来自肺炎链球菌的人补体c3降解性多肽的制作方法

专利名称：来自肺炎链球菌的人补体c3降解性多肽的制作方法
技术领域：
本发明涉及肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)且特别涉及一种肺炎链球菌多肽的鉴定，该多肽能够降解人补体蛋白C3。
背景技术：
肺炎链球菌造成的呼吸道感染每年引起估计约500,000例肺炎及47,000人死亡。对细菌性肺炎链球菌感染具有高危险性者为二岁以下的婴儿，免疫系统功能受损的个人及老年人。在这些族群中，肺炎链球菌为细菌性肺炎及脑膜炎的主要原因。进而，肺炎链球菌为所有年龄儿童的耳感染主因。儿童与老人两者在细菌移生(colonization)，局部或全身感染后或以纯化多醣免疫接种后，对于肺炎链球菌荚膜多醣的保护性抗体的合成有障碍。肺炎链球菌对于HIV感染的成人或儿童而言皆为侵入性细菌吸呼道疾病的主因，并在这些病人身上引发出血性感染(Connor等人，Current Topics in AIDS1987；1185-209及Janoff等人，Ann.Intern.Med.1992117(4)314-324)。
对于严重感染显示最大危险性的个体无法对现有荚膜多醣疫苗产生抗体。结果，目前有四种结合(conjugate)疫苗进入临床试验阶段。结合疫苗包括与蛋白质载体或佐剂结合的肺炎链球菌荚膜多醣，希望能加强抗体反应。然而，在临床试验中的结合疫苗另有其它潜在难题。例如，在美国极为盛行的肺炎链球菌血清型与在例如以色列，西欧，南非或斯堪地那维亚等地最常见的血清型不同。因此，在一个局部地域有利的疫苗在另一个地区可能是不利的。至于修饰目前可用荚膜多醣疫苗或发展蛋白质结合物作为适应地域血清型差异的荚膜疫苗的潜在需求，则产生令人止步的金钱及技术上的复杂性。因此，对于肺炎链球菌感染的预防及配制广泛保护性肺炎链球菌疫苗而言，在不同的有毒力的血清型中找寻具有全世界保守性的免疫原性外露蛋白质是至为重要的。而且，全世界性地出现青霉素及头芽孢素抗药性肺炎链球菌，使得对于有效疫苗的需求至为迫切(Baquero等人，J.Antimicrob.Chemother.1991；28S；31-8)。
有数个肺炎链球菌蛋白质已被提出与肺炎链球菌荚膜多醣结合或作为单一免疫原来激发对抗肺炎链球菌的免疫反应。已有报导指出，与肺炎链球菌粘附至呼吸道上皮细胞相关的表面蛋白质包括PsaA，PspC/CBP112及IgA1蛋白酶(Sampson等人，Infect.Immun.1994；62319-324，Sheffield等人，Microb.Pathogen.1992；13261-9及Wani等人Infect.Immun.1996；643967-3974)。对抗这些粘附蛋白的抗体可以抑制肺炎链球菌粘附至呼吸道上皮细胞，从而减少移生。其它如肺炎链球菌溶血素、自溶素、神经氨酸酶或透明质酸酶的细胞质肺炎链球菌蛋白质被提出作为疫苗抗原，因为抗体可以潜在性阻止这些蛋白质在肺炎链球菌感染病人身上的毒性作用。然而，这些蛋白质通常并非位于肺炎链球菌的表面，而是当细胞溶解及死亡时自细菌分泌出或释放出(Lee等人，Vaccine 1994；12875-8及Berry等人，Infect.Immun.1994；621101-1108)。虽然使用这些胞质蛋白作为免疫原可以缓和肺炎链球菌感染的晚期影响，但对抗这些蛋白质的抗体既不会促进肺炎链球菌死亡，也不会防止最初或后续的肺炎链球菌移生。
正在进行肺炎链球菌疫苗试验的原型表面蛋白为肺炎链球菌表面蛋白质A(PspA)。PspA为约70-140kDa的异源蛋白。PspA的结构包括在氨基端的α螺旋，接着是富含脯氨酸的序列，且在羧端以一系列的11个胆碱结合性重复序列作为结束。虽然与其结构相关的许多信息均为已知，PspA在不同肺炎链球菌血清型之间并无结构保守性，且其功能完全未知(Yother等人，J.Bacteriol.1992；174601-9及Yother，J.Bacteriol.1994；1762976-2985)。研究已经证实了PspA在动物的免疫原性(McDaniel等人，Microb.Pathogin.1994；17323-337)。虽然PspA具有免疫原性，其作为疫苗抗原的能力却因PspA的异源性、其以四个结构群存在以及其未予定性的功能而使情形变得复杂。
在无法对型-特异性多醣荚膜产生保护性抗体的病人身上，补体的第三种成份C3及替代补体路径相关的蛋白质构成宿主对抗肺炎链球菌感染的第一道防线。因为补体蛋白质不能穿透肺炎链球菌的坚固的细胞壁，调理性C3b在肺炎链球菌表面的沉积成为清除肺炎链球菌的主要媒介物。肺炎链球菌与血浆中C3之间的相互作用已知会在肺炎链球菌性菌血症时发生，此时C3b(C3的调理活性片段)的共价结合激活吞噬细胞的识别和吞噬(Johnston等人，J.Exp.Med.1969；1291275-1290，Hasin HE，J.Immunol.1972；10926-31及Hostetter等人，J.Infect.Dis.1984；150653-61)。C3b沉积在肺炎链球菌荚膜及细胞壁上。然而，这种控制肺炎链球菌感染的方法的效果相当差。激发肺炎链球菌调理作用的方法能改善此微生物引发的疾病过程。目前对于限制肺炎链球菌感染的方法及治疗仍有强烈需求。
发明概述本发明涉及鉴定及使用肺炎链球菌所表现的人补体C3降解性多肽(蛋白质)家族。这些多肽宜具有约15kDa至约25kDa或约75kDa至约95kDa的分子量，该分子量例如是在10％SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳上测得的。本发明包括自肺炎链球菌的不同C3-降解性菌株所能分离的许多蛋白质。
一方面，本发明涉及与SEQ ID NO2或SEQ ID NO5具有至少80％序列相同性的分离的多肽。在较佳的实施方案中，该多肽系分离自肺炎链球菌，或者该多肽是重组多肽。较佳的是，该分离的多肽降解人补体蛋白C3。本发明优选的多肽为具有包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5的氨基酸序列的分离的多肽，更佳的是该氨基酸序列，即SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。术语「分离的」在本文意指已由其自然环境移出的天然存在的物质或合成的物质。术语「多肽」在本文中包括肽、多肽及蛋白质，不论其长度如何。较佳的是，本发明多肽包含一或多个功能性单元，这些单元包括降解人类补体C3蛋白质的多肽。
因此，本发明还涉及自本发明C3-降解性蛋白分离出的多肽片段。此类片段包括在本说明书中所使用的术语「多肽」内。较佳的是，本发明提供了至少15个连续氨基酸的多肽，其衍生自与SEQ ID NO2或SEQ ID NO5具有80％序列相同性的蛋白质，且更佳的是提供SEQ ID NO2或SEQ ID NO5中至少15个连续氨基酸的多肽。在本发明另一方面，该较佳的多肽能够降解人补体蛋白C3。
另一方面，本发明涉及能较佳地降解人补体蛋白C3的分离的多肽，其中编码该分离多肽的核酸可与SEQ ID NO1或SEQ ID NO4或其互补链的一部分在高度严谨杂交条件下杂交。较佳的是，该多肽包括至少15个连续氨基酸，更佳的是SEQ ID NO2或SEQ ID NO5中的至少15个连续氨基酸。
另一方面，本发明涉及具有人C3降解活性减少或不会降解人类C3的多肽；然而，编码此群多肽的核酸各自包含可与编码人类C3降解性多肽的核酸或可与个别核酸杂交的核苷酸序列。后一多肽群具有降低的或不具有人类C3降解活性，在本说明书被称为「非降解性」多肽。非降解性多肽与C3降解性多肽的差别可为一或多个氨基酸。氨基酸的改变可为置换、改变或缺失一或多个氨基酸。不同类型的氨基酸改变将在本说明书中讨论。编码非降解性多肽的核酸为本发明另外的较佳实施方案。
本发明还涉及免疫系统刺激性组合物(优选的是疫苗)，其包括有效量的本发明免疫系统刺激性多肽以及治疗上可接受的载体，该多肽宜分离自肺炎链球菌。在一个实施方案中，该免疫系统刺激性组合物或疫苗还包括至少一种分离自肺炎链球菌的其它免疫系统刺激性多肽。
本发明还涉及一种能与本发明多肽(至少一部分)结合(通常为特异性结合)的抗体。在一个实施方案中，该抗体为单克隆抗体，且在另一个实施方案中，该抗体为多克隆抗体。在另一实施方案中，该抗体为抗体片段。该抗体或抗体片段可得自小鼠，大鼠，山羊，鸡，人，或兔。
