反应产生的片段的克隆用于PCR反应的正向和反向引物引入限制性位点，使扩增的DNA片段两侧能被特异的内切酶(Ndel和Xhol)识别，并被克隆到一个PCR克隆的载体pCR2.1-TOPO(Intvitrogen)上。这连结了的质粒被转化到E，coliXL1-Blue(Steatagene)的感受态细胞。用微量制备纯化柱(Qiagen)提取质粒DNA。用于克隆纯化的质粒DNA被命名为Bip-Topo。这些DNA样品是被储藏在-20℃。这纯化的质粒DNA用Ndel和Xhol酶切。该限制性片段通过Agarose胶电泳分离和用Qiagen DNA胶试剂盒纯化。
3)限制性基因片段亚克隆到细菌的表达载体克隆纯化的片段连接到予处理的细菌的表达载体pET30a(Novagen)的Ndel/Xhol上。连接是在T4连接酶(20单位)、十倍连接酶缓冲液0.1毫升(T4连接酶由Promega提供)、12℃过夜的条件下进行的。连接的质粒转化到感受态大肠杆菌E.coliXLl-Blue(Stratagene)然后用Bip的特殊引物用PCR菌落进行筛选。纯化携带所要的重组质粒的阳性转化子及转化到感受态大肠杆菌E.coli表达株BL21-(DE3)(Invitrogen)。当然，克隆可以在包括细菌、昆虫细胞、和脯乳动物细胞的原核生物或真核生物寄主上进行。那些优选的寄主是能够保证表达产物的糖基化。
4)1890bppET30::Bip亚克隆序列的测定pET30::Bip克隆的5`和3`末端的测序确认重组DNA分子在pET30具有ATG起始密码子的框架而且从该位点通读全Bip基因和最后有6个组氨酸结尾，终子密码子位于表达载体的3`端臂上。
用合成的全长Bip亚克隆寡核甘酸引物进行延伸的DNA序列测定。对照数据库(登记号X87949)已有的grp78序列通过对比进行分析新的亚克隆Bip基因片段。被检测的两个序列在DNA和蛋白质水平上(参见附录2)都有许多不同。这些方面的差异可能是由于起初的grp78DNA序列测定产生的误差，或者表明基因组中存在另外有关的但是轻微差异的Bip基因。
所有的DNA序列都是用dRhodamine终止剂染料试剂盒通过AppliedBiosystems ABI377自动DNA测序仪进行测定。
细菌的表达和重组的蛋白质的纯化含有重组pET30a-Bip质粒的大肠杆菌E.coli表达株BL21-(DE)生长在37℃含有卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中。当细胞生长达到0.6单位/OD600时，1mM的异丙基β-D硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)加入到培养基中，通过IPTG可诱导的表达载体启动子的驱动诱导重组蛋白质的表达，为了使得重组蛋白质最大量的表达，在37℃进一步培养4小时。通过离心沉淀细胞并且储藏在-70℃。
为了纯化重组细菌蛋白质，用连接缓冲液(20mM NaPO4，500mM NaCl，5mM Imidazole，1mM PMSF，1mg/ml溶菌酶，5单位/ml DNAse，0.1％TritonX-100，pH7.4)溶解细菌的沉淀物。通过离心澄清裂解液，除去不容物和细胞碎片。澄清裂的解液从一个5ml床体积用连接缓冲液平衡过的高截留亲和层析柱(Pharmacia)上面通过。非特异结合的蛋白质用三种洗脱缓冲液依照严格的条件下从柱上洗脱下来。首先用100ml的连接缓冲液进行洗脱。接下去严格的用低pH缓冲液(20mM NaPO4，500mM NaCl，0.1％TritonX-100，pH5.5)和100ml pH7.4缓冲液(20mM NaPO4，500mMNaCl，0.1％TritonX-100，50mM咪唑)洗脱。
组氨酸标记的重组蛋白质用50mM EDTA从柱上洗脱下来。洗脱下来的蛋白质用1×PBS透析过夜，以除去EDTA和Ni的污染。纯化的蛋白质是用一个截断50000Mw的浓缩柱(Millipore)，以无菌的PBS进行浓缩和洗脱。蛋白质的总量以SBA作为标准用二辛可酸试验通过分光光度计进行测定。
实验关节炎的免疫学研究在实验关节炎中抗体对p78的应答按照我们前面描述的方法在DBA/1小鼠中诱导胶原质关节炎(CIA)和姥鲛烷关节炎(PIA)。将不诱导关节炎的小鼠(15只)、诱导CIA的小鼠(16只)、诱导PIA的小鼠(14只)放血，。用重组p78通过酶联免疫试验(ELISA)测定小鼠血清中p78的抗体。用Nunc 96-孔ELISA板(Fisher Biotech，Orangeburg，NY)，每个孔包被(加)500ng p78(在100ml含5％脱脂奶的PBS中)，ELISA板置于4℃包被过夜。次日，用含0.05％吐温-20的PBS洗ELISA板3次后，加含5％脱脂奶的PBS，并置于4℃封闭过夜。次日，用含0.05％吐温-20的PBS洗ELISA板3次后加入用含脱脂奶的PBS作1∶200稀释的小鼠血清，置于4℃过夜。洗ELISA板后，加入用含脱脂奶和吐温-20的PBS作1∶500稀释的碱性磷酸化酶标记的羊抗小鼠Ig结合物(anti-Ig-AK，Fisher Biotec)。在37℃保温60分钟。用含吐温-20的PBS洗ELISA板3次后，在每一个孔中加100μl用二乙基对丙烯基苯酚胺缓冲液配制对硝基苯磷酸盐(PNPP片；Sigma Chemicals；St Louis)溶液。在避光的条件下，反应30min.，然后将ELISA板置于分光光度计(MolecularDevices，Menlo Park，CA)在405nm下读数。用SOFTmax分析软件分析数据。这特异的连结是从包被p78孔所读得的OD减去由未包被又未加血清的空白对照孔所读得的OD。抗体的水平用OD405单位来表示。
结果自身抗原的鉴定当RA和对照血清用软骨细胞抽提物为对照被印迹，30％的RA血清与相当10％的对照血清的一种78Kd蛋白质反应(图1)。用低能量的CAD测定三种胰蛋白酶肽的序列鉴定78kD带的一个组分，作为78kD葡萄糖调节的蛋白质，也是已知的重链结合蛋白质的免疫球蛋白(BiP)。分析来自关节炎软骨细胞cDNA的DNA序列，表明与一发表的(登记号X87949)有些偏差。共有六个单核甘酸取代和一个密码子插入，导致三个氨基酸取代和在p78的834-836位置插入一个精氨酸(登记号AF188611)。
风湿性关节炎免疫测试从23位患风湿性关节炎的病人和12位疾病对照的成对的外周血和滑膜液的单核细胞制备物测定T细胞增殖应答。结果23位风湿性关节炎的病人中有12位患者(52％)和12位疾病对照组中仅有2位表明增加了外周增殖(图2)增殖对风湿性关节炎外周T细胞的p78的应答显著的高于成对的外周血的应答(刺激指数，平均±SEMSF3.5±0.7；PB1.6±0.2；p＜0.01 Wilcoxon成对测试)滑膜液对风湿性关节炎的病人和疾病对照组之间的p78的应答也可以看出明显的差异(SISF 3.5±0.7；OIJD 1.4±0.2；p＝0.03 Mann Whitny U测试)因50％的应答者和非应答者是HLA-DR4阳性，所以与HLA-DR没有联系(数据没有示出)。
风湿性滑膜液T细胞增殖被p78抗-HLA-DR单克隆抗体L243(ATCC，Rockville，MD)抑制66％-84％。(数据没有示出)。除非用敏感到0.01ng％的ELISA测定，否则从成对的滑膜液和外周血单核细胞的上清液中不能测出IFNg。P78刺激后，用胞内莹光没能检测出RA患者(n＝7)或者健康对照的外周血T细胞有IFNg。(数据没有示出)。这些发现暗示应答T细胞不象是属于产生THl亚组{1461}的经典的IFNg。
实验关节炎的免疫研究用p78加弗氏完全佐剂对DBA/l，C57BL小鼠和Lewis大鼠免疫接种，没能导致关节炎发展。当注射CFA到HLA-DRl+/+(0/10鼠)或HLA-DR4+/-(0/5)鼠时，有一种类似的p78关节炎基因的缺少。
实验关节炎对p78的免疫应答尽管用p78免疫动物诱导关节炎没有成功，我们研究了DBA/l小鼠是在胶原过程(CIA)还是姥鲛烷(PIA)诱导产生关节炎抗体p78(图4)。在胶原关节炎开始反应时小鼠产生血清抗-p78抗体(O.D405.0.189±0.042，m±sem)与放血前的血清比较姥鲛烷(PIA)诱导关节炎(0.070±0.019；p＜versusCIA and p＜versusPIA，respectivly)。还有在PIA小鼠中这些抗体的浓度显著地比CIA小鼠中高(p)每组有十四只小鼠。