本发明还涉及可与SEQ ID NO1或SEQ ID NO4或其互补链在高度严谨的杂交条件下进行杂交的分离的核酸分子(即多核苷酸，其可为单链或双链，且其可为大分子(如载体)的部分或片段)。在本文中所指的高度严谨杂交条件包括，例如，以6X SSC，5X Denhardt，0.5％SDS，及100微克/毫升片段化及变性鲑精DNA在65℃杂交过夜，并在2X SSC，0.1％SDS中室温下清洗一次约10分钟，接着于65℃清洗一次约15分钟，接着在0.2X SSC，0.1％SDS中室温下清洗至少一次至少3-5分钟。在一个实施方案中，该核酸片段系分离自肺炎链球菌，且在另一个实施方案中，该核酸分子编码一个多肽。在一个实施方案中，该多肽降解人补体蛋白C3。在另一实施方案中，该核酸分子编码一种不会降解人类补体C3的多肽。
在另一实施方案中，该核酸分子是在载体中(即，其为核酸载体的片段)，且该载体是能够生产多肽的表达载体。包含该核酸分子的细胞亦包括在本发明中。在一个实施方案中，该细胞为细菌或真核细胞。
本发明还涉及包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO4核酸序列或其互补链的分离的核酸分子。本发明还涉及由包括SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的双链DNA所转录的RNA分子。
本发明另一方面涉及一种在哺乳动物(特别是人类)中产生对抗肺炎链球菌的免疫反应的方法。该方法包括将一组合物给予哺乳动物，以产生对抗该多肽的免疫反应，该组合物包括治疗有效量的本发明多肽及医药上可接受的载体。该免疫反应可为B细胞反应、T细胞反应、上皮细胞反应或内皮细胞反应。在一个较佳的实施方案中，该组合物为疫苗组合物。较佳的是，该蛋白质为至少15个氨基酸长，亦较佳的是该组合物还包括至少一种来自肺炎链球菌的其它免疫系统刺激性多肽。在一个实施方案中，该多肽包括SEQ ID NO2或SEQ ID NO5中的至少15个氨基酸。
本发明还涉及来自肺炎链球菌的约15kDa至约25kDa或约75kDa至约95kDa的能降解人类补体C3的分离的多肽，并涉及一种抑制肺炎链球菌-介导的C3降解作用的方法。该方法包括使肺炎链球菌细菌接触一抗体，而该抗体能与本发明多肽(其至少一部份)结合。
本发明还涉及一种抑制C3-介导的发炎反应及异种移植时排斥作用的方法。该方法包括在异种移植时所用的动物器官表面上表达本发明多肽。此方法特别有利于在例如猪肾来表达本发明所述多肽，从而抑制异种移植后的C3介导的发炎。
本发明还涉及一种分离的核酸分子，其包含一至少15个核苷酸的区域，该区域可与SEQ ID NO1或SEQ ID NO4或其互补链中至少一部分在高度严谨的杂交条件下杂交。
本发明还涉及具有如SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ ID NO8及SEQ ID NO9所示核酸序列的分离的DNA分子或引物。
附图简述

图1提供本发明的C3-降解性多肽(约20kDa)基因的翻译部份的核酸序列(SEQ IDNO1)。
图2提供本发明的C3-降解性多肽(约20kDa)基因的氨基酸序列(SEQ ID NO2)。
图3提供本发明的C3-降解性多肽(约20kDa)基因的氨基酸序列，其与编码本发明C3-降解性多肽基因的核酸序列(双链)并列(SEQ ID NOS1-3，其中SEQ ID NOS3为SEQ IDNOS1的互补序列)。
图4提供预测的92kDa氨基酸序列的核酸序列(SEQ ID NO4)。
图5提供预测的92kDa氨基酸序列(SEQ ID NO5)。
图6显示SEQ ID NO1与部份SEQ ID NO4的序列比对。
图7显示SEQ ID NO2与部份SEQ ID NO5的序列比对。
图8数种肺炎链球菌全细胞溶解物以多克隆抗-～r20kDa血清进行的Western印迹分析。分子量标记在泳道1；来自pDF122的重组性20kDa多肽在泳道2；来自第7型的重组性92kDa多肽在泳道3；泳道4为空白；CP1200全细胞溶解物在泳道5；第3型全细胞溶解物在泳道6；第7型全细胞溶解物在泳道7。该抗血清可辨识约20kDa及约92kDa的重组性多肽，但在全细胞溶解物中只能识别较大的多肽。
图9显示经由本发明20kDa及92kDa多肽降解的生物素化C3的放射自显影图。
图10经由本发明20kDa(泳道A8)及92kDa(泳道C8)多肽降解的考马斯蓝染色的7.5％SDS-PAGE分析。
图11为显示SC(皮下)接种r79kDa蛋白质(佐剂为MPL)并以肺炎链球菌第3型进行IN(鼻内)攻击后CBA/CAHN xid/J老鼠存活率的图形。
图12为实施例8所述的SDS-PAGE凝胶。
较佳实施方案详述本发明涉及鉴定及分离约75kDa至约95kDa的较大多肽的人补体C3降解性多肽片段。此片段具有分子量约为20kDa(±5kDa)(在10％ SDS-PAGE上)。本发明还涉及编码人类补体C3降解性多肽的核酸。
已观察到来自数个血清型的肺炎链球菌在对数期生长阶段的培养物能首先降解C3的α-链随后降解β-链，不会产生既有定义的C3切割片段(Angel等人，J.Infect.Dis.170600-608，1994)。此类不发生切割的降解形式实质上不同于其它微生物的产物，如绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)的弹性蛋白酶及溶组织内阿米(Entamoebahistolytica)的半胱氨酸蛋白酶。
在本文中所使用的术语「降解」意指将氨基酸自蛋白质性分子移除，产生肽或多肽。本发明的多肽降解C3而不会产生已知的C3b，iC3b或C3d切割片段。本发明的C3-降解性多肽对于C3有一些程度的偏好，例如，该C3-降解性多肽并不会降解其它的蛋白质，如白蛋白。
约20kDa的C3-降解性多肽系自一插入性中断的肺炎链球菌基因库中鉴定出，与野生型肺炎链球菌相比，具有减弱的C3降解活性的克隆而予以分离。实施例1提供了评估克隆的C3-降解活性的例示性试验。鉴定C3降解活性减弱的克隆并基于该显示减弱C3降解活性的克隆选出546bp的SmaI嵌入物。此SmaI片段用作由CP1200菌株制得的肺炎链球菌基因库的探针。来自肺炎链球菌基因库而能与该SmaI片段杂交的阳性克隆被分离，并鉴定与C3-降解活性相关基因的开放读框。下列与PspA的一部份具有序列相同性的寡核苷酸(SEQ ID NO10)在示差杂交反应中被用于证实编码C3-降解性多肽的基因与编码PspA的基因截然不同。
SEQ ID NO10GAAAACAATAATGTAGAAGACTACTTTAAAGAAGCTTTAGA20kDa多肽的完整开放读框有500个碱基对(SEQ ID NO1)，预测分子量约为20kDa(+/-5kDa)或约有168个氨基酸(SEQ ID NO2)的多肽。编码C3-降解性多肽的例示性基因序列示于图1(SEQ ID NO1)，而该多肽的氨基酸序列示于图2(SEQ IDNO2)。图3将较佳的基因序列与对应的较佳的翻译多肽结合成为SEQ ID NOS1-3。
使用SEQ ID NO2，确定该约20kDa多肽的氨基酸序列与在GenBank或瑞士Prot数据库中的其它多肽无关。预测的多肽具有原核细胞膜蛋白质的富含脯氨酸(特别是介于氨基酸第80-108个之间)的序列特征，这暗示该多肽表达在细胞表面上。该氨基酸序列并不显示明显的胆碱-结合性重复序列。将来自CP1200培养物的肺炎链球菌溶解物及上清液在以C3浸润的SDS-PAGE凝胶上进行电泳，在上清液及溶解物两者均鉴定出约20kDa(±5kDa)的条带，证实具有如SEQ ID NO2所预测大小的多肽拥有C3-降解活性(见实施例2)。如实施例3所述，编码该20kDa的C3-降解性多肽的基因在至少代表5个血清型(血清型1，3，4，14，及19F)的24个肺炎链球菌分离株中俱有保守性。
编码本发明C3-降解性多肽的核苷酸序列被插入基因表达载体用于在大肠杆菌(E.coli)中表达。如实施例所述，将重组性C3-降解性多肽进行分离。本领域中一般技术人员将会了解，就一特定基因序列(如SEQ ID NO1所提供者)而言，可以使用不同的表达载体来表达该基因。进而，可以使用本领域中不同的已知方法来生产及分离本发明的重组多肽，且本领域中一般技术人员亦会了解，本发明的C3降解性试验将确定除了在实施例中所提出的表达系统以外的特定表达系统是否具有功能，而无需进一步的试验。在基础技术文献中可以发现许多不同的分子及免疫学技术，如Sambrook等人(Molecular Cloning-A Laboratory Manual，1989 Cold Spring Harbor LaboratoryPress，Cold Spring Harbor，NY)及Harlow等人(Antibodies；A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，NY；Cold Spring Harbor Laboratory Press，1988)。