通过静脉给予p78胶原诱导关节炎的预防在有CIA或PIA的小鼠血清中存在p78的抗体，表明操作对p78的免疫应答通过一个旁路阻止其后CIA的发展。用含CFA的II型胶原免疫的一周前，静脉注射1mg p78到HLA-DRl+/+转基因小鼠(表2)。当用盐水予处理八周，其中83％的动物它们46％的肢与关节炎有关，在先前静脉给予p78处理的那组中，仅有10％的动物它们3％的肢与关节炎有关。这些差异非常显著(p＜-0.008和p＜-0.0001)。表2也表明在p78予处理的动物中抗胶原抗体明显的降低是对照组的1/3，抗胶原抗体的降低等同于同型的IgG1和IgG2(表3)这些动物的关节的组织学(图6)确认，p78予处理的小鼠的关节在临床上没有发现它们有滑膜炎。
在本研究中，通过Western blotting直接对人陪伴子BiP/GRP78和由我们明名的p78检测，表明了30％的RA病人有抗体。还有，来自风湿滑膜液的T细胞优选地扩散到p78。来自同样病人外周血的T细胞有最小的应答。来自另外炎症的关节炎病人的T细胞，不管是滑膜液还是外周血的，都没有显著地扩散到p78。最后，扩增受到抗-HLA-DR单克隆抗体的抑制认为CD4+阳性T细胞是对存在于HLA-DR的抗原的肽的应答。这种多克隆T细胞应答不限于HLA-DR4。这样，T-细胞扩增p78刺激作用期待类风湿的抗原有两个特性，即，它是关节和疾病特异的。根据这些观察，我们采用p78静脉免役小鼠，为了测试偏离对p78的应答会产生一个旁路机制阻止CIA的形成。事实上这是针对在HLADRl+/+转基因小鼠CIA的导入提供的一个总的预防方案。在过去，多种类型的实验关节炎通过细菌的、和特别真菌细菌的、比如HSP60或T细胞对完整的HSP60或特异的肽{2103，2280，2282，2283，2284，2281}应答的热休克蛋白质的给药已被制止和治疗。然而，它的某些值得注意的重要性是表明自身-HSP60肽没有这些保护作用{2281}。这样p-78制止CIA的能力是非常重要的。就我们所知，本研究描述的在RA发病时包含一个内源陪伴子和实验关节炎的免疫治疗的这些观察是属首例。RA的免疫治疗明显是可能的。
2.实验检测生物的液体和培养物上清中对p78的抗体例如凝集反应，Western blotting，和ELISA，这些技术可以被使用。
ELISA的方法用于检测血清中p78的抗体ELISA板一半用p78在重碳酸盐缓冲液中包被，另一半单独用重碳酸盐缓冲液包被，室温保温4小时。用PBS洗两次后，为了停止非特异的蛋白质吸附，用10％的羊血清含0.05％Tween20的PBS封闭板。两次进一步的冲洗后，双份稀释的血清(PBS中1％羊血清/0.05％Tween)加到被p78包被的和没有被p78包被的板的两边。洗四次后，将抗人免疫球蛋白的生物素(用PBS/1％羊血清0.05％Tween作1/10000的稀释)加到板上。板被冲洗六次。用辣根过氧化物酶标记的链霉亲和素结合物(用PBS/1％羊血清0.05％Tween作1/800的稀释)和适量的底物检测结合了生物素的抗体。用分光光度计测定血清含有的p78的抗体。这个实验成为风湿性关节炎诊断和/或予后实验的基础。
3.治疗的应用重组蛋白质或载体的许多给药途径，包括静脉，肌肉的，鼻，口，皮肤的和局部的是可能。用于治疗的目使用p78或衍生物有一些方法，包括如下a)黏膜耐药量的诱导通过黏膜，即，通过肠和鼻的黏膜的途径投递p78自身抗原或由其得到的肽，由于保留了病人的免疫系统其它方面保持原样降低疾病的活动改变了免疫应答。选择投递p78或p78的肽任意一种可以用作为编码他们的DNA质粒用一个适当的脯乳动物表达载体投递。
b)接种TCR肽疫苗T细胞受体Valpha和Vbeta链的CDR3区的肽可以被合成和可作为内皮或内黏膜注射投递的疫苗使用。编码这些肽的质粒能够以同样的方式使用。
c)天然或修饰的肽对MHC阻滞在适当的情况，非肠道或口的途径可以服用不管是用氨基酸取代基修饰或者没有修饰过的和/或化学基团连接的p78肽以便封闭MHC，特别是HLA-DR4由此导致T细胞活性的抑制和疾病。不管是天然的或者修饰的p78可以与可溶的HLA-DR4结合而且通过非肠道或口的途径应用。
d)DNA质粒免疫耐药量的诱导由DNA编码完整p78蛋白质或它的肽组成连到脯乳动物表达载体的质粒可以通过注射给药。DNA编码的人IL-10，IL-4，IL-11，或TGF-beta可以是单独地或任何结合地形式参与偏离对p78的免疫应答，有利于一种TH2的模式以便抑制疾病。上述指出的蛋白质或肽在治疗中可以用适当的组成，投递量的范围从大约0.1毫克到约1克或相当量的质粒或疫苗制剂。
附录1凝胶电泳的方法丙烯酰胺胶10％6.075ml丙烯酰胺(40％)(BDH，Poole，UK)3.35ml甲叉双丙烯酰胺(2％)(Pharmacia Biotech，Uoosala，Sweden)6.25ml丙烯酰胺胶缓冲液(见下面)9ml蒸馏水(实验室制备)250μl过硫酸胺(AMPERS)(Sigma-Aldrich，Poole，UK)(0.025mg在250μl蒸馏水中)25μl NNN′N′-四甲基乙二胺(TEMED)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)丙烯酰胺胶缓冲液pH8.81.5M Tris(tris(hydoxymethyl)aminomethane)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)用浓盐酸调pH0.4％十二烷基磺酸钠(SDS)(BDH-Merk，Poole，UK)浓缩胶0.2ml丙烯酰胺(40％)(BDH，Poole，UK)0.65ml双丙烯酰胺(2％)(Pharmacia Biotech，Uoosala，Sweden)3.15ml浓缩胶缓冲液(见下面)7.5ml蒸馏水(实验室制备)125μl过硫酸胺(AMPERS)(Sigma-Aldrich，Poole，UK)(0.025mg/250μl)12.5μl NNN′N′-四甲基乙二胺(TEMED)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)浓缩胶pH6.80.5M Tris(tris(hydoxymethyl)aminomethane)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)用浓盐酸调pH0.4％十二烷基磺酸钠(SDS)(BDH-Merk，Poole，UK)样品缓冲液2ml甘油2ml 10％十二烷基磺酸钠(SDS)(BDH-Merk，Poole，UK)0.25mg溴酚蓝2.5ml 4x浓缩胶缓冲液(0.5M Tris；0.4％SDS；pH6.8)0.5ml 2-巯基乙醇(Sigama-Aldrich，Poole，UK)电泳/走胶缓冲液3g/lTris(tris(hydoxymethyl)aminomethane)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)14.4g/l甘氨酸(BDH-Merk，Poole，UK)1g/l十二烷基磺酸钠(SDS)(BDH-Merk，Poole，UK)转移缓冲液3g/lTris(tris(hydoxymethyl)aminomethane)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)14.4g/l甘氨酸(BDH-Merk，Poole，UK)1g/l十二烷基磺酸钠(SDS)(BDH-Merk，Poole，UK)10％甲醇(BDH-Merk，Poole，UK)Tris吐温缓冲液盐(TTBS)2.4g/lTris(tris(hydoxymethyl)aminomethane)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)29g/l氯化钠(BDH-Merk，Poole，UK)500μl吐温-20(polyoxyethylene-sorbitan mono-laurate)(Sigama-Aldrich，Poole，UK)3％牛血清白蛋白(BSA)溶液3g牛白蛋白分部5(BDH-Merk，Poole，UK)100ml TTBS(见上面)
附录2表达的Bip重组人蛋白质的氨基酸序列。共1917个核苷酸启始于甲硫氨酸(启始密码)以6个组氨酸终止。