编码本发明C3降解性多肽的多核苷酸是用CP1200菌株的肺炎链球菌基因组DNA片段所制得的质粒基因库来进行鉴定的。虽然已知有许多不同的方法可以得到质粒基因库，以较佳的策略而言，质粒基因库的构建是用来自肺炎链球菌CP1200菌株(得自D.A.Morrison，University of Illinois，Champagne-Urbana，Illinois，且如Havarstein LF等人Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)1995；9211140-11144所描述)的经Sau3A切割的肺炎链球菌基因组DNA片段(0.5-4.0kb)，并插入嵌入性穿梭载体pVA891(ermr，cmr；具有大肠杆菌的复制起点)的BamHI位置。将此基因库利用电穿孔去转化大肠杆菌DH5αMCR菌株。自一些随机选择的大肠杆菌转化株中抽取质粒，显示所有转化株都含有重组性质粒。
质粒基因库DNA可以自大肠杆菌转化株中抽取，并用于转化CP1200亲代肺炎链球菌株，该转化是用同源重组插入性突变来实现的。
肺炎链球菌菌株CP1200细胞可以在CTM培养基中用以HCl移动pH的步骤转变为感受态细胞。将感受态细胞以少量分装方式冷冻于-70℃直到需要使用为止。
本发明的分离多肽与人类补体C3在PBS的存在下于37℃培育4小时或更久以检测C3降解作用。不具有分离肺炎链球菌多肽的对照组样品可以作为比较目的的对照组。
本发明的多肽在10％ SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上具有表观分子量约15kDa至约25kDa，较佳的约20kDa；或者具有表观分子量约75kDa至约95kDa，较佳的约92kDa。典型的多肽序列示于SEQ ID NO2及SEQ ID NO5。本领域的一般技术人员将了解，在氨基酸序列中有一些变异是可以预期的，且这些变异不应排除在本发明的范围外。例如，保守性突变并不排除在本发明范围外，氨基酸序列相同性中少于约80％氨基酸序列相同性(且较佳的是少于约90％氨基酸序列相同性)的变异物亦包含于本发明范围中，其中该多肽能够降解人补体蛋白C3且特别是当该多肽分离或原始得自一肺炎链球菌细菌。蛋白质及其片段(全部称为多肽)亦在本发明的范围中，特别是当这些多肽能降解人补体蛋白C3时。
在肺炎链球菌菌株及血清型中可以预期有一些核酸序列变异，正如预期会有一些氨基酸变异一样。保守性氨基酸取代是本领域中已知的，且包括，例如，用与该氨基酸属于同一类的其它成员氨基酸取代。例如，非极性氨基酸包括丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，及色氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸，丝氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，酪氨酸，天冬酰胺及谷氨酰胺。阳性电荷(碱性)的氨基酸包括精氨酸，赖氨酸及组氨酸。阴性电荷(酸性)的氨基酸包括天冬氨酸及谷氨酸。此类改变预期不会影响聚丙烯酰胺凝胶电泳或所测得的分子量或等电点。特别佳的保守性取代作用包括，但不限于，将Lys置换为Arg(反之亦然)以维持阳性电核；将Glu置换为Asp(反之亦然)以维持阴性电核；将Ser置换为Thr以维持游离的OH；且将Gln置换为Asn以维持游离的NH2。
本发明较佳的多肽包括具有氨基酸序列SEQ ID NO2及SEQ ID NO5的多肽。其它多肽包括可降解人类补体多肽C3的多肽，且编码该多肽的核酸可与SEQ IDNO1及SEQ ID NO4在高度严谨的杂交条件下杂交，高度严谨的杂交条件为例如以6X SSC，5X Denhardt，0.5％SDS(十二烷基磺酸钠)，及100微克/毫升片段化及变性的鲑精DNA在65℃进行杂交过夜，并在2X SSC，0.1％ SDS中于室温下清洗一次约10分钟，接着于65℃清洗一次约15分钟，接着在0.2× SSC，0.1％SDS中于室温下清洗至少一次至少3-5分钟。通常，SSC溶液包含氯化钠，柠檬酸钠及水以制备贮存溶液。
本发明多肽可以重组多肽的形式予以分离或制备。换言之，编码该蛋白质或该蛋白质一部份的核酸可以被插入表达载体或嵌入细胞的染色体中，以便在该细胞中表达该多肽。该多肽可以自细菌或另一细胞(较佳的是真核细胞且更佳的是动物细胞)中纯化。或者，该多肽可以自表达该多肽的细胞(如肺炎链球菌细胞)中分离。因此，当使用术语「多肽」时，蛋白质、肽或多肽也被认为在本发明范围内。该肽或多肽宜为至少15个氨基酸的长度，且较佳的肽或多肽具有至少来自SEQ ID NO2及SEQ ID NO5的15个连续氨基酸。
编码该约15kDa至约20多肽及约75kDa至约95kDa多肽的核酸亦为本发明的一部份。SEQ ID NOS1及4为编码C3-降解性多肽的较佳的核酸分子。本领域中一般技术人员将了解，一些取代并不会使C3-降解性多肽序列改变致使该C3-降解性多肽的特征及性质到达实质上改变的程度。例如，本发明也包括与SEQ ID NO1具有至少80％相同性的核酸。确定一具体核酸序列是否落于本发明范围的方法应看该具体核酸序列是否编码C3-降解性多肽及与SEQ ID NO1及SEQ ID NO4相比是否具有至少80％的核酸相同性。编码C3多肽的其它核酸序列包括那些编码C3多肽的核酸，其中该C3多肽与SEQ ID NO2或SEQ ID NO5相比具有相同序列或至少90％的序列相同性，且包括该核酸序列的简并性。简并的密码子意指相异的三字母密码子用于确定相同的氨基酸。例如，在本领域中已知下列RNA密码子(且因此，相关的DNA密码子，其中以T取代U)可以互相交换用于编码每个特定氨基酸苯丙氨酸(Phe或F) UUU，UUC，UUA或UUG亮氨酸(Leu或L) CUU，CUC，CUA或CUG异亮氨酸(Ile或I) AUU，AUC或AUA甲硫氨酸(Met或M) AUG缬氨酸(Val或V) GUU，GUC，GUA，GUG丝氨酸(Ser或S) AGU或AGC脯氨酸(Pro或P) CCU，CCC，CCA，CCG苏氨酸(Thr或T) ACU，ACC，ACA，ACG丙氨酸(Ala或A) GCU，GCG，GCA，GCC色氨酸(Trp)UGG酪氨酸(Tyr或Y) UAU或UAC组氨酸(His或H) CAU或CAC谷氨酰胺(GIn或Q) CAA或CAG天冬酰胺(Asn或N) AAU或AAC赖氨酸(Lys或K) AAA或AAG天冬氨酸(Asp或D) GAU或GAC谷氨酸(Glu或E) GAA或GAG半胱氨酸(Cys或Q) UGU或UGC
精氨酸(Arg或R) AGA或AGG甘氨酸(Gly或G) GGU或GGC或GGA或GGG终止密码子 UAA，UAG或UGA进而，可以将一特别的DNA序列进行修饰，以使用一特别细胞类别较佳的密码子。例如，大肠杆菌的较佳密码子的使用，以及动物(包括人类)的较佳密码子均为已知。这些改变为本领域中一般技术人员已知的，因此这些基因序列被认为是本发明的一部份。其它的核酸序列包括来自SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的长度为至少15个(且较佳的至少30个)核酸的核酸片段，或其它长度为至少15个(且较佳的为至少30个)核酸的核酸片段，其中该片段可与SEQ ID NO1或SEQ ID NO4在高度严谨的杂交条件下杂交，高度严谨的杂交条件例如以6X SSC，5X Denhardt，0.5％ SDS(十二烷基磺酸钠)，及100微克/毫升片段化及变性的鲑精DNA在65℃进行杂交过夜，并在2X SSC，0.1％SDS于室温下清洗一次约10分钟，接着于65℃清洗一次约15分钟，接着在0.2X SSC，0.1％ SDS中于室温下清洗至少一次至少3-5分钟。
本发明的核酸分子可编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO5的全部，可不含SEQ IDNO2或SEQ ID NO5(即无法转录的片段，包括基因调节性区域的片段等)或可编码SEQ ID NO2或SEQ ID NO5的部份，较佳的是包含编码来自SEQ ID NO2或SEQ IDNO5的至少9个氨基酸的连续性核酸片段。因为在本发明中包括了编码C3降解性多肽的一部份的核酸分子，将可了解的是，并非所有的核酸片段都编码具C3-降解活性的蛋白质或肽或多肽。另外，本发明的核酸可以进行突变以移除该多肽的C3降解活性(或用其它方式灭活)。因此，本发明也考虑了符合上述杂交条件而编码不具C3-降解活性多肽的核酸分子。使核酸序列突变或以其它方式改变核酸序列的方法已于本领域中有所详述，且在具免疫原性但无酶促活性的多肽的产生可针对治疗用途进行测试。
本发明的核酸分子可以被插入核酸载体中或稳定地插入宿主基因组中以生产重组性多肽，包括重组性嵌合多肽。在一个实施方案中，C3-降解性蛋白质由载体中的基因所编码，而该载体在细胞中。较佳的是，该细胞为原核细胞，如细菌。基因及基因片段可以该基因的全部或部份与另一基因融合的方式存在，且该C3-降解性多肽可以一个或多个蛋白质的融合蛋白质方式存在，该融合蛋白质以单一蛋白质的方式表达。本发明的各种核酸载体是本领域已知的，包括许多市售的表达质粒或病毒载体。这些载体的使用是本领域一般技术人员已知的。在实施例中所使用的是一些典型的载体，但不应被认为对本发明范围有所限制。
本发明还涉及能结合(通常为特异性结合)肺炎链球菌的约15kDa至约20kDa(较佳的约20kDa)的多肽及约75kDa至约95kDa(较佳的约92kDa)的多肽的抗体，且较佳的是其中该多肽能够降解人类补体C3。可以针对本发明多肽的全部或部份制备多克隆抗体或单克隆抗体。针对蛋白质制备抗体的方法详见于，例如，Harlow等人，(Antibodies ；A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor，NY；Cold Spring HarborLaboratory Press，1988)。在一较佳的实施例中，该抗体可衍生自人类，大鼠，小鼠，山羊，鸡，或兔子。多肽结合性抗体片段及嵌合片段亦是已知的且在本发明的范围中。
本发明还涉及免疫刺激性组合物的使用。术语「免疫刺激性」或「免疫系统刺激性」组合物意指本发明的蛋白质、肽或多肽组合物，它们活化个体(如哺乳动物)免疫系统中的至少一种细胞类型。较佳的是，该免疫刺激性组合物在正常(未感染的)个体内可提供一种免疫接种反应或预防效果，其通常为一疫苗。然而，在治疗应用或过程中任何可测得的免疫反应均有利于个体。免疫系统中较佳的活化细胞包括吞噬细胞，如嗜中性白细胞或巨噬细胞，T细胞，B细胞，上皮细胞及内皮细胞。包括本发明的肽，多肽或蛋白质的免疫刺激性组合物可用于在动物(如大鼠，小鼠，山羊，鸡，兔子或人类)中产生抗体，或用于研究肺炎链球菌感染的动物模型。较佳的免疫刺激性组合物包括免疫刺激性(例如治疗有效量)的至少一种肽或多肽，其包括来自该C3降解性多肽的至少15个氨基酸。
术语「疫苗」意指用于免疫接种的组合物。免疫作用的过程可包括给予蛋白质，肽，多肽，抗原，核酸序列或互补(例如反义)序列，或抗体或其悬浮液，其中给予该分子后，该分子将产生活性免疫力并提供保护以对抗肺炎链球菌感染或移生。通常，此等疫苗被制成可注射的液体溶液或悬浮液。亦可制成适合在注射前溶解或悬浮于液体中的固体型式。该疫苗制备物可选择性地加以乳化，或被包裹于微脂体中。
该免疫刺激性组合物(如疫苗)还可包括在制药上可接受的缓冲液或载体中的其它多肽，这些缓冲液或载体例如是PBS(磷酸盐缓冲盐水)，或在本领域中其它被认为适合安全用于将多肽导入宿主以刺激免疫系统的缓冲液。该免疫刺激性组合物还可包括其它免疫系统刺激性多肽，如佐剂或来自肺炎链球菌或其它生物的免疫刺激性蛋白质、肽或多肽。例如，控制肺炎链球菌感染最适合用肽或多肽的混合物。较佳的是，在疫苗制备物中使用本发明的一个或多个多肽或其片段，以对抗或限制肺炎链球菌的移生或肺炎链球菌移生所带来的致病结果。
在本文中所使用的术语「治疗有效量」意指有效产生所需结果的份量。该份量视个体免疫系统的健康或物理(即抗体合成)状况，所需保护的程度，制备的剂型及其它相关因素而定。可以预计，该份量将落于一相当广泛的范围，且可经由常规试验来决定。
活性免疫刺激性成份经常与赋形剂或稀释剂混合，这些赋形剂或稀释剂为制药上可接受的载体且与活性成份相容。术语「制药上可接受的载体」意指在与一组合物中其它成份相容且不危害接受者的意义上为「可接受的」载体。合适的赋形剂为，例如，水、盐水、右旋糖、甘油、乙醇等，及其混合物。此外，如果需要，该免疫刺激性组合物(包括疫苗)可包含少量的辅助性物质，如湿润剂或乳化剂，pH缓冲剂，和/或可以增强该免疫刺激性组合物效果的佐剂。
有效的佐剂或载体包括但不限于，氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰基-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)；N-乙酰基-新-胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰胺(CGP11637，被称为nor-UDP)，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰基-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′，2′-二棕榈酰基-sn-甘油-3-羟基磷酰基氧)-乙基胺(CGP 19835A，被称为MTP-PE)，及RIBI，其于2％的角鲨烯/Tween 80乳化液中包含三种自细菌抽取的成份，单磷酰基脂A，二霉菌酸海藻糖及细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
本发明还涉及抑制肺炎链球菌-介导的C3降解作用的方法，包括将肺炎链球菌与多肽接触，如能与来自肺炎链球菌的约15kDa至约25kDa或约75kDa至约95kDa的分离多肽(典型的至少一部份)结合的抗体或另一多肽。能与约15kDa至约25kDa或约75kDa至约95kDa的分离多肽结合的蛋白质可为一抗体或其片段，或该蛋白质可为嵌合蛋白，该嵌合蛋白包括来自抗体的抗体结合区(如可变区)，该抗体能特异性识别来自肺炎链球菌的约15kDa至约25kDa或约75kDa至约95kDa且具有C3降解活性的分离的多肽。
本发明的分离的肺炎链球菌多肽可被分离，且可选择性地予以纯化，且可以使用该分离多肽或其免疫原性片段来产生免疫学反应，在一实施例中，其包括在人类或实验动物身上的抗体反应。不具有C3降解活性的多肽可针对其限制肺炎链球菌感染影响的能力进行试验。类似地，本发明的多肽的修饰可例如经由突变来中断或灭活该多肽的C3降解活性。可以使用能抑制本发明多肽的C3-降解活性的抗体作为经由调理途径来预防C3降解作用及促进肺炎链球菌清除的策略。该分离的多肽可在试验中使用，以检测对抗肺炎链球菌的抗体，或作为肺炎链球菌治疗用的疫苗的一部份，或作为包含多价或多个蛋白质，肽或多肽的疫苗。
因此，在本文所使用的术语「处理」意指对正常哺乳动物个体或遭各种肺炎链球菌感染入侵、经诊断为各种肺炎链球菌感染，或表现出各种肺炎链球菌感染的特征或症状的哺乳动物个体进行预防或治疗。术语「治疗」意指对于哺乳动物个体提供治疗性效果，使得该个体表现出较少或不表现肺炎链球菌感染或其它相关疾病的症状。此类处理可伴随本发明的核酸分子(具意义或反义者)，蛋白质，肽或多肽或抗体的给予。
进一步的规划是，本发明多肽可以表达在脊椎动物细胞表面且用于降解C3，例如，当补体沉积(或活化)成为难题时，例如在异种移植或补体-介导的肾小球肾炎的情况下。例如，完整的肺炎链球菌多肽，重组性多肽，或以上两者任一的一部份，可以被并入异种移植细胞中，并以表面多肽或分泌多肽的方式表达，以预防补体沉积(及/或补体-介导的发炎反应)或使其减至最小。
本发明另一个具体的方面涉及使用表达分离的蛋白质及由其而来的肽或多肽的疫苗载体。据此，本发明另一方面提供了一种在哺乳动物中引发免疫反应的方法，其包括将表达本发明的分离的蛋白质及/或肽或多肽的至少一种或其混合物的疫苗载体提供至哺乳动物。本发明的蛋白质及肽或多肽可使用活的疫苗载体输送给哺乳动物，特别是使用活的重组细菌、病毒或其它活的物质，其包含以外来多肽方式表达该蛋白质及/或肽或多肽时所需的遗传物质。特别是那些在胃肠道内繁殖的细菌已被发展成为疫苗载体，如沙门氏杆菌(Salmonella)，志贺氏杆菌(Shigella)，耶尔辛氏杆菌(Yersinia)，弧菌(Vibrio)，埃希氏菌(Escherichia)及BCG，以上及其它例子在J.Holmgren等人，Immunobiol.184，157-179(1992)及J.McGhee等人，Vaccine，10，75-88(1992)中有所讨论。