分子量70937.50道尔顿639个氨基酸86个强硷性氨基酸(K，R)108个强酸性氨基酸(D，E)204个疏水氨基酸(A，I，L，F，W，V)142极性氨基酸(N，C，Q，S，T，Y)等电点5.173pH7.0，电荷-20.041MEEDKKEDVGTVVGIDLGTTYSCVGVFKNGRVEIIANDQGNRITPSYVAFTPEGERLIGDAAKNQLTSNPENTVFDAKRLIGRTWNDPSVQQDIKFLPFKVVEKKTKPYIQVDIGGGQTKTFAPEEISAMVLTKMKETAEAYLGKKVTHAVVTVPAYFNDAQRQATKDAGTIAGLNVMRIINEPTAAAIAYGLDKREGEKNILVFDLGGGTFDVSLLTIDNGVFEVVATNGDTHLGGEDFDQRVMEHFIKLYKKKTGKDVRKDNRAVQKLRREVEKAKRALSSQHQARIEIESFYEGEDFSETLTRAKFEELNMDLFRSTMKPVQKVLEDSDLKKSDIDEIVLVGGSTRIPKIQQLVKEFFNGKEPSRGINPDEAVAYGAAVQAGVLSGDQDTGDLVLLDVCPLTLGIETVGGVMTKLIPRNTVVPTKKSQIFSTASDNQPTVTIKVYEGERPLTKDNHLLGTFDLTGIPPAPRGVPQIEVTFEIDVNGILRVTAEDKGTGNKNKITITNDQNRLTPEEIERMVNDAEKFAEEDKKLKERIDTRNELESYAYSLKNQIGDKEKLGGKLSSEDKETMEKAVEEKIEWLESHQDADIEDFKAKKKELEEIVQPIISKLYGSAGPPPTGEEDTAELHHHHHH
附录3用于表达重组人蛋白质的RT-PCR克隆并测序的grp78(Bip)片段。共1917个核苷酸。启始于ATG启始密码以6个组氨酸终止。ATGGAGGAGGACAAGAAGGAGGACGTGGGCACGGTGGTCGGCATCGACCTGGGGACCACCTACTCCTGCGTCGGCGTGTTCAAGAACGGCCGCGTGGAGATCATCGCCAACGATCAGGGCAACCGCATCACGCCGTCCTATGTCGCCTTCACTCCTGAAGGGGAACGTCTGATTGGCGATGCCGCCAAGAACCAGCTCACCTCCAACCCCGAGAACACGGTCTTTGACGCCAAGCGGCTCATCGGCCGCACGTGGAATGACCCGTCTGTGCAGCAGGACATCAAGTTCTTGCCGTTCAAGGTGGTTGAAAAGAAAACTAAACCATACATTCAAGTTGATATTGGAGGTGGGCAAACAAAGACATTTGCTCCTGAAGAAATTTCTGCCATGGTTCTCACTAAAATGAAAGAAACCGCTGAGGCTTATTTGGGAAAGAAGGTTACCCATGCAGTTGTTACTGTACCAGCCTATTTTAATGATGCCCAACGCCAAGCAACCAAAGACGCTGGAACTATTGCTGGCCTAAATGTTATGAGGATCATCAACGAGCCTACGGCAGCTGCTATTGCTTATGGCCTGGATAAGAGGGAGGGGGAGAAGAACATCCTGGTGTTTGACCTGGGTGGCGGAACCTTCGATGTGTCTCTTCTCACCATTGACAATGGTGTCTTCGAAGTTGTGGCCACTAATGGAGATACTCATCTGGGTGGAGAAGACTTTGACCAGCGTGTCATGGAACACTTCATCAAACTGTACAAAAAGAAGACGGGCAAAGATGTCAGGAAAGACAATAGAGCTGTGCAGAAACTCCGGCGCGAGGTAGAAAAGGCCAAACGGGCCCTGTCTTCTCAGCATCAAGCAAGAATTGAAATTGAGTCCTTCTATGAAGGAGAAGACTTTTCTGAGACCCTGACTCGGGCCAAATTTGAAGAGCTCAACATGGATCTGTTCCGGTCTACTATGAAGCCCGTCCAGAAAGTGTTGGAAGATTCTGATTTGAAGAAGTCTGATATTGATGAAATTGTTCTTGTTGGTGGCTCGACTCGAATTCCAAAGATTCAGCAACTGGTTAAAGAGTTCTTCAATGGCAAGGAACCATCCCGTGGCATAAACCCAGATGAAGCTGTAGCGTATGGTGCTGCTGTCCAGGCTGGTGTGCTCTCTGGTGATCAAGATACAGGTGACCTGGTACTGCTTGATGTATGTCCCCTTACACTTGGTATTGAAACTGTGGGAGGTGTCATGACCAAACTGATTCCAAGGAACACAGTGGTGCCTACCAAGAAGTCTCAGATCTTTTCTACAGCTTCTGATAATCAACCAACTGTTACAATCAAGGTCTATGAAGGTGAAAGACCCCTGACAAAAGACAATCATCTTCTGGGTACATTTGATCTGACTGGAATTCCTCCTGCTCCTCGTGGGGTCCCACAGATTGAAGTCACCTTTGAGATAGATGTGAATGGTATTCTTCGAGTGACAGCTGAAGACAAGGGTACAGGGAACAAAAATAAGATCACAATCACCAATGACCAGAATCGCCTGACACCTGAAGAAATCGAAAGGATGGTTAATGATGCTGAGAAGTTTGCTGAGGAAGACAAAAAGCTCAAGGAGCGCATTGATACTAGAAATGAGTTGGAAAGCTATGCCTATTCTCTAAAGAATCAGATTGGAGATAAAGAAAAGCTGGGAGGTAAACTTTCCTCTGAAGATAAGGAGACCATGGAAAAAGCTGTAGAAGAAAAGATTGAATGGCTGGAAAGCCACCAAGATGCTGACATTGAAGACTTCAAAGCTAAGAAGAAGGAACTGGAAGAAATTGTTCAACCAATTATCAGCAAACTCTATGGAAGTGCAGGCCCTCCCCCAACTGGTGAAGAGGATACAGCAGAACTCCACCACCACCACCACCAC
附录4用于表达重组人蛋白质的RT-PCR克隆并测序的grp78(Bip)片段。共1917个核苷酸。启始于ATG启始密码以6个组氨酸终止。□□ATGGAGGAGGACAAGAAGGAGGACGTGGGCACGGTGGTCGGCATCGACCTGGGGACCACCTACTCCTGCGTCGGCGTGTTCAAGAACGGCCGCGTGGAGATCATCGCCAACGATCAGGGCAACCGCATCACGCCGTCCTATGTCGCCTTCACTCCTGAAGGGGAACGTCTGATTGGCGATGCCGCCAAGAACCAGCTCACCTCCAACCCCGAGAACACGGTCTTTGACGCCAAGCGGCTCATCGGCCGCACGTGGAATGACCCGTCTGTGCAGCAGGACATCAAGTTCTTGCCGTTCAAGGTGGTTGAAAAGAAAACTAAACCATACATTCAAGTTGATATTGGAGGTGGGCAAACAAAGACATTTGCTCCTGAAGAAATTTCTGCCATGGTTCTCACTAAAATGAAAGAAACCGCTGAGGCTTATTTGGGAAAGAAGGTTACCCATGCAGTTGTTACTGTACCAGCCTATTTTAATGATGCCCAACGCCAAGCAACCAAAGACGCTGGAACTATTGCTGGCCTAAATGTTATGAGGATCATCAACGAGCCTACGGCAGCTGCTATTGCTTATGGCCTGGATAAGAGGGAGGGGGAGAAGAACATCCTGGTGTTTGACCTGGGTGGCGGAACCTTCGATGTGTCTCTTCTCACCATTGACAATGGTGTCTTCGAAGTTGTGGCCACTAATGGAGATACTCATCTGGGTGGAGAAGACTTTGACCAGCGTGTCATGGAACACTTCATCAAACTGTACAAAAAGAAGACGGGCAAAGATGTCAGGAAAGACAATAGAGCTGTGCAGAAACTCCGGCGCGAGGTAGAAAAGGCCAAACGGGCCCTGTCTTCTC · ·AGCATCAAGCAAGAATTGAAATTGAGTCCTTCTATGAAGGAGAAGACTTTTCTGAGACCCTGACTCGGGCCAAATTTGAAGAGCTCAACATGGATCTGTTCCGGTCTACTATGAAGCCCGTCCAGAAAGTGTTGGAAGATTCTGATTTGAAGAAGTCTGATATTGATGAAATTGTTCTTGTTGGTGGCTCGACTCGAATTCCAAAGATTCAGCAACTGGTTAAAGAGTTCTTCAATGGCAAGGAACCATCCCGTGGCATAAACCCAGATGAAGCTGTAGCGTATGGTGCTGCTGTCCAGGCTGGTGTGCTCTCTGGTGATCAAGATACAGGTGACCTGGTACTGCTTGATGTATGTCCCCTTACACTTGGTATTGAAACTGTGGGAGGTGTCATGACCAAACTGATTCCAAGGAACACAGTGGTGCCTACCAAGAAGTCTCAGATCTTTTCTACAGCTTCTGATAATCAACCAACTGTTACAATCAAGGTCTATGAAGGTGAAAGACCCCTGACAAAAGACAATCATCTTCTGGGTACATTTGATCTGACTGGAATTCCTCCTGCTCCTCGTGGGGTCCCACAGATTGAAGTCACCTTTGAGATAGATGTGAATGGTATTCTTCGAGTGACAGCTGAAGACAAGGGTACAGGGAACAAAAATAAGATCACAATCACCAATGACCAGAATCGCCTGACACCTGAAGAAATCGAAAGGATGGTTAATGATGCTGAGAAGTTTGCTGAGGAAGACAAAAAGCTCAAGGAGCGCATTGATACTAGAAATGAGTTGGAAAGCTATGCCTATTCTCTAAAGAATCAGATTGGAGATAAAGAAAAGCTGGGAGGTAAACTTTCCTCTGAAGATAAGGAGACCATGGAAAAAGCTGTAGAAGAAAAGATTGAATGGCTGGAAAGCCACCAAGATGCTGACATTGAAGACTTCAAAGCTAAGAAGAAGGAACTGGAAGAAATTGTTCAACCAATTATCAGCAAACTCTATGGAAGTGCAGGCCCTCCCCCAACTGGTGAAGAGGATACAGCAGAACTCCACCACCACCACCACCAC□□□□□□□□□来自数据库的Bip(grp78)的原始全长cDNA。登记号X87949。总长度2554核苷酸。
(previously published)□□aggtcgacgccggccaagacagcacagacagattgacctattggggtgtttcgcgagtgtgagagggaagcgccgcggcctgtatttctagacctgcccttcgcctggttcgtggcgccttgtgaccccgggcccctgccgcctgcaagtcggaaattgcgctgtgctcctgtgctacggcctgtggctggactgcctgctgctgcccaactggctggcaagatgaagctctccctggtggccgcgatgctgctgctgctcagcgcggcgcgggccgaggaggaggacaagaaggaggacgtgggcacggtggtcggcatcgacttggggaccacctactcctgcgtcggcgtgttcaagaacggccgcgtggagatcatcgccaacgatcagggcaaccgcatcacgccgtcctatgtcgccttcactcctgaaggggaacgtctgattggcgatgccgccaagaaccagctcacctccaaccccgagaacacggtctttgacgccaagcggctcatcggccgcacgtggaatgacccgtctgtgcagcaggacatcaagttcttgccgttcaaggtggttgaaaagaaaactaaaccatacattcaagttgatattggaggtgggcaaacaaagacatttgctcctgaagaaatttctgccatggttctcactaaaatgaaagaaaccgctgaggcttatttgggaaagaaggttacccatgcagttgttactgtaccagcctattttaatgatgcccaacgccaagcaaccaaagacgctggaactattgctggcctaaatgttatgaggatcatcaacgagcctacggcagctgctattgcttatggcctggataagagggagggggagaagaacatcctggtgtttgacctgggtggcggaaccttcgatgtgtctcttctcaccattgacaatggtgtcttcgaagttgtggccactaatggagatactcatctgggtggagaagactttgaccagcgtgtcatggaacacttcatcaaactgtacaaaaagaagacgggcaaagatgtcaggaaggacaatagagctgtgcagaaactccggcgcgaggtagaaaaggccaaggccctgtcttctcagcatcaagcaagaattgaaattgagtccttctatgaaggagaagacttttctgagaccctgactcgggccaaatttgaagagctcaacatggatctgttccggtctactatgaagcccgtccagaaagtgttggaagattctgatttgaagaagtctgatattgatgaaattgttcttgttggtggctcgactcgaattccaaagattcagcaactggttaaagagttcttcaatggcaaggaaccatcccgtggcataaacccagatgaagctgtagcgtatggtgctgctgtccaggctggtgtgctctctggtgatcaagatacaggtgacctggtactgcttcatgtatgtccccttacacttggtattgaaactgtaggaggtgtcatgaccaaactgattccaagtaatacagtggtgcctaccaagaactctcagatcttttctacagcttctgataatcaaccaactgttacaatcaaggtctatgaaggtgaaagacccctgacaaaagacaatcatcttctgggtacatttgatctgactggaattcctcctgctcctcgtggggtcccacagattgaagtcacctttgagatagatgtgaatggtattcttcgagtgacagctgaagacaagggtacagggaacaaaaataagatcacaatcaccaatgaccagaatcgcctgacacctgaagaaatcgaaaggatggttaatgatgctgagaagtttgctgaggaagacaaaaagctcaaggagcgcattgatactagaaatgagttggaaagctatgcctattctctaaagaatcagattggagataaagaaaagctgggaggtaaactttcctctgaagataaggagaccatggaaaaagctgtagaagaaaagattgaatggctggaaagccaccaagatgctgacattgaagacttcaaagctaagaagaaggaactggaagaaattgttcaaccaattatcagcaaactctatggaagtgcaggccctcccccaactggtgaagaggatacagcagaaaaagatgagttgtagacactgatctgctagtgctgtaatattgtaaatactggactcaggaacttttgttaggaaaaaattgaaagaacttaagtctcgaatgtaattggaatcttcacctcagagtggagttgaactgctatagcctaagcggctgtttactgcttttcattagcagttgctcacatgtctttgggtggggggggagaagaagaattggccatcttaa
附录4(续)aaagcgggtaaaaaacctgggttagggtgtgtgttcaccttcaaaatgttctatttaacaactgggtcatgtgcatctggtgtaggaagttttttctaccataagtgacaccaataaatgtttgttatttacactggtcaaaaaaaaaaaaaaaaa□表1 通过静脉注射重组p78预防CIA耐受原a关节炎小鼠％ 关节炎肢％ 对CII°的抗体在8周b在8周b(IgG)P78(1mg) 1/10(10％)*1/40(3％)**22±9***PBS 5/6(83％)11/24(46％)68±10a用PBS(阴性对照)或重组的p78静脉注射HLA-DR1+/+转基因小鼠。1mg的蛋白质溶在0.1ml的PBS中或0.1ml的PBS静脉注射。注射后七天，用有CFA的II型胶原免疫小鼠。