本发明的额外的实施方案涉及在个体(如哺乳动物)内引发免疫反应的方法，包括将一定量的编码本发明分离蛋白质及/或自其而来的肽或多肽的DNA分子(任选地联合感染-协助性因子)给予该个体，其中该蛋白质及/或肽或多肽保留免疫原性，且当该蛋白质及/或肽或多肽掺入免疫刺激性组合物(例如疫苗)并给予人类时，可提供保护而不会在人类由肺炎链球菌病原引发后续感染时加重病情。感染-协助性因子是本领域中已知的。
进一步的规划是，编码该约15kDa至约25kDa及约75kDa至约95kDa多肽的基因的反义序列可作为抗肺炎链球菌感染的疫苗或治疗性处理。反义DNA被定义为非-编码性序列，其与SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的全部或部份互补(即互补链)。例如，5′-ATGTCAAGC-3′的反义序列为3′-TACAGTTCG-5′。将反义序列或寡核苷酸输送给动物可使动物产生抗体，或使该序列插入活菌或其它细胞中，致使该92kDa基因产物的全部或部份的转录及/或翻译受到抑制。
反义核酸序列的导入例如可经由将反义核酸装载于合适的载体(如微脂体)上而导入肺炎链球菌或受感染细胞内。通常，具有8个或更多核苷酸的反义核酸序列能结合到细菌核酸或细菌信使RNA上。反义核酸序列通常包含至少约15个核苷酸(较佳的为至少约30个核苷酸或更多)，以为细菌核酸或细菌信使RNA的杂交产物提供所需的稳定性。序列的导入宜抑制至少一个内源性肺炎链球菌核酸序列的转录或翻译。装载反义核酸的方法在本领域中是已知的，例如U.S.专利第4,242,046号。
本发明还提供了具有2478碱基开放读框(SEQ ID NO4)的核酸，其包括核酸序列(SEQ ID NO1)的开放读框，其编码分子量约20kDa(SEQ ID NO2)的多肽。本文所述的20kDa多肽进而被定性为C3-降解性蛋白质。较大的开放读框，例如2163bp(SEQ ID NO4)，编码约92kDa(SEQ ID NO5)的推定的多肽。
在本文中所有引用的参考文献及发表文献俱并入本说明书作为参考资料。对于熟知该项技术的人而言，有许多不同的替代技术及步骤可以类似地使实施者根据本说明书来成功实施规划的发明。熟习该项技术者将会了解，虽然本发明已于上文中依据特定实施方案及实施例加以描述，本发明并未当然受到如此限制，且可以进行许多其它实施方案、实施例、用途、改进以及在这些实施方案、实施例及用途以外的情形，而不会偏离本申请案的发明范围。
实施例1C3-降解活性减弱的插入性突变株的鉴定插入性突变株系得自Elaine Tuomanen博士(Rockefeller Inst.，New York，New York)。具有插入物的克隆于试验中进行测试，以检测减弱的C3-降解活性。137个克隆经由使这些细胞在Todd Hewitt培养液中室温下于微量滴定板上生长过夜而进行测试。这些细胞以供肺炎链球菌的合成性培养基(见Sicard A.M.，Genetics5031-44，1984)进行1∶10稀释，且剩余的细胞被冷冻于微量滴定板中。将在100微升培养基(包含1毫克/毫升在磷酸盐缓冲盐水(PBS)的0.1％BSA)中的63毫微克或83毫微克的C3(根据Tack等人，Meth.Enzymol.8064-101，1984的方法自血浆中纯化)加入约200微升经稀释的细胞内。将细胞37℃培育4小时。将100微升的混合物加入ELISA板中，并于4℃培育过夜。将该板用清洗缓冲液进行清洗三次，且将在PBS中的0.05％Tween 20加入孔洞中，在每次清洗前进行5分钟培育。抗C3的100微升抗体(对人类C3-IgG部份具专一性的多克隆辣根过氧化物酶-偶联的山羊抗体，ICN Cappel，Costa Mesa，CA)以在PBS中的3％BSA进行1∶1200的稀释。该ELISA板于37℃在黑暗中培育约30分钟至1小时，并以上述清洗缓冲液进行清洗。该试验用12毫克OPD(在30毫升0.1M柠檬酸钠缓冲液中)以及12微升的30％过氧化氢进行显影。试验结果在ELISA板读测仪上490纳米下经由光学密度读数来测定。
每个克隆进行试验四次。与非突变对照组相比具有少于40％的C3降解作用的19个克隆被选出。这19个克隆以上述试验进行筛选六次，且由结果选出与非突变对照组相较具有少于40％的C3降解作用的6个克隆。这6个克隆每个进行筛选11次，且选出具有最低C3-降解活性的2个克隆作进一步研究。
得到其中一个克隆的部份序列，且将546bp的SmaI片段以32P进行随机引物标记(得自Stratagene的试剂盒，LaJolla，CA)。来自SEQ ID NO1的546bp的SmaI片段与来自许多肺炎链球菌菌株的EcoRI及Kpnl消化产物在Southern印迹上进行杂交。此相同的片段还用于筛选得自肺炎链球菌菌株CP1200的基因组DNA的Sau3A片段基因库。
自CP1200基因库鉴定出3.5kb的插入物。将该插入物进行测序，并鉴定出一492个碱基对的开放读框，包括终止密码子。该开放读框编码168个氨基酸且预计分子量约为18,500道尔顿的多肽。
构建PCR引物以扩增开放读框；该5’PCR引物包括一个BamHI位置；该3’引物包括一个PstI位置。被扩增的插入物依符合译读框架的方式连接到His-加尾的大肠杆菌表达载体pQE30(Qiagen，San Diego，CA)。将得到的质粒用于转化大肠杆菌菌株BL21(Novagen，Madison，WI)，其包含lac抑制物质粒pREP4(Qiagen)。诱导大肠杆菌培养物以表达His-加尾的多肽，该多肽以Ni-NTA树脂(Qiagen)进行柱纯化。该纯化的蛋白质用SDS-PAGE凝胶来确认。
实施例220kDa的C3-降解性多肽的鉴定为了决定20kDa蛋白质的C3-降解能力，使0.5毫克/毫升的C3(根据Tack等人，Meth.Enzymol.8064-101，1984进行制备)在含有15％丙烯酰胺的十二烷基磺酸钠(SDS)凝胶(15％SDS-PAGE凝胶)上进行共聚。肺炎链球菌上清液系得自于Todd Hewitt培养液中生长至对数期的肺炎链球菌菌株CP1200培养物，肺炎链球菌溶解物是通过将5×108个细胞与5％SDS在室温下培育30分钟而得到的。用具10,000MW分离值的Centricon过滤装置(Amicon，Beverly，MA)将溶解物浓缩10倍。样品在电泳前不进行加热。将上清液及溶解物的样品加入15％含C3的SDS-PAGE凝胶，电泳于4℃在150V进行，直到染料前缘跑出为止。凝胶连续用50毫升在水中的2.5％TritonX-100清洗(2次，10分钟)，用在50Mm Tris-HCl中的2.5％Triton X-100，pH7.4(2次，10分钟)清洗，及以50mm Tris-HCl，pH7.4清洗(2次，10分钟)，以移除SDS。清洗后，将50毫升的50mM Tris-HCl，pH7.4，倒入含有这些凝胶的盘皿中，将盘皿加盖并于37℃培育1.5小时并过夜(约16小时)。将胶以考马斯蓝染色10分钟，随后完全地脱色。
对照在溶解物及上清液中的暗蓝色背景，可以观察到两个溶解性条带，其中之一约为20kDa大小。在肺炎链球菌溶解物中的C3降解活性于37℃培育1.5小时后观察到，然而在Pn上清液中C3降解活性经过夜培育后才观察到。因此，C3降解活性显然主要与细胞相关。
实施例3编码该20kD多肽的基因在一些肺炎链球菌菌株中具保守性自各种不同的肺炎链球菌菌株(第1型，第3型，LOO2及LOO3(第3型)，第4型，第14型的临床分离株及CP1200，WU2，R6X，6303，109，110，JY1119，JY182，及JY53的实验室分离株)得到DNA，并将SEQ ID NO3作为探针以检测编码该20kD多肽的核酸是否存在于来自这些菌株的DNA中。分离染色体DNA以EcoRI进行切割并经由电泳分离。将DNA转移至固体支持物上，并与末端-标记的SEQ ID NO3杂交，杂交及清洗条件为用6X SSC，5X Denhardt’s，0.5％SDS及100微克/毫升片段化且变性的鲑精DNA在65℃杂交过夜，并用2X SSC，0.1％SDS于室温下清洗一次约10分钟，接着于65℃清洗一次约15分钟，接着在0.2X SSC，0.1％SDS中于室温下清洗3分钟两次。
结果表明，SEQ ID NO3在每个受试DNA样品中有同样的杂交反应，这表明该多肽显然在各菌株间具有保守性。在一些菌株中，编码20kDa的C3-降解性多肽的DNA显然为一较大的2478bp开放读框的一部份，该开放读框假设性编码92kDa多肽。
实施例4肺炎链球菌DNA探针的Southern印迹自11个肺炎链球菌菌株得到基因组DNA的5微克样品。每个样品以限制酶KpnI切割。这些样品随后装载于琼脂糖凝胶上并经由电泳进行拆分。包含在凝胶胶中的样品随后经由毛细移转至购自Amersham(Upsafla，Sweden)的Hybond-N+膜上。得自开放读框的540bp的SmaI片段用T7QuickPrime试剂盒(Pharmacia，Piscathaway，NJ)以32P进行随机引物标记，并用NucTrap柱(Stragene，La Jolla，CA)从非掺入的核苷酸中纯化，并进行杂交。
杂交条件为以6X SSC，5X Denhardt，0.5％SDS，及100微克/毫升片段化及变性鲑精DNA在65℃进行杂交过夜，并在2X SSC，0.1％ SDS于室温下清洗一次约10分钟，接着于65℃清洗一次约15分钟，接着在0.2X SSC，0.1％ SDS中于室温下清洗至少一次至少3-5分钟。印迹显示该20kDa基因系存在于所有肺炎链球菌的受试菌株中。
实施例5自SEQ ID NO1制得两个DNA引物，并用来扩增编码20kDa多肽来自肺炎链球菌(血清型3)基因体DNA的核苷酸序列。第一个引物为5′-引物(SEQ ID NO6)，其包括该核苷酸序列5′端的ATG起始密码子，其中插入了一个NcoI位点，且在ATG起始密码子之后有Ala残基以维持正确的译读架。第二个引物为3′-引物(SEQ ID NO7)，其包括该核苷酸序列的3′端的终止密码子，其中插入了一个BamHI位点。
5′-GGGGG CCA TGG CC TCA AGC CTT TTA CGT GAA TTG-3′；(SEQ ID NO6)5′-GGGGG GGA TCC CTA GCT ATA TGA GAT AAA CTT TCC TGC T-3′；(SEQ ID NO7)这两个引物是在Applied Biosystems 380A DNA合成仪(Foster City，CA)中用购自Glen Research(Sterling，VA)的反应剂合成得到的。扩增是用Perkin ElmerThermocycler(ABI)根据制造商说明书进行。经鉴定的PCR产物被连接至以TA为尾端的PCR克隆载体PCR2.1(购自Invitrogen，Carlsbad，CA)，并用于转化OneShot Top10F′感受态细胞(Invitrogen)。卡那霉素抗药性转化株经由将碱性溶解法制得的质粒DNA进行限制酶分析而加以筛选。鉴定出一约为500bp的插入片段并随后用限制酶NcoI及BamHI切割。将该500bp片段从低融点琼脂糖胶中分离出，并随后连接到购自Novagen(Madison，WI)的T7激活性表达载体pET28a的NcoI-BamHI位置。
该连接混合物随后转化入Top10F′细胞(Invitrogen)，且卡那霉素抗药性转化株是通过对碱性溶解法制得的质粒DNA进行限制酶分析而筛选出的。重组性质粒(pLP505)随后经转化送入BL21(Novagen)细胞并使其于添加30微克/毫升卡那霉素的SOB培养基中生长。细胞生长至O.D.600值0.6，并随后用0.4mM IPTG(Boehringer Mannheim，Indianapolis，Indiana)诱导2-4小时。制备全细胞溶解物并于14％SDS-PAGE上电泳。用考马斯蓝对凝胶染色，并检测到表达产物。该考马斯蓝染色的凝胶显示出在28kDa及18kDa分子量标记之间的条带，且经测定约为20kDa。
在该重组性pLP505质粒中插入物的DNA序列用ABI 370A DNA测序仪测定。将该DNA序列与SEQ ID NO1的DNA序列用Pustell的MacVector DNA矩阵点绘特征(Oxford Molecular Group，Campbell，CA)进行比对。将得自pLP505质粒，SEQ ID NO1及肺炎链球菌(血清型4)基因组的DNA序列进行比对，显示编码该20kDa多肽的开放读框(ORF)可能为一较大ORF的部份，即在血清型4的基因组中编码具有约92kDa预计分子量的多肽的2478bp(SEQ ID NO4)。DNA SEQ ID NO4编码如SEQ ID NO5所示的预计氨基酸序列。
肺炎链球菌(血清型4)基因组序列系使用MacVector的ClustalW特征(OxfordMolecular Group，Campbell，CA)自网址为www.tigr.org的Institute for Genomic Research及/或经由网址为www.ncbi.nlm.nih.gov的NCBI而得到。在该20kDa的氨基酸序列(SEQ ID NO2)及预测为92kDa的氨基酸序列(SEQ ID NO5)之间进行序列比较。
根据可得的基因组DNA(血清型4)序列，设计在2478bp的ORF两侧的引物并随后使用ABI 380A DNA合成仪进行合成(SEQ ID NOS8及9)。SEQ ID NO8为肺炎链球菌5’-引物，其具有插入的NcoI位点且在ATG起始密码子之后加入Glu残基以维持一正确的开放读框。SEQ ID NO9为肺炎链球菌3’-引物，其具有插入的HindIII位点。
5′-CCC GGG CCA TGG CTA AAA TTA ATA AAA AAT ATC TAG-3’；(SEQ ID NO8)5′-CCG GGC AAG CTT TTA CTT ACT CTC CT-3′；(SEQ ID NO9)约2400bp DNA片段随后自4个不同的肺炎链球菌血清型(血清型3，5，6B及7)扩增，得到4个片段。4个片段随后各自连接至PCR克隆载体PCR2.1(Invitrogen)，并用于转化OneShot Top10F′细胞(Invitrogen)。卡那霉素抗药性转化株经由将碱性溶解法制得的质粒DNA进行限制酶分析而加以筛选。含有血清型7的PCR产物的重组性质粒被鉴定出来，例如为pLP512。使用ABI型号370A DNA定序仪得到血清型7的克隆的DNA序列。该DNA序列基本上同于SEQ ID NO4并编码基本上和SEQ IDNO5相同的预测氨基酸序列。
实施例6全肺炎链球菌细胞中92kDa多肽的Western印迹检测在含有质粒pDF122的大肠菌株BLR纯化出重组性约20kDa C3降解性多肽。质粒pDF122含有示于SEQ ID NO1的多核苷酸，其表达受T7噬菌体激活子的控制。细菌细胞在Hy-Soy/yeast Extract培养基内生长至对数中期，该培养基含有氨苄青霉素用以选择该质粒。该重组性多肽的表达通过加入IPTG至1mM浓度并继续培育额外3小时来诱导。细菌细胞经由离心进行收集并再悬浮于Tris缓冲食盐水，pH7.2中。将细胞在French Pressure容器中以机械方式溶解，而含有包涵体的不溶性物质在离心步骤中沉淀。将沉淀物溶于以100mM NaPO4，pH8.0缓冲液并含有0.1％Triton X-100的3M尿素中。经过沉淀及弃去不溶性物质后(在～100,000xg离心)，该可溶性r20kDa多肽被置换至0.1％双性清洁剂(Zwittergent)3-12(Calbiochem-Behrng)中以取代尿素，并随后被置换至100mM NaPO4，pH8.0以取代清洁剂。SDS-PAGE分析确认该～20kDa物质仍为可溶的。此His-加尾的重组多肽在50mM NaPO4缓冲液，pH8.0中透析，并吸附于以同样缓冲液平衡的Ni柱上。将该柱依序以50mM NaPO4在pH7.0，6.6及5.5加以清洗，直到每次缓冲液均达基线吸收度(OD280)为止。被结合的～r20kDa多肽以50mM NaPO4，pH4.5洗提。由SDS-PAGE分析可知被洗提出的多肽约为90％均质性。
此多肽被用于接种Swiss-Webster老鼠。五微克剂量的多肽与50微克的单磷酰基脂A(Ribi Immunochemicals)混合，并肌内注射至老鼠。动物在第0，4及6周进行接种并于第8周采血。将血清合并并发现其含有对抗该免疫原的高效价抗血清。
肺炎链球菌株CP1200，T3及T7系生长于含有酵母萃取物的Todd-Hewitt培养液中，且细胞经离心而沉淀。肺炎链球菌细胞在SDS-PAGE裂解缓冲液中于还原性条件下经煮沸5分钟加以溶解。将溶解物加入10％SDS-PAGE凝胶中进行电泳。分离的多肽经电印迹于硝化纤维上，并将该滤膜以在磷酸盐缓冲食盐水，pH7.4中的5％BLOTTO进行阻断。将多克隆抗血清在BLOTTO中以1∶2000稀释并用于检测分离的多肽。结合的抗体以与碱性磷酸酶偶联的山羊抗鼠IgG进行检测。Western印迹结果示于图8并进而描述于该图简述中。