b免疫后8周报告的关节炎的发生率。
c免疫后8周收集血清，抗体用每组的平均值来表示。ELISA测试结果由测试血清和标准血清(具有50活性单位)比较得到的活性单位。血清是分别地被分析，结果用每组动物的平均值±SD来表示。
*p≤0.008(Fischer’s Exact test)**≤0.0001(Fischer’s Exact test)***＜0.05(Students t test).
表2用PBS或重组的p78静脉注射小鼠后II型胶原的同型抗体IgG1和IgG2耐受原a对II型胶原的IgG1抗体b对II型胶原的IgG2抗体bp78(1000μg)0.71±0.019*0.110±0.022PBS 0.135±0.066 0.250±0.044a用PBS(阴性对照)或重组的p78静脉注射HLA-DR1转基因小鼠七天后，接着用有CFA中的II型胶原免疫。
bELISA测试同表1的说明.*p＜0.05(Students t test).
表3 在CI或PIA小鼠血清(1∶200稀释)中的抗p78抗体减去空白和未包被的值小鼠ID 预先放血 CIA发作 PIA(小鼠ID#1-14)961 0.000 0.243 0.263982 0.181 0.328 0.981963 0.155 0.567 0.780965 0.076 0.198 0.934966 0.162 0.257 0.388967 0.068 0.000 0.291968 0.039 0.189 0.469970 0.000 0.000 0.551197 0.173 0.000 0.537198 0.023 0.000 0.711200 0.000 0.099 0.430248 0.000 0.183 0.535702 0.090 0.011 0.038703 0.012 0.206 0.147705 0.341706 0.407平均0.070 0.189 0.504计数141614SEM 0.019 0.042 0.07
图1显示6个风湿性关节炎血清(泳道1-6)，5个正常血清((泳道7-11)和4个病样对照(泳道12-15)与软骨瘤细胞裂解物反应的Western blotting。标出标准分子量。
图2刺激指数表示淋巴细胞在单核细胞中培养六天增殖；培养基中仅有p78时的增殖。刺激≥2.5认为是明显的。RAPB是指风湿性关节炎外周血；RASF是指风湿性关节炎滑膜液；OIJDPB是指其它的炎症关节疾病外周血；OHDSF是指其它的炎症关节疾病滑膜液。
图3通过ELISA测定实验诱导关节炎前(预先放血)、CIA和PIA发作小鼠血清中重组人p78的抗体，用OD405表示。
参考文献1 Gregersen PK，Silver J，Winchester RJ.The shared epitope hypothesis.Anapproach to understanding the molecular genetics of susceptibility torheumatoid arthritis.(共享抗原决定簇的假说.一种了解风湿性关节炎易感性的分子遗传的方法).Arthritis Rheurn.1987，301205-1213.2.Panayi GS.T cell dependent pathways in rheumatoid arthritis.(依赖于T-淋巴细胞途径的风湿性关节炎).Current Opinion in Rheumatology 1997；9236-240.3.Sakata A，Sakata K，Ping H，Ohmura T，Tsukano M，Kakimoto K.Successful induction of severe destrictive arthfiti～by the transfer ot～in vitroactivated synovial fluid T cells from patients with rheumatoid arthritis(RA)insevere combined immunodeficient(SCID)mice.(从有严重免疫缺欠关节炎病人体外活化的滑液T-细胞的转移试验成功的诱发了严重毁坏性的关节炎)Gin Exp Lmmunol 1996；104247-254.4.Ikeda Y，Masuko K，Nakai Y，et al.High frequencies of identical T cellclonotypes in synovial tissues of rheumatoid arthritis patients suggest theoccurrence of common antigen-driven immune responses.(风湿性关节炎病人滑膜液组织均一的T细胞的高发率暗示发生了免疫抗原免疫反应).Arthritis& Rheumatism 1996；39446-453.5.Uematsu Y.Wege H，Strauss A，et al.The T cell receptor repertoire in thesynovial fluid of a patient with rheumatoid arthritis is polyclonal.(风湿性关节炎病人滑膜液的T细胞受体的功能).Proc Natl Acnd Sci 1991；888534-8538.6.Cope AP，Sonderstrup G.Evaluating candidate autoantigens in rheumatoidarthritis.(风湿性关节炎病人自身免疫抗原的评估)Springer Seminars inImmunology 1998；2023-39.7.Lame VA.Early synovectomy in rheumatoid arthritis[Review][87 refs].(风湿性关节炎的早期滑膜切除)Annual Review of Medicine 1967；18173-184.8.Laskin RS.Total condylar knee replacement in patients who haverheumatoid arthritis.(风湿性关节炎病人髁膝盖的复位)A ten year follow-upstudy J Bone Jt Surg(Am)1991；72；529-535.9.Laemnili UK.Cleavage of structural proteins during the assembly of thehead ofbacteriophage T4.(T4噬菌体头部装配中结构蛋白质的降解).Nature1970；227；680-685.10 Towbin H～Staehelin I，Gordon T.(蛋白质从SDS的酸性/尿素胶电转移到硝酸纤维素膜上).Etectrophoretic transfer ofproteins from SDS and acid/ureagels to riitrocellulose IProc Nat Acad Sci 1979；76435011.Jobanputra P，Corrigall V.Panayi GS.Expression of the 65kD heat shockprotein in human chodrocytes.(人软骨细胞中热休克蛋白质的表达).Brit JRheumatol 1993；32；259-230.12.Bunce M，O’Neill CM，Barnaclo MCNM，et al.Phototypingcomprehensive DNA typing for HLA-A，B，C.DRB3，DRB5 and DQBl byPCR with 144 primer mixes utilising sequence-specific primers(PCR-SSP).(一套照片利用序列特异引物(PCR-SSP)，由144引物从HLA-A，B，C.DRB3，DR]B5 and DQBl PCR产生的DNA类型)Tissue Antigens 1995；46355-367.
REF*******Not found in the database“SAMPLE”14.Mossman TR，Cherwinski H.Bond MW，Giedlin MA，CoWman RL.Twotypes of murine I helper I cell clones I definition according to profiles oflympholcirie activities and secreted proteins.(按照淋巴活性因子及分泌的蛋白质的轮廓定义两种类型鼠T辅助T细胞克隆l).JImmunol 1986；136；2348-2356.15.Auger 1，Roudier J.A function for the QKRAA amina acid motifmediating binding of DnaJ to DnaK.Implications for the Association ofRheumatoid Arthiitis with HLADR4.(QKRAA氨基酸的功能调节DnaJ结合到DnaK，包含风湿性关节炎与HLADR4的关系).J Clin Invest 1997；991818-1822.16.van Shooten WCA，Devereux D，Ho CH，Aguilar BA，Rust CJJ.Jointderived T cells in rheumatoid arthritis react with self-immunoglobulin heavychains or immunoglobulin binding proteins that copurify with immunoglobulin.(风湿性关节炎T细胞得到的关节与自身免疫球蛋白重链或与免疫球蛋白共纯化的免疫球蛋白结合蛋白的反应)Eur JImmunol 1945；2393-98.17.Knarr G，Gething M，Modrow S，Buchner J.BiP binding sequences inantibodies.(抗体BiP连结序列)J Bio Cheui 1995；4627589-27594.18.Winfield JB.Stress proteins，arthritis and autoirmmunity.(应激蛋白质、关节炎和自身免疫).Arthritis & Rheum 1989；321497-150419.Srivastava PK，Menoret A，Basu S，Binder RJ，McQuade KL.Heat shockproteins come of agePrimitive functions acquire new roles in an adaptiveworld.(成人的热休克蛋白在适应环境中最初功能获得新的作用)Immunity 1998；8；657-665.20.Amold-Schild D，Hanau D，Spehner D，et at.Cutting Edgereceptor-mediated endocytosis of heat shock proteins by professional antigen-presentingcells.(刀口受体介导的通过细胞特异抗原热休克蛋白的细胞内吞作用)JImmunol 1999；1623757-3760.00000000000000002603*******Not found in the database“SAMPLE”22.BIa.ss S，Burmester G.Anti-BiP antibodies in rheumatoid arthritis；methodand test kits for detecting them.(Abstract)(检测风湿性关节炎抗BiP抗体的方法和检测试剂盒)(摘要)1999；WO 99/1813123.Rosloniec EF，Brand DD，Myers LK，et al.Induction of autoimmunearthritis in HLA-DR4(DRB1*0401)transgenic mice by immunization withhuman and bovine typeII collagen.(在转基因小鼠HLA-DR4(DRB1*0401)中用人和牛的II型胶原质免疫诱导自身免疫关节炎)J Immunol 1998；1602573-257824.Myers LK，Rosloniec EF，Crerrier MA.Kang AH.Collagen-inducedarthritis，an animal model ofautoimmunity.(胶原质诱导关节炎，一个动物的自身免疫原性模型).[Review][144 refs].Life Sciences 1997；611861-1878.25.Wooley PH，Si.td S.Whalen JD.Nasser S.Pristane-induced arthritis inmice.V.Susceptibility to pristane-induced arthritis is determined by the geneticregulation ofthe T cell repertoire.(在小鼠中姥姣烷诱导的关节炎中，通过T细胞遗传调节检测了姥鲛烷诱导的关节炎的易感性).Arthritis & Rheumatism1998；412022-2031.26.KouskoffV，Korganow A.，Due hatelle V，Degott C，Benoist C，Mathis D.Organ-specific disease provoked by systemic autoimrnunity.(由系统免疫激发的组织特异性疾病)Cell 1996；67；811-822.27.Verheijden GF，Rijnders AW，Bos E，et at.Human cartilage glycoprotein-39 as a candidate autoantigen in rheumatoid arthritis.(在风湿性关节炎中人软骨糖蛋白-39作为一个候选的自身抗原)Arthritis & Rheumatism 1997；401115-1125.28.Low-Friedrich[，Weisensee D，Mi.trou P，Schoeppe W.Cytokines inducestress protein formation in cultured cardiac myocytes.(在心脏肌细胞培养中细胞因子诱导应激蛋白的形成)Basic Research in Cardiology 1992；8712-18.29.Haskins K.Wegmann D.Diabetogenic T-cell clones.(致糖尿病的T细胞克隆)[Review][49 refs].Diabetes 1996；451299-1305.30.Hirvonen MR.Brune B，Lapetina EG.Heat shock proteins and macrophageresistance to the toxic effects of nitric oxide.(热休克蛋白和巨噬细胞对氧化氮毒性的抗性)Biochemical Journal 1996；315845-849.31.Beech JT，Siew LK，Ghoraishian M，Stasiuk LM.，Elson CJ，Thompson SI.CD4+T1i2 cells specific for mycobactetial 65-kilodaiton heat shock proteinprotect against pristane-induced arthritis.(分枝杆菌65kD热休克蛋白对姥鲛烷诱导的关节炎CD4+，Th2细胞的特性)J Immunol 1997；1593692-3697.32.van Eden W，Thole SE，van der Zee R，et aJ.Cloning of the mycobacterialepitope recognized by T lymphocytes in adjuvant arthritis.(由有佐剂的关节炎T淋巴细胞识别的分枝杆菌抗原决定簇的克隆)Nature 1988；331171-173.33.van den Broek MF，Hogervorst EJ，van，der Zee R，et al.Protection againststreptococcal cell wall-induced arthritis by pretreatment with the 65-kDmycobacterial heat shock protein.(用分枝杆菌65-kD热休克蛋白预处理的对链球菌细胞璧诱导关节炎的保护作用)J Exp Med 1989；170449466.34.Thompson SJ，Rook GA，Brealey RJ，van，der Zee R，Elson CJ.Autoimmune reactions to heat-shock proteins in pristane-induced arthritis.(姥鲛烷诱导的关节炎对热休克蛋白的自身免疫反应).Eur J Immunol 1990；2024 79-2484.35.Bilhingha.rn ME，Carney S，Butler R，Colston MJ.A mycobacterial 65-kDheat shock protein induces antigen-specific suppression of adjuvant arthritis，but is not itself arthritogenic.(分枝杆菌热休克蛋白诱导佐剂关节炎的抗原特异抑制，而自身不能导致关节炎)J Exp Mcd 1990；171339-344.36.Anderton SM，van der，Zee R，et at Activation of T cells recognizing self60-kD heat shock protein can protect against experimental arthritis.(自身识别60-kD热休克蛋白的T细胞的活性能够保护实验关节炎).J Exp Med 1995；181943-952.