实施例720kDa及92kDa多肽降解C3的证据示于图9的凝胶为Western印迹结果。此数据系经由将20kDa多肽及92kDa多肽与下表所示的生物素化及甲胺-处理的C3一起培育而得。这些多肽表达自T7载体。
甲胺-处理C3浓度4.46毫克/毫升的500微升纯化的人C3(根据Tack等人，Meth.Enzymol.8064 101，1984的方法进行制备)与55微升在0.1M TRIS/0.01M EDTA，pH8.0中的1M甲胺(CH3NH2)在37℃共同培育80分钟，随后在0.1M TRIS/0.01M EDTA，pH8.0中在4℃进行透析过夜。次日，将C3与在0.1 TRIS/0.01M EDTA中的60微升的1M甲基胺在37℃培育80分钟，随后在50mM NaHCO3中0℃透析过夜。
甲胺-处理的C3的生物素化将2毫克如上所制备的甲基胺-处理的C3与75微升的NSC-生物素(Pierce)(其以1毫克NSC生物素溶于1毫升H2O方式制备)在室温培育30分钟。生物素化的C3在50mM NaHCO3，pH8.0中于4℃进行透析过夜。
来自试管A及C的样品培育66小时后移出，在还原性缓冲液中与β-巯基乙醇经由煮沸2分钟进行还原反应，在7.5％SDS-PAGE上电泳，并转移至硝化纤维滤纸上进行Western印迹。将Western印迹法根据标准程序(Tobin等人PNAS USA764350 4354，1979)进行1小时。将滤纸与辣根-过氧化物酶-亲和素(1∶10,000稀释)共同培育，并以Supersignal CL-HRP Substrate System(Amersham)显影来检测生物素化的C3片段。
在图9中，第1泳道仅有C3(对照组)，第2及3泳道是20及92kDa多肽，且第4及5泳道仅有C3(对照组)。右边界显示在对照组样品中的C3α链、C3β链及C3片段的位置。将在20kDa切割的一C3片段及在92kDa切割的数个片段的位置进行确认。
第二个实验使用如上表所述同样比例的第一个实验反应剂(经表达的多肽，生物素化的C3，及缓冲液)。C3对照组样品在0，2小时，8小时，及24小时时移出。然而，这些样品并不进行Western印迹，而是在7.5％SDS-PAGE发生还原反应，说明一些额外的降解片段可能不是生物素化的，且因此可能会显示于考马斯蓝染色的SDS-PAGE凝胶上。事实上，这就是真正所观察到的情形。仅有20(第A8泳道)及92(第C8泳道)kDa多肽在此凝胶上分析。图10的凝胶上沿右边界显示C3α链及C3β链的位置，并在第C8泳道显示92kDa多肽的位置。在第C8泳道至少有两个片段，其大小自约90kDa至75kDa。在75kDa的C3β链下方亦有数个片段。在第A8泳道中是正好低于C3β链的主要降解片段。所以，在第C8泳道的92kDa多肽及第A8泳道的20kDa多肽均降解C3。
实施例892kDa重组蛋白的制备及多克隆抗血清的产生在质粒pLP512(见实施例5)中的插入物以NcoI及HindIII剪切。如预期大小的片段自低融点琼脂糖中纯化，并随后连接至T7驱动的表达载体pET28a(Novagen，Madison，W1)的NcoI-HindIII位置中。
随后将连接混合物转化入Top 10F′细胞(Invitrogen)，并如先前实施例5所述筛选出卡那霉素(kanamycin)抗性转化株。随后将重组质粒(pLP515)转化入BL21细胞(Novagen)，并于添加30微克/毫升卡那霉素的SOB培养基中培养。使细胞生长至O.D.600值达0.6，且随后以0.4mM IPTG(Boehringer Marinheim，Indianapolis，IN)诱导2-4小时。制备全细胞溶解物并在10％SDS-PAGE凝胶上进行电泳。凝胶经考马斯蓝染色后，与未经诱发的样品比较显示出约80kDa的新色带。
将约92kDa ORF所编码的重组蛋白自含有质粒pLPS 15的大肠杆菌株BL21(Novagen)中分离。使细菌细胞在含有30微克/毫升卡那霉素的SOB培养基中生长至对数中期，以选择该质粒。重组多肽的表达经加入IPTG至0.4mM并继续培养3小时来诱导。将细菌细胞经由离心收集并再悬浮于Tris缓冲食盐水，pH7.2中。将细胞在French Pressure Cell中进行机械式溶解，含有包涵体的不溶性物质在7700xg于4℃离心10分钟而沉淀。将含有包涵体的沉淀物进行再溶解，且该可溶性蛋白质经由离子交换层析法而纯化。重组蛋白质被用于在老鼠中产生多克隆抗体。简而言之，5微克蛋白质每剂以20微克QS21为佐剂皮下注射6-8周龄Swiss Webster老鼠颈部。在第0周时将老鼠采血并预防接种，在第4周进行预防接种，随后在第6周进行采血及放血。10只老鼠用佐以QS21的重组性92kDa蛋白质进行预防接种。合并的血清经1∶1000稀释，用于Western印迹法中以检验全细胞溶解物以及来自数种血清型肺炎链球菌的浓缩培养上清液。这些血清与全细胞溶解物及浓缩培养上清液中蛋白质发生专一性反应，该蛋白质分子量约为90kDa。
实施例9图11中的图表总结了来自对以r92kDa蛋白质预防注射的CBA/CAHNxid/J老鼠进行鼻内(IN)攻击的结果，r92kDa蛋白质如实施例8(SEQ ID NO5)所述制得而佐以单磷酰基脂A(MPL)。
10只老鼠成一组于第0，3及5周在颈部区域用每5微克佐以50微克MPL的92kDa，每0.1微克佐以100微克磷酸铝的第3型荚膜(其与蛋白质载体CRM197连接)，或仅有磷酸盐缓冲食盐水(PBS)，以10微升的样品体积进行皮下预防接种。CRM 197为基因工程去毒的白喉毒素。每只老鼠在第7周以内含1×106cfu第三型肺炎链球菌的10微升样品进行攻击。攻击后三天分离出鼻内组织，且经由植于选择性培养基上而决定每克鼻组织中第三型肺炎链球菌菌落形成单位数目。第三型荚膜系分离自肺炎链球菌第三血清型，并随后经由还原性激活(reductive animation)而连接至蛋白质载体CRM 197(关于第三型荚膜对照组的制备可参见美国专利No.5,360,897；关于基因工程去毒的白喉毒素可参见美国专利No.5,614,382；关于使用CRM 197作为载体可参见美国专利4,902,506)。
图11中的图表显示出，在此模式中，阴性对照组(老鼠以MPL注射)及未处理老鼠于6周大时，当鼻内攻击时皆具有约30％的存活率，但阳性对照组(第三型荚膜连接物佐以磷酸铝)至此研究终止(约14天)则提供100％免于死亡的保护。当以r92kDa预防接种的老鼠受攻击时，至此研究终止100％存活。此结果显示r92kDa蛋白质确实可以对第三型肺炎链球菌鼻内攻击引起的死亡提供保护。
实施例10方法重组的92kDa(r92kDa)多肽(SEQ ID NO5)与经纯化的人类C3在37℃培育2小时，6小时，及26小时，比例如下试管A(对照组)C3-3微升[7.2×10-12摩尔]PBS/0.01％牛血清白蛋白(BSA)-100微升；试管Br92kDa-50微升[5.6×10-10摩尔]C3-3微升[7.2×10-12摩尔]PBS/0.01％BSA-50微升。
在每个时间点(2，6，及26小时)，将20微升样品自试管A及B移出，并加入还原性缓冲液，且将此样品于100℃煮沸2分钟。煮沸后将样品于7.5％SDS-PAGE上在还原条件下进行电泳。将该SDS-PAGE凝胶以考马斯蓝染色。所得的凝胶示于图12。
第1泳道-分子量标准(由凝胶上方读数如下200kDa，116kDa，97kDa，66kDa，45kDa)；第2及4泳道-2小时培育；第2泳道-C3对照组(试管A)；第4泳道-r92kDa样品(试管13)；第5及7泳道-6小时培育；第5泳道-C3对照组(试管A)；第7泳道-r92kDa样品(试管13)；第8及10泳道-26小时培育；第8泳道-C3对照组(试管A)；第10泳道-r92kDa样品(试管B)。
凝胶的解读C3的α链电泳显示为约115kDa。C3的β链电泳显示为约75kDa。这些在凝胶上形成标记。在约66kDa的蛋白带为白蛋白。第2及4泳道为2小时培育。与第2泳道(C3对照组)相比，第4泳道显示C3α链发生切割现象-在约97kDa出现新的蛋白带。第5及7泳道为6小时培育。在第7泳道亦出现新的97kDa切割片段。第8及10泳道是26小时培育。与第8泳道(C3对照组)比较，第10泳道显示C3α链继续切割。
本领域技术人员将会了解，虽然本发明已于上文中依据特定实施方案及实施例作了描述，本发明并未当然受到如此限制，且可以进行许多其它实施方案，实施例，用途，改进以及在这些实施方案，实施例及用途以外的情形，而不会偏离本申请案的发明范围。
序列表<110>HOSTETTER，Margaret K.
FINKEL，David J.
CHENG，QiMASI，Amy W.
REGENTS OF THE UNIVERSITY OF MINNESOTAAMERICAN CYNAMID COMPANY<120>来自肺炎链球菌的人补体C3降解性多肽<130>11000570230<140>未转让<141>1999-09-24<150>60/101,736<151>1998-09-24<150>09/283,094<151>1999-03-31<160>10<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>504<212>DNA<213>肺炎链球菌<400>1atgtcaagcc ttttacgtga attgtatgct aaacccttat cagaacgcca tgtagaatct 60gatggcctta ttttcgaccc agcgcaaatc acaagtcgaa ccgccaatgg tgttgctgta 120ccgcacggag accattatca ctttattcct tattcacaac tgtcaccttt ggaagaaaaa 180ttggctcgta ttattcccct tcgttatcgt tcaaaccatt gggtaccaga ttcaagacca 240gaacaaccaa gtccacaatc gactccggaa cctagtccaa gtccgcaacc tgcaccaaat 300cctcaaccag ctccaagcaa tccaattgat gagaaattgg tcaaagaagc tgttcgaaaa 360gtaggcgatg gttatgtctt tgaggagaat ggagttcctc gttatatccc agccaaggat 420ctttcagcag aaacagcagc aggcattgat agcaaactgg ccaagcagga aagtttatct 480cataagctgc agttagatcc atta 504<210>2<211>168<212>蛋白质<213>肺炎链球菌<400>2Met Ser Ser Leu Leu Arg Glu Leu Tyr Ala Lys Pro Leu Ser Glu Arg1 5 10 15His Val Glu Ser Asp Gly Leu Ile Phe Asp Pro Ala Gln Ile Thr 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Ala Glu805 810 815Lys Leu Leu Ala Leu Leu Lys Glu Ser Lys820 825<210>6<211>34<223>寡核苷酸<400>10.gaaaacaata atgtagaaga ctactttaaa gaaggttaga 40
权利要求
1.一种分离的多肽，它具有一氨基酸序列，其中编码该分离多肽氨基酸序列的核酸序列在高度严谨杂交条件下与下列序列的至少一部份杂交(a)SEQ ID NO1中的核苷酸或其互补链，或(b)SEQ ID NO4中的核苷酸或其互补链。
2.根据权利要求1所述的多肽，它分离自肺炎链球菌。
3.根据权利要求1所述的多肽，它是重组多肽。
4.根据权利要求1所述的多肽，其分子量为15kDa至25kDa。
5.根据权利要求1所述的多肽，其分子量为75kDa至95kDa。
6.根据权利要求1所述的多肽，它可降解人补体蛋白C3。
7.根据权利要求1所述的多肽，它包含至少15个连续的氨基酸。
8.一种分离的多肽，它包含SEQ ID NO2或SEQ ID NO5中的至少15个连续的氨基酸。
9.一种分离的多肽，它是SEQ ID NO2或SEQ ID NO5。
10.一种免疫系统刺激性组合物，它包含有效量的权利要求1所述的多肽以及及治疗上可接受的载体。
11.根据权利要求10所述的免疫系统刺激性组合物，其中该多肽分离自肺炎链球菌。
12.根据权利要求11所述的免疫系统刺激性组合物，它还包含至少一种分离自肺炎链球菌的其它免疫系统刺激性多肽。
13.根据权利要求10所述的免疫系统刺激性组合物，其中该多肽可有效地免疫接种或治疗哺乳动物个体以对抗肺炎链球菌的感染或移生。
14.根据权利要求13所述的免疫系统刺激性组合物，其中该多肽以能为哺乳动物个体有效提供治疗效果的量予以供给。
15.一种抗体，它能与权利要求1所述的多肽结合。
16.根据权利要求15所述的抗体，它是单克隆抗体。
17.根据权利要求16所述的抗体，它从小鼠、大鼠、山羊、鸡、人或兔子获得。
18.一种分离的核酸分子，它在高度严谨的杂交条件下可与下列序列的至少一部份杂交(a)SEQ ID NO1中的核苷酸或其互补链，或(b)SEQ ID NO4中的核苷酸或其互补链。
19.根据权利要求18所述的核酸分子，它分离自肺炎链球菌。
20.根据权利要求19所述的核酸分子，它编码降解人补体C3的多肽。
21.一种载体，它包含权利要求18所述的核酸分子。
22.一种细胞，它包含权利要求18所述的核酸。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中该细胞是细菌或真核细胞。
24.一种分离的核酸分子，它包含SEQ ID NO1或其互补链、或SEQ ID NO4或其互补链的核酸序列。
25.一种RNA分子，它是由包含SEQ ID NO1或SEQ ID NO4的双链DNA序列转录得到的。
26.一种在哺乳动物中产生对抗肺炎链球菌的免疫反应的方法，该方法包括给予哺乳动物一种组合物，该组合物包含(a)治疗上有效量的权利要求1所述的多肽；及(b)医药上可接受的载体。
27.根据权利要求26所述的方法，其中免疫反应是B细胞反应、T细胞反应、上皮细胞反应或内皮细胞反应。
28.根据权利要求26所述的方法，其中该多肽的长度至少为15个氨基酸。
29.根据权利要求26所述的方法，其中该组合物还包含至少一种来自肺炎链球菌的其它免疫系统刺激性多肽。
30.一种抑制肺炎链球菌-介导的C3降解作用的方法，该方法包括使肺炎链球菌细菌与能结合权利要求1所述的多肽的抗体接触。
31.一种抑制异种移植中C3-介导的发炎反应和排斥作用的方法，该方法包括在异种移植时所用的动物器官表面上表达权利要求1所述的多肽。
32.一种分离的核酸片段，它具有选自SEQ ID NO6，SEQ ID NO7，SEQ IDNO8和SEQ ID NO9的核酸序列。
33.一种分离的多肽，它与SEQ IDNO2或SEQ IDNO5有至少80％的序列相同性。
34.一种来自肺炎链球菌的15kDa至25kDa的分离的多肽，它能降解人补体蛋白C3。
35.一种来自肺炎链球菌的75kDa至95kDa的分离的多肽，它能降解人补体蛋白C3。
全文摘要
本发明涉及肺炎链球菌表达的人补体C3降解性多肽家族的鉴定和应用。这些多肽例如具有约15－25kDa或约75－95kDa的分子量。本发明的较佳的多肽包括SEQ ID No:2和SEQ ID No:5的氨基酸序列。
文档编号A61K39/00GK1352691SQ99813016
公开日2002年6月5日 申请日期1999年9月24日 优先权日1998年9月24日
发明者马格例特K·贺斯泰特, 大卫J·芬科尔, 程希, 布鲁斯A·葛林, 爱美W·马西 申请人:美国明尼苏达州大学, 美国氰胺公司