序列表<110>KING’S COLLEGE LONDONPANAYI，GABRIEL SCORRIGALL，VALERIE MBODMAN-SMITH，MARK DFIFE，MARK SLANCHBURY，JEREMY S<120>炎症疾病的治疗<130>N8862<140><141><150>GB9822115.3<151>1998-10-09<160>5<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>639<212>蛋白质<213>人类<400>1Met Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly Ile Asp1 5 10 15Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly Arg Val20 25 30Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val35 40 45Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn50 55 60Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu65 70 75 80Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile Lys Phe85 90 95Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile Gln Val
100 105 110Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu Ile Ser115 120 125Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly130 135 140Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp145 150 155 160Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn165 170 175Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly180 185 190Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly195 200 205Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly Val Phe210 215 220Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe225 230 235 240Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys Lys Thr245 250 255Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu Arg Arg260 265 270Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala Arg275 280 285Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr Leu290 295 300Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser Thr305 310 315 320Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys Ser325 330 335Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys340 345 350Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser Arg
355 360 365Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala370 375 380Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu Asp385 390 395 400Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr405 410 415Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile420 425 430Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val Tyr435 440 445Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr Phe450 455 460Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu465 470 475 480Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala Glu485 490 495Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Gln500 505 510Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala Glu515 520 525Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr Arg530 535 540Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly Asp545 550 555 560Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr Met565 570 575Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln Asp580 585 590Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu Ile595 600 605Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro Pro
610 615 620Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu His His His His His His625 630 635<210>2<21l>633<212>蛋白质<213>人类<400>2Met Glu Glu Asp Lys Lys Glu Asp Val Gly Thr Val Val Gly Ile Asp1 5 10 15Leu Gly Thr Thr Tyr Ser Cys Val Gly Val Phe Lys Asn Gly Arg Val20 25 30Glu Ile Ile Ala Asn Asp Gln Gly Asn Arg Ile Thr Pro Ser Tyr Val35 40 45Ala Phe Thr Pro Glu Gly Glu Arg Leu Ile Gly Asp Ala Ala Lys Asn50 55 60Gln Leu Thr Ser Asn Pro Glu Asn Thr Val Phe Asp Ala Lys Arg Leu65 70 75 80Ile Gly Arg Thr Trp Asn Asp Pro Ser Val Gln Gln Asp Ile Lys Phe85 90 95Leu Pro Phe Lys Val Val Glu Lys Lys Thr Lys Pro Tyr Ile Gln Val100 105 110Asp Ile Gly Gly Gly Gln Thr Lys Thr Phe Ala Pro Glu Glu Ile Ser115 120 125Ala Met Val Leu Thr Lys Met Lys Glu Thr Ala Glu Ala Tyr Leu Gly130 135 140Lys Lys Val Thr His Ala Val Val Thr Val Pro Ala Tyr Phe Asn Asp145 150 155 160Ala Gln Arg Gln Ala Thr Lys Asp Ala Gly Thr Ile Ala Gly Leu Asn165 170 175Val Met Arg Ile Ile Asn Glu Pro Thr Ala Ala Ala Ile Ala Tyr Gly180 185 190Leu Asp Lys Arg Glu Gly Glu Lys Asn Ile Leu Val Phe Asp Leu Gly195 200 205Gly Gly Thr Phe Asp Val Ser Leu Leu Thr Ile Asp Asn Gly Val Phe210 215 220Glu Val Val Ala Thr Asn Gly Asp Thr His Leu Gly Gly Glu Asp Phe225 230 235 240Asp Gln Arg Val Met Glu His Phe Ile Lys Leu Tyr Lys Lys Lys Thr245 250 255Gly Lys Asp Val Arg Lys Asp Asn Arg Ala Val Gln Lys Leu Arg Arg260 265 270Glu Val Glu Lys Ala Lys Arg Ala Leu Ser Ser Gln His Gln Ala Arg275 280 285Ile Glu Ile Glu Ser Phe Tyr Glu Gly Glu Asp Phe Ser Glu Thr Leu290 295 300Thr Arg Ala Lys Phe Glu Glu Leu Asn Met Asp Leu Phe Arg Ser Thr305 310 315 320Met Lys Pro Val Gln Lys Val Leu Glu Asp Ser Asp Leu Lys Lys Ser325 330 335Asp Ile Asp Glu Ile Val Leu Val Gly Gly Ser Thr Arg Ile Pro Lys340 345 350Ile Gln Gln Leu Val Lys Glu Phe Phe Asn Gly Lys Glu Pro Ser Arg355 360 365Gly Ile Asn Pro Asp Glu Ala Val Ala Tyr Gly Ala Ala Val Gln Ala370 375 380Gly Val Leu Ser Gly Asp Gln Asp Thr Gly Asp Leu Val Leu Leu Asp385 390 395 400Val Cys Pro Leu Thr Leu Gly Ile Glu Thr Val Gly Gly Val Met Thr405 410 415Lys Leu Ile Pro Arg Asn Thr Val Val Pro Thr Lys Lys Ser Gln Ile420 425 430Phe Ser Thr Ala Ser Asp Asn Gln Pro Thr Val Thr Ile Lys Val Tyr435 440 445Glu Gly Glu Arg Pro Leu Thr Lys Asp Asn His Leu Leu Gly Thr Phe450 455 460Asp Leu Thr Gly Ile Pro Pro Ala Pro Arg Gly Val Pro Gln Ile Glu465 470 475 480Val Thr Phe Glu Ile Asp Val Asn Gly Ile Leu Arg Val Thr Ala Glu485 490 495Asp Lys Gly Thr Gly Asn Lys Asn Lys Ile Thr Ile Thr Asn Asp Gln500 505 510Asn Arg Leu Thr Pro Glu Glu Ile Glu Arg Met Val Asn Asp Ala Glu515 520 525Lys Phe Ala Glu Glu Asp Lys Lys Leu Lys Glu Arg Ile Asp Thr Arg530 535 540Asn Glu Leu Glu Ser Tyr Ala Tyr Ser Leu Lys Asn Gln Ile Gly Asp545 550 555 560Lys Glu Lys Leu Gly Gly Lys Leu Ser Ser Glu Asp Lys Glu Thr Met565 570 575Glu Lys Ala Val Glu Glu Lys Ile Glu Trp Leu Glu Ser His Gln Asp580 585 590Ala Asp Ile Glu Asp Phe Lys Ala Lys Lys Lys Glu Leu Glu Glu Ile595 600 605Val Gln Pro Ile Ile Ser Lys Leu Tyr Gly Ser Ala Gly Pro Pro Pro610 615 620Thr Gly Glu Glu Asp Thr Ala Glu Leu625 630<210>3<211>1917<212>DNA<213>人类<400>3atggaggagg acaagaagga ggacgtgggc acggtggtcg gcatcgacct ggggaccacc 60tactcctgcg tcggcgtgtt caagaacggc cgcgtggaga tcatcgccaa cgatcagggc 120aaccgcatca cgccgtccta tgtcgccttc actcctgaag gggaacgtct gattggcgat 180gccgccaaga accagctcac ctccaacccc gagaacacgg tctttgacgc caagcggctc 240atcggccgca cgtggaatga cccgtctgtg cagcaggaca tcaagttctt gccgttcaag 300gtggttgaaa agaaaactaa accatacatt caagttgata ttggaggtgg gcaaacaaag 360acatttgctc ctgaagaaat ttctgccatg gttctcacta aaatgaaaga aaccgctgag 420gcttatttgg gaaagaaggt tacccatgca gttgttactg taccagccta ttttaatgat 480gcccaacgcc aagcaaccaa agacgctgga actattgctg gcctaaatgt tatgaggatc 540atcaacgagc ctacggcagc tgctattgct tatggcctgg ataagaggga gggggagaag 600aacatcctgg tgtttgacct gggtggcgga accttcgatg tgtctcttct caccattgac 660aatggtgtct tcgaagttgt ggccactaat ggagatactc atctgggtgg agaagacttt 720gaccagcgtg tcatggaaca cttcatcaaa ctgtacaaaa agaagacggg caaagatgtc 780aggaaagaca atagagctgt gcagaaactc cggcgcgagg tagaaaaggc caaacgggcc 840ctgtcttctc agcatcaagc aagaattgaa attgagtcct tctatgaagg agaagacttt 900tctgagaccc tgactcgggc caaatttgaa gagctcaaca tggatctgtt ccggtctact 960atgaagcccg tccagaaagt gttggaagat tctgatttga agaagtctga tattgatgaa 1020attgttcttg ttggtggctc gactcgaatt ccaaagattc agcaactggt taaagagttc 1080ttcaatggca aggaaccatc ccgtggcata aacccagatg aagctgtagc gtatggtgct 1140gctgtccagg ctggtgtgct ctctggtgat caagatacag gtgacctggt actgcttgat 1200gtatgtcccc ttacacttgg tattgaaact gtgggaggtg tcatgaccaa actgattcca 1260aggaacacag tggtgcctac caagaagtct cagatctttt ctacagcttc tgataatcaa 1320ccaactgtta caatcaaggt ctatgaaggt gaaagacccc tgacaaaaga caatcatctt 1380ctgggtacat ttgatctgac tggaattcct cctgctcctc gtggggtccc acagattgaa 1440gtcacctttg agatagatgt gaatggtatt cttcgagtga cagctgaaga caagggtaca 1500gggaacaaaa ataagatcac aatcaccaat gaccagaatc gcctgacacc tgaagaaatc 1560gaaaggatgg ttaatgatgc tgagaagttt gctgaggaag acaaaaagct caaggagcgc 1620attgatacta gaaatgagtt ggaaagctat gcctattctc taaagaatca gattggagat 1680aaagaaaagc tgggaggtaa actttcctct gaagataagg agaccatgga aaaagctgta 1740gaagaaaaga ttgaatggct ggaaagccac caagatgctg acattgaaga cttcaaagct 1800aagaagaagg aactggaaga aattgttcaa ccaattatca gcaaactcta tggaagtgca 1860ggccctcccc caactggtga agaggataca gcagaactcc accaccacca ccaccac1917<210>4<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>4tatacatatg gaggaggaca agaaggagga cg 32<210>5<211>32<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述引物<400>5ccacctcgag ttctgctgta tcctcttcac ca 3权利要求
1.免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD)或一种从其衍生的肽作为表明风湿性关节炎存在的试剂的应用。
2.按照权利要求1所述的蛋白质BiP(78KD)的应用，其中该蛋白质具有序列表中SE1或SE2的氨基酸序列。
3.具有序列表中SE1或SE2的氨基酸序列的蛋白质BiP(78KD)。
4.重组BiP(78KD)。
5.一种用于关节炎预后或诊断的测试，其中用于体液测试的试剂是免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD)，或一种由此得到的肽。
6.按照权利要求5所述的测试，是一种ELISA测试。
7.按照权利要求5所述的测试，是一种Western Blot测试。
8.用于治疗的免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD)，或一种由其衍生的肽。
9.用于风湿性关节炎治疗的免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(GRP78)，或一种由其衍生的肽。
10.一种用于治疗的编码免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD)，或由其衍生的肽的DNA序列。
11.一种用于风湿性关节炎治疗的编码免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD)，或由其衍生的肽的DNA序列。
12.一种DNA序列，它具有或含有序列表中SE3的核苷酸序列。
13.一种重组载体，它含有权利要求12所述的DNA序列。
14.一种用于风湿性关节炎测试的方法，使用蛋白质BiP(78KD)或编码它的cDNA序列来确定针对所述的蛋白质抗体的存在。
15.一种治疗风湿性关节炎的方法，包括施用蛋白质BiP(78KD)或编码它的cDNA。
16.按照权利要求15所述的方法，其中施用方法是通过静脉，鼻，口，或皮的途径进行的。
17.一种能够表达蛋白质BiP(78KD)的重组生物体。
全文摘要
免疫球蛋白重链结合蛋白质BiP(78KD),或一种由其衍生的肽,为风湿性关节炎的存在提供了一种指示试剂。所使用的蛋白质是一种具有所述序列的重组蛋白质BiP(78KD)。关节炎预后或诊断的测试可以用ELISA或Western Blot方法。本发明也包括一种检测风湿性关节炎的方法,用蛋白质BiP(78KD)或编码它的cDNA序列测定所述的蛋白质抗体的存在。本发明也包括一种治疗风湿性关节炎的方法,包括施用蛋白质BiP(78KD)或编码它的cDNA,并通过静脉,鼻,口,或皮的途径进行。
文档编号A61K48/00GK1322213SQ9981184
公开日2001年11月14日 申请日期1999年10月8日 优先权日1998年10月9日
发明者加布里埃尔·斯塔夫罗斯·帕纳伊, 瓦莱丽·马丽·科里加尔, 马克·邓肯·博德曼－史密斯, 马克·斯图尔特·菲费, 杰里米·肖恩·兰特博里 申请人:伦敦皇家学